UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA (RENORBIO-UFC)
SAMANTHA PINHEIRO DA COSTA
MICROBIOMAS DO SOLO DE VIVEIROS E DO INTESTINO DO CAMARÃO
LITOPENAUES VANNAMEI RELACIONADOS AO USO DE PROBIÓTICOS NA
CARCINICULTURA
FORTALEZA 2015
SAMANTHA PINHEIRO DA COSTA
MICROBIOMAS DO SOLO DE VIVEIROS E DO INTESTINO DO CAMARÃO LITOPENAUES VANNAMEI RELACIONADOS AO USO DE PROBIÓTICOS NA CARCINICULTURA
FORTALEZA 2015
Tese submetida ao Programa de Doutorado em Biotecnologia da Universidade Federal do Ceará (RENORBIO-UFC) como requisito para obtenção do grau de Doutor. Área de concentração: Biotecnologia Industrial.
AGRADECIMENTOS
Às forças do Universo por me permitirem trilhar um caminho diferente do habitual e por me dar forças, sempre.
À minha família por acreditar em mim, mesmo não entendendo muito bem o que faço. Ao Alysson por ser um ótimo companheiro de trabalho e alguém a quem tenho muito respeito acadêmico e admiro infinitamente. Pelas ajudas nas coletas e no delineamento experimental. Você é aquele tipo raro de gente que quanto mais de perto se olha, mais se admira.
Ao meu lindo esposo (Alinho) por ser muito mais do que um companheiro lindo e afetuoso. Por ter aguentado a barra de uma gestação adicionada à conclusão de um doutorado, por ter assumido para si compromissos tradicionalmente femininos, como arrumar o quarto do nosso filho e cuidar de cada detalhe para o recebermos, por cada massagem, por cada ajuda na escrita da tese, por cada momento de compreensão e paciência, mas principalmente por me apoiar, estudar e participar em todos os assuntos relacionados ao parto. Amo muito você!
À Profa. Dra. Vânia Maria Maciel Melo, pelo apoio incomensurável, pela orientação, pelos inúmeros ensinamentos, pelo incentivo contínuo e pelos conselhos na vida profissional e pessoal.
À Professora Dra. Letícia Costa-Lotufo e Prof. Diego Wilke, coordenadores do Laboratório de Oncologia Experimental do Departamento de Farmacologia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará pela infraestrutura disponibilizada para os ensaios de sequenciamento.
Ao Daniel Pascoalino, pelo seu conhecimento, disposição e alegria em nos ajudar durante o sequenciamento de DNA no MiSeq e principalmente por ser esta pessoa doce por quem tenho apreço.
À professora Ana de Fátima Urano, coordenadora do Laboratório de Bioprospecção de Recursos Regionais, do Departamento de Biologia da Universidade Federal do Ceará, principalmente Luiz Carlos e Nathanna Mateus, pela disponibilidade e ajuda nos experimentos de determinação de Nitrogênio Total.
Ao professor José Marcos Sasaki, coordenador do Laboratório de Raios X, no Departamento de Física da Universidade Federal do Ceará, principalmente Ana Cláudia e Édipo, pela ajuda com as determinações por fluorescência de raios X.
Aos professores Wandemberg Paiva e Felipe Munarin, do Grupo de Teoria da Matéria Condensada do Departamento de Física da Universidade Federal do Ceará, por disponibilizarem o suporte computacional para as análises in silico.
Ao Dr. Antonio Gonzalez, da Universidade do Colorado, ―QIIME master‖, pela valiosa ajuda nas análises de bioinformática.
Ao biólogo Pedro Bastos, do Laboratório de Ciências do Mar, pela incrível habilidade com o programa R e análises estatísticas, paciência e didática. Obrigada pela presteza e pelas contribuições na reta final da elaboração deste trabalho.
A todos os professores da Rede Nordeste de Biotecnologia - Renorbio. Ao secretário da coordenação Adil Oliveira pela presteza e disponibilidade.
Aos companheiros do Lembiotech, Bárbara Cibelle, Camila Tauane, Danielle Alves, Denise Hissa, Edilson Lima, Gabrielly da Silva, Geórgia Barguil, Gustavo Amaral, Hortência Barroso, Jamille Lima, Jonanthan Araújo, Júlio Ximenes, Kizeane Fajardo, Laís Feitosa, Lara Azevedo, Lidianne Leal, Luis Henrique, Lyanderson Aquino, Mirella Pereira, Natalia Falcão, Raissa Bezerra, Samuel Araújo, Santiago Moura, Sasha Gabrielle, Tallita Tavares, Vanessa Câmara, Vanessa Nogueira e Yara Dias. Agradeço muitíssimo o apoio, os anos de convivência e os aprendizados.
À Mirella Pereira, Santiago Moura e Samuel Araújo pelas análises de nitrogênio, sem vocês eu não teria conseguido. Sou muito grata a vocês.
Ao Sr. Valdenor, pelas conversas alegres, pelo respeito incomensurável às diferenças e pelo belo exemplo de trabalho honesto.
Aos mais legais do Renorbio, Simone Semionato, Rômulo Castro e Walderly Melgaço pelas tardes ―desperdiçadas‖ pelos almoços ―intermináveis‖ pelas longas horas de gargalhadas e ao Júlio Ximenes, por ser o Lombardi desse grupo.
À Geórgia Barguil pelo apoio e incentivo ao parto normal e pelas longas horas de conversa, essenciais para me acalmar nestes dias de turbulências.
À Vanessa Nogueira por ser sempre tão solícita e amiga.
À Denisona por ser um exemplo de pesquisadora, uma pessoa extremamente agradável, por nos escutar sempre e por ser companheira de surfe do meu marido, admiro muito a amizade de vocês.
Ao Júlio por ter me incentivado a entrar no doutorado e à Wal e ao Alysson por me ajudarem a sair.
À Wal pela parceria agradável, discussão dos experimentos, ensinamentos em vários campos da vida e do trabalho, e principalmente pela amizade.
Ao Leonardo pela solicitude em ajudar nas coletas, a fazer gráficos, figuras, formatações, fórmulas do Excel... Enfim, por tudo que você foi generoso em ensinar e em executar.
Às minhas amigas (Michelle, Julliane e Liana) pelas noites de farra de chocolate, gargalhadas, horas de Maria Rita, Chico e Bethânia...Esses anos não seriam os mesmos sem vocês.
Às Spices que mesmo à distância se fazem presentes em minha vida. Obrigada pelo apoio, carinho e respeito.
À Coordenadoria de Aperfeiçoamento Pessoal de Nível Superior (Capes) pelo apoio financeiro à pesquisa.
À Biotrends pelo custeamento das coletas e pela confecção do coletor de amostras de solo.
A todos que contribuíram direta e indiretamente para a execução deste trabalho, meu muito obrigada.
―O que sabemos é uma gota, o que ignoramos é um oceano.‖ (Isaac Newton)
RESUMO
Inicialmente, este estudo analisou a composição e a carga microbiana de um probiótico comercial de composição desconhecida utilizado em uma fazenda de camarão no Ceará, através de métodos dependentes e independentes de cultivo. Os resultados mostraram a presença de bactérias dos gêneros Lactobacillus, Acetobacter e Streptococcus e da levedura Saccharomyces. O monitoramento do manejo do probiótico mostrou que após 15 dias, o produto continha quase que exclusivamente representantes de Lactobacillus e Saccharomyces, sendo a população de leveduras mais numerosa do que a de bactérias. Estes resultados demonstram que o manejo altera a composição microbiana e que o consórcio restante não justifica a aplicação no tratamento do solo e da água, indicado pelo fabricante. Em seguida, com o intuito de verificar as consequências do uso prolongado de probióticos na carcinicultura e seus efeitos na composição taxonômica e funcional da microbiota do intestino do camarão Litopenaeus vannamei e do solo de viveiros, duas fazendas foram selecionadas: uma que utiliza probióticos, constituídos por bactérias do gênero Bacillus (Filo Firmicutes) há 11 anos, e outra onde dois viveiros foram utilizados como referência, sem utilização de probióticos. Análises da composição química e granulométrica do solo foram realizadas, sendo verificadas correlações positivas entre o viveiro que utiliza probióticos e as seguintes variáveis abióticas: silte-argila, carbono orgânico, matéria orgânica, manganês e a razão carbono/nitrogênio. A diversidade taxonômica e funcional das comunidades microbianas do intestino do camarão e do solo foi acessada através do sequenciamento em massa de bibliotecas metagenômicas e de bibliotecas de fragmentos do gene RNAr 16S na plataforma ―Miseq‖ da Illumina. Os dados das análises metagenômicas mostraram que o intestino do camarão e os solos de viveiros compartilham cinco filos de Bacteria (Proteobacteria, Cyanobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, Actinobacteria) e um filo de Archaea (Euryarchaeota), e que o filo Firmicutes apresenta de 3 a 4 vezes mais sequências nas amostras de solos e de intestino de animais que recebem probióticos. Apesar disso, não foram detectadas alterações significativas no perfil funcional dos microbiomas (solo e intestino). O sequenciamento em massa de fragmentos do gene RNAr 16S revelou que os solos, independentemente de receberem ou não probióticos, compartilham sete filos (Proteobacteria, Bacteroidetes, Chloroflexi, Firmicutes, Planctomycetes, Spirochaetes e Acidobacteria), sendo, mais uma vez, o filo Firmicutes 3 a 4 vezes mais abundante no viveiro que recebe probióticos. Nesta análise, o domínio Archaea apresentou, pela primeira vez neste estudo, além do filo Euryarchaeota, os filos Crenarchaeota e Parvarchaeota. A despeito das diferenças observadas na composição taxonômica, os índices de diversidade destacam a manutenção da diversidade nos solos, independentemente do tratamento utilizado. O filo Proteobacteria (composto de bactérias Gram-negativas) foi o único filo especialista compartilhado por todos os viveiros, enquanto Firmicutes (composto por bactérias Gram-positivas) despontou como um dos especialistas de habitat do viveiro que aplica probióticos. Estes resultados inéditos demonstram a contribuição do hábito bentônico no microbioma do intestino de L. vannamei adulto e também sinalizam que o uso prolongado de probióticos pode alterar a estrutura da comunidade microbiana, indicando a necessidade de ações diagnósticas e de monitoramento do uso de probióticos no Brasil.
ABSTRACT
Initially, this study analyzed the microbial composition and micro-organism cell count of a commercial probiotic used in a shrimp farm in Ceará, whose composition is unknown, by dependent and independent methods. The results showed the presence of the bacteria genera of Lactobacillus, Acetobacter and Streptococcus and Saccharomyces yeast. The monitoring of the probiotic management showed that after 15 days the product contained almost exclusively representatives of Lactobacillus and Saccharomyces, being the population of yeasts more numerous than bacteria. As conclusion, this study showed that the handling changes the composition of the initial product and that the microbial composition does not justify the application suggested by the manufacturer for treating soil and water. In order to verify the consequences of long term use of probiotics in shrimp farming and its possible effects on the microbial taxonomic and functional composition in Litopenaeus vannamei shrimp gut and pond soils, two farms were selected: one that use probiotics which are mainly constituted by bacteria from the genus Bacillus (phylum Firmicutes), since 2004 and another two ponds used as reference, where do not use probiotics products. Chemical composition and particle size of the soil analyses were accomplished and positive correlations were verified between the farm that use probiotics and the following abiotic variables: silt-clay, organic carbon, organic matter, manganese and carbon/nitrogen ratio. The taxonomic and functional diversity of microbial communities in gut shrimp and soil were accessed by sequencing of metagenomic and gene fragments of 16S rRNA libraries using the platform "Miseq" of Illumina. The metagenomic data showed that the intestine and shrimp ponds soil shared five phyla of bacteria (Proteobacteria, Cyanobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, Actinobacteria) and one phylum of Archaea (Euryarchaeota), and that phylum Firmicutes predominates in the samples obtained from soil and animals whose uses probiotics. Nevertheless, no significant changes were detected in the metabolic profile of those microbiomes (soil and intestine). Sequencing of the fragments of 16S rRNA gene showed that all samples of soil shared seven phyla (Proteobacteria, Bacteroidetes, Chloroflexi, Firmicutes, Planctomycetes, spirochaetes and Acidobacteria), and over again the Firmicutes phylum had higher abundance when compared which those that do not use probiotics in ponds. The Archaea domain showed, for the first time in this study, two others phyla (Crenarchaeota and Parvarchaeota) besides the Euryarchaeota phylum. Despite the differences observed in the taxonomic composition, the diversity indices highlight for the maintaining of diversity in soils, regardless of the treatment used. The Proteobacteria phylum (consisting of Gram-negative bacteria) was the only habitat specialist shared by all pond soils, and the Firmicutes phylum (composed of Gram-positive bacteria) has emerged as one of habitat specialists for the pond where the probiotics are applied. Our results demonstrate the contribution of benthic habit of L. vannamei for the gut microbiome of adult shrimps, and also indicate that long term use of probiotics can change the structure of the microbial community, suggesting the need for diagnostic actions and monitoring of the use of probiotics in Brazil.
LISTA DE FIGURAS
Figura 2.1 Desenho esquemático da morfologia do sistema digestivo do camarão adaptado de ANDRETTA; BELTRAME, 2004. ... 25 Figura 2.2 Resumo das principais preparações microbianas e/ou químicas usadas em
aquicultura (adaptado de GATESOUPE, 1999). ... 28 Figura 5.1 Localização das fazendas de camarão onde foram realizadas as coletas. Fazenda Aquarium (Rio Grande do Norte) que utiliza probióticos há pelo menos 11 anos e onde foi amostrado o viveiro identificado como V1 e Fazendas da Associação Comunitária dos Produtores de Parajuru (ACPP) no Ceará, que não usam probióticos e onde foram amostrados os viveiros nomeados de V2 e V3. ... 57 Figura 5.2 Vista aérea dos viveiros no Ceará (a) e no Rio Grande do Norte (b) ressaltando os pontos de coleta dentro dos viveiros e a representação esquemática dos pontos de coleta e número de réplicas de amostras coletadas ao longo do viveiro (c) em relação a entrada e saída de água. ... 58 Figura 5.3 Modelo de coletor confeccionado para coleta de solo de viveiros de camarão,
adaptado de LEHMANN; VINATEA (2008) . Visão geral do coletor, com destaque para os furos laterais, que permitem a saída de água (a), para a válvula de fluxo unidirecional (b) e para o registro e o coletor de amostras em frasco de vidro (c). ... 59 Figura 5.4 Coleta das amostras de solo com o auxílio de caiaque e coletor (a); recipiente de
vidro usado como coletor (b); tamanho do solo coletado (c) e retirada de alíquota de solo para análise molecular (d). ... 60 Figura 5.5 Procedimento de coleta do intestino de camarão realizado de forma asséptica com
auxílio de bisturi e pinça. ... 61 Figura 5.6 Curvas de rarefação para os metagenomas das amostras de intestino de camarão
dos diferentes viveiros CV1 (com probióticos), CV2 (sem probióticos) e CV3 (sem probióticos). Estes dados foram calculados comparando-se as sequências obtidas com o banco de dados M5NR usando e-value máximo de 1e-10, com um mínimo de identidade de 75%, e um tamanho mínimo de alinhamento de 50 aminoácidos para proteína e pares de bases para bancos de dados de RNA. ... 74 Figura 5.7 Curva de rarefação dos metagenomas de solos de viveiros de camarão: viveiro 1 (MV1), viveiro 2 (MV2) e viveiro 3 (MV3). Estes dados foram calculados
comparando as sequências obtidas com o banco de dados M5NR usando e-value máximo de 1e-10, com um mínimo de identidade de 75 %, e um tamanho mínimo de alinhamento de 50 aminoácidos para proteína e pares de bases para bancos de RNA. ... 75 Figura 5.8 Comparação dos perfis taxonômicos em nível de classe entre as amostras CV1 e
CV2 (a), entre CV1 e CV3 (b) e entre CV2 e CV3 (c). Os perfis taxonômicos para as amostras foram gerados na plataforma MG -RAST v3.0 e o programa STAMP v2.0.9. Os pontos mostrados adjacentes à linha de tendência (tracejada) encontram-se enriquecidos em cada amostra analisada. Quanto mais distantes desta linha, mostra que estes táxons possuem mais diferenças entre os metagenomas. Um filtro foi aplicado para remover pontos com p > 0.05. ... 80 Figura 5.9 Perfil taxonômico em nível de gênero, em comparações par a par dos metagenomas de amostras de intestino (a) CV1 e CV2, (b) CV1 e CV3 e (c) CV2 e CV3, usando o programa STAMP (2.0.9). ... 81 Figura 5.10 Abundância relativa dos domínio Bacteria, Archaea e Eucarya, além dos vírus e sequências não identificadas detectadas nos metagenomas de solos de viveiros de camarão MV1 (com probióticos), viveiro MV2 (sem probióticos), viveiro MV3 (sem probióticos). ... 82 Figura 5.11 Diagrama de Venn revelando os principais filos compartilhados entre os
microbiomas do intestino de camarão L. vannamei e de solos de viveiros que recebem probióticos (MV1/CV1) e que não recebem probiótcos (MV2/CV2 e MV3/CV3). ... 85 Figura 5.12 Abundância relativa dos principais filos do domínio Bacteria compartilhados
entre as amostras de intestino (CV1, CV2 e CV3) e de solos (MV1, MV2 e MV3) em cada viveiro. ... 86 Figura 5.13 Categorias funcionais dos microbiomas de intestino do camarão L. vannamei que
recebem probióticos (CV1) e que não recebem probióticos (CV2 e CV3) no subsistema 1 MG-RAST (programa STAMP), usando e-value de 1e-5, um
mínimo de identidade de 60% e um tamanho máximo de alinhamento de 15 de aminoácidos para proteínas e de pares de bases para bancos de dados de RNA. Os dados foram normalizados para valores entre 0 e 1. ... 88 Figura 5.14 Análise dos perfis funcionais da microbiota do intestino de camarão L. vannamei, em comparações par a par, no nível 1 Subsistema, MGRAST (programa STAMP). ... 89
Figura 5.15 Categorias funcionais dos metagenomas de solos de diferentes viveiros de camarão (Subsistema, MG-RAST), usando um e-value de 1e-5, um mínimo de identidade de 60% e um tamanho máximo de alinhamento de 15 de aa para proteínas e bp para bancos de dados de RNA. Os dados foram normalizados para valores entre 0 e 1. ... 90 Figura 5.16 Análise de componentes principais das variáveis abióticas analisadas em solos de
viveiros de camarão que recebem probióticos (V1) e que não recebem probióticos (V2 e V3), utilizando distância Euclidiana. ... 92 Figura 5.17 Agrupamentos das 12 amostras de solos coletadas nos viveiros de camarão que
recebem probióticos (V111, V112, V113, V121, V122, V123, V131, V132, V133, V141, V142, V243) e de viveiros que não recebem probióticos (V211, V212, V213, V221, V222, V223, V231, V232, V233, V241, V242, V243) e (V311, V312, V313, V321, V322, V323, V331, V332, V333, V341, V342, V343) quanto aos fatores abióticos, revelado a partir da análise de UPGMA usando distância Euclidiana, no programa PAST (v.3.05). ... 93 Figura 5.18 Panorama geral da abundância relativa de filos do domínio Bacteria nas amostras de solos de viveiros de camarão que recebem probióticos (V111, V112, V113, V121, V122, V123, V131, V132, V133, V141, V142, V243) e de viveiros que não recebem probióticos (V211, V212, V213, V221, V222, V223, V231, V232, V233, V241, V242, V243) e (V311, V312, V313, V321, V322, V323, V331, V332, V333, V341, V342, V343) realizada pelo sequenciamento de fragmentos do gene RNAr 16S considerando 97% de similaridade. ... 96 Figura 5.19 Curvas de rarefação representando a cobertura das bibliotecas de amplicons do
gene RNAr 16S de amostras de solos de viveiros de camarão, para 97% de similaridade. ... 99 Figura 5.20 Dendrogramas de UPGMA baseados na distância de Bray–Curtis para UTOs
encontradas nas 12 amostras de solos de viveiros de camarão que utilizam probióticos (série V1) e que não utilizam probióticos (série V2 e série V3) utilizando o programa Figtree (v1.4.2). ... 102 Figura 5.22 Diagrama de Venn com as UTOs especialistas estritas de cada viveiro de camarão (V1, V2 e V3). Análise realizada com o pacote labdsv (http://ecology.msu.montana.edu/labdsv/R/) dentro do ambiente R, considerando as UTO especialistas com significância (p<0.05) e valores de INDVAL (>0.3). ... 105
Figura 5.23 Diagrama de Venn com o número de filos especialistas estritos de cada viveiro (a) e a identificação dos filos especialistas estritos dentro do domínio Bacteria (b),
análise realizada com o pacote labdsv
(http://ecology.msu.montana.edu/labdsv/R/) dentro do ambiente R, sendo consideradas UTO especialistas somente UTOs com significância (p<0.05) e valores de INDVAL (>0.3). ... 106
LISTA DE TABELAS
Tabela 2.1 Lista dos principais probióticos para aquicultura comercializados no Brasil e suas instruções contidas nos rótulos. ... 29 Tabela 5.1 Informações obtidas pelo sequenciamento em massa de DNA metagenômico de
amostras de intestino de camarão CV1 (com probiótico), CV2 (sem probióticos) e CV3 (sem probióticos) e análise na plataforma MG-RAST. ... 73 Tabela 5.2 Informações obtidas pelo sequenciamento em massa do DNA metagenômico de
amostras de solos de viveiro de camarão MV1 (com probióticos), MV2 (sem probióticos) e MV3 (sem probióticos) e análise na plataforma MG-RAST. ... 75 Tabela 5.3 Percentual dos domínios Bacteria, Archaea e Eucarya e de vírus no intestino do camarão L. vannamei reveladas a partir do sequenciamento em massa na Plataforma Miseq Illumina. ... 76 Tabela 5.4 Abundância relativa dos Filos do domínio Bacteria presentes no intestino de camarão L. vannamei. ... 77 Tabela 5.5 Abundância relativa de classes do domínio Bacteria presentes no intestino de camarão L. vannamei. ... 78 Tabela 5.6 Classes de Archaea presentes nos microbiomas de solos de viveiros de camarão:
viveiro MV1 (com probióticos), viveiro MV2 (sem probióticos), viveiro MV3 (sem probióticos). ... 83 Tabela 5.7 Filos de Bacteria detectados nos microbiomas de solos de viveiros de camarão:
viveiro MV1 (com probióticos), viveiro MV2 (sem probióticos), viveiro MV3 (sem probióticos). ... 84 Tabela 5.8 Principais classes do Domínio Bactéria encontradas nas amostras de solos de
diferentes viveiros de camarão. ... 87 Tabela 5.9 Principais características abióticas de solos de viveiros de camarão que recebem
probióticos (V1) e que não recebem probióticos (V2 e V3). ... 91 Tabela 5.10 Relação carbono/nitrogênio (%) das diferentes regiões de coleta dentro dos
viveiros (Figura 5.2) V1 (com probióticos), V2 e V3 (sem probióticos). ... 93 Tabela 5.11 Média da análise semi-quantitativa dos elementos químicos, realizada por espectrometria de fluorescência de raios X, das amostras de solos coletadas em cada uma das quatro áreas dentro dos viveiros V1, V2 e V3 (Figura 5.2). ... 94
Tabela 5.12 Média da abundância relativa dos principais filos (>1%) do domínio Bacteria encontrados nas amostras de viveiros de camarão: viveiro 1 (V1), viveiro 2 (V2) e viveiro 3 (V3). ... 97 Tabela 5.13 Estimadores de riqueza e índices de diversidade calculados a partir de dados das
bibliotecas de amplicons do gene RNAr 16S das amostras de solos de viveiro de camarão que recebem probióticos (V1) e que não recebem probióticos (V2 e V3). ... 98 Tabela 5.14 Análise de similaridade (Anosim) das comunidades microbianas de solos de
viveiros usando índice de Bray-Curtis. Valores de p<0.05 são estatisticamente significantes. ... 100 Tabela 5.15 Principais filos de bactéria que mais explicam as diferenças encontradas entre os viveiros de camarão que recebem (V1) ou não recebem probióticos (V2 e V3) (Análise de SIMPER, Vegan- R). ... 103
SUMÁRIO
1 Introdução ... 17
2 Revisão Bibliográfica ... 19
2.1 Carcinicultura no Brasil ... 19
2.2 O camarão Litopenaeus vannamei ... 23
2.3 O uso de micro-organismos em carcinicultura ... 26
2.4 Métodos de estudos de micro-organismos ... 31
3 Objetivo ... 34
3.1 Objetivos específicos ... 34
4 Capítulo 1: Composição de um probiótico usado em carcinicultura orgânica no nordeste do Brasil acessada por métodos dependentes e independentes de cultivo ... 35
4.1 Introdução ... 36
4.2 Assessment of probiotic composition used in organic shrimp farming in Brazil by culture-dependent and independent methods ... 37
Abstract ... 37
1. Introduction ... 38
2. Material and Methods ... 40
2.1 Commercial farm site ... 40
2.2 DNA extraction ... 41
2.3 Cloning library ... 42
2.4 Phylogenetic analysis ... 42
2.5 Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) ... 43
2.6 Viable cell counting and pH measurement ... 44
3. Results and Discussion ... 44
3.1 Probiotic composition ... 44
3.2 Microbial community structure ... 47
3.3 Viable cell count ... 48
4. Conclusion ... 49
References ... 50
5 Capítulo 2: efeito do uso prolongado de probióticos sobre o microbioma do solo de viveiros e do intestino do camarão Litopenaeus vannamei ... 54
5.1 Introdução ... 55
5.2 Material e Métodos ... 56
5.2.2 Construção das bibliotecas metagenômicas e de amplicons do gene codificador
do rRNA 16S ... 60
5.2.3 Sequenciamento de fase sólida na plataforma Illumina MiSeq® ... 63
5.2.4 Análise metagenômica de fragmentos aleatórios (shotgun) ... 64
5.2.5 Análise de amplicons do gene do RNAr 16S ... 65
a) Análise de alfa-diversidade ... 65
b) Análise de beta diversidade ... 66
c) A relação entre composição da comunidade microbiana, o ambiente e a distância geográfica ... 67
d) Identificação de especialistas estritos de um habitat ... 67
e) Taxons raros e abundantes ... 68
5.2.6 Caracterização física e química das amostras de solos... 69
a) Determinação do pH ... 69
b) Determinação de nitrogênio total ... 69
c) Determinação da textura do solo por granulometria ... 70
d) Determinação da matéria orgânica no solo (MOS) pela perda por ignição ... 71
e) Determinação semi-quantitativa de elementos químicos por fluorescência de Raio X (FRX). ... 71
5.3 Resultados ... 72
5.3.1 Microbiomas do intestino de camarão (Litopenaeus vannamei) e de solos de viveiros de camarão ... 72
a) Microbioma do intestino do camarão Litopenaeus vannamei ... 76
b) Microbioma de solos de viveiros de camarão ... 82
c) Perfil metabólico dos microbiomas de intestino de camarão e dos solos de viveiros 87 5.3.2 Caracterização física e química de solos de viveiros de camarão ... 91
5.3.3 Bibliotecas de fragmentos do gene RNAr 16S de amostras de solos de viveiros 94 a) Composição taxonômica da microbiota do solo de viveiros de camarão obtida pelo sequenciamento de fragmentos do gene do RNAr 16S ... 95
b) Análises de Alfa diversidade ... 98
c) Análises de Beta diversidade ... 99
d) Taxons raros e abundantes ... 103
e) Identificação de especialistas ... 104
5.4 Discussão ... 107
5.5 Conclusões ... 118
