Victor Silva da Fonsêca
Avaliação dos efeitos da administração intranasal do
fator neurotrófico derivado do encéfalo em um
modelo animal da doença de Huntington
Dissertação apresentada ao
Programa de Pós-graduação
em Neurociências da
Universidade Federal de
Santa Catarina como requisito
para a obtenção do Título de
Mestre em Neurociências
Orientadora: Prof. Dr. Patricia
de Souza Brocardo
Florianópolis
2017
Dedico este trabalho a todas as pessoas que me apoiaram na caminhada até aqui.
AGRADECIMENTOS
Gostaria de agradecer primeiramente a minha mãe, que sempre me estimulou com todo o amor, carinho e companheirismo incondicional durante todo o tempo e esteve sempre preocupada por causa da distância, mas feliz e orgulhosa de ver o crescimento profissional do filho.
Agradeço a excelentíssima professora doutora Patrícia Brocardo por aceitar me orientar, mesmo sem me conhecer e a 2000 km de distância. Não foi só uma orientadora, mas uma amiga, companheira de experimentos e madrugadas corridas de revisão de artigo. Foi uma segunda mãe para mim. Obrigado.
Agradeço a Pollyana que me acompanhou durante todos estes anos sempre (quase sempre) me apoiando e estando do meu lado.
Agradeço ao meu grupo de pesquisa, o LANEP (que tem uma farda que dá inveja para os outros laboratórios), pelo apoio mútuo que existiu entre a equipe, onde todo mundo se ajuda, supre a falta do outro e ajuda a progredir juntos. Obrigado Cristine, Kátia, Evelini, Elisa, Ana e Cláudia, vocês são todas umas queridas, obrigado pela companhia, aprendizado e momentos felizes.
Agradeço ao grande doutor André Colla, que foi meu tutor inicial com o tratamento nos YACs, na vida acadêmica e no container.
Às professoras Ana Lúcia, Joana Mohapel e Andreza de Bem pela hospitalidade e conhecimentos passados através das aulas e dos encontros nos laboratórios.
Agradeço a Davi por ter me recepcionado inicialmente na cidade de Florianópolis e por dividir o mesmo teto comigo, nos perrengues e nas alegrias por 1 ano.
Agradeço a galera que estava ali comigo, dividindo as dores de cabeça, estresses, e risadas, tanto no bar quanto no lab, Francis, Júlia, Gisa, Gianni, Aline e Maurício.
Aos alunos dos laboratórios das duas professoras pelo tempo em conjunto, me aguentando, reclamando do cheiro dos camundongos que eu estava dissecando, aguentando minhas conversas e etc.
Agradeço também a todos os meus colegas de disciplina que estavam ali na luta comigo, vendo os problemas e habilidades de cada um e contribuindo no desenvolvimento mútuo.
Agradeço ao pessoal do vôlei do Alcir por me ajudar a aumentar meus níveis de BDNF endógeno. Valeu Francis por me convidar para conhecer essa galera massa.
À CAPES por não me deixar morrer de fome (e ao RU pelo mesmo motivo).
À minha mãe, porque ela fez papel de “pãe” e por isso (e muitas outras coisas, a mulher é ligada no 220, nunca para) merece agradecimento dobrado.
RESUMO
A doença de Huntington (DH) é uma doença neurodegenerativa causada por uma expansão de repetições CAG no gene que codifica a proteína huntingtina. O estágio sintomático é definido pelo aparecimento de sintomas motores. Entretanto, sintomas psiquiátricos, incluindo humor deprimido, são características comuns da DH e podem ocorrer até uma década antes da manifestação dos sintomas motores. Os camundongos transgênicos YAC128 são um modelo da DH e apresentam comportamento tipo-depressivo e déficits cognitivos antes dos sintomas motores, similar ao que ocorre em humanos. O que nos permite estudar as alterações comportamentais emocionais sem confundir com os efeitos causados pela deficiência motora. Neste estudo os camundongos YAC128 foram utilizados para testar os efeitos do tratamento intranasal (i.n.) por 15 dias com o fator neurotrófico derivado do encéfalo (BDNF) na dose de 1,66 µg/kg na prevenção dos comportamentos tipo-depressivo. Os camundongos YAC128 tratados com BDNF apresentaram uma diminuição do comportamento anedônico nos testes de preferência a sacarose e no teste de borrifagem de sacarose. Além disso, o tratamento com BDNF i.n. foi capaz de prevenir o aumento do tempo de imobilidade no teste de suspensão pela cauda e no teste do nado forçado sem alterar a locomoção no campo aberto. Investigou-se posteriormente se o efeito do tipo-antidepressivo do BDNF estava associado com uma modulação da neurogênese hipocampal. Entretanto, o tratamento i.n. com BDNF por 15 dias aumentou a proliferação celular (Ki-67) e a diferenciação neuronal (DCX) no giro denteado (GD) hipocampal dos camundongos selvagens sem alterar estes parâmetros nos animais YAC128. Com o objetivo de verificar se as alterações comportamentais ocorreram devido a um aumento na neuroplasticidade avaliou-se a densidade dendrítica destes animais. Nossos resultados mostram que o tratamento com BDNF na dose utilizada não foi capaz de modificar a plasticidade dendrítica. Em conclusão, nossos resultados sugerem que a administração não invasiva de BDNF por via i.n. pode ter um importante potencial terapêutico para tratar sintomas tipo-depressivos em pacientes em estágios iniciais da DH sem alterar a neurogênese e a plasticidade dendrítica.
Palavras-chave: YAC128, BDNF, doença de Huntington, intranasal, depressão
ABSTRACT
Huntington disease (HD) is a neurodegenerative disorder caused by an expanded CAG repeat in the Huntington’s disease gene. The symptomatic stage of the disease is defined by the onset of motor symptoms. However, psychiatric symptoms, including depressive humor, are common features of HD and can occur a decade before the manifestation of motor symptoms. The YAC128 HD transgenic mouse model develops motor deficits at a later stage, allowing more time to study the occurrence of early-stage depressive behaviors without the confounding effects of motor impairment. We used this HD mouse model to test the effects of intranasal (i.n.) brain-derived neurotrophic factor (BDNF) treatment for 15 days, with a dose of 1.66 µg/kg, in the occurrence of depressive-like behaviors during the early-stage of disease progression. The BDNF-treated YAC128 mice showed a decrease in anhedonic behavior in the sucrose preference test and in the splash test. In addition, i.n. treatment with BDNF was able to prevent the increase in the immobility time in the tail suspension test and in the forced swim test without altering the locomotion investigated in the open field test. Furthermore, we also investigated whether the antidepressant-like effects of BDNF were associated with an increase in adult hippocampal neurogenesis. However, BDNF treatment only increased cell proliferation (ki-67) and neuronal differentiation (DCX) in the hippocampal dentate gyrus (DG) of wild-type (WT) mice without altering these parameters in their YAC128 counterparts. To verify if the behavioral changes were caused by an increase in the neuroplasticity, we analyzed dendritic density in the hippocampal DG of WT and YAC128 mice treated with BDNF, using Sholl Analyses. Our results show that BDNF i.n. administration for 15 days was not able of modifying dendritic plasticity. In conclusion, our results suggest that non-invasive administration of BDNF via the i.n. route may have a therapeutic potential for the treatment of mood disorders in early symptomatic HD patients without altering neurogenesis and dendritic plasticity.
Keywords: YAC128, intranasal, BDNF, depression, Huntington Disease
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Funções principais da huntingtina. ... 4 Figura 2: Linha do tempo que correlaciona às mudanças comportamentais e neuropatológicas da doença de Huntington em camundongos YAC128. ... 9 Figura 3: Eixo nariz-encéfalo ... 13 Figura 4: Protocolo experimental ... 18 Figura 5: Exemplo do gel da genotipagem dos camundongos YAC12819 Figura 6: Administração i.n. de BDNF realizada nos animais ... 20 Figura 7: Resumo da transformação da fotografia de um neurônio marcado com DCX até a figura representativa da análise de Sholl completa no programa Fiji ... 28 Figura 8: Avaliação do tratamento repetido com BDNF i.n. no comportamento anedônico dos camundongos YAC128 no teste de preferência a sacarose ... 31 Figura 9: Avaliação do tratamento repetido com BDNF i.n. no comportamento anedônico dos camundongos YAC128 no teste de borrifagem de sacarose ... 32 Figura 10: Avaliação do tratamento repetido com BDNF i.n. no comportamento tipo-depressivo dos camundongos YAC128 no teste de suspensão pela cauda ... 34 Figura 11: Avaliação do tratamento repetido com BDNF i.n. no comportamento tipo-depressivo dos camundongos YAC128 no teste do nado forçado ... 36 Figura 12: Avaliação do tratamento repetido com BDNF i.n. na proliferação celular hipocampal ... 39 Figura 13: Avaliação do tratamento repetido com BDNF i.n. na diferenciação neuronal ... 41 Figura 14: Avaliação do tratamento repetido com BDNF i.n. na arborização dendrítica dos neurônios marcados com DCX ... 42
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
BDNF – Fator neurotrófico derivado do encéfalo (do inglês, Brain Derived Neurotrophic Factor)
CAG – Citosina-Adenina-Guanina (glutamina) DCX - Doublecortina
DH – Doença de Huntington E.P.M. – Erro padrão da média GD – Giro Denteado
i.c.v. – Intracerebroventricular i.n.- intranasal
Long term potentiation)
NGF – Fator de crescimento neural (do inglês, Neural Growth Factor) NT-3 – Neurotrofina 3
NT-4 - Neurotrofina 4
PBS – Solução tampão fosfato (do inglês, Phosphate Buffered Saline) PFA – Parafolmaldeído
SNC – Sistema Nervoso Central TCA – Teste do campo aberto TBS – Tampão fosfato
TPS- Teste da preferência de sacarose TNF – Teste do nado forçado
TST – Teste de suspensão pela cauda (do inglês, Tail Suspension Test) YAC – Cromossomo artificial de levedura (do inglês, Yeast artificial chromossome)
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 1
1.1.A DOENÇA DE HUNTINGTON ... 1
1.2.A PROTEÍNA HUNTINGTINA ... 3
1.3.HIPOCAMPO NA DH ... 6
1.4.MODELOS ANIMAIS DA DOENÇA DE HUNTINGTON ... 7
1.5.FATOR NEUROTRÓFICO DERIVADO DO ENCÉFALO NA DH ... 9
1.6.O USO DA VIA INTRANASAL (I.N.) COMO ROTA DE ENTREGA DE SUBSTÂNCIAS AO SNC ... 11
1.6.1. Absorção de fármacos na região olfatória ... 12
2 JUSTIFICATIVA ...15 3. OBJETIVOS ...16 3.1.OBJETIVO GERAL: ... 16 3.2.OBJETIVOS ESPECÍFICOS: ... 16 4. MATERIAIS E MÉTODOS ...17 4.1.O CAMUNDONGO YAC128 ... 17 4.2.PROTOCOLO EXPERIMENTAL ... 17
4.3. GENOTIPAGEM DOS ANIMAIS ... 18
4.4.ADMINISTRAÇÃO I.N. DO BDNF ... 19
4.5.TESTES COMPORTAMENTAIS ... 20
4.5.1. Teste da preferência de sacarose (TPS) ... 21
4.5.2. Teste de borrifagem da sacarose (TBS) ... 21
4.5.3. Teste de suspensão pela cauda (TSC) ... 22
4.5.4. Teste do nado forçado (TNF) ... 22
4.5.5. Teste do campo aberto ... 23
4.6.PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS ... 23
4.7.DOSAGEM DE BDNF MADURO ATRAVÉS DE ELISA ... 24
4.8.IMUNOHISTOQUÍMICA ... 24
4.9.QUANTIFICAÇÃO MORFOLÓGICA ... 26
4.10.ANÁLISE DE SHOLL ... 26
4.11.ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 29
5. RESULTADOS ...30
5.1. EFEITOS DO TRATAMENTO REPETIDO COM BDNF I.N. NO COMPORTAMENTO ANEDÔNICO EM CAMUNDONGOS YAC128 ... 30
5.2. EFEITOS DO TRATAMENTO COM BDNF I.N. NO COMPORTAMENTO TIPO-DEPRESSIVO EM CAMUNDONGOS YAC128 32 5.3.EFEITO DO TRATAMENTO COM BDNF I.N. NOS NÍVEIS DE BDNF
MADURO NO HIPOCAMPO E ESTRIADO ... 37
5.4. EFEITO DO TRATAMENTO COM BDNF I.N. NA PROLIFERAÇÃO CELULAR HIPOCAMPAL ... 38
5.5. EFEITO DO TRATAMENTO COM BDNF I.N. NA DIFERENCIAÇÃO NEURONAL HIPOCAMPAL ... 40
5.6. EFEITO DO TRATAMENTO COM BDNF I.N. NA ARBORIZAÇÃO DENDRÍTICA DE NEURÔNIOS IMATUROS NO GD HIPOCAMPAL ... 41
6.DISCUSSÃO ... 43
7. CONCLUSÃO ... 51
8. PERSPECTIVAS FUTURAS ... 52
1. INTRODUÇÃO
1.1. A doença de Huntington
A doença de Huntington (DH) é uma doença neurodegenerativa autossômica dominante que geralmente apresenta seus sinais clínicos na meia idade e é caracterizada por distúrbios cognitivos, psiquiátricos e motores (MARTIN e GUSELLA, 1986; ROOS, 2010b). Esta doença foi citada inicialmente em 1842 por Waters (CRITCHLEY, 1984) e descrita em 1872 pelo médico George Huntington (HUNTINGTON, 1872). Em 1993, uma colaboração entre grupos de pesquisas na DH descobriu a mutação genética na doença, uma expansão instável de repetições Citosina-Adenina-Guanina (CAG) na região codificante do gene da proteína huntingtina que está localizado no braço curto do cromossomo 4 (MACDONALD et al., 1993). Apesar de ser considerada uma doença rara, com uma prevalência de 5-10 casos nos Estados Unidos (ROOS, 2010a), de 12 no Reino Unido (EVANS et al., 2013) de 8 no Canadá, de 5-6 na Austrália e de 2 na África do Sul (CONNEALLY, 1984) a cada 100 mil habitantes esta é a doença de poliglutaminas que mais afeta pessoas no planeta. O caráter incapacitante da doença também traz consigo a questão monetária, pacientes com a DH possuem um custo social elevado, custando anualmente, direta e indiretamente, em média 4.947 dólares por pessoa nos EUA em estados iniciais e chegando a 22.582 dólares em estados tardios (DIVINO et al., 2013; JONES et al., 2016).
Nos estágios iniciais da DH podem ser observadas dificuldades na resolução de problemas matemáticos, irritabilidade e depressão (GIL-MOHAPEL e REGO, 2011). Os sintomas motores e a consequente
perda de coordenação de movimentos voluntários acontecem de forma gradual e lenta. Os movimentos involuntários se tornam mais frequentes e progridem até que o indivíduo afetado perderá a capacidade de se mover e se comunicar (BRANDT et al., 1984; FOLSTEIN et al., 1987; ALBIN et al., 1990). Em estágios finais, o paciente pode sofrer de bradicinesia, rigidez severa e demência (THOMPSON et al., 1988; RUIZ et al., 2000; SANCHEZ-PERNAUTE et al., 2000).
Em estágios pré-motores, a DH se manifesta através de diminuição das funções cognitivas e esta pode ser detectada décadas antes do aparecimento dos sintomas motores. Diversos estudos clínicos relataram uma diminuição da cognição em indivíduos afetados pela DH em fase pré-motora, com uma diminuição nas habilidades de memória visuoespacial (JASON et al., 1988; LAWRENCE et al., 1998), percepção temporal (RIGHI et al., 2016), empatia (STOUT et al., 2011; MAURAGE et al., 2016) e em diversos outros testes de cognição (STOUT et al., 2011).
Embora a expressão da proteína huntingtina ocorra em todo o organismo, é no sistema nervoso central (SNC) que a mutação exerce maiores prejuízos, levando inicialmente à degeneração seletiva dos neurônios estriatais (GRAVELAND et al., 1985), e posteriormente das regiões corticais (HEDREEN et al., 1991; ROSAS et al., 2002) e cerebelares (RODDA, 1981; JESTE et al., 1984).
Um dos motivos que fazem com que o estriado seja mais suscetível à degeneração é a falta de fatores tróficos nesta região devido ao menor transporte de vesículas contendo neurotrofinas na direção córtex-estriado, em especial o fator neurotrófico derivado do encéfalo (BDNF) (GAUTHIER et al., 2004), pois este não é produzido no
estriado em indivíduos adultos, sendo necessário o transporte anterógrado do córtex cerebral para a manutenção dos níveis adequados de BDNF nesta estrutura (BAYDYUK e XU, 2014), e este transporte é comprometido na presença da huntingtina mutante (CAVISTON e HOLZBAUR, 2009).
1.2. A proteína huntingtina
A huntingtina possui diversas funções no SNC. Uma das funções mais importantes é o transporte vesicular de substâncias, entre elas a neurotrofina BDNF, extremamente importante na manutenção e sobrevida de algumas células específicas do SNC, especialmente neurônios (GAUTHIER et al., 2004). A proteína também participa na síntese de substâncias, entre elas, o BDNF através do sequestro de fatores de silenciamento. A huntingtina mutada possui um déficit no transporte e no sequestro do fator de silenciamento, diminuindo os níveis de BDNF total na célula em estágios embrionários (DUYAO et al., 1995) (Figura 1), e a inativação pode levar a hidrocefalia (DIETRICH et al., 2009). A huntingtina é fundamental para o correto funcionamento do organismo e a mutação desta pode levar a diminuição da eficiência de sistemas fundamentais ao organismo, como diminuição da produção de adenosina trifosfato mitocondrial (MILAKOVIC e JOHNSON, 2005), apoptose (DRAGUNOW et al., 1995), transporte vesicular sináptico (DIFIGLIA et al., 1995), alteração na transcrição de alguns genes (WYTTENBACH et al., 2001; SUGARS et al., 2004; KUHN et al., 2007), alterações no transporte de glutamato (BEHRENS et al., 2002) e cálcio (KUHN et al., 2007) e cascatas envolvidas com sobrevivência celular como o alvo mecanístico da rapamicina (mtor)
(LI et al., 2002; RAVIKUMAR et al., 2004; WEYDT et al., 2006). Em neurônios a presença da huntingtina mutada causa alterações morfológicas como diminuição do tamanho e densidade dos dendritos (SPIRES, GROTE, GARRY, et al., 2004; KUHN et al., 2007).
Figura 1: Funções principais da huntingtina.
Legenda: A) O Transporte vesicular de BDNF está relacionado ao bom funcionamento da huntingtina. Esta estabiliza o complexo dineína-dinactina aumentando sua eficiência e taxa de transporte vesícular. B) A huntingtina normal sequestra o REST no citoplasma prevenindo a formação de um complexo co-repressor (envolvendo Sin3a, coREST e HDAC) no sítio RE1 e permitindo que o gene do BDNF seja transcrito. C) A huntingtina mutante causa a entrada patológica do REST no núcleo, permitindo a formação do complexo repressor e consequentemente a diminuição da transcrição do BDNF. Abreviações: BDNF, fator neurotrófico derivado do encéfalo; coREST, co-repressor REST 1; HAP1, proteína 1 associada a huntingtina; HDAC, desacetilases de histona; RE1, elemento repressor 1; REST, fator silenciador de transcrição RE1; RILP, interação do REST com o domínio proteico LIM; Sin3a, proteína co-repressora Sin3a. Painel A – adaptado de Karasinska, 2011 e painéis B e C- adaptado de Zuccato e Cattaneo, 2009.
Diversas evidências apontam que o número de repetições de CAG está diretamente relacionada com a gravidade e velocidade do aparecimento dos sintomas (MACDONALD et al., 1993), sendo que a huntingtina normal possui de 6 a 34 repetições de glutamina (DUYAO et al., 1993). Com um número de repetições entre 36 a 39 o indivíduo pode vir a apresentar os sintomas motores, mas em geral somente em idade avançada (80 anos), sendo que a partir de 40 repetições dificilmente o indivíduo não apresentará os sintomas característicos da DH (RUBINSZTEIN et al., 1996).
A proteína huntingtina possui a característica de formar naturalmente aglomerados proteicos, mas estes são altamente dinâmicos, possuindo um período de vida curto, de 10 a 20 segundos na proteína normal, enquanto o tempo na proteína afetada é maior, formando agregados mais estáveis (LI et al., 2016). Há uma grande discussão sobre a formação dos agregados proteicos e sua toxicidade. Alguns autores defendem que os agregados são tóxicos (SCHERZINGER et al., 1999; LI et al., 2000; CHANG et al., 2006). Por exemplo, no modelo de camundongos transgênicos R6/2 ocorre o acumulo destes agregados seletivamente no estriado, que é a região mais afetada na DH (LI et al., 2000). Por outro lado, existem trabalhos que defendem que os agregados de huntingtina não são tóxicos, mostrando que a toxicidade advinda da supressão do complexo de chaperonas ocorre independentemente destes agregados (ZHOU et al., 2001). Outros trabalhos mostram que os agregados nem sempre aparecem com os sintomas da doença (SLOW et al., 2005) chegando a surgir apenas meses depois que os animais apresentam os sintomas em alguns casos (MENALLED et al., 2003; SLOW et al., 2003).
1.3. Hipocampo na DH
Muitos trabalhos pré-clinicos e clínicos na DH tem focado na degeneração estriatal, pela forte relação aos déficits motores da doença (BERNHEIMER et al., 1973; COYLE e SCHWARCZ, 1976b; a; BLOCK et al., 1993). Mas, apesar dos déficits no estriado estarem bem caracterizados em modelos animais (SLOW et al., 2003; SPIRES, GROTE, VARSHNEY, et al., 2004; APOSTOL et al., 2008), outras regiões encefálicas também são afetadas na DH como o hipocampo (SQUIRE, 1992; LAZIC et al., 2004) e o cerebelo (JESTE et al., 1984; FENNEMA-NOTESTINE et al., 2004). A diminuição da plasticidade hipocampal ocorre antes dos sintomas motores (USDIN et al., 1999; MURPHY et al., 2000) e é acompanhada por comprometimento cognitivo (CIAMEI e MORTON, 2008). Alguns estudos clínicos demonstraram a ocorrência de morte neuronal nesta região (SPARGO et al., 1993; ROSAS et al., 2003).
O hipocampo é uma região cerebral que está relacionada com a cognição, em particular com vários aspectos de aprendizagem e memória (COLLINGRIDGE et al., 2010; LEUNER e GOULD, 2010), e alterações na plasticidade sináptica hipocampal têm sido repetidamente mostradas em vários modelos transgênicos da DH (MURPHY et al., 2000; GIBSON et al., 2005; PANG et al., 2006). Vale destacar que estas alterações são acompanhadas por um decréscimo da capacidade cognitiva (MURPHY et al., 2000) e no desenvolvimento de um fenótipo depressivo (PANG et al., 2009). Além disso, alguns estudos demonstraram que uma redução da capacidade neurogênica do hipocampo (uma das poucas regiões no cérebro adulto que retém a capacidade de produzir novos neurônios) pode ser detectada antes do
aparecimento dos sintomas motores em diferentes modelos transgênicos da DH (GIL et al., 2004; LAZIC et al., 2004; GIL et al., 2005; LAZIC e BARKER, 2005; FEDELE et al., 2011; SIMPSON et al., 2011). Esta redução parece ter um impacto funcional uma vez que a recuperação dos déficits neurogênicos com inibidores seletivos da recaptação de serotonina como a fluoxetina e a sertralina (PENG et al., 2008) resultou numa melhoria do fenótipo tipo-depressivo característico de vários modelos transgênicos da DH, nomeadamente das linhagens R6/1 (GROTE et al., 2005), R6/2 (PENG et al., 2008), e N171-82Q (DUAN et al., 2003).
1.4. Modelos animais da doença de Huntington
Diversos modelos animais foram criados para estudar os mecanismos da doença, o primeiro modelo genético surgiu em 1996, com a inserção do gene da huntingtina mutada de um paciente em um camundongo da linhagem C57BL/6, nomeadamente o modelo R6/1 (MANGIARINI et al., 1996), e os fenótipos apresentados por este animal fizeram com que este modelo fosse amplamente utilizado desde então. Novos modelos genéticos foram então criados, como os R6/2 (MANGIARINI et al., 1996), BACHD (GRAY et al., 2008; LEE et al., 2013), hdhq111 (WHEELER et al., 2000), N171-82Q (SCHILLING et al., 1999), YAC72 e YAC128 (HODGSON et al., 1999).
Os camundongos YAC128 expressam o gene inteiro da DH com 128 repetições CAG e apresentam uma degeneração seletiva dos neurônios estriatais com uma deterioração motora progressiva e uma sobrevida longa (SLOW et al., 2003). Sendo assim, essa linhagem apresenta elevado grau de representatividade da condição humana (VAN
RAAMSDONK et al., 2007; GIL-MOHAPEL et al., 2011). Do ponto de vista comportamental, os camundongos YAC128 exibem comprometimento motor bifásico com um período inicial de hiperatividade aos 60 dias seguido por uma fase hipoativa (a partir dos 4 meses de idade), semelhante ao que é observado em indivíduos portadores da DH (VAN RAAMSDONK et al., 2007). O aparecimento dos déficits motores está bem correlacionado com a perda dos neurônios estriatais nos camundongos YAC128 (SLOW et al., 2003). Além disso, o acúmulo nuclear da huntingtina mutante pode ser observada no estriado desses animais logo aos 2 meses de idade, coincidindo com o aparecimento dos sintomas motores e cognitivos (VAN RAAMSDONK, MURPHY, et al., 2005). Estudos recentes têm também indicado que os camundongos transgênicos YAC128 desenvolvem déficits cognitivos moderados, que precedem o aparecimento das anormalidades motoras e estes progridem com a idade (VAN RAAMSDONK, MURPHY, et al., 2005), bem como comportamento tipo-depressivo nos estágios iniciais da DH, aos 3 meses de idade (POULADI et al., 2009) (Figura 2). As similaridades entre o fenótipo dos camundongos YAC128 com a condição humana faz deste modelo transgênico uma excelente ferramenta para estudar os mecanismos implicados na fisiopatologia dessa doença e para testar potenciais estratégias terapêuticas que possam modificar o curso da progressão da DH (GIL-MOHAPEL et al., 2011).
Figura 2: Linha do tempo que correlaciona às mudanças comportamentais e neuropatológicas da doença de Huntington em camundongos YAC128.
Legenda: Sintomas que ocorrem no YAC128 durante os primeiros 12 meses de vida. Adaptado de: Pouladi et al, 2009.
1.5. Fator neurotrófico derivado do encéfalo na DH
O BDNF é membro da família das neurotrofinas, que também inclui o fator de crescimento neural (do inglês, nerve growth factor - NGF), a neurotrofina-3 (NT-3) e a neurotrofina-4 (NT-4), foi descoberto e isolado na década de 80 (BARDE et al., 1982). O BDNF mantém a sobrevivência e a diferenciação neuronal no sistema nervoso periférico e central, participa do crescimento e direcionamento axonal e na modulação do crescimento e da morfologia dendrítica durante o desenvolvimento e é importante para a aprendizagem e memória em adultos (MAISONPIERRE et al., 1990; ISLAM et al., 2009).
O BDNF parece ter um papel especifico na patologia da DH, pois estudos post mortem das estruturas cerebrais de pacientes mostraram a redução na expressão do BDNF nos núcleos putâmen e caudado (FERRER et al., 2000; SEO et al., 2004), no córtex cerebral (SEO et al., 2004; ZUCCATO et al., 2008), no estriado, cerebelo e substância negra (SEO et al., 2004). Uma diminuição dos níveis de BDNF plasmático em
pacientes também foi reportada (CIAMMOLA et al., 2007). Em diferentes modelos animais da DH também foi encontrada uma diminuição da expressão de BDNF no córtex cerebral (ZUCCATO et al., 2005; GIRALT et al., 2011) e estriado (SPIRES, GROTE, VARSHNEY, et al., 2004). Além disso, tratamento com o antidepressivo sertralina aumentou os níveis de BDNF no hipocampo e estriado e melhorou a desempenho motor e diminuiu a atrofia cerebral no modelo genético de camundongos R6/2 para a DH (SPIRES, GROTE, VARSHNEY, et al., 2004). Deste modo, é possível que a redução dos níveis de BDNF que ocorre em cérebros afetados com a DH esteja envolvida na disfunção hipocampal e o consequente desenvolvimento de déficits cognitivos na DH.
As evidências que mostram que o BDNF está diminuído na DH deram origem a alguns estudos envolvendo diferentes abordagens terapêuticas com o objetivo de aumentar os níveis de BDNF em modelos animais da DH. Por exemplo, um aumento por manipulação genética da expressão de BDNF no córtex cerebral e estriado de camundongos YAC128 diminuiu a perda de neurônios estriatais e melhorou a disfunção motora e o aprendizado nestes animais (GIRALT et al., 2011). Ainda, o aumento da expressão de BDNF no estriado de camundongos R6/2 melhorou a conectividade cortico-estriatal e a função motora (BERNHEIMER et al., 1973).
Além dos estudos citados acima que utilizaram uma manipulação mais direta dos níveis de BDNF, vários trabalhos utilizaram diferentes estratégias para modificar os níveis de BDNF como forma de tratamento em modelos animais da DH, como restrição nutricional (DUAN et al., 2003), aumento da expressão de BDNF por transfecção viral
(BEMELMANS et al., 1999; KELLS et al., 2004; ARREGUI et al., 2011), exercício físico (PANG et al., 2006), tratamento com antidepressivos (PENG et al., 2008; SHIEH et al., 2008) e a introdução de células embrionárias e mesenquimais que produziam o BDNF (DEY et al., 2010; OLSON et al., 2012).
As várias estratégias para administrar BDNF no SNC incluem injeções, uso de minibombas ou terapia gênica (GILL et al., 2003; DEIERBORG et al., 2008). Infelizmente, muitos desses métodos são poucos práticos devido à natureza invasiva do método, possuindo pouca relevância na prática clínica (THOENEN e SENDTNER, 2002; ZUCCATO e CATTANEO, 2009). Além disso, a administração intracerebroventricular (i.c.v.) de BDNF resulta em pouca difusão cerebral (BURKE et al., 1994) e a administração sistêmicapossui biodisponibilidade do BDNF no encéfalo muito baixa devido ao metabolismo celular. A natureza hidrofílica e macromolecular (aproximadamente 28 kDa de peso molecular, sendo 2 subunidades formadas por dímeros de 14kDa ligados não-covalentemente) do BDNF limita sua permeabilidade para passar as barreiras biológicas (CONNOR e DRAGUNOW, 1998), como a barreira hematoencefálica (SAKANE e PARDRIDGE, 1997). Portanto, existe a necessidade de testar novas formas de entrega do BDNF para o SNC de maneira segura e não invasiva.
1.6. O uso da via intranasal (i.n.) como rota de entrega de substâncias ao SNC
A cavidade nasal é de fácil acesso e rica em capilares sanguíneos o que permite que drogas administradas topicamente alcancem rapidamente altas concentrações sanguíneas. Além disso, os
medicamentos administrados pela via i.n. não sofrem interferência do metabolismo hepático ou má absorção pelo trato digestório (WERMELING et al., 2002), e mais importante, o uso desta via possibilita a ação central de moléculas que normalmente não atravessam a barreira hematoencefálica (TALEGAONKAR e MISHRA, 2004).
A cavidade do nariz se divide em três áreas funcionais: vestíbulo nasal, região respiratória e região olfatória. A região respiratória, revestida por epitélio pseudoestratificado colunar ciliado, é a mais relevante para que ocorra absorção sistêmica das drogas administradas no nariz, enquanto a região olfatória é essencial à passagem de medicamentos para o SNC.
1.6.1. Absorção de fármacos na região olfatória
Quando o medicamento administrado pela via i.n. entra em contato com a mucosa olfatória que contem células olfatórias que se estendem até o SNC, este é transportado para o SNC, sem precisar passar pela barreira hematoencéfalica e atingindo rapidamente níveis detectáveis no líquor (ALCALÁ-BARRAZA et al., 2010). Um estudo realizado em ratos demonstrou que a administração i.n. de um análogo da prostaglandina D2 resulta em altas concentrações da droga no bulbo olfatório (YAMADA et al., 2007). Este conceito de transferência de moléculas do nariz para o encéfalo é referenciado como a via nariz-encéfalo (Figura 3).
Figura 3: Eixo nariz-encéfalo
Legenda: Via de administração i.n. até o encéfalo em humanos Fonte:http://www.blackhagendesign.com/wpcontent/uploads/2015/01/2 0141229143445222.jpg
No entanto, alguns fatores podem afetar a eficácia dos medicamentos usados por via intranasal. A viscosidade excessiva do muco nasal impede a difusão do fármaco, enquanto a rápida depuração mucociliar nasal reduz o tempo de contato com o epitélio. Para melhorar a absorção i.n. dos fármacos, substâncias como os surfactantes, glicosídeos, ciclodextrinas, lipossomos, géis e glicóis, são utilizadas para ajudar a reduzir a viscosidade do muco, inibir enzimas ou aumentar a permeabilidade da membrana celular (WERMELING et al., 2002; CAO et al., 2007). Também podem ser utilizados veículos com polímeros mucoadesivos, como a quitosana, os quais aumentam o tempo
de contato do medicamento com a mucosa nasal (WERMELING et al., 2002; MAJITHIYA et al., 2006; VARSHOSAZ et al., 2006).
A quitosana na concentração de 0.25% possui efeito modulador sob a barreira hematoencefálica, abrindo poros nesta e facilitando a entrada de substâncias, e esse agente consegue aumentar a quantidade do BDNF em até 13 vezes no hipocampo, sendo adequada para a utilização desta substância como veículo (VAKA et al., 2012).
2 JUSTIFICATIVA
A DH é uma doença hereditária neurodegenerativa e progressiva caracterizada por uma variedade de sintomas desde déficits motores até sintomas psiquiátricos como a depressão, anedonia e disfunção cognitiva. Existem evidências que o hipocampo é uma das regiões encefálicas implicada na DH porque entre os sintomas pré-motores estão déficits na memória espacial e sintomas depressivos, comportamentos regulados pelo hipocampo. No entanto, poucos estudos têm investigado esta estrutura na DH. Portanto, investigar se o tratamento com BDNF em camundongos YAC128, um modelo animal com o desenvolvimento gradual dos sintomas vistos na DH, terá um valor terapêutico na modulação do comportamento tipo-depressivo, anedônico, bem como das alterações bioquímicas e estruturais características justificando assim a utilização deste modelo animal neste trabalho. Destaca-se ainda que o uso de uma estratégia terapêutica não invasiva como a administração i.n. de BDNF, poderá ter um impacto clinico significativo, uma vez que esta permite a manipulação de circuitos neuronais cerebrais sem causar efeitos colaterais significantes.
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo Geral:
Avaliar os efeitos da administração i.n. de BDNF nos comportamentos tipo-depressivo e anedônico e na neuroplasticidade nos camundongos YAC128.
3.2. Objetivos Específicos:
1. Investigar se a administração i.n. repetida de BDNF é capaz de prevenir o aparecimento de comportamento tipo-depressivo e anedônico em camundongos YAC128 e alterar os níveis de BDNF estriatal e hipocampal;
2. Verificar se a administração repetida de BDNF via i.n. é capaz de promover a proliferação celular e diferenciação neuronal no giro denteado (GD) hipocampal em camundongos YAC128;
3. Investigar se a administração repetida de BDNF via i.n. é capaz de alterar a arborização dendrítica de neurônios imaturos no GD hipocampal.
4. MATERIAIS E MÉTODOS 4.1. O camundongo YAC128
Foram utilizados camundongos de ambos os sexos selvagens (n=45) e YAC128 (n=39), com 2 meses de idade. Todos os animais foram gerados na nossa colônia local a partir de um casal de animais gentilmente cedidos pelo professor Dr. Brian Christie (University of Victoria, BC, Canada). Os animais foram mantidos em gaiolas plásticas com dimensões de 30x20x13 cm no Biotério Setorial do Departamento de Bioquímica na Universidade Federal de Santa Catarina (Florianópolis, SC, Brasil) em estantes ventiladas e climatizadas a 21-23ºC com livre acesso à água e comida, sob um ciclo claro-escuro de 12:12h (07:00-19:00).
4.2. Protocolo Experimental
Aos 75 dias de idade, os animais de ambos os sexos foram divididos em dois grandes grupos: 1- Controle (camundongos YAC128 e selvagens que receberam a solução veículo por via i.n. por 15 dias); 2- BDNF (camundongos YAC128 e selvagens que receberam BDNF (1,6 ug/kg/dia) via i.n. por 15 dias. O grupo controle recebeu uma solução de quitosana (0,25%) (figura 4). Os procedimentos foram realizados de acordo com os princípios éticos do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA), e todos os esforços foram feitos para minimizar o número de animais utilizados e o sofrimento dos animais. Os procedimentos experimentais foram aprovados na Comissão de Ética no Uso de Animais da UFSC (CEUA), sob protocolo n° PP00944.
Figura 4: Protocolo experimental
Legenda: Os animais YAC128 e selvagens receberam o tratamento i.n. por 15 dias, sendo: BDNF (1,66 µg/kg/dia) ou solução veículo (quitosana 0,25%) 5 µl por dia, alternando a narina a cada dia. Decorridas 24 horas após a última administração os animais foram submetidos aos testes comportamentais. Ao final dos testes comportamentais os animais foram eutanasiados para a coleta das amostras para a análise bioquímica e morfológica.
4.3. Genotipagem dos animais
Amostras de tecido da orelha coletadas no momento do desmame dos camundongos foram utilizadas para a extração do DNA. Brevemente, após a retirada do tecido, estes foram colocados em eppendorfs com solução de lise nucléica contendo Master mix (0,5M EDTA, proteinase K e RNAse A) por 3 horas a 55ºC. As amostras foram homogeneizadas e centrifugadas e o sobrenadante foi retirado posteriormente. Foi adicionado tampão de lise e tampão de lavagem (3 vezes), sendo centrifugada a cada adição dos tampões a 13000g por 3 minutos e 1 minuto respectivamente para isolar o DNA. Posteriormente foi adicionado o DNA em solução de 8µl contendo Master Mix Go Taq
e primers específicos e encaminhado para um aparelho de reação de cadeia da polimerase (PCR) para multiplicação do DNA e posterior análise através de eletroforese (HOFSTETTER et al., 1997).
Figura 5: Exemplo do gel da genotipagem dos camundongos YAC128
Legenda: Os símbolos (+) indicam animais positivos para a mutação (YAC128) e o (-) indicam animais negativos para a mutação (selvagens). Fonte: o autor.
4.4. Administração i.n. do BDNF
A administração de BDNF (Prospec®) foi realizada por 15 dias através de micropipeta para dispensa de 5 microlitros de uma solução de quitosana (0,25%) contendo BDNF (1,66 µg/kg) em cada narina alternando a cada dia (VAKA et al., 2012). A manipulação dos camundongos para a administração i.n. de BDNF está ilustrada abaixo (Figura 6). Brevemente, cada camundongo foi individualmente retirado da sua caixa pela base da cauda, e apoiado na tampa da gaiola. O animal foi suspenso pela pele da região dorso-cervical, entre o dedo indicador e polegar do experimentador. Em seguida a cauda do camundongo foi fixada entre os outros dedos e a palma da mão, para a limitação total de seus movimentos de modo a facilitar o procedimento de administração do BDNF. Enquanto a manipulação não ocorria, os
animais permaneceram nas gaiolas plásticas com comida e água ad libitum. A via i.n. é uma técnica eficiente, não invasiva, de fácil administração e pode ser repetida sem problemas ao longo do tratamento (SIMMONS et al., 2009; ALCALÁ-BARRAZA et al., 2010; XIE et al., 2010).
Figura 6: Administração i.n. de BDNF realizada nos animais
Legenda: Modo de administração realizada nos animais. Fonte: O autor.
4.5. Testes Comportamentais
Foi utilizada uma bateria de testes para verificar o comportamento emocional dos animais. Os testes foram organizados em três grupos. Um grupo de animais (n=28) realizou os seguintes testes: teste da preferência pela sacarose (TPS), teste da suspensão pela cauda
(TSC) e teste do nado forçado (TNF). O segundo grupo (n=36) foi utilizado para os testes de campo aberto, teste da borrifagem da sacarose, e da esquiva inibitória. Todos os testes comportamentais foram gravados utilizando uma câmera Webcam Logitech C920 acoplada a um notebook Dell Vostro 5470 utilizando o software Any-maze (Stoelting Co., U.S.A.). Quando a contagem teve que ser manual o experimentador foi cego em relação ao genótipo e ao tratamento dos animais.
4.5.1. Teste da preferência de sacarose (TPS)
Para o TPS, os animais foram ambientados durante o tratamento com 2 garrafas de água. No dia do teste foram separados em gaiolas individuais contendo 2 garrafas, uma com água e outra com solução de sacarose a 2% por 24 horas. Para prevenir uma possível preferência a um dos lados da caixa, as garrafas foram invertidas depois de 12 horas. O consumo de sacarose foi estimado baseado na quantidade de solução restante. A preferência foi calculada pela porcentagem de sacarose consumida do total de líquido consumido. Não houve privação de água ou comida antes do teste. Animais com o comportamento tipo-depressivo apresentam anedonia, diminuindo a preferência pela sacarose (BBIOMEDSC, 2013).
4.5.2. Teste de borrifagem da sacarose (TBS)
O TBS foi utilizado para avaliar o comportamento de auto-limpeza (“grooming”) dos animais, após a borrifagem dos mesmos com solução de sacarose a 10% no dorso. O tempo em que o animal permaneceu neste comportamento foi cronometrado durante 5 minutos (DUCOTTET et al., 2004). O TBS é um teste que afere a anedonia e motivação, uma vez que animais submetidos a modelos
comportamentais de depressão apresentam um menor tempo de autolimpeza quando comparados aos animais controle (KALUEFF, 2002; KALUEFF e TUOHIMAA, 2004). Em modelos animais de depressão, a administração crônica de antidepressivos clássicos aumenta o tempo despendido neste comportamento (YALCIN et al., 2005).
4.5.3. Teste de suspensão pela cauda (TSC)
Foi analisado o período total de imobilidade e a latência para a primeira imobilidade utilizando o método descrito por STERU em 1985 (STERU et al., 1985). Os camundongos foram suspensos pela cauda através de fita adesiva por 6 minutos a 80 cm do chão. Animais com comportamento tipo-depressivo possuem o tempo de imobilidade maior e latência reduzida e a utilização de antidepressivos reverte esses efeitos (CASTAGNÉ et al., 2011).
4.5.4. Teste do nado forçado (TNF)
Os animais foram colocados individualmente em tanques cilíndricos de policloreto de vinila com 24 x 10 cm de altura x diâmetro contendo água até 19 cm de altura mantida em 25 ± 1ºC. Os testes foram registrados em AnyMaze® e posteriormente foram contabilizados a latência para a primeira imobilidade e o tempo total de imobilidade. Os camundongos foram considerados imóveis quando estes pararam de nadar e permaneceram imóveis na água, executando movimentos apenas para manter a cabeça fora da água. Diminuição no tempo de imobilidade é um indicativo de efeito tipo-antidepressivo, enquanto um aumento neste tempo é considerado efeito tipo-depressivo (CAN et al., 2012).
4.5.5. Teste do campo aberto
Para verificar se o tratamento com BDNF alterou a locomoção dos animais e por consequência afetou as respostas comportamentais do TNF e do TSC foi utilizado o teste do campo aberto. Neste teste a locomoção e ansiedade podem ser avaliadas através da distância total percorrida e do tempo gasto no centro da arena, respectivamente. Os animais foram colocados individualmente na arena do campo aberto, de modo a mensurar a atividade locomotora durante 6 minutos. A distância total percorrida e o tempo gasto no centro da arena neste período foram analisada pelo software AnyMaze®. O campo aberto foi limpo com álcool 10% após cada teste, para evitar pistas olfatórias.
4.6. Preparação das amostras
Após os testes comportamentais, um grupo de animais foi eutanasiado por deslocamento cervical para retirada do estriado e hipocampo para avaliar os níveis de BDNF (CHIU et al., 2007); e outro grupo de animais sofreu perfusão cardíaca com solução salina a 0,9% seguida de paraformaldeído a 4% (PFA), após a anestesia com cetamina (100 mg/kg) e xilazina (8 mg/kg). Os encéfalos foram retirados da calota craniana e colocados em frascos de vidro contendo PFA 4% por 12h e após foram transferidos para solução de sacarose 30%. Após a saturação do tecido com a sacarose, estes foram cortados serialmente (séries de 6) em orientação coronal através de vibrátomo (Vibratome, Series 1000, St. Luis, Mo, EUA ®) com espessura de 30 µm. As fatias foram coletadas em placas com 6 poços com solução de azida 0,5% e tampão fosfato (PBS) em geladeira (4ºC) para posterior análise.
4.7. Dosagem de BDNF maduro através de ELISA
Foi utilizado um kit da Promega (Madison, Wisconsin, EUA) e o procedimento realizado seguiu as instruções do fabricante. Brevemente, as placas foram revestidas usando 10 µl de anticorpo monoclonal anti-BDNF em 9.99 ml de tampão carbonato e foram adicionados 100 µl da solução em cada poço da placa, durante uma noite em geladeira a +4ºC. 12 horas depois foi colocada solução bloqueadora na placa por uma hora, depois preparada uma curva padrão de 7.8 a 500 pg/ml. As amostras foram preparadas a partir da homogeneização, centrifugação e retirada do sobrenadante. O sobrenadante foi incubado por 2 h. Foi adicionado então 100 µl em cada poço de uma solução de 20 µl de anticorpo policlonal anti-BDNF em 9.98 ml de solução tampão e incubadas por 2 horas, e em seguida lavadas com tampão carbonato. Foi adicionada 50 µl em cada poço de uma solução de 50 µl anticorpo IgY em 9.95 ml de solução tamponante, mantida por uma hora e depois lavada. Para o desenvolvimento da cor, foi utilizada TMB One solution com 1N de ácido clorídrico. A visualização da absorbância foi através de espectrofotômetro a 450nm. Os resultados foram apresentados como uma razão entre os níveis de absorbância do BDNF em relação a curva padrão e os níveis totais de proteína. A dosagem de proteínas foi realizada de acordo com o método de Bradford (BRADFORD, 1976) utilizando albumina bovina como padrão.
4.8. Imunohistoquímica
Para avaliar a proliferação de células no GD hipocampal, foi utilizado o marcador da proteína endógena, o ki-67. O ki-67 é expresso em quase todo o ciclo celular G1, S, G2 e M, exceto na fase de descanso
(G0). Para quantificar a diferenciação neuronal foi utilizada a proteína endógena doublecortina (DCX) que é expressa em neurônios imaturos. Para a marcação de ki-67, as fatias foram pré-incubadas com ácido cítrico 10 mM (pH 6.0) por 10 minutos (divididos em 2 vezes de 5 minutos) a 95 ºC com 20 minutos de intervalo entre elas. Foram então pré-incubadas com solução de soro de cabra por 1 hora e depois incubadas com o anticorpo primário policlonal anti-ki67 (1:500; Vector Laboratories, Burlingame, CA, EUA) feito em coelho, por 48 horas a 4ºC. As fatias foram então lavadas e incubadas com o anticorpo secundário (biotin-conjugated goat anti-rabbit IgG, 1:200; Vector Laboratories) por 2 horas, lavados e incubados com a solução ABC (Vectastain ABC Elite Kit PK4000; Vector Laboratories) por 1 hora e marcada com DAB (DAB; DAB kit SK 4100; Vector Laboratories) por cerca de 3 minutos. As fatias foram então montadas em lâminas gelatinizadas, desidratadas com soluções crescentes de etanol e em seguidas incubadas em xilol (Synth, Diadema, SP, Brasil) e cobertas com Entellan (Merck Millipore, Billerick, Massachussets, EUA) seguidos por lamínula. De modo similar, a marcação de DCX ocorreu com a exposição inicial das fatias com solução de água oxigenada a 3% e metanol a 10% em solução tampão de fosfato, lavadas e pré-incubadas em solução de 5% de soro cavalo e Triton, incubadas posteriormente em soro de cabra anti-DCX (1:400; Santa Cruz Biotechnology) por 48 horas a +4ºC. Após este período, as fatias foram incubadas com solução de 2% de anticorpo secundário anti-cabra feito em cavalo (biotin-conjugated horse anti-goat IgG, 1:200; Vector Laboratories) por 2 horas, lavados e incubados com solução ABC da Vectastain por 1 hora, lavadas e desenvolvidas em DAB por 3 minutos. As fatias foram então montadas
em lâminas gelatinizadas, desidratadas com soluções crescentes de etanol e em seguidas incubadas em xilol (Synth, Diadema, SP, Brasil) e cobertas com Entellan e lamínula.
4.9. Quantificação Morfológica
A contagem das células positivas para o ki-67 e para a DCX foi feita por 2 pesquisadores cegos ao experimento utilizando um microscópio óptico (Olympus CX21). Todas as fatias ao longo do eixo dorso/ventral do hipocampo contendo o GD foram usadas para a análise, resultando em 10-12 fatias por poço. Todas as células positivas na ZSG de cada GD foram contadas. Os resultados foram expressos como número total de células positivas multiplicando médias aritméticas de cada hipocampo por 73, que é a quantidade de fatias de 30 µm contendo o hipocampo no encéfalo de camundongo, para estimar o número total de células positivas em todo o GD.
4.10. Análise de Sholl
Para a aquisição das imagens para a análise de Sholl foi utilizado um microscópio óptico invertido modelo Olympus IX83, acoplado com uma câmera digital Olympus DP73 (17 megapixels) através do software CellSens Dimension 1.72.
Foram fotografadas 5 fatias hipocampais marcadas para a DCX, de cada animal (n=4-5 animais/grupo) com ampliação de 400x. A análise de Sholl foi feita através do programa Fiji, versão 1.51J criado a partir do programa de código aberto imageJ (RASBAND, 2016). A ramificação dendrítica visível foi marcada em branco através da ferramenta “pencil” com um raio de 10 pixels, a partir do soma,
transformadas em preto e branco e marcadas através da ferramenta “threshold”, resultando em uma foto branca com o contorno preto anteriormente marcado (Figura 7). Foi traçada uma reta com a ferramenta “straight” no Fiji do início do traçado, onde originalmente estaria o soma, até o ponto mais distante da ramificação. A partir deste traçado foi executada a análise de Sholl através do próprio plugin do Fiji.
Figura 7: Resumo da transformação da fotografia de um neurônio marcado com DCX até a figura representativa da análise de Sholl completa no programa Fiji
Legenda: Transformação das fotos até a execução da análise de Sholl. A – Foto de um neurônio marcado com DCX (zoom de 400x). B – Ramificação traçada com a ferramenta lápis e convertida em preto e branco. C – Marcação do traçado da ramificação dendrítica em preto e branco e utilizada a ferramenta régua para determinar o local da análise de Sholl. D – Figura representativa do resultado da análise de Sholl.
4.11. Análise Estatística
Todas as análises foram realizadas utilizando o software Statistica 10 (StatSoft Inc., Tulsa, OK, EUA). Os animais machos e fêmeas foram analisados juntos por não haver diferença estatística nos testes executados neste trabalho. Foi realizada análise de variância (ANOVA) de 2 vias para o genótipo (selvagem x YAC128) e para o tratamento (veículo x BDNF) para os testes comportamentais que visavam verificar o comportamento tipo-depressivo e as análises morfológicas. Quando houve diferença estatística entre os genótipos ou tratamentos, mas não houve interação, foi utilizado um teste T de Student para verificar estas diferenças. A análise de Sholl foi realizada usando ANOVA de medidas repetidas. Os testes estatísticos foram seguidos por uma análise post-hoc de Newman-Keuls quando apropriado, exceto na ANOVA de medidas repetidas onde foi utilizada análise de Bonferroni. Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média (E.P.M.). Foram considerados significativos os valores de p<0,05.
5. RESULTADOS
5.1. Efeitos do tratamento repetido com BDNF i.n. no comportamento anedônico em camundongos YAC128
A Figura 8 mostra que os camundongos YAC128 possuem um comportamento anedônico caracterizado pela diminuição no consumo de sacarose em relação ao grupo controle. O tratamento com BDNF foi capaz de prevenir essa diminuição no consumo no TPS. A ANOVA de duas vias revelou diferença significativa para o tratamento [F (1,24) = 5,81, p<0,05], genótipo [F (1,24) = 9,65, p<0,01] e para a interação tratamento x genótipo [F (1,24) = 10,82, p<0,01].
Figura 8: Avaliação do tratamento repetido com BDNF i.n. no comportamento anedônico dos camundongos YAC128 no teste de preferência a sacarose
Legenda: Efeito da administração i.n. de BDNF (1,66 µg/kg) ou veículo (0,25% quitosana) por 15 dias no comportamento anedônico dos camundongos YAC128 e selvagens testados no teste de preferência a sacarose. Os dados são apresentados como média ± E.P.M. (n=7).
**
p<0,01 quando comparado ao grupo selvagem tratado com veículo,
##
p<0,01 quando comparado com o grupo YAC128 tratado com veículo.
Os camundongos YAC128 apresentaram uma diminuição do tempo de autolimpeza no TBS e o tratamento com BDNF foi capaz de reverter este efeito. A ANOVA de duas vias revelou diferença significativa para o tratamento [F (1, 29) = 15,58, p<0,01], genótipo [F (1,29) = 4,69, p<0,05], mas não para a interação tratamento x genótipo [F (1,29) = 0,87, p=0,35]. O teste t revelou diferença no tratamento (p<0,01) mas não entre os genótipos (p=0,09) (figura 9).
Figura 9: Avaliação do tratamento repetido com BDNF i.n. no comportamento anedônico dos camundongos YAC128 no teste de borrifagem de sacarose
Legenda: Efeito da administração de BDNF i.n. (1,66 µg/kg) ou veículo (0,25% quitosana) por 15 dias no comportamento anedônico dos camundongos YAC128 e selvagem no teste de borrifagem de sacarose. Os dados são apresentados como média ± E.P.M. (n=6-10) ##p<0,01 quando comparado ao grupo YAC128 tratado com solução veículo.
5.2. Efeitos do tratamento com BDNF i.n. no comportamento tipo-depressivo em camundongos YAC128
A Figura 10 mostra um comportamento tipo-depressivo dos camundongos YAC128 verificado pela diminuição no tempo de latência para a imobilidade (painel A), bem como pelo aumento no tempo total de imobilidade (painel B) no TSC. O tratamento com BDNF foi capaz de prevenir tanto a redução da latência quanto o aumento do tempo de imobilidade dos camundongos YAC128 no TSC. A ANOVA de duas vias mostrou efeito significativo para o tratamento [F (1,24) = 4,85, p<0,05] e para o genótipo [F (1,24) = 7,86, p<0,01], mas não para a
interação genótipo x tratamento [F (1,24) = 0,62, p=0,44], em relação a latência, e efeito significativo para o tratamento [F (1,24) = 8,06, p<0,01] e para o genótipo [F (1,24) = 20,76, p<0,01] e não houve interação entre genótipo x tratamento [F (1,24) = 3,94, p=0,06], em relação ao tempo de imobilidade no TSC. Foi encontrada diferença estatística no genótipo (p<0,05) e no tratamento (p<0,05) no tempo para a primeira imobilidade. No tempo total de imobilidade foi encontrada diferença estatística entre o genótipo (p<0,05) e entre o tratamento (p<0,01).
Figura 10: Avaliação do tratamento repetido com BDNF i.n. no comportamento tipo-depressivo dos camundongos YAC128 no teste de suspensão pela cauda
Legenda: Efeito da administração de BDNF i.n. (1,66 µg/kg) ou veículo (0,25% quitosana) por 15 dias no comportamento tipo-depressivo dos camundongos YAC128 e selvagem no teste de suspensão pela cauda. Os dados são apresentados como média ± E.P.M. (n=7). A – Tempo até o primeiro evento de imobilidade (latência) B – Tempo total de imobilidade no teste do nado forçado. *p<0,05 quando comparado ao grupo selvagem tratado com veículo. #p<0,05, ##p<0,01 quando comparado ao grupo YAC128 tratado com solução veículo.
A Figura 11 mostra um comportamento tipo-depressivo dos camundongos YAC128 verificado tanto pela diminuição no tempo de latência para a imobilidade (painel A), quanto pelo aumento no tempo total de imobilidade (painel B) no TNF. O tratamento com BDNF foi capaz de prevenir ambos os parâmetros no TNF. A ANOVA de duas vias mostrou efeito significativo para o tratamento [F (1,24) = 5,12, p<0,05] e para o genótipo [F (1,24) = 10,74, p<0,01], mas não houve interação entre o genótipo x tratamento [F (1,24) = 1,16, p=0,29] em relação a latência para a imobilidade. Houve efeito significativo para o genótipo [F (1,24) = 19,37, p<0,01] mas não houve para o tratamento [F (1,24) = 3,52, p=0,07] ou para a interação [F (1,24) = 0,10, p=0,75], em relação ao tempo total de imobilidade. Foi encontrada diferença significativa entre genótipo (p<0,01) e tratamento (p<0,01) na latência para a primeira imobilidade. Também foi encontrada diferença entre o genótipo (p<0,05) e o tratamento (p<0,05) no tempo total de imobilidade.
Figura 11: Avaliação do tratamento repetido com BDNF i.n. no comportamento tipo-depressivo dos camundongos YAC128 no teste do nado forçado
Legenda: Efeito da administração de BDNF i.n. (1,66 µg/kg) ou veículo (0,25% quitosana) por 15 dias no comportamento tipo-depressivo dos camundongos YAC128 e selvagem no teste do nado forçado. Os dados são apresentados como média ± E.P.M. (n=7) A – Tempo para a primeira imobilidade (latência) B – tempo total de imobilidade no teste de nado forçado. *p<0,05, **p<0,01 quando comparado ao grupo selvagem tratado com veículo. #p<0,05, ##p<0,01 quando comparado com YAC128 tratado com veículo.
De modo a avaliar se o BDNF modificou a atividade locomotora ou o comportamento tipo-ansioso nestes animais, foi
executado o teste de campo aberto para distância total percorrida e tempo total no centro, respectivamente. A ANOVA de duas vias revelou que não existe diferença entre as variáveis genótipo [F (1,32) = 2,80, p=0,10], tratamento [F (1,32) = 0,27, p=0,61] e interação [F (1,32) = 0,10, p=0,75].
Tabela 1 – Efeitos da administração i.n. repetida de BDNF recombinante humano na atividade locomotora nos camundongos YAC128 e selvagem.
Genótipo Tratamento Distância (m) Tempo no centro (s) N Selvagem Veículo 28.86 ± 1.37 8.12 ± 1.33 8 YAC128 Veículo 27.59 ± 1.58 8.23 ± 1.54 6 Selvagem BDNF 26.74 ± 1.37 10.22 ± 1.33 8 YAC128 BDNF 25.22 ± 1.29 8.28 ± 1.26 9 Legenda: O teste de campo aberto determinou a distância percorrida (m) e o tempo gasto (s) no centro do campo aberto nos camundongos YAC128 e selvagens por 6 minutos usando o programa Any-maze. Resultados estão apresentados como média ± E.P.M..
5.3. Efeito do tratamento com BDNF i.n. nos níveis de BDNF maduro no hipocampo e estriado
Os níveis de BDNF maduro foram mensurados no hipocampo e estriado dos camundongos YAC128 e selvagens tratados com BDNF ou veículo através do ensaio de imunoabsorção enzimática (ENGVALL e PERLMANN, 1971) da marca PROMEGA. Os resultados estão sumarizados na tabela 2 como média ± E.P.M..
Tabela 2 – Efeitos da administração repetida de BDNF recombinante humano nos níveis de BDNF maduro no hipocampo e estriado de camundongos YAC128 e selvagem aos 3 meses de idade
Região Genótipo Tratamento Níveis de BDNF maduro
E.P.M.
Hipocampo Selvagem Veículo 29.48 ± 1.94
YAC128 Veículo 29.46 ± 1.34
Selvagem BDNF 31.94 ± 0.46
YAC128 BDNF 28.21 ± 2.48
Estriado Selvagem Veículo 27.44 ± 0.83
YAC128 Veículo 27.46 ± 0.62
Selvagem BDNF 28.34 ± 0.99
YAC128 BDNF 27.97 ± 0.37
Legenda: Níveis de BDNF maduro estão expressos como pg/mg de proteína. Resultados apresentados como Média ± E.P.M (n = 5/grupo).
5.4. Efeito do tratamento com BDNF i.n. na proliferação celular hipocampal
Para analisar o efeito do tratamento do BDNF i.n. sobre a proliferação celular hipocampal, foi utilizada uma marcação de imunohistoquímica para a proteína endógena ki-67 que é expressa durante as fases ativas do ciclo celular (SCHOLZEN e GERDES, 2000). A ANOVA de duas vias revelou um efeito significativo do genótipo [F (1,18) = 4,72, p<0,05], do tratamento [F (1, 18) = 5,59, p<0,05], e do tratamento x genótipo [F (1, 18) = 6,4, p<0,05] no número de células positivas para o marcador ki-67 ao longo da ZSG do GD hipocampal. A análise de post-hoc revelou um aumento significativo no número de
células marcadas no grupo selvagem tratado com BDNF (p < 0.05) (figura 12).
Figura 12: Avaliação do tratamento repetido com BDNF i.n. na proliferação celular hipocampal
Legenda: Efeito da administração de BDNF i.n. (1,66 µg/kg) ou veículo (0,25% quitosana) por 15 dias na diferenciação celular no GD hipocampal de animais YAC128 e selvagem com 3 meses de idade A – Gráfico com as médias ± E.P.M. (n = 4-6). ##p<0,01 quando comparado ao grupo selvagem tratado com veículo. B – Imagens representativas (aumento de 100x) do giro denteado de animais YAC128 e selvagem, com marcação para a proteína endógena de proliferação celular ki-67, que passaram pelo tratamento com BDNF ou veículo.
5.5. Efeito do tratamento com BDNF i.n. na diferenciação neuronal hipocampal
Para avaliar os efeitos da administração de BDNF i.n. na diferenciação neuronal, imunohistoquímica contra a proteína DCX, uma proteína do citoesqueleto expressa em neurônios (GLEESON et al., 1998; COUILLARD-DESPRES et al., 2001; BROWN et al., 2003; COUILLARD-DESPRES et al., 2005), foi realizada. A ANOVA de duas vias revelou uma diferença estatística significativa no efeito do tratamento [F (1, 16) = 6,85, p<0,05], do genótipo [F (1, 16) = 23,99, p<0,01], e da interação genótipo x tratamento [F (1, 16) < 11,46, p<0,01] no número total de células DCX positivas ao da ZSG do GD hipocampal. O teste de post-hoc revelou que o tratamento com BDNF aumentou significantemente o número de neurônios imaturos no grupo selvagem (p<0,05) (Figura 13).
Figura 13: Avaliação do tratamento repetido com BDNF i.n. na diferenciação neuronal
Legenda: A – Efeito da administração de BDNF i.n. (1,66 µg/kg) ou veículo (0,25% quitosana) por 15 dias na diferenciação celular no GD hipocampal de camundongos YAC128 e selvagem com 3 meses de idade. A – Gráficos com as médias ± E.P.M. (n = 4-6). ##p<0,01 quando comparado ao selvagem tratado com veículo. B – Imagens representativas (aumento de 100x) do GD de animais YAC128 e selvagem, marcadas para a proteína endógena de diferenciação neuronal DCX, que passaram pelo tratamento com BDNF ou veículo.
5.6. Efeito do tratamento com BDNF i.n. na arborização dendrítica de neurônios imaturos no GD hipocampal
Para avaliar se o tratamento repetido com BDNF altera a arborização dendrítica em neurônios imaturos a análise de Sholl foi realizada em neurônios marcados com a proteína DCX. A ANOVA de
Nú mero d e intersecç õe s
medidas repetidas revelou diferença significativa do tratamento [F (30,61) = 1,83, p<0,05], mas não encontrou diferença entre genótipos [F (30, 61) = 0,85, p = 0,67] e nem na interação genótipo x tratamento [F (30, 61) = 1,0853, p= 0,38] (Figura 14).
Figura 14: Avaliação do tratamento repetido com BDNF i.n. na arborização dendrítica dos neurônios marcados com DCX
Legenda: Efeito da administração de BDNF i.n. (1,66 µg/kg) ou veículo (0,25% quitosana) por 15 dias na análise na arborização dendrítica nos primeiros 60 µm a partir do soma em neurônios marcados com DCX (análise feita a cada 2 µm) no GD hipocampal. Resultados apresentados como média ± E.P.M. (n = 4-5).
6. DISCUSSÃO
A DH é uma doença neurodegenerativa fatal que é caracterizada por uma variedade de sintomas motores, cognitivos e psiquiátricos (SHOULSON e FAHN, 1979; PAULSEN et al., 2001). Apesar do tratamento dos sintomas não levar a cura da DH, novas estratégias podem trazer melhora na qualidade de vida dos pacientes com a DH. Os modelos genéticos são os mais utilizados para estudar possíveis intervenções terapêuticas para o tratamento da DH porque mimetizam melhor a doença, apresentando diversas características que estão presentes na condição humana. Entre estas se destaca comportamentos similares ao comportamento depressivo humano e menor neurogênese hipocampal (SLOW et al., 2003; VAN RAAMSDONK, MURPHY, et al., 2005; BEGETI et al., 2016).
Dentre os modelos genéticos existentes, o YAC128 é um modelo interessante por apresentar validade de face (os camundongos YAC128 mimetizam vários dos sintomas clínicos da DH, como por exemplo, déficits motores), constructo (os YAC128 apresentam características fisiopatológicas da DH, como por exemplo, morte neuronal estriatal), e validade preditiva (os YAC128 respondem ao tratamento clinico clássico para tratar os sintomas motores da DH) (LAST et al., 2001; WANG et al., 2010; YANG e GRAY, 2011). Além disso, os camundongos YAC128, de modo similar aos humanos, possuem diferenças na manifestação dos sintomas ao longo da vida (CROOK e HOUSMAN, 2011). A linhagem de camundongos YAC128 exibe anormalidades neuropatológicas e comportamentais similares as encontradas em pacientes com DH (SLOW et al., 2003; VAN
