Metabólitos secundários de duas espécies de guaco (Mikania glomerata Sprengel e Mikania laevigata Schultz) cultivadas sob condições variadas

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CLÁUDIA DE LÁZZARI ALMEIDA

METABÓLITOS SECUNDÁRIOS DE DUAS ESPÉCIES DE GUACO (Mikania glomerata SPRENGEL E Mikania laevigata SCHULTZ) CULTIVADAS SOB CONDIÇÕES VARIADAS

CAMPINAS 2015

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A Deus.

A meus pais e minha irmã por todo apoio, carinho, amor e incentivo. Obrigada por sempre estarem ao meu lado, mesmo com a distância.

A professora Dra. Alexandra, pela orientação, pelos ensinamentos, pela confiança e por ter me dado à oportunidade de realizar esse trabalho.

A FAPESP (Processo nº 2013/15962-2) e a Capes pelo apoio financeiro.

Ao CPQBA-Unicamp por fornecer amostras que foram utilizadas neste trabalho. A Dra. Vera Rehder pela por ter disponibilizado os padrões de terpenos.

Às pessoas que contribuíram e ajudaram na realização do trabalho: A Vivian, por ter me ensinado e me ajudado nos primeiros passos do trabalho. A Begoña, pela ajuda nas análises e na PCA. Ao Luciano pelas ajudas variadas. Aos demais colegas do grupo: João, Alexandre, Mara, Vanessa, Diego e Renata, e também a Carol, ao Ricardo, e ao João Victor pela companhia, ajuda e idas ao bandejão.

Ao Régis, por todo apoio e compreensão. Pelo carinho, amor, amizade e paciência. Por todas as revisões de textos e apresentações. Por estar sempre ao meu lado. A Eloá, pelas varias noites que gentilmente me acolheu em Campinas.

A todos os membros do Departamento de Biologia Vegetal, pelas risadas, bolos e cafés, ao longo desses dois anos.

Ao Rafael da Secretaria de Pós-Graduação do Programa de Biociências e Tecnologia de Produtos Bioativos por toda ajuda, disponibilidade e paciência.

Aos membros da banca de qualificação e de análise previa por todos os comentários e dicas de grande ajuda.

A todos os amigos que conquistei ao longo destes anos, em todas as cidades em que passei: Amigos de Cajuru, Amigos de Assis, Amigos de Ribeirão Preto e Amigos

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A todos meus familiares, minha vó, tios, tias, primos e primas, por sempre me receberem de braços abertos nas minhas breves visitas.

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incentivada, de maneira crescente, por diretrizes governamentais em todos os níveis. O xarope à base de Mikania glomerata Sprenguel é atualmente fornecido por postos do Sistema Único de Saúde (SUS) como fitoterápico para bronquite e tosse. Porém, diferentes condições de cultivo de plantas medicinais podem resultar em variações nas concentrações de princípios ativos, afetando a segurança, qualidade e eficácia esperada dos fitoterápicos. Poucos estudos referentes ao cultivo das duas espécies de guaco de interesse terapêutico,

Mikania glomerata e Mikania laevigata Schultz, foram encontradas. Até o momento a

questão da variação de teores de metabolitos secundários nestas espécies ocasionados por variações ambientais não foi satisfatoriamente abordada. Como ambas constam no 1º Formulário de Fitoterápicos da Farmacopeia Brasileira, aparentemente podendo ser usadas indiscriminadamente, elas devem ser estudadas em paralelo. Avaliamos como os metabólitos secundários são influenciados pelas variações nas condições de cultivo como: temperatura, luminosidade e danos mecânicos. Após os tratamentos, a composição química dos extratos das folhas foi avaliada por cromatografia líquida de ultra alta eficiência com espectrometria de massas, acompanhando o teor do seu marcador (cumarina) e o perfil dos outros componentes. Os resultados obtidos apontam significativa influência dos tratamentos sobre diversos compostos secundários. Após o dano mecânico, ambas as espécies apresentaram diminuição da maioria dos compostos na primeira hora, e posterior aumento após 24 horas de dano. Apesar da cumarina ser considerada o marcador químico para as duas espécies, ela foi encontrada em pequenas concentrações, e até mesmo ausente em

M. glomerata. Em resposta ao tratamento de luminosidade, observamos aumento

significativo de compostos fenólicos, como ácido clorogênico e ácido dicafeoilquínico, em plantas cultivadas em luz plena. Em resposta à modificação de temperatura, observamos aumento de diversos compostos fenólicos, inclusive a cumarina, em plantas mantidas em temperaturas de 12 °C e de 30 °C. Observando a distinção química entre as duas espécies e a diferença de resposta de cada uma frente a situações variadas de cultivo, concluímos que elas devem ser diferenciadas, bem como necessitam de padronização das condições de cultivo para um uso terapêutico seguro e eficaz.

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government policies at all levels. Syrup based on Mikania glomerata Spreng.is presently furnished by the Brazilian Health System (SUS) as medicine for cough and bronchitis. However, variations in the cultivation conditions of medicinal plants may result in different concentrations of active components, affecting the safety, quality and efficiency expected of herbal medicines. Few studies regarding the cultivation of the two species of interest as medicinal plants, Mikania glomerata e Mikania laevigata Schultz, were found. To this moment, the fluctuations in the concentrations of secondary metabolites in these species due to environmental variations have not been satisfactorily evaluated. As both species are found in the 1st Brazilian Phytotherapic Formulary, and apparently may be used indiscriminately, they shall be studied in parallel. We evaluated how the secondary metabolites are influenced by variations in the following cultivation conditions: temperature, luminosity and mechanical damage. After the treatments, the extracts of the leaves was evaluated by liquid chromatography-mass spectrometry, following the differences in the concentration of their chemical marker, coumarin, and the profile of the other components. The results show significant influence of treatments on various secondary compounds. After mechanical damage, both species showed a decrease in most of the compounds in the first hour, and subsequent increase after 24 hours of the damage. Despite the coumarin be considered the chemical marker for both species, it was found in small concentrations, and even absent in

M. glomerata. In response to the treatment of light, we observed a significant increase of

phenolics compounds such as chlorogenic acid and dicaffeoylquinic acid in plants grown in full sun light. In response of changes in temperature, we observed an increase of various phenolic compounds, including coumarin, in plants kept temperatures of 12°C and 30°C. Observing the chemical difference between the two species and the difference response of each one for the variation of cultivation conditions, we concluded that they need to be differentiated and require standardization of culture conditions for a safe and effective therapeutic use.

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Tabela 2. Gradiente otimizado para análise por UHPLC-MS. Fase móvel A- água

purificada (Milli-Q) com 0,1 % de ácido fórmico e como fase móvel B- acetonitrila .. 33

Tabela 3. Concentrações de cumarina (µg / 200mg de folhas liofilizadas) nas

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Figura 2. Matrizes cultivadas no campo experimental do IB- Unicamp: (A) folha e

(B) planta de Mikania glomerata; (C) folha e (D) planta de Mikania laevigata. ... 30

Figura 3. Espectros de fragmentação (MS/MS) dos íons encontrados nos extratos

hidroetanólicos de Mikania glomerata e/ou Mikania laevigata: m/z 365 – dissacarídeo (A), m/z 147 - cumarina (B), íon m/z 325 – cis ou trans melilotosídeo (C), m/z 301 - ácido cauenóico (D), m/z 317 – ácido grandiflórico (E). ... 36

hidroetanólicos de Mikania glomerata e/ou Mikania laevigata: m/z 353 – ácido clorogênico (C), m/z 515 - ácido dicafeoilquínico (D), m/z 677 - ácido

tricafeoilquínico. ... 37

Figura 5. Estruturas dos compostos identificados nos extratos hidroetanólicos de

folhas de M. glomerata e/ou M. laevigata. ... 38

Figura 6. Cromatogramas UHPLC-MS em modo positivo de extratos de (A) M.

glomerata, e (B) M. laevigata; Cromatogramas UHPLC-MS em modo negativo de

extratos de (C) M. glomerata e (D) M. laevigata, obtidos das matrizes. ... 39

Figura 7. PCA dos resultados das análises UHPLC-MS obtidos em modo positivo e

negativo de todas as amostras coloridas por espécie (A), e os íons (B). ... 40

negativo de todas as amostras de M. glomerata coloridas por tratamento (A), e os íons (B). ... 41

negativo de todas as amostras de M. laevigata coloridas por tratamento (A), e os íons (B). ... 42

Figura 10. Cromatogramas UHPLC-MS em modo positivo de extratos de M.

glomerata (A) controle, (B) tratamento dano coletado após 1 hora, (C) tratamento

dano coletado após 12 horas e (D) tratamento de dano coletado após 24 horas. .... 43

Figura 11. Cromatogramas UHPLC-MS em modo negativo de extratos de M.

glomerata (A) controle, (B) tratamento dano coletado após 1 hora, (C) tratamento

Figura 12. Cromatogramas UPHLC-MS em modo positivo de extratos de M.

laevigata (A) controle, (B) tratamento dano coletado após 1 hora, (C) tratamento

Figura 13. Cromatogramas UHPLC-MS em modo negativo de extratos de M.

laevigata (A) controle, (B) tratamento dano coletado após 1 hora, (C) tratamento

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entre os grupos pelo teste post hoc de Tukey, p<0,05. ... 45

Figura 15. Comparação das áreas encontradas nos cromatogramas UHPLC-MS em

modo negativo dos extratos de Mikania glomerata Controle, 1 hora, 12 horas e 24 horas após o dano. Letras diferentes em cada íon indicam diferenças significativas entre os grupos pelo teste post hoc de Tukey, p<0,05. ... 46

modo positivo dos extratos de Mikania laevigata Controle, 1 hora, 12 horas e 24 horas após o dano. Letras diferentes em cada íon indicam diferenças significativas entre os grupos pelo teste post hoc de Tukey, p<0,05. ... 47

modo negativo dos extratos de Mikania laevigata Controle, 1 hora, 12 horas e 24 horas após o dano. Letras diferentes em cada íon indicam diferenças significativas entre os grupos pelo teste post hoc de Tukey, p<0,05. ... 48

modo positivo dos extratos de Mikania glomerata mantidas em luz plena, sombrite 25% e sombrite 50%. Letras diferentes em cada íon indicam diferenças significativas entre os grupos pelo teste post hoc de Tukey, p<0,05. ... 50

modo negativo dos extratos de Mikania glomerata mantidas em luz plena, sombrite 25% e sombrite 50%. Letras diferentes em cada íon indicam diferenças significativas entre os grupos pelo teste post hoc de Tukey, p<0,05. ... 51

modo positivo dos extratos de Mikania laevigata mantidas em luz plena, sombrite 25% e sombrite 50%. Letras diferentes em cada íon indicam diferenças significativas entre os grupos pelo teste post hoc de Tukey, p<0,05. ... 52

modo negativo dos extratos de Mikania laevigata mantidas em luz plena, sombrite 25% e sombrite 50%. Letras diferentes em cada íon indicam diferenças significativas entre os grupos pelo teste post hoc de Tukey, p<0,05. ... 53

modo positivo dos extratos de Mikania glomerata mantidas em temperaturas de 12 °C, 20 °C e 30 °C. Letras diferentes em cada íon indicam diferenças significativas entre os grupos pelo teste post hoc de Tukey, p<0,05. ... 55

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modo positivo dos extratos de Mikania laevigata mantidas em temperaturas de 12 °C, 20 °C e 30 °C. Letras diferentes em cada íon indicam diferenças significativas entre os grupos pelo teste post hoc de Tukey, p<0,05. ... 57

modo negativo dos extratos de Mikania laevigata mantidas em temperaturas de 12°C, 20°C e 30°C. Letras diferentes em cada íon indicam diferenças significativas entre os grupos pelo teste post hoc de Tukey, p<0,05. ... 58

Figura 26. Cromatogramas UHPLC-MS em modo positivo do (A) Padrão de

cumarina, (B) do extrato de M. glomerata e (C) do extrato de M. laevigata,

selecionando o íon de m/z 147. ... 60

Figura 27. Curva analítica obtida pela análise de soluções de 10 μg.mL-1 a 750 μg.mL-1

de padrão de cumarina. ... 61

Figura 28. Espectros de fragmentação ESI(+) (MS/MS) dos íons encontrados nos

extratos hidroetanólicos de Mikania glomerata e/ou Mikania laevigata. Íon m/z 165 (A), íon m/z 365 (B), íon m/z 301 – Tr 7,04 min (C), íon m/z 301 - Tr 8,66 min (D). .. 83

Figura 29. Espectros de fragmentação ESI(-) (MS/MS) dos íons encontrados nos

extratos hidroetanólicos de Mikania glomerata e/ou Mikania laevigata. Íon m/z 317 (A). íon m/z 387 (B). Íon m/z 399 min (C), íon m/z 401 (D). Íon m/z 651 (E). Íon m/z 439 (F). Íon m/z 487 (G). ... 84

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ANOVA – Análise de Variância

ANVISA – Agencia nacional de vigilância sanitária CCD - Cromatografia em Camada Delgada

DAD - Arranjo de Diiodo ESI - Eletrospray

GC-MS - Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas HPLC – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (High Performance Liquid Chromatography)

HPLC-DAD - Cromatografia líquida de alta eficiência com arranjo de diodo LD – Limite de Detecção

LQ – Limite de Quantificação

M. glomerata - Mikania glomerata

M. laevigata – Mikania laevigata

m/z - razão massa/carga

MO – Substrato orgânico

MS – Espectrometria de Massas (Mass Spectrometry) MS/MS – Espectrometria de massas sequencial PAR – Radiação fotossinteticamente ativa PCA – Analise por componentes principais

PNPIC – Politica nacional de práticas integrativas e complementares RENAME – Relação nacional de medicamentos essenciais

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UHPLC - Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência (Ultra-High Performance Liquid Chromatography)

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1. INTRODUÇÃO ... 17

1.1. A importância do cultivo de plantas medicinais ... 18

1.2. Mikania glomerata e Mikania laevigata ... 19

1.3. Fitoterapia e o medicamento fitoterápico ... 21

1.4. Composição química de M. glomerata e M. laevigata ... 22

1.6. Morfologia e produção das duas espécies ... 25

2. OBJETIVOS ... 28

3. MATERIAIS E MÉTODOS ... 28

3.1. Equipamentos ... 28

3.2. Reagentes e solventes ... 28

3.3. Material para cultivo ... 29

3.4. Material vegetal ... 29

3.5. Produção de mudas ... 29

3.6. Tratamentos ... 31

3.7. Extração das folhas e análise por UHPLC-MS... 33

3.8. Análise dos Resultados ... 34

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 35

4.1. Perfil químico das duas espécies e escolha dos íons ... 39

4.2. Dano mecânico ... 45

4.3. Luminosidade ... 50

4.4. Temperatura... 55

4.6. Quantificação do marcador químico cumarina ... 60

5. CONCLUSÕES ... 64

6. REFERÊNCIAS ... 65

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1. INTRODUÇÃO

Produtos naturais a base de plantas tem sido de grande importância para a construção da medicina ao longo da história do homem (Gorelick e Bernstein, 2014). Muitas plantas medicinais têm sido utilizadas há séculos para o tratamento de diversas doenças. Atualmente, a fitoterapia representa uma grande parte da indústria farmacêutica mundial, sendo responsável por movimentar bilhões de dólares anualmente (Rufatto et al., 2012).

Um dos principais atrativos das plantas medicinais é o conceito de “natural”. Porém, os diferentes compostos encontrados podem trazer riscos à saúde, sendo necessária uma correta identificação e caracterização química, a fim de se obter eficácia e segurança (Canter, Thomas e Ernst, 2005; Rufatto et al., 2012).

Metabólitos secundários representam um grupo de compostos orgânicos produzidos pelas plantas para auxiliá-las na sua interação com o ambiente. Tais compostos apresentam atividades biológicas e são muito utilizados em diferentes áreas, como agroquímica, alimentícia, cosmética, e principalmente, farmacêutica (Wink, 1988; Murthy, Lee e Paek, 2014). Uma vez que o metabolismo secundário está relacionado ao ambiente, modificações de diferentes variáveis ambientais (como pluviosidade, sazonalidade, temperatura, e outras) podem trazer consequências sobre a composição e concentração de princípios ativos na planta, influenciando diretamente na atividade biológica esperada.

No Brasil, duas espécies do gênero Mikania, popularmente conhecidas como guaco, são facilmente encontradas e muito utilizadas na medicina popular para o tratamento de doenças no trato respiratório. São elas: Mikania glomerata Sprengel. e Mikania laevigata Schultz Bip. ex Baker (Freitas et al., 2008). Ambas ocorrem principalmente na Floresta Atlântica do Brasil, crescendo desde o estado de São Paulo até o Rio Grande do Sul. Por estar presente nos mesmos ambientes e por apresentarem características morfo-anatômicas muito similares, ambas são frequentemente utilizadas sem distinção pela população (Gasparetto et al., 2010; Bastos et al., 2011). Estudos químicos, porem, tem apontado diferenças marcantes entre as duas espécies (Bertolucci et al., 2009; De Melo e Sawaya, 2015).

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Considerando o crescente interesse na utilização de fitoterápicos, bem como a grande utilização das duas espécies de Mikania no Brasil, estudos a respeito destas espécies são fundamentais para compreender os efeitos atribuídos a elas. Além disto, entender como o metabolismo secundário delas responde ao ambiente (ou seja, as condições nas quais são cultivadas) é essencial para a produção de uma matéria prima de qualidade, e consequentemente, de um fitoterápico seguro e eficaz.

1.1. A importância do cultivo de plantas medicinais

A qualidade das plantas medicinais é determinada, principalmente, pelo teor dos compostos ativos, pela ausência de elementos estranhos e pela ausência de falsificação, fatores que são determinados em todas as etapas do processo de produção: cultivo, pré-colheita, pós-colheita e, finalmente, a extração do produto final (Carvalho, Costa e Carnelossi, 2010).

Os princípios ativos de plantas medicinais são produtos do metabolismo secundário, cuja composição e teores variam em função de uma série de fatores intrínsecos como: órgão, idade da planta e estágio de desenvolvimento; e fatores extrínsecos como: umidade, temperatura, luminosidade, nutrientes no solo, sazonalidade, entre outros (Poutaraud e Girardin, 2005; Gobbo-Neto e Lopes, 2007; Gouvea, Gobbo-Neto e Lopes, 2012; Pavarini et al., 2012). Estímulos mecânicos ou ataques de patógenos e herbívoros podem resultar em modificações nos teores e composição dos metabólitos secundários, que são frequentemente sintetizados em resposta a tais estímulos (Metlen, Aschehoug e Callaway, 2009). Além disto, nem sempre a maior produção de biomassa da planta medicinal representa a melhor qualidade do medicamento fitoterápico, sendo necessário um controle do cultivo para obter boa produtividade, não só de biomassa, mas também do(s) princípio(s) ativo(s) (Simões et al., 2007).

Grande parte das espécies vegetais utilizadas com interesse farmacêutico ainda é obtida por extrativismo vegetal. Isto acontece em virtude da falta de

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informação e de dificuldades encontradas no cultivo e produção, tais como, dormência e viabilidade das sementes, dificuldades na propagação, susceptibilidade a pragas e doenças, e desconhecimento das necessidades nutricionais e climáticas (Carvalho, Costa e Carnelossi, 2010). Porém, o cultivo de plantas medicinais apresenta muitas vantagens em relação ao extrativismo, como evitar variação genética e fenotípica, permitir uma identificação correta e segura da espécie, manipular as condições de cultivo a fim de aumentar biomassa e a concentração dos princípios ativos, além de impedir a extinção das espécies (Canter, Thomas e Ernst, 2005).

Tratando-se de plantas medicinais, observa-se vários estudos relacionados a atividade biológica, processos de extração, caracterização e quantificação de compostos bioativos. Porém, estudos a respeito de cultivo e produção relacionando a variação dos princípios ativos são pouco encontrados. Isto pode ser explicado pelo fato da maioria das espécies medicinais utilizadas serem provenientes do extrativismo (Edwards, 2004).

Considerando o aumento da utilização de plantas medicinais, e o incentivo das politicas públicas do Brasil para essa prática (Santos et al., 2011), torna-se necessário uma produção em nível industrial, a fim de aumentar a produtividade, impedir a extinção da espécie e possivelmente aumentar a qualidade da matéria prima através da manipulação do ambiente (manejo de produção) (Canter, Thomas e Ernst, 2005; Carvalho, Costa e Carnelossi, 2010).

1.2. Mikania glomerata e Mikania laevigata

O gênero Mikania Wild. apresenta cerca de 430 espécies, distribuídas principalmente nas Américas do Sul e Central (Barroso, 1958; Ritter e Miotto, 2005). No Brasil são encontradas cerca de 170 espécies, crescendo desde o estado de São Paulo até o Rio Grande do Sul, com algumas espécies se estendendo até a Argentina, Uruguai e Paraguai (Gasparetto et al., 2010).

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Espécies do gênero Mikania são popularmente conhecidas no Brasil como guaco, coração de Jesus, guaco-cheiroso, cipó-caatinga, erva de cobra ou guaco trepador (Castro et al., 2003; Vidal et al., 2006). Na medicina popular, as duas espécies mais utilizadas são Mikania laevigata Schultz Bip. ex Baker e Mikania

glomerata Sprengel, tradicionalmente empregadas para o tratamento de várias

condições inflamatórias e alérgicas do sistema respiratório (Freitas et al., 2008) como asma, bronquite e tosse. Também são usadas para tratamento de reumatismo (Graça et al., 2007), malária (Botsaris, 2007), nevralgia (Agra et al., 2008) e picada de cobras (Floriano et al., 2009; Mourao et al., 2014).

Estudos avaliaram primeiramente as atividades de M. glomerata. O extrato aquoso desta espécie apresentou atividade analgésica e anti-inflamatória (Ruppelt et al., 1991). O efeito antialérgico do extrato etanólico de M. glomerata foi avaliado comparando a atividade das frações com o extrato inicial e cumarina pura. A fração mais rica em cumarina apresentou efeito menor que o extrato inicial (Fierro

et al., 1999), indicando que a cumarina não seria a única substância responsável por

essa atividade. Estudos da atividade bronco dilatadora do extrato de M. glomerata também indicaram que esta atividade estava associada à cumarina e outras substâncias (Moura et al., 2002). Apesar disso, a cumarina ainda é considerada o único marcador químico para a espécie. Uma fraca atividade antibacteriana também foi observada (Do Amaral et al., 2003). Estudos recentes apontam, também, atividade ansiolítica para o extrato etanólico (Santana et al., 2014).

Extratos de M. laevigata também apresentaram atividade anti-inflamatória (Suyenaga et al., 2002; Alves et al., 2009), atividade antitumoral (Rufatto

et al., 2013), relaxamento de traqueia (Graça et al., 2007) e atividade

anti-ulcerogênica (Bighetti et al., 2005), sendo os três últimos relacionados à presença de cumarina. Estudos comparativos indicaram o efeito protetor de pulmão (Freitas et al., 2008) e efeito antimicrobiano (Yatsuda et al., 2005) para as duas espécies.

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1.3. Fitoterapia e o medicamento fitoterápico

Em virtude das propriedades terapêuticas atribuídas ao guaco, este tem sido incluído em diferentes programas de fitoterapia na ultima década, consequência da volta do interesse em usar medicamentos derivados de plantas medicinais.

A ANVISA emitiu duas resoluções em 2004 referentes a fitoterápicos: a RDC 48 (Anvisa, 2004) determinou como deve ser feito o registro de medicamentos fitoterápicos, comprovando sua eficácia, segurança e boas práticas de fabricação; e a RE 89 (Anvisa, 2004b) que definiu uma lista de 34 plantas de registro simplificado de espécies cuja segurança e eficácia já se consideravam devidamente comprovados. Mikania glomerata já constava nessa lista, com indicação expectorante e broncodilatadora. Em 2006 a Portaria 971 (Ministerio Da Saúde, 2006) e o Decreto 5813 (Brasil, 2006) instituíram a Política Nacional de Práticas Integrativas e Complementares (PNPIC) no SUS com o objetivo de ampliar as opções terapêuticas dos usuários do SUS (incluindo a Medicina Tradicional Chinesa, Acupuntura, Termalismo e Homeopatia). Pela possibilidade de utilizar produtos e conhecimentos de origem nacional, a Fitoterapia se destacou e ganhou grande aceitação.

Em 2007 teve início a distribuição de medicamentos fitoterápicos pelas secretarias estaduais e municipais de saúde, inicialmente com o guaco (Mikania

glomerata) e a espinheira santa. A partir de 2010, a rede pública passou a contar

com mais seis produtos. Em 2012, o Ministério da Saúde publicou a Portaria MS/GM nº 533, de 28 de março de 2012 que estabelece o elenco de medicamentos e insumos da Relação Nacional de Medicamentos Essenciais – RENAME, em que mais quatro medicamentos fitoterápicos foram implementados. Assim, atualmente 12 medicamentos, inclusive o xarope de guaco, são oferecidos pela rede pública em 14 estados do Brasil (Ministério da Saúde, 2012).

Em 2011 foi lançado o 1º Formulário de Fitoterápicos da Farmacopeia Brasileira (Anvisa, 2011), onde constam 47 plantas medicinais e algumas possíveis formulações reconhecidas como oficiais. Aparecem, por exemplo, as duas espécies,

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mesma proporção de folhas secas e solvente. Porém, um estudo anterior realizado pelo nosso grupo mostrou que o teor de cumarina (marcador químico) varia de maneira expressiva entre estas duas espécies (Melo e Sawaya, 2011; De Melo e Sawaya, 2015).

Apesar do uso tradicional e de constar nos compêndios oficiais, observaremos a seguir que ainda há muitas questões em aberto a respeito das duas espécies, cujas respostas ajudarão diretamente a população que as utiliza.

1.4. Composição química de M. glomerata e M. laevigata

Com relação à composição química, mais estudos foram encontrados sobre a composição dos extratos de M. glomerata. O seu óleo essencial, avaliado por cromatografia gasosa com espectrometria de massas (GC-MS), é rico em sesquiterpenos oxigenados como espatulenol, germacreno D (Rehder, Sartoratto e Rodrigues, 2006) e óxido de cariofileno (Limberger et al., 2001). Entre os compostos menos polares foram encontrados triterpenos de estrutura esteroidal (Veneziani e Oliveira, 1999) e diversos derivados do ácido caurenóico (Vilegas, De Marchi e Lancas, 1997). O teor de cumarina em extratos de M. glomerata já foi avaliado por diversos métodos como GC-MS (Bueno e Bastos, 2009) e cromatografia líquida de alta eficiência com arranjo de diodo (HPLC-DAD) (Celeghini, Vilegas e Lanças, 2001). O teor de cumarina em xaropes contendo extrato de M. glomerata, preparados por diversos processos, também foi avaliado por métodos cromatográficos (Rocha et al., 2008).

Estudos também avaliaram composição de M. laevigata. Ferreira e De Oliveira (2010) identificaram 21 compostos de diversas polaridades além da cumarina. Muceneeki et al. (2009) desenvolveram e validaram um método de HPLC-DAD para determinar as concentrações de siringaldeído, ácido o-cumárico e cumarina em extratos de M. laevigata. HPLC-DAD e UPLC-MS também foram utilizados para observar variações nos teores de cumarina, ácido o-cumárico e ácido

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melilótico, considerando diferentes tipos de extratos e estações do ano (Passari, Scarminio e Bruns, 2014).

Uma revisão recente apresenta um grande número de substâncias já identificadas nas duas espécies, com detalhes da preparação de amostra, forma de extração e método analítico utilizado (Gasparetto, De Francisco e Pontarolo, 2013).

Observa-se que vários estudos se referem ao material vegetal pelo nome popular guaco, sem especificar a espécie. Outros apresentam a composição de somente uma espécie. Gasparetto et al. (2010) apresentam uma revisão das substâncias já identificadas nestas espécies, e mostra a quase completa inexistência de estudos comparativos entre as duas espécies. Dos Santos et al. (2006) relataram que o extrato de M. glomerata tinha aproximadamente o dobro de cumarina do extrato de M. laevigata, e que o processo de liofilização afetou a composição e atividade dos extratos. Bolina, Garcia e Duarte (2009) compararam o teor de cumarina em extratos de duas espécies por HPLC e concluíram que, embora a M.

laevigata tenha apresentado maior teor de cumarina (0,43%) que a M. glomerata

(0,30%), as duas poderiam ser usadas indistintamente. Já Bertolucci et al. (2009) concluíram que havia marcantes diferenças na composição dos extratos das duas espécies, o que contrasta com o estudo de Bolina e colaboradores (2009). Estudos anteriores (Melo e Sawaya, 2011) também indicam uma marcante diferença na composição dos extratos das duas espécies, com baixos teores de cumarina em M.

glomerata.

Estas incongruências entre resultados de diversos estudos das duas principais espécies de guaco, M. laevigata e M. glomerata, podem ser o resultado de erros na identificação botânica das amostras, variabilidade genética das espécies com diferentes quimiotipos, diferenças nas condições de cultivo e, finalmente, diferenças no modo de secagem e extração.

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1.5. Via de biossíntese da cumarina e do ácido clorogênico

A biossíntese da cumarina ocorre pela via do ácido o-cumárico (Gestetner e Conn, 1974). Após a formação do ácido cinâmico, pela enzima fenilalanina

amônia-liase (PAL), ele é então orto-hidroxilado pela ação da enzima cinamato

2-hidroxilase (C2H) produzindo o ácido o-cumárico. Em seguida, este ácido é então glicosilado e passa por uma isomerização cis-trans da dupla ligação da cadeia lateral (Kosuge e Conn, 1961) e a formação da cumarina se dá por lactonização espontânea (Dewick, 2002).

Para biossíntese do acido clorogênico, a primeira reação é a desaminação do aminoácido fenilalanina, por essa enzima, gerando o ácido trans-cinâmico. Esse ácido é então para-hidroxilado pela enzima cinamato 4-hidroxilase (C4H) para produzir o ácido p-coumárico, que é ativado pelo tio éster CoA correspondente, pela enzima 4-coumarato CoA ligase (4CL), resultando no ρ-coumaroil CoA, seguido da hidroxilação do ρ-coumaroil pela enzima C3’H, formando o ácido clorogênico (Schilmiller et al., 2009)

Os núcleos benzo-2-pirona comuns na biossíntese da cumarina e do ácido clorogênico derivam do esqueleto fenilacrílico do ácido cinâmico.

(25)

N H₂ O OH O OH OH O OH

Fenilalamina Ácido cinâmico Ácido o- cumárico

O OH O H O OH OH O O H SH O O O H OH O H O OH O O OH OH

Figura 1. Rota biossintética da cumarina e do ácido clorogênico.

1.6. Morfologia e produção das duas espécies

A morfologia das duas espécies é reconhecidamente muito similar. Ambas são frequentemente confundidas ou citadas na literatura de forma errada (Czelusniak et al., 2012). A morfologia de M. glomerata foi descrita detalhadamente por Milan, Hayashi e Appezzato-Da-Glória (2006), enquanto Budel et al. (2009) descreveram M. laevigata. Bastos et al. (2011) concluíram que as duas espécies poderiam ser consideradas como uma única espécie devido à grande semelhança anatômica existente entre elas. Porém, como observado anteriormente, os estudos apontam divergências a respeito da composição química das duas espécies.

2 coumarato

C2H PAL

NH2

C4H

Ácido p-cumárico Β-D-glicosideo do ácido cumárico

Glicose C4Cl Lactonização P-cumaril CoA CoA Cumarina HCT P-cumaril quinato C3H Ácido clorogênico

(26)

A fenologia indica que o florescimento da M. laevigata é de agosto a dezembro, e da M. glomerata é de agosto a novembro (Lima et al., 2003b). A melhor forma de propagação do guaco é através do método assexuado por estaquia, principal método utilizado na produção. Estudos sobre a melhor forma de produzir mudas de M. glomerata (Negrelle e Doni, 2001; Vidal et al., 2006) e comparando M.

glomerata e M. laevigata (Lima et al., 2003a; b) foram efetuados. As condições de

micropropagação de M. glomerata também foram avaliadas (Pereira, Franca e Câmara, 1999). Na cultura de células das duas espécies (Pereira, Bertoni, et al., 2000) foi observada uma razão inversa entre crescimento celular e teor de cumarina. Como os teores de metabólitos secundários de plantas são dependentes de vários fatores, desde a genética (espécie e quimiotipo) até o cultivo (variações no tipo de solo, iluminação, irrigação, temperatura e ataque de pragas), estes efeitos devem ser avaliados quando se trata de produção de fitoterápico. Foram encontrados estudos avaliando o efeito do fotoperíodo na biomassa de M. glomerata (Castro et al., 2003; Castro et al., 2005). O número de cloroplastos e o teor de pigmentos fotossintéticos em M. laevigata cultivada sob condições variadas de iluminação sugeriram que houve uma foto-inibição nas plantas cultivadas sob pleno sol (De Souza et al., 2011). Em outros casos a menor disponibilidade à luz pode também levar à concentração de amido foliar, que é precursor de vários compostos orgânicos (Spoehr e Milner, 1936). Em nenhum dos três estudos de crescimento e biomassa do guaco já citados foi avaliado o teor de princípios ativos, que é a finalidade do cultivo destas espécies. O aumento da biomassa, por si só, não indica que haja uma quantidade adequada de princípios ativos na planta medicinal (Vaz et al., 2006). Em plantas de M. laevigata cultivadas em quatro municípios de São Paulo, aquelas com maior biomassa não foram as que tiveram maior teor de cumarina. A maioria dos estudos não descrevem o tipo de solo. Lima et al. (2003b) citam apenas que usam solo sem adubação, e Baratto et al. (2008) comparam plantas cultivadas em hidroponia e solo.

Apenas um estudo foi encontrado avaliando a influência da fertilidade do solo sobre a biomassa e a concentração de cumarina: plantas (M. glomerata)

(27)

cultivadas com húmus (fertilização orgânica) tiveram maiores concentrações de cumarina do que plantas tratadas com fertilizantes químicos (Pereira et al., 1998).

Um estudo recente avaliou a influência da luminosidade e da sazonalidade: M. glomerata cultivada com elevada radiação e coletadas no inverno, apresentaram maiores concentrações de diterpenos. Por outro lado, M. laevigata cultivada com maior nível de sombrite (80%), portanto menor radiação solar, apresentou maiores valores de cumarina (Bertolucci et al., 2013).

Embora as condições de produção de mudas já tenham sido avaliadas, a influência das condições de cultivo sobre o teor de princípios ativos necessita de

mais estudos. Como as duas espécies são frequentemente usadas

indiscriminadamente, elas devem ser estudadas em paralelo.

Por fim, considerando o crescente interesse em utilizar o guaco como fitoterápico e a problemática em cima da utilização das duas espécies de forma indiscriminada, é fundamental saber como variações nas condições de cultivo dessas espécies afetam os teores dos princípios ativos e, consequentemente, a atividade terapêutica no paciente.

(28)

2. OBJETIVOS

Este estudo tem como objetivo comparar a composição química de extratos hidroetanólicos de folhas de M. laevigata e M. glomerata cultivados em condições variadas de temperatura, luminosidade e danos mecânicos, visando:

A. Avaliar se a composição química das duas espécies permite que sejam usadas intercambiavelmente.

B. Avaliar como estes fatores afetam a produção dos metabolitos secundários de cada espécie.

C. Quantificar o teor de cumarina (marcador químico definido em farmacopeia) em cada tratamento.

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Equipamentos



IRGA ADC BioScientific, modelo LC-pro SD  Liofilizador Liotop® modelo L1O1

 Cuba de Ultra-Som Cristófoli

 Balança semi-analítica BEL Enginnering® modelo Mark 500  Cromatógrafo a Líquido de Ultra-Alta Eficiência - UPLC - TQD Acquity (Waters - USA) acoplado a Espectrômetro de massas TQD ESI Acquity (Waters - USA)

3.2. Reagentes e solventes

 Álcool etílico grau PA (Ecibra ®)

 Ácido fórmico 85% grau PA (Synth ®)

(29)

 Padrão de cumarina (Sigma Aldrich ®)

 Padrão de ácido clorogênico (Sigma Aldrich ®)

3.3. Material para cultivo

 Ureia agrícola

 Solo comercial

 Vermiculita

3.4. Material vegetal

Mudas de plantas adultas (matrizes) das espécies Mikania glomerata e

Mikania laevigata, obtidas do CPQBA-UNICAMP pelo método de estaquia, foram

plantadas na área experimental do Instituto de Biologia, UNICAMP. As suas exsicatas foram depositadas no herbário da Universidade Estadual de Campinas sob registro nº 102046 para a M. laevigata e nº 102047 para a M. glomerata. As matrizes (uma para cada espécie) encontravam-se já adaptadas no momento da produção das mudas.

3.5. Produção de mudas

Para evitar que as variações genéticas entre indivíduos da mesma espécie afetassem os resultados, todas as mudas da mesma espécie foram obtidas por estaqueamento a partir das matrizes certificadas (Figura 1).

(30)

Figura 2. Matrizes cultivadas no campo experimental do IB- Unicamp: (A) folha e (B) planta de Mikania glomerata; (C) folha e (D) planta de Mikania laevigata.

As estacas foram obtidas tanto da parte semilenhosa dos ramos como das partes apicais. Depois de desinfetadas, receberam cortes retos na porção superior e na extremidade inferior em forma de bisel (Lima et al., 2003a; b). Estacas com o seguinte padrão: aproximadamente 12 cm de comprimento, dois nós e pelo menos duas folhas inteiras por estaca (Giocobbo et al., 2003; Lima et al., 2003b; Boeger, Alquini e Negrelle, 2004) foram colocadas em caixas com vermiculita de granulação média e mantidas em casa de vegetação com irrigação periódica por nebulização (3 vezes ao dia por 10 minutos) e 50% de luminosidade.

(B)

(D) (A)

(31)

Após o período de enraizamento, que variou de 50 a 60 dias, as estacas foram avaliadas quanto ao seu desenvolvimento, selecionando as mais sadias e com características padronizadas para o plantio nos vasos de tratamento. Foram utilizados vasos de 1,0 litro, contendo uma mistura de terra comum e substrato orgânico (MO) 50:50% v/v, com composição previamente analisada (Anexo I), conforme a Tabela 1.

Tabela 1. Propriedades físico-químicas dos solos utilizados nos ensaios.

Substrato Conteúdo de argila

Conteúdo de silte

Conteúdo de

areia total M.O.

pH (CaCl2) CTC ---(%)--- (g/dm³) (mmolc/dm3) terra 16,0 3,6 80,4 13,0 4,0 34,7 M.O. 12,3 26,9 60,7 103,0 5,4 131,6 Substrato Ca Mg K Fe Mn Zn Cu P ---(mmolc/dm3)--- ---(mg/dm3)--- terra 2,0 1,0 0,7 8,0 0,6 0,7 0,1 3,0 M.O. 83,0 31,0 4,5 115,0 32,8 54,0 8,0 31,0 3.6. Tratamentos

As mudas foram replantadas aleatoriamente em vasos conforme o tratamento que foram submetidas, com 10 repetições por tratamento (Boeger, Alquini e Negrelle, 2004). Antes de iniciar os tratamentos todas as mudas permaneceram nos vasos com terra por 20 dias na mesma estufa com nebulização, para sua completa recuperação de eventuais danos sofridos durante o transplante. Sempre foram produzidas mais mudas que o necessário para poder excluir mudas doentes ou fracas antes dos tratamentos. Os tratamentos serão descritos a seguir:

(32)

A) Dano mecânico: As mudas permaneceram dentro da casa de vegetação. Suas folhas tiveram as lâminas pressionadas com pinça anatômica de cirurgia, evitando-se as nervuras. Cada folha foi pressionada três vezes a fim de imitar ataques de herbívoros. O grupo controle deste tratamento foi constituído por plantas mantidas no mesmo ambiente sem o dano. As folhas foram coletadas após 1 hora, 12h e 24h da realização do dano. O tratamento de dano mecânico foi realizado nos dias 05 e 06 de setembro de 2013. A temperatura média do ar nesses dias foi de 20,3 ºC (Dados obtidos do Centro de Pesquisas Meteorológicas e Climáticas Aplicadas a Agricultura (CEPAGRI) Unicamp).

B) Luminosidade: Cada vaso permaneceu por três semanas (do dia 18 de novembro de 2013 ao dia 09 de dezembro de 2013) nas seguintes situações: luz plena, sombrite 25% e sombrite 50% (controle). Foi utilizada tela de cobertura do tipo sombrite, na cor preta. A radiação incidente pela sombrite foi medida com sensor para radiação fotossinteticamente ativa (Sensor PAR do IRGA ADC LCpro+). Foram feitas medidas dentro e fora dos dois tipos de sombrite a fim de determinar a porcentagem de radiação fotossinteticamente ativa (PAR) que atingia as mudas. Obteve-se para sombrite 25%, uma incidência de 51% de radiação fotossinteticamente ativa; e para sombrite 50%, uma incidência de 28% de radiação fotossinteticamente ativa. As regas foram manuais e iguais para todos os vasos. A temperatura média do ar no período de tratamento foi de 24,1 ºC (Dados obtidos do (CEPAGRI) Unicamp).

C) Temperatura: Os vasos foram colocados por três semanas (do dia 22 de agosto de 2013 ao dia 19 de setembro de 2013) em câmara de crescimento com temperatura controlada de 12 °C, 20 °C (controle) e 30 °C. A intensidade de luz da câmara a 10 cm de altura foi de 180 µmol fótons m-2 s-1 usando-se luzes LED vermelha (655nm) e azul (475nm), com fotoperíodo de 12 horas. A temperatura da câmara foi monitorada diariamente por termômetro a fim de verificar possíveis variações.

(33)

3.7. Extração das folhas e análise por UHPLC-MS

Após coletadas, as folhas das mudas foram imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e mantidas em freezer -80 °C. As folhas foram liofilizadas, trituradas em almofariz com auxílio de nitrogênio líquido e foram submetidas a extração conforme descrito por Celeghini, Vilegas e Lanças (2001), com modificações. Optou-se pela avaliação de extratos hidroalcoólicos das folhas, por essa ser a extração preconizada nos compêndios oficiais (Anvisa, 2011). Para cada amostra, 0,2 g das folhas pulverizadas foi extraída com 3 mL de uma solução etanol 70 % em banho de ultrassom por 30 minutos e filtradas. Uma alíquota de 100 µL de cada extrato foi adicionada a 200 µL de água MilliQ diretamente nos vials para a análise cromatográfica. Alíquotas de 4 µL de cada amostra foram injetadas no UHPLC em duplicata. As condições de cromatografia, os solventes e gradiente, volume de extrato injetado, temperatura de coluna e os parâmetros do espectrômetro de massas utilizados nesse estudo foram validados por De Melo e Sawaya (2015) e serão descritos a seguir. Foi utilizado um Cromatógrafo UPLC® Acquity da Waters com uma coluna C18 BEH Acquity Waters (1,7 μm x 2,1 mm x 50 mm) com temperatura do forno em 30 °C. A eluição foi feita por gradiente, com fluxo de 200 μL min-1

, utilizando como fase móvel A- água purificada (Milli-Q) com 0,1% de ácido fórmico e como fase móvel B- acetonitrila (grau cromatográfico), conforme descrito na Tabela 2.

Tabela 2. Gradiente otimizado para análise por UHPLC-MS. Fase móvel A- água

purificada (Milli-Q) com 0,1 % de ácido fórmico e como fase móvel B- acetonitrila

Tempo (min) % fase móvel A % fase móvel B

Inicial 90 10 4,00 75 25 8,00 0 100 8,50 0 100 8,51 90 10 10,00 90 10

(34)

Foi usado um espectrômetro de massas triplo-quadrupolar (TQD-Acquity da Waters) com ionização por eletrospray (ESI) realizando varredura em modo positivo e modo negativo nas seguintes condições: capilar de ± 3000 V, cone de ± 35 V, extrator de 1,0 V, temperatura da fonte de 150 °C e temperatura de dessolvatação de 300 °C.

Os cromatogramas (UHPLC-MS) em modo positivo e negativo foram analisados para detectar diferenças nas composições químicas resultantes dos diferentes tratamentos.

3.8. Análise dos Resultados

Todos os tratamentos foram feitos com dez replicatas e os resultados foram submetidos à análise estatística ANOVA seguido de Post hoc Tukey, realizados no software Graphpad Prism 6.01. Foram comparadas as áreas dos principais íons encontrados nos cromatogramas obtidos em modo positivo e em modo negativo, consideraram-se diferenças significativas para p<0,05.

Paralelamente, foi realizada uma análise multivariada Análise de Componentes Principais (PCA) com o software The Unscrambler 10.2, com todas as áreas geradas pelos picos resultantes dos principais íons obtidos pelos cromatogramas. Os dados foram previamente autoescalados e normalizados pelas médias para padronização.

(35)

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Com o intuído de demonstrar os efeitos de algumas condições de cultivo sobre a composição química de extratos das duas espécies de guaco, M.

glomerata e M. laevigata, este estudo verificou, através de cromatografia líquida de

ultra-alta eficiência com espectrometria de massas, os extratos hidroetanólicos das folhas de mudas de guaco submetidas a condições variadas de temperatura, luminosidade e danos mecânicos. A análise proposta possibilitou a detecção de variabilidade na composição química, observadas nos cromatogramas, tanto em modo positivo quanto em modo negativo. Alguns dos íons observados foram identificados com auxilio dos espectros de fragmentação (MS/MS) (figuras 3 e 4). O íon m/z 147, a partir da comparação com o padrão, refere-se a cumarina, considerado marcador químico para as duas espécies, e encontrada principalmente em M. laevigata, neste estudo. O íon m/z 365 refere-se a um aduto de sódio de um dissacarídeo (342 + Na 23). O íon m/z 325, presente apenas em M. laevigata, possui perda neutra de 162Da e refere-se possivelmente ao cis/trans melilotosídeo. O íon

m/z 301, apesar de apresentar fragmentação não elucidativa, foi comparado com

padrão, e identificado como ácido caorenóico. O íon m/z 317, encontrado principalmente em M. glomerata, foi comparado com padrão e refere-se ao ácido grandiflórico.

O íon m/z 353, com fragmentos m/z 191 (ácido quínico) e m/z 179 (ácido cafeico), e perda neutra de 162 Da, refere-se ao ácido clorogênico ou 5- cafeoilquínico, Com fragmentação similar ao ácido clorogênico (m/z 353), o íon m/z 515, refere-se ao ácido dicafeoilquínico, apresentando perda neutra inicial de 162 Da, depois outra de 162 Da, restando os íons (m/z 191, 179 e 161) iguais do ácido clorogênico. Já o íon m/z 677 apresenta fragmentação similar ao ácido dicafeoilquínico, com mais uma perda neutra de 162 Da, indicando então ser o ácido tricafeoilquínico.

(36)

As estruturas dos íons identificados são apresentadas na figura 5. Os demais íons encontrados nos cromatogramas e citados nesse estudo ainda não foram identificados (Anexo II).

.

hidroetanólicos de Mikania glomerata e/ou Mikania laevigata: m/z 365 – dissacarídeo (A), m/z 147 - cumarina (B), íon m/z 325 – cis ou trans melilotosídeo (C), m/z 301 - ácido cauenóico (D), m/z 317 – ácido grandiflórico (E).

dano m/z 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 % 0 100

dano mg ms pos 174 (0.900) Sm (Mn, 2x0.75); Cm (130:228) 1: Daughters of 365ES+ 2.35e4 365 203 185 113 362 240 354 dano m/z 100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 % 0 100

dano mg ms neg 46 (3.977) Sm (Mn, 2x0.75); Cm (26:58) 7: Daughters of 677ES-

7.82e4 515 514 353 179 173 677 675 589 564 m/z 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 % 0 100

ml hidroet ms 32 (2.841) Cm (25:41) 4: Daughters of 325ES-

3.34e5 163 119 162 120 164 ₃₂₅ MSMS m/z 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 % 0 100

Acido caurenóico MSMS2 86 (9.022) Cm (76:110) 2: Daughters of 301ES-

1.11e5 301 300 298 279 251 216 302 303 312 MSMS m/z 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 % 0 100

Acido grandiflorico MSMS2 87 (7.035) Cm (81:107) 2: Daughters of 317ES-

2.88e4 317 134 111 97 61 117 313 293 249 163 265284 320 341 326

(A)

(B)

(C)

(E)

(D)

(37)

hidroetanólicos de Mikania glomerata e/ou Mikania laevigata: m/z 353 – ácido clorogênico (C), m/z 515 - ácido dicafeoilquínico (D), m/z 677 - ácido tricafeoilquínico. m/z 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 % 0 100

ml hidroet ms 51 (4.867) Cm (31:77) 8: Daughters of 147ES+

9.83e5 91 77 65 147 146 103 ₁₄₈ dano m/z 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 % 0 100

dano mg ms neg 32 (2.467) Sm (Mn, 2x0.75); Cm (10:57) 2: Daughters of 353ES- 8.89e4 191 179 161 351352 dano m/z 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 % 0 100

dano mg ms neg 34 (3.313) Sm (Mn, 2x0.75); Cm (12:82) 6: Daughters of 515ES- 2.65e5 353 191 179 173 135 161 515

(F)

(G)

(H)

(38)

M. laevigata M. glomerata Cumarina PM = 146 Ácido clorogênico PM = 354 Ácido dicafeoilquínico PM = 516 Ácido tricafeoilquínico PM = 618

Cis ou trans melilotosídeo PM = 326

Ácido caurenóico PM = 302

Ácido grandiflórico PM = 318

Figura 5. Estruturas dos compostos identificados nos extratos hidroetanólicos de folhas de M. glomerata e/ou M. laevigata. M. laevigata M. glomerata M. laevigata M. glomerata M. laevigata M. glomerata M. glomerata M. glomerata M. laevigata

(39)

4.1. Perfil químico das duas espécies e escolha dos íons

Na Figura 6, observa-se que os perfis cromatográficos dos extratos das folhas das duas espécies (matrizes) são distintos entre si, tanto em modo positivo como em modo negativo, assim como observado em estudos anteriores (De Melo e Sawaya, 2015).

Figura 6. Cromatogramas UHPLC-MS em modo positivo de extratos de (A) M. glomerata, e (B) M. laevigata; Cromatogramas UHPLC-MS em modo negativo de extratos de (C) M.

glomerata e (D) M. laevigata, obtidos das matrizes.

Time 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 % 0 100 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 % 0 100

mg hidroet Sm (SG, 2x3) 1: Scan ES+

BPI 2.02e7 0.65 0.44 9.65 7.04 5.92 5.79 2.53 1.91 1.57 _3.14_3.26 _3.89 _5.00 6.50 7.30 8.81 8.59 7.94

ml hidroet Sm (SG, 2x3) 1: Scan ES+

BPI 4.34e7 4.90 0.65 0.30 2.86 1.05 9.67 8.48 7.30 5.87 6.19 6.60 7.94 8.78 Time 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 % 0 100 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 % 0 100

mg hidroet Sm (SG, 2x3) 2: Scan ES-

BPI 9.09e6 9.55 8.87 0.70 7.03 4.19 3.38 2.31 1.88 3.62 6.82 5.39 4.54 _6.26 7.57 7.78 9.66

ml hidroet Sm (SG, 2x3) 2: Scan ES-

BPI 1.89e7 0.71 9.55 8.80 8.49 2.85 6.54 5.71 4.11 7.55 9.71 A B C D

(40)

A Análise por Componentes Principal (PCA) também permitiu observar a separação das duas espécies de Mikania (Gráfico scores figura 7A), devido a presença do íon marcador m/z 147 (cumarina) presente em Mikania laevigata (figura 7B). O PC1 versus PC2 consegue explicar 85% da variância dos dados.

Figura 7. PCA dos resultados das análises UHPLC-MS obtidos em modo positivo e negativo de todas as amostras coloridas por espécie (A), e os íons (B).

Assim, observa-se que os perfis químicos das duas espécies são nitidamente distintos. Tal avaliação inicial já contesta a utilização das duas espécies como fitoterápico de modo indiscriminado. Além disto, veremos a seguir que os diferentes tratamentos também influenciam no perfil fitoquímico das amostras.

O PCA obtido a partir dos resultados das análises de todas as amostras de cada espécie também permite observar uma separação dos tratamentos, conforme observado na figura 8A para M. glomerata e 9A para M. laevigata. Observam-se diferenças entre os tratamentos dentro de cada espécie, principalmente em M. glomerata. De fato, cada tratamento foi realizado em condições diferentes: Dano mecânico realizado dentro da casa de vegetação;

(A)

(B)

M. glomerata M. laevigata

(41)

Luminosidade realizado na área experimental externa; e Temperatura realizado dentro da câmara de crescimento com iluminação artificial. Tal divergência entre os tratamentos também é refletida na presença de cumarina, mesmo que em pequenas concentrações, no tratamento de dano mecânico, e ausência nos tratamentos de luminosidade e temperatura em M. glomerata. No extrato das folhas da matriz de M.

glomerata utilizada nesse estudo também não é possível encontrar cumarina, assim

como observado por Melo, 2013.

Figura 8. PCA dos resultados das análises UHPLC-MS obtidos em modo positivo e negativo de todas as amostras de M. glomerata coloridas por tratamento (A), e os íons (B).

Dano mecânico Luminosidade Temperatura

(42)

Figura 9. PCA dos resultados das análises UHPLC-MS obtidos em modo positivo e negativo de todas as amostras de M. laevigata coloridas por tratamento (A), e os íons (B).

Dentro da mesma espécie, a comparação visual direta dos cromatogramas dos extratos das amostras não permitiu avaliar as diferenças na composição química entre os diferentes grupos propostos, como observado nas figuras 10, 11, 12 e 13 referentes ao tratamento de Dano Mecânico, por exemplo. Então, foram selecionados os principais íons encontrados e extraíram-se suas áreas dos cromatogramas (TIC) a fim de determinar diferenças significativas na composição. Para a seleção dos íons de interesse, uma mistura com alíquotas de todas as amostras (controle/tratamento) foi realizada. Tal pool de amostras, denominado “Mix”, apresentaria todos os componentes químicos do controle e tratamento de ambas as espécies de Mikania. Esta mistura foi injetada no início, no decorrer e no final da série de injeções de amostras no UPLC-MS. Seus cromatogramas serviram para marcar o tempo de retenção esperado para os íons de interesse bem como detectar eventuais mudanças que poderiam ocorrer ao longo da série de injeções das amostras no sistema cromatográfico, como deslocamento do tempo de retenção de alguns picos, ou aumento ou diminuição de sua intensidade, devido a erros do instrumento. Após selecionados os principais íons, suas áreas foram extraídas e submetidas a analise estatística ANOVA. Veremos a

Dano mecânico Luminosidade Temperatura

(43)

seguir a variação dos íons selecionados, nas diferentes condições e tratamentos em que as duas espécies de guaco foram submetidas.

Figura 10. Cromatogramas UHPLC-MS em modo positivo de extratos de M. glomerata (A) controle, (B) tratamento dano coletado após 1 hora, (C) tratamento dano coletado após 12 horas e (D) tratamento de dano coletado após 24 horas.

Figura 11. Cromatogramas UHPLC-MS em modo negativo de extratos de M. glomerata (A) controle, (B) tratamento dano coletado após 1 hora, (C) tratamento dano coletado após 12 horas e (D) tratamento de dano coletado após 24 horas.

claudia Time 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 % 0 100 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 % 0 100 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 % 0 100 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 % 0 100 GC1 Sm (SG, 2x3) 1: Scan ES+ BPI 1.47e7 9.32 9.07 8.64 4.10 0.58 1.24 2.74 3.68 4.83 5.37 6.31 7.06 9.54 GD1H1 Sm (SG, 2x3) 1: Scan ES+ BPI 1.26e7 9.32 9.11 8.74 4.10 0.72 1.84 3.16 5.09 5.40 6.39 6.59 7.00 7.75 8.36 9.54 GD12H1 Sm (SG, 2x3); Sm (SG, 2x3) 1: Scan ES+ BPI 1.44e7 9.32 8.64 4.10 0.65 1.92 3.283.82 5.39 5.89 6.787.04 8.34 GD24H1 Sm (SG, 2x3); Sm (SG, 2x3) 1: Scan ES+ BPI 1.62e7 9.32 8.66 4.08 0.69 1.80 2.27 4.74 5.94 7.04 7.93 9.54 claudia Time 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 % 0 100 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 % 0 100 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 % 0 100 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 % 0 100 GC2 Sm (SG, 2x3) 2: Scan ES- BPI 1.81e6 9.08 8.68 4.07 1.79 1.62 0.71 0.56 3.32 3.08 2.14 2.51 3.93 4.32_4.72 5.25 5.38 6.006.12 7.017.137.90 8.40 9.57 9.76 GD1H1 Sm (SG, 2x3) 2: Scan ES- BPI 1.58e6 4.11 1.77 0.70 0.38 1.08 1.62 1.91 3.06 3.383.93 8.67 4.47 4.87 7.53 5.71 6.39 7.03 7.88 8.32 9.08 9.57 9.83 GD12H1 Sm (SG, 2x3) 2: Scan ES- BPI 1.76e6 4.09 1.79 1.60 0.70 0.54 0.84 3.31 3.08 2.33 3.72 9.08 8.67 4.52 4.82 5.505.72 6.46 7.08 7.578.118.30 9.579.67 GD24H2 Sm (SG, 2x3) 2: Scan ES- BPI 2.15e6 1.79 1.57 0.82 0.16 0.94 4.07 3.22 2.30 3.06 3.48 4.254.59 _5.39 8.67 7.03 5.59 _6.54 6.39 7.50 7.697.97 9.07 9.579.74 A B C D A B C D

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Figura 12. Cromatogramas UPHLC-MS em modo positivo de extratos de M. laevigata (A) controle, (B) tratamento dano coletado após 1 hora, (C) tratamento dano coletado após 12 horas e (D) tratamento de dano coletado após 24 horas.

Figura 13. Cromatogramas UHPLC-MS em modo negativo de extratos de M. laevigata (A) controle, (B) tratamento dano coletado após 1 hora, (C) tratamento dano coletado após 12 horas e (D) tratamento de dano coletado após 24 horas.

claudia Time 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 % 0 100 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 % 0 100 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 % 0 100 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 % 0 100 LC3 Sm (SG, 2x3) 1: Scan ES+ BPI 1.23e7 4.86 0.57 0.69 1.87 3.52 4.11 9.32 5.77 8.55 6.55 6.78 8.00 8.73 9.56 LD1H1 Sm (SG, 2x3) 1: Scan ES+ BPI 5.78e6 9.32 5.79 4.85 0.580.69 4.43 4.15 2.62 1.77 1.50 _2.46 _3.18 5.35 8.76 8.33 7.04 6.29 6.48 7.537.70 9.56 LD12H1 Sm (SG, 2x3) 1: Scan ES+ BPI 1.50e7 4.86 0.69 1.44 3.18 3.714.11 9.32 5.79 8.53 8.36 7.23 6.32 8.73 LD24H1 Sm (SG, 2x3) 1: Scan ES+ BPI 1.26e7 9.32 4.86 0.57 0.13 _1.37_1.78 2.86 _3.16 4.11 _4.57 5.77 9.07 8.74 6.31 7.61 claudia Time 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 % 0 100 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 % 0 100 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 % 0 100 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 % 0 100 LC2 Sm (SG, 2x3) 2: Scan ES- BPI 4.14e6 6.35 5.78 1.91 0.61 1.04 2.17 _{2.85 3.17} _4.05 4.54 4.82 5.25 _6.99_7.34_7.45 8.54 9.07 _9.55 LD1H1 Sm (SG, 2x3) 2: Scan ES- BPI 2.97e6 6.39 5.79 1.91 0.70 0.23 0.94 4.52 2.19 2.84 3.17 3.62_4.14 _4.735.25 _6.86_7.22_7.62 8.27 8.56 9.01 _9.57 LD12H1 Sm (SG, 2x3) 2: Scan ES- BPI 3.71e6 6.35 5.79 1.91 0.71 0.14 1.77 2.14 4.12 2.80 3.20 3.64 4.514.85_5.27 _6.89 _{7.41 7.71} 8.56 _9.05 9.55 LD24H1 Sm (SG, 2x3) 2: Scan ES- BPI 4.85e6 6.35 5.78 1.90 0.71 0.57 2.17 4.45 2.84 3.17 3.574.11 4.75 5.17 6.80 7.55 8.638.80 9.55 9.78 B B C C D D A A

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4.2. Dano mecânico

No tratamento de dano mecânico, para Mikania glomerata, em modo positivo (Figura 14), observou-se diferenças significativas entre as áreas dos picos de todos os principais íons encontrados. O íon de m/z 365 é o aduto de sódio de um dissacarídeo, e sua área apresentou redução estatisticamente significativa em 1 hora (p=0,0032) e 12 horas (p=0,02) após o dano, comparado com o controle. A área do marcador, cumarina (m/z 147) apresentou diferenças significativas nos três grupos, quando comparado ao controle, sendo menor que o controle em 1h e 12 horas (p=0,0001; p=0,0001) e maior que o controle em 24 horas (p=0,0009). Os íons

m/z 165, m/z 301 - 7,04 min e m/z 301 - 8,66 min também apresentaram menores

áreas em plantas coletadas 1 e 12 horas após o dano, mas ainda não foram identificados.

Figura 14. Comparação das áreas encontradas nos cromatogramas UHPLC-MS em modo positivo dos extratos de Mikania glomerata Controle, 1 hora, 12 horas e 24 horas após o dano. Letras diferentes em cada íon indicam diferenças significativas entre os grupos pelo teste post hoc de Tukey, p<0,05.

ab a a a a bc b _b ab b c b b b b a _ab _c ab a 0 500.000 1.000.000 1.500.000 2.000.000 2.500.000 3.000.000 3.500.000 165 - 0,58 365 - 0,68 147 - 4,86 301 - 7,04 301 - 8,66 Á re a mé d ia d o s p ic o s m/z - Tr (min) M . g l o m e r a t a m o d o p o s i t i v o d a n o Controle 1 horas 12 horas 24 horas

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Em modo negativo (Figura 15), para M. glomerata, observou-se variação significativa para vários íons. O ácido clorogênico (m/z 353) e o ácido dicafeoilquínico (m/z 515) aumentaram significativamente nas amostras coletadas após 24 horas de dano (p=0,0062 para m/z 353 e p=0,0004 para m/z 515). De fato, estes compostos estão relacionados com os mecanismos de defesa de plantas (Dixon e Paiva, 1995). Por outro lado, outros íons (m/z 387, m/z 399, m/z 401) apresentaram redução significativa em 1 e 12 horas após o dano, comparado ao grupo controle. Estes íons ainda não foram identificados. O íon m/z 677, cujo espectro de fragmentação sugere ser o ácido tricafeoilquínico (Figura 2), não apresentou diferenças significativas. O íon m/z 301, referente ao ácido caurenóico, também apresentou menor área em 1 e 12 horas após o dano, e aumento após 24 horas do dano. O íon m/z 317, referente ao ácido grandiflórico, apresentou menor área em extratos de folhas coletadas após 12 horas do dano.

Figura 15. Comparação das áreas encontradas nos cromatogramas UHPLC-MS em modo negativo dos extratos de Mikania glomerata Controle, 1 hora, 12 horas e 24 horas após o dano. Letras diferentes em cada íon indicam diferenças significativas entre os grupos pelo teste post hoc de Tukey, p<0,05.

a a a a a a a a a a a ab b b b b a a a b b b b b b b a ab _a a a a 0 500.000 1.000.000 1.500.000 2.000.000 2.500.000 3.000.000 3.500.000 4.000.000 353 - 1,79 515 - 4.1 677 - 5,85 317 - 7,05 387 - 7,9 399 - 8,68 401 - 8,8 301 - 9,08 Á re a mé d ia d o s p ic o s m/z - Tr (min) M . g l o m e r a t a m o d o n e g a t i v o d a n o Controle 1 hora 12 horas 24 horas

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Para M. laevigata observa-se novamente em modo positivo (Figura 16) que o aduto de sódio de um dissacarídeo, íon de m/z 365, diminuiu significativamente na primeira hora após o dano (p= 0,0086). O íon m/z 165 não apresentou variações significativas entre os tratamentos e o controle, diferentemente de M. glomerata. A área do marcador, cumarina (m/z 147), apresentou diferença significativa apenas na primeira hora do dano (p=0,003), com área menor que a do grupo controle. O íon m/z 301 com tempo de retenção (Tr) 8,66 min também apresentou diferenças significativas, com menor área em 1 e 12 horas, comparado ao controle.

Figura 16. Comparação das áreas encontradas nos cromatogramas UHPLC-MS em modo positivo dos extratos de Mikania laevigata Controle, 1 hora, 12 horas e 24 horas após o dano. Letras diferentes em cada íon indicam diferenças significativas entre os grupos pelo teste post hoc de Tukey, p<0,05.

ab _a a a a b b b a b b a a a b a ab a a ab 0 2.000.000 4.000.000 6.000.000 8.000.000 10.000.000 12.000.000 14.000.000 16.000.000 18.000.000 20.000.000 165 - 0,58 365 - 0,85 147 - 4,90 301 - 7,04 301 - 8,66 Á re a mé d ia d o s p ic o s m/z - Tr (min) M . l a e v i g a t a m o d o p o s i t i v o d a n o Controle 1 horas 12 horas 24 horas