SIMONE NATALY BUSATO DE FEIRIA
Bioatividade de óleos essenciais de Mentha spp. sobre
microrganismos orais
Piracicaba 2019
SIMONE NATALY BUSATO DE FEIRIA
Bioatividade de óleos essenciais de Mentha spp. sobre
microrganismos orais.
Orientador: Prof. Dr. José Francisco Hofling
Piracicaba 2019
Tese apresentada à Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Biologia Buco-Dental, na Área de Microbiologia e Imunologia.
Esse exemplar corresponde a versão final da tese defendida pela aluna Simone Nataly Busato de Feiria, e orientada pelo Prof. Dr. José Francisco Hofling.
Biblioteca da Faculdade de Odontologia de Piracicaba Marilene Girello - CRB 8/6159
Busato de Feiria, Simone Nataly,
B96b BusBioatividade de óleos essenciais de Mentha spp. sobre microrganismos orais / Simone Nataly Busato de Feiria. – Piracicaba, SP : [s.n.], 2019.
BusOrientador: José Francisco Hofling.
BusTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba.
Bus1. Plantas medicinais. 2. Mentha. 3. Óleos voláteis. 4. Micro-organismos. I. Hofling, José Francisco, 1947-. II. Universidade Estadual de Campinas.
Faculdade de Odontologia de Piracicaba. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Bioactivity of Mentha spp. essential oils against oral microorganisms Palavras-chave em inglês: Medicinal plants Mentha Oils, volatile Microorganisms
Área de concentração: Microbiologia e Imunologia Titulação: Doutora em Biologia Buco-Dental
Banca examinadora:
José Francisco Hofling [Orientador] Marcelo Fabiano Gomes Boriollo Cristiane Duque
Daniela Defávari do Nascimento Natália Leal Vizoto
Data de defesa: 30-08-2019
Programa de Pós-Graduação: Biologia Buco-Dental
Identificação e informações acadêmicas do(a) aluno(a)
- ORCID do autor: https://orcid.org/0000-0001-6200-9893 - Currículo Lattes do autor: http://lattes.cnpq.br/4977159018597840
Faculdade de Odontologia de Piracicaba
A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa de Tese de Doutorado, em sessão pública realizada em 30 de Agosto de 2019, considerou a candidata SIMONE NATALY BUSATO DE FEIRIA aprovada.
PROF. DR. JOSÉ FRANCISCO HOFLING
PROFª. DRª. CRISTIANE DUQUE
PROFª. DRª. DANIELA DEFÁVARI DO NASCIMENTO
PROF. DR. MARCELO FABIANO GOMES BORIOLLO
PROFª. DRª. NATÁLIA LEAL VIZOTO
A Ata da defesa, assinada pelos membros da Comissão Examinadora, consta no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa da Unidade.
Dedico esse trabalho à minha família, meu marido e minha filha, que me deram apoio e me incentivaram a progredir, me auxiliaram em todos os momentos que
precisei e estiveram do meu lado.
Dedico à minha Mãe e meu Pai, que me deram a oportunidade de ter acesso à educação de qualidade, que me respeitaram em minhas escolhas, me ensinaram
valores e confiaram nisso.
Em especial, dedico à minha filha, que é o incentivo para que eu possa estar em constante crescimento pessoal e profissional. Que tem me ensinado o quanto
À Deus por guiar minhas escolhas e iluminar meu caminho
À minha Família
Meu marido Marden, minha filha Mariana e meus Pais, Mélcia e Orlando, por me incentivarem em minhas escolhas, pelo amor e dedicação comigo. Vocês são
pessoas especiais e responsáveis pelo meu crescimento.
Ao meu orientador
José Francisco Höfling pela confiança, ensinamentos transmitidos e orientação docente.
Às minhas queridas amigas, Giovana Claudia Boni, Marcelle Marie Buso Ramos, Natália Leal Vizoto, Priscilla de Laet Santana, Thaís Rossini de Oliveira e Valéria
Alessandra Defavari Franco que tornaram meus dias mais alegres e pela amizade valiosa.
À Universidade Estadual de Campinas, através do Reitor Prof. Dr. Marcelo Knobel, e a Faculdade de Odontologia de Piracicaba, através do diretor Prof. Dr. Francisco Haiter Neto. Agradeço pelo zelo com a educação superior e pós-graduação no país e a oportunidade de estudar nesse centro de excelência em ensino, pesquisa e extensão.
Ao meu Orientador Prof. Dr. José Francisco Höfling, que me deu a oportunidade de ingressar no programa de pós-graduação, à confiança depositada em mim, à orientação, por todo o aprendizado adquirido e pela amizade valiosa.
Aos Professores da Área, Prof. Dra. Renata de Oliveira Mattos Graner e Prof. Dr. Rafael Nobrega Stipp e ao Prof. Dr. Marcelo Fabiano Gomes Boriollo, pesquisador colaborador da área, pelo aprendizado e conhecimento transmitido.
À Professora Mary Ann Foglio, pela disponibilidade, conhecimento transmitido e co-orientação.
Aos Professores Prof. Dr. Edgard Graner (Patologia Oral), Prof. Dr. Pedro Duarte Novaes (Morfologia), Prof. Dr. Pedro Luiz Rosalen e Prof. Dra. Janaína Orlandi Sardi pela autorização do uso das dependências dos laboratórios de outras áreas, e pela colaboração dada ao trabalho realizado.
Aos Professores que aceitaram compor a banca titular da defesa, Prof. Dra. Cristiane Duque, Prof. Dra. Daniela Defavari do Nascimento, Prof. Dra. Natália Leal Vizoto, Prof. Dr. Marcelo Fabiano Gomes Boriollo, por aceitarem compor a banca examinadora da tese.
Às Professoras Prof. Dra. Priscilla de Laet Santana e Prof. Dra. Marcelle Marie Buso-Ramos por aceitarem compor a banca examinadora suplente da tese.
Aos técnicos Valéria Alessandra Defavari Franco, técnica do Laboratório de Microbiologia e Imunologia, à Flávia Sammartino Mariano Rodrigues, técnica da Microscopia Eletrônica de Transmissão, ao Adriano Luis Martins, técnico da Microscopia Eletrônica de Varredura, ao Fábio Haach Téo, técnico da Patologia Oral, aos trabalhos desenvolvidos, pela convivência tranquila e pelo auxílio que me deram.
Eduardo Martinelli Franco, Felipe Joia, Flávia Camila Maia, Gayan Kanchana Wijesinghe, Geovanny Nilton Cuya Salvatierra, Giovana Claudia Boni, Hassan Naveed, Janaina Priscila Barbosa, Jeferson Junior da Silva, Lívia Araújo Alves, Marcelle Marie Buso Ramos, Mateus Cardoso Oliveira, Natália Leal Vizoto, Paula Cristina Anibal, Thaís Rossini de Oliveira, Vanessa da Silva Cardoso e Vítor Aragão Abreu de Freitas à convivência e conhecimento compartilhado.
Em especial agradeço às amigas e irmãs do coração, Giovana Claudia Boni, Marcelle Marie Buso Ramos, Natália Leal Vizoto, Priscilla de Laet Santana, Thaís Rossini de Oliveira e Valéria Alessandra Defavari Franco pelo companheirismo, amizade, conhecimento compartilhado e convivência, admiro vocês.
Ao CECI-FOP, coordenadora Milene, Professoras Paula, Joseane e Claúdia, estagiárias Fernanda, Sara, Camila e Larissa e à todos os funcionários da unidade pelo carinho com minha filha e pelo trabalho que realizam com as crianças de alunos e funcionários da FOP UNICAMP. O trabalho de vocês é essencial para o coração de uma mãe.
O presente trabalho foi realizado com o apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal de Nível Superior –Brasil (CAPES) – Código de Financiamento 001.
O presente trabalho foi realizado com apoio da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), processo nº 2015/10814-0 e 2018/02308-6.
A todos aos meus amigos que me apoiaram durante esse período, entenderam minha ausência e me incentivaram a buscar minha qualificação profissional.
A todos que direta ou indiretamente colaboraram com esse trabalho durante esses anos.
Introdução: Casos crescentes de microrganismos resistentes a antibióticos convencionais tem sido relatados na literatura, e estudos com Mentha spp. tem demonstrado potencial de ação antimicrobiana contra esses microrganismos. Objetivos: O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade antimicrobiana do óleo essencial de Mentha arvensis e Mentha piperita contra microrganismos orais e alguns de seus fatores de virulência. Métodos: Os óleos foram analisados por CG-EMS. A atividade microbiana foi determinada por microdiluição em caldo. Fatores de virulência como biofilme uniespécie e misto e a capacidade de formar hifas foram avaliados. Biofilmes de C. albicans foram analisados por MEV. A atividade morfológica dos óleos foi avaliada por citometria de fluxo e MET. A toxicidade foi testada pela atividade antiproliferativa de células Hacat e larvas de Galleria
mellonela. Resultados: Os principais compostos encontrados foram: isomentona,
mentona e mentol. Os óleos essenciais apresentaram atividade antifúngica contra todas as espécies de microrganismos testados. O biofilme de C. albicans apresentou redução de até 50% nas concentrações de 0,0156 - 16 mg/mL e os biofilmes mistos tratados com óleo, apresentaram diminuição da biomassa ou da atividade metabólica. As imagens de MEV mostraram murchamento celular. Os óleos essenciais apresentaram uma diminuição na formação de hifas em até 100%. A estrutura da levedura afetada pela ação do óleo foi a membrana citoplasmática, confirmada pelo MET. Os resultados da toxicidade mostraram uma viabilidade celular superior a 50% a 1 e 8 mg/mL para M. arvensis e M. Piperita, respectivamente. A toxicidade em Galleria mellonella mostrou DL50 de 13 e 25 mg/mL para M. arvensis e M. piperita, respectivamente. Os óleos essenciais de
Mentha spp. mostraram ação antimicrobiana, antibiofilme contra Candida spp. e
biofilmes mistos. Os óleos essenciais de Mentha spp. testados apresentaram baixa toxicidade.Conclusão: Estes resultados demonstram que os óleos essenciais de
Mentha spp. possuem ação efetiva contra bactérias e fungos da microbiota oral,
sugerindo ser um potencial antimicrobiano alternativo à terapias convencionais.
Palavras-chave: Plantas Medicinais, Mentha spp., óleos essenciais, microrganismos orais.
Introduction: Growing cases of resistant microorganisms have been reported in the literature and studies with Mentha spp. showed potential antimicrobial action against microorganisms. Aim: Thus, the aim of this study was to evaluate the antimicrobial activity of the essential oil of Mentha arvensis and Mentha piperita. against the structure of Candida spp. and some virulence factors. Methodology: The oils were analyzed by GC-MS. Microbial activity was determined by broth microdilution. Virulence factors by unispecies and mixed biofilm and the ability to form hyphae were evaluated. C. albicans biofilm were observed by SEM. The Candida cells structure was evaluated by flow cytometry and MET. Toxicity was analized by antiproliferative activity of Hacat cells and Galleria mellonella larvae. Results:The majority compounds were: isomentone, mentone and menthol. The assays tested antifungal activity against all species of microorganisms tested. C.
albicans biofilm showed 50% of reduction at concentrations of 0.0156 - 16 mg/mL
and mixed biofilms were decrease in mass or metabolic activity. As SEM images came cell wilting. The hyphae formation decrease by up to 100%. The yeast structure affected by the oil was the membrane revealed by MET. Toxicity results showed cell viability up to 50% at 1 and 8 mg / mL for M. arvensis and M. piperita, respectively. Galleria melonella toxicity resulted in DL50 of 13 and 25 mg/mL for M.
arvensis and M. piperita, respectively. Conclusion: The essential oils of Mentha
spp. show antimicrobial action against oral microorganisms, simple and mixed biofilms tested. A morphological structure affected by the oil is the cytoplasmic membrane. The essential oils of Mentha spp. tested showed low toxicity. The results of the experiments shown that Mentha essential oils can be a potential alternative therapy against Candida spp. and its virulence factors.
Keywords: Medicinal Plants; Mentha spp.; essential oils; oral microorganisms;
Figura1: Teste de inibição da formação de Hifas de Candida albicans em meio sólido após exposição aos óleos essenciais de Mentha spp.
Figura 2: Teste de inibição da formação de Hifas de Candida albicans em meio líquido após exposição aos óleos essenciais de Mentha spp..
Figura 3: Imagens adquiridas por microscopia eletrônica de transmissão de C.
albicans SC 5314 tratadas com Fluconazol.
Figura 4: Imagens adquiridas por microscopia eletrônica de transmissão de células de C. albicans SC 5314 do grupo controle e grupos de tratamentos com óleos essenciais de Mentha spp.
Figura 5: Gráfico referente às médias das absorbâncias de três experimentos independentes de atividade metabólica do biofilme em formação de C. albicans SC 5314 expostos em concentrações seriadas de óleos essenciais de Mentha spp., coradas com XTT.
Figura 6: Gráfico referente às médias das absorbâncias de três experimentos independentes de atividade metabólica do biofilme maduro de C. albicans SC 5314 expostos em concentrações seriadas de óleos essenciais de Mentha spp., coradas com XTT.
Figura 7: Gráfico referente às médias das absorbâncias da atividade metabólica do biofilme em formação de C. albicans SC 5314 tratados com os antifúngicos comerciais, coradas com XTT.
Figura 8: Gráfico referente às médias das absorbâncias da atividade metabólica do biofilme maduro de C. albicans SC 5314 tratados com os antifúngicos comerciais, coradas com XTT.
Figura 9: Imagens adquiridas por microscopia eletrônica de varredura de biofilme em formação de Candida albicans SC 5314 após exposição ao óleo essencial de
M. arvensis
Figura 10: Imagens adquiridas por microscopia eletrônica de varredura de biofilme em formação de Candida albicans SC 5314 após exposição ao óleo essencial de
Figura 12: Imagens adquiridas por microscopia eletrônica de varredura de biofilme maduro de C. albicans SC 5314 após exposição ao óleo essencial de M. piperita. Figura 13: Imagens tridimensionais adquiridas por microscópio confocal a laser de biofilme maduro de Candida albicans tratados com óleos essenciais por 24 horas. Figura 14: Imagens tridimensionais adquiridas por microscópio Confocal a laser de biofilme maduro de C. albicans tratados por 5 minutos com óleos essenciais de
Mentha spp.
Figura 15: Imagens tridimensionais adquiridas por microscópio Confocal a laser de biofilme maduro de C. albicans suplementados com SFB e tratados por 24 horas com óleos essenciais de Mentha spp.
Figura 16: Gráfico referente às médias das absorbâncias de biomassa do biofilme misto de Candida albicans e S. mutans, corados com CV (Cristal violeta). Tratamentos: Óleos essenciais de M. arvensis e M. piperita.
Figura 17: Gráfico referente às médias das absorbâncias de atividade metabólica do biofilme misto de Candida albicans e S. aureus, corados com XTT. Tratamentos: Óleos essenciais de M. arvensis e M. piperita.
Figura 18: Gráfico referente às médias das absorbâncias da atividade antiproliferativa de células HaCat, coradas com SRB. Tratamentos: Óleos essenciais de M. arvensis e M. piperita.
Figura 19: Gráfico referente ao ensaio de toxicidade in vivo com Galleria mellonella
após tratamento com óleo essencial de Mentha arvensis.
Figura 20: Gráfico referente ao ensaio de toxicidade in vivo com Galleria mellonella
Tabela 1. Compostos encontrados no óleo essencial de Mentha arvensis a partir de análise de CG (Cromatografia Gasosa).
Tabela 2. Compostos encontrados no óleo essencial de Mentha arvensis a partir de análise de CG (Cromatografia Gasosa).
Tabela 3. Perfil de sensibilidade das cepas de Candida spp. quando expostas aos óleos essenciais e ao antifúngico padrão Fluconazol.
Tabela 4. Perfil de sensibilidade das cepas de Streptococcus spp. quando expostas aos óleos essenciais de Mentha spp. e à Clorexidina.
Tabela 5. Teste de formação de tubo germinativo de Candida albicans SC 5314 quando expostas aos óleos essenciais de Mentha spp.
Tabela 6. Eventos adquiridos por Citometria de Fluxo de células de Candida
albicans após exposição aos óleos essenciais de Mentha spp. e expostas à
corantes.
Tabela 7: Dados capturados por microscopia confocal a laser das porcentagens de células vivas/mortas dos biofilmes maduros de Candida albicans tratados por 24 horas com óleos essenciais de Mentha spp..
Tabela 8: Dados capturados por microscopia confocal a laser das porcentagens de células vivas/mortas dos biofilmes maduros de Candida albicans tratados por 5 minutos com óleos essenciais de Mentha spp.
Tabela 9: Dados capturados por microscopia confocal a laser das porcentagens de células vivas/mortas dos biofilmes maduros de Candida albicans suplementados com SFB e tratados por 24 horas com óleos essenciais de Mentha spp..
AIDS- Acquired Immunodeficiency Syndrome ATCC- American Type Culture Collection BHI- Brain Heart Infusion
BOD-Biochemical Oxygen Demand
CBS- Centraal Bureau voor Schimmelcutures
CG/EM- Cromatografia gasosa com detector de espectrometria de massas CIM- Concentração Inibitória Mínima
CLSI- Clinical Laboratorial Standart Investigation
CPQBA- Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas CV- Cristal violeta
DMSO- Dimetil sulfóxido DO-Densidade Óptica DL50- Dose Letal 50%
DHR-1,2,3- Dihydrorhodamine 123
DiOC6 (3)- 3,3'-Dihexyloxacarbocyanine iodide FDA- Food and Drug Administration
FL- Fluorescence Intensity IP: Iodeto de Propídeo
IZ-Instituto Zimotécnico-ESALQ/USP
MET- Microscópio Eletrônico de Transmissão MEV- Microscópio Eletrônico de Varredura MRSA- Meticilina resistente
PBS- Phosphate Buffered Saline
RENISUS- Relação Nacional de Plantas Medicinais de Interesse ao Sistema Único de Saúde
RPMI–1640 Meio de cultura desenvolvido por Roswell Park Memorial Institute ROS: Reativos de Oxigênio
SAP- Secreted Aspartyl Proteinase SDA- Sabouraud Dextrose Agar SFB- Soro Fetal Bovino
SUB Biofilme: A concentração igual ou abaixo 50% de morte do biofilme SUS- Sistema Único de Saúde
TCA- Ácido tricloroacético UV- Ultravioleta
UFC- Unidade Formadora de Colônia YPD-Yeast Peptone Dextrose
XTT-2,3-Bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide inner salt
1 INTRODUÇÃO 17 2 REVISÃO DA LITERATURA 19 3 PROPOSIÇÃO 29 4 MATERIAL E MÉTODOS 31 5 RESULTADOS 41 6 DISCUSSÃO 63 7 CONCLUSÃO 72 REFERÊNCIAS 74 ANEXOS 83
ANEXO 1 – CERTIFICADO DO COMITÊ DE ÉTICA 83
ANEXO 2 - RECEITA DO TAMPÃO DE SORENSEN 84
ANEXO 3 – RECEITA DO FIXADOR KARNOVSKY 85
ANEXO 4 – RECEITA DA RESINA DR SPURR 86
ANEXO 5 – SOLUÇÕES DE CONTRASTE 87
ANEXO 6 – PREPARO DA SOLUÇÃO DE TETRÓXIDO DE ÓSMIO 89
ANEXO 7 – COMPOSIÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA UTILIZADOS 90
1 Introdução
O uso das plantas como recurso terapêutico no tratamento de enfermidades, é conhecido milenarmente sendo utilizado até hoje. Nas últimas décadas, houve um grande avanço nos estudos envolvendo a temática, permitindo a comprovação científica da atividade medicinal de espécies vegetais (Santos et al., 2009; Oliveira et al., 2007). Nesse contexto, vale à pena ressaltar que os estudos envolvendo o uso das plantas medicinais e ação fitoterápica, já contribuíram para a obtenção de vários fármacos utilizados na medicina tradicional (Veiga Jr et al., 2008).
Nos últimos anos, estudos que envolvem a área de comprovação de plantas medicinais têm sido estimulados pelo Ministério da Saúde, com programas de incentivo junto às unidades básicas de saúde do país. Na área microbiológica, estudos mostram que óleos e extratos obtidos através de diversas plantas aromáticas se mostram eficientes no controle microbiano, entre eles os que colonizam a cavidade bucal (Duarte et al., 2005; Cecanho et al., 1999). Assim, as propriedades antimicrobianas, antifúngicas e anti-inflamatórias de substâncias encontradas em extratos e óleos essenciais produzidos pelas plantas através de seu metabolismo secundário, têm sido comprovadas cientificamente em estudos realizados em diversos países (Duarte et al., 2005; Michelin et al., 2005; Oliveira et al., 2007). Apesar da grande diversidade de antimicrobianos existentes, estudos têm sido encaminhados na busca de alternativas capazes de apresentar maior espectro de ação, menor indício de resistência microbiana e menor toxicidade para o hospedeiro (Alvarenga et al., 2007). Na literatura há uma série de extratos de plantas e óleos essenciais que demonstraram atividade antibacteriana e antifúngica in vitro, incluindo atividade contra microrganismos resistentes a antimicrobianos convencionais, o que justifica mais pesquisas acerca de suas atividades e mecanismos de ação.
A cavidade oral é o segundo microbioma do corpo humano com maior diversidade de espécies. É um habitat que apresenta peculiaridades como diferentes superfícies e condições atmosféricas. Os microrganismos encontrados nessa região corporal podem variar de acordo com a dieta do hospedeiro e sua higienização, e é revestido com microrganismos que coabitam, compartilhando nichos e desenvolvendo uma relação de simbiose. Sendo assim, a ecologia do ambiente oral é complexa e pode ser formada por bactérias, fungos, vírus, archae e protozoários. Os principais gêneros encontrados de bactérias são: Streptococcus, Actinomyces, Bifidobacterium,
predominantes na região oral são Candida spp. Geralmente, o crescimento microbiano in loco ocorre na forma de biofilmes, comunidades multiespécies tridimensionais envoltas por uma matriz extracelular. A promoção da saúde está intimamente relacionada com o equilíbrio de todos os microbiomas corporais, sendo essas comunidades responsáveis por funções fisiológicas, diferenciação e maturação de células e tecidos do hospedeiro, bem como do sistema imunológico (Deo & Deshmukh, 2019).
Muitos enxaguatórios e dentifrícios encontrados hoje no mercado possuem extratos vegetais em sua composição, proporcionando um melhor controle dos microrganismos e sabor agradável para esses produtos. A área da fitoterapia e uso das plantas como prática integrativa e complementar à saúde bucal foi recentemente reconhecida pelo Conselho Federal de Odontologia (CFO), um passo importante na atuação do cirurgião dentista em uma área ainda pouco explorada pelos profissionais (Assis, 2009; Oliveira et al., 2007). A literatura mostra que alguns óleos e extratos obtidos através de algumas espécies de plantas aromáticas e medicinais se mostram eficientes no controle antimicrobiano, entre eles os que colonizam a cavidade bucal (Duarte et al., 2004; Cecanho et al., 1999).
Nesse contexto, uma das plantas citadas como medicinal na literatura é a
Mentha spp., conhecida popularmente como hortelã. Planta frequentemente citada
como antimicrobiana e anti-inflamatória em estudos etnobotânicos e etnofarmacológicos. De sabor agradável e reconhecida pela RENISUS (Relação Nacional de Plantas Medicinais de Interesse ao Sistema Único de Saúde- Ministério da Saúde) é uma planta de grande interesse industrial e econômico, devido a sua produção de mentol (Lorenzi & Matos, 2013).
Devido aos casos de infecções microbianas, tanto fúngicas quanto bacterianas, muitos antimicrobianos convencionais foram utilizados com maior frequência, selecionando microrganismos resistentes e dificultando o controle dos mesmos, o que tem se tornado um dos maiores desafios no tratamento das doenças (Yang et al., 2013; Saharkhiz et al., 2012; Kunamoto et al., 2002; Jewtuchowicz et al., 2007).
Assim, um dos objetivos mais promissores envolvendo o estudo sobre plantas, em especial com potencial medicinal, é o de encontrar princípios ativos ou substâncias eficazes na descoberta de novas drogas antimicrobianas, que atuem no controle fungicida ou fungistático desses microrganismos, e que possam ser utilizados
sozinhos ou em associação (coadjuvantes) no tratamento quimioterápico de doenças infecciosas ou que diminuam fatores de virulência desses microrganismos, sem danos ao hospedeiro.
2 Revisão de Literatura
2.1 Microrganismos orais e sua interação
A cavidade oral é considerada um ambiente ecológico complexo com diferentes estruturas anatômicas e teciduais que permitem a colonização de microrganismos diversos. Esses diferentes habitats possuem características atmosféricas, nutricionais, de retentividade, lisura e exposição aos fluidos corporais distintas, o que confere a esse ambiente diferentes reservatórios para os microrganismos (Deo & Deshmukh, 2019).
Estudos microbiológicos desse habitat, revelam que nesse ambiente corporal existam cerca de 700 espécies ou filotipos diferentes. Além de ser um ambiente que permite a sobrevivência de diferentes tipos de microrganismos, ainda é um lugar de passagem de alimentos, o que permite que microrganismos transitem pelo ambiente, permitindo a colonização de microrganismos pré-selecionados pela dieta (Ghannoum et al., 2010; Dewhirst et al., 2010).
O microbioma, comunidade de microrganismos encontrado na região oral são compostos por bactérias, fungos, vírus, archae e protozoários. Os principais gêneros de bactérias encontradas são: Abiotropha, Peptostreptoscoccus,
Streptococcus, Stomatococcus, Actinomyces, Bifidobacterium, Corynebacterium, Eubacterium, Lactobacillus, Propionebacterium, Moxarella, Neisseria,Veillonella,
Campylobacter, Fusobacterium, Prevotella, Hemophilus, Selemonas e Treponema.
As principais espécies de fungos estudadas da cavidade oral são: Candida,
Cladosporium, Aureobasidium, Saccharomycetales, Aspergillus, Fusarium e Cryptococcus (Marsh, 2009; Sharma et al., 2014).
Esse ecossistema, desempenha um papel fundamental na homeostase da cavidade oral, favorecendo funções críticas como maturação das células da região e do sistema imunológico (Welch et al., 2016).
Assim, a colonização bucal é composta por uma diversa microbiota, permitindo diferentes interações entre esses microrganismos. Geralmente esses microrganismos são encontrados como biofilmes, que são exemplos de coagregação
de microrganismos multiespécies, originando a formação de microambientes próprios, promovendo uma relação simbiótica entre os microrganismos que os compõe. Entre as espécies de microrganismos que colonizam a cavidade oral estão: as bactérias do grupo estreptococos e leveduras do gênero Candida. A espécie Streptococcus mutans é o principal agente do biofilme cariogênico (Kreth et al., 2005), Entretanto, S.
mutans e C. albicans desenvolvem uma relação simbiótica e a presença da C. albicans em biofilmes mistos aumenta a virulência de biofilmes bacterianos formados
nas superfícies dos dentes (Falsetta et al., 2014)
O grupo dos Streptococcus orais presentes tanto em mucosas como em biofilmes dentários, tem como seus principais colonizadores S. gordonii, S. oralis, S.
mitis, S. sanguinis e S. mutans, sendo queessa última espécie possui capacidade de
acidificação do ambiente (Kreth et al., 2005). O biofilme dental, estrutura tridimensional e multimicrobiana, composta a partir da interação de microrganismos como leveduras e bactérias, favorece a sobrevivência dos microrganismos que o compõe, permitindo o escape ao sistema imune, troca de moléculas quorum sensing, material genético extracelular, resistência a agentes químicos e físicos, transferência horizontal de genes e expressão de genes que favorecem a sobrevivência entre eles (Kreth et al., 2005).
Sendo assim, as espécies de Candida albicans e bactérias do grupo dos
Streptococcus orais são conhecidos por interagirem fisicamente, permitindo a adesão
de ambas as espécies e por interações de quorum sensing, permitindo troca de moléculas químicas que podem regular a expressão gênica relacionados a virulência e resistência (Chen et al., 2016; Metwalli et al., 2013; Bamford et al., 2009).
2.2 Candida spp.
As leveduras do gênero Candida pertencem ao Reino Funghi, Filo Ascomycota, Classe Saccharomycetes, Ordem Saccharomycetales, Família Sacchamycetaceae (Guarro et al., 1999). Entre as espécies conhecidas do gênero, se
destacam por sua importância clínica as espécies: C. albicans, C. parapsilosis, C.
tropicalis, C. glabrata, C. krusei, C. guilliermondii, C. lusitaniae, C. dubliniensis, C. rugosa e C. utilis (Peixoto et al., 2016; Barbedo & Sgarbi, 2010; Colombo &
Guimarães, 2003).
Esse gênero de leveduras é pertencente à microbiota do ser humano, sendo encontradas principalmente em mucosas, adquiridas já nas primeiras horas de
vida. Esses microrganismos vivem em equilíbrio simbiôntico com o hospedeiro, não ocasionando doença em indivíduos sadios. No entanto, esses microrganismos são considerados patógenos oportunistas por causarem infecções em seus hospedeiros em casos de imunodepressão, desequilíbrio da microbiota local ou quebra da homeostase do sistema imunológico do paciente. Alguns fatores que aumentam a predisposição de infecções por esse agente etiológico são: doenças imunossupressoras como AIDS e doenças autoimunes, aumento de terapias quimioterápicas, aumento do uso de antimicrobianos, idade avançada e neonatos. Desequilíbrios da homeostase corporal podem ocasionar a queda do sistema imunológico, promovendo manifestações agressivas de espécies de Candida, fazendo com que elas se tornem patogênicas (Barbedo & Sgarbi, 2010).
As espécies mais patogênicas de Candida spp. são: C. auris e C. albicans.
Outras espécies como C. parapsilosis, C. tropicalis, C. glabrata, C. krusei, C. guilliermondii e C. lusitaniae também se destacam entre as mais estudadas com
interesse clínico (Naves et al., 2013; Montero et al., 2012)
A Candida albicans é o agente etiológico de maior ocorrência nos casos de infecções fúngicas, associadas em até 50% das vezes a essas infecções (Montero et al., 2012; Péman et al., 2012; Quindós, 2014). Entre as infecções mais preocupantes, se encontra a candidemia, quando o fungo consegue acessar o tecido sanguíneo, podendo ser disseminado para o restante do organismo. Esse tipo de infecção costuma ter uma taxa de mortalidade muito alta (em torno de 70%), demonstrando uma preocupação clínica médica. A prevalência de determinadas espécies de
Candida para esse tipo de infecção varia conforme a área geográfica e está
relacionada com a frequência de utilização de antifúngicos como equinocandinas e fluconazol. Em nível global, a Candida albicans se encontra como a espécie principal encontrada em casos de Candidemia. Porém, sabe-se que houve na última década o aumento de Candidemia não albicans. No noroeste da Europa e nos EUA a segunda espécie mais comum encontrada é a C. glabrata. Na América Latina, Europa do Sul, Índia e Paquistão é C. parapsilosis e C. tropicalis; A espécie C. krusei é a menos comum das cinco principais de Candida, porém é com frequência encontrada em pacientes com neoplasias hematológicas. A preocupação mundial hoje é o aparecimento de infecções ocasionadas por C. auris. Essa foi isolada pela primeira vez em 2009, no Japão. Associada a uma alta taxa de mortalidade por infecções fúngicas, em torno de 30-72%, esse agente etiológico é considerado uma espécie
multirresistente de fungo (MDR) e seu aparecimento é temido entre os casos clínicos (Lone & Ahmad, 2019).
Candida spp. possui capacidade de se adaptar e se proliferar com
facilidade ao ambiente do corpo humano, demonstrando uma série de fatores de virulência que permite a sobrevivência desse microrganismo no ambiente em que se encontra. Essa habilidade está relacionada com sua capacidade de transição morfológica, produção de proteínas, formação de biofilme e capacidade de comunicação (quorum-sensing) (Tsang et al., 2012). Essas características têm sido demonstradas em cepas associadas com a patogênese (Marsh & Martin, 2005; Coutinho, 2009; Shareck et al., 2011; Braga et al., 2007; Cottier & Mühlschlegel, 2009; Jacobsen et al., 2012).
2.2.1 Mecanismos de Virulência associados às espécies de Candida
2.2.1.1 Dimorfismo
Algumas espécies de Candida são capazes de apresentar transições morfológicas de levedura para hifa ou pseudo-hifa. O formato de levedura (arredondado) está associado com a disseminação do fungo, enquanto que a morfologia de hifa ou pseudohifas, são células mais alongadas, podendo ser encontradas na norma de pseudo-hifas (com constrições) e na forma de hifas (sem constrições), associada com a invasão tecidual (Sudbery, 2011; Jacobsen et al., 2012; Naves et al., 2013; Mayer et al., 2013). Os fatores ambientais que favorecem essa transição morfológica são: mudança de pH, ou pH elevado, maior que 7; exposição ao soro fisiológico; e presença de níveis de CO2 (Gow et al., 2012; Vylcova et al., 2011; Jacobsen et al., 2012). Candida albicans tem a capacidade de apresentar esse fator de virulência de forma mais acentuada, agressiva, mas C. krusei, C. tropicalis e
C. parapsilosis também exibem a capacidade de formar pseudo-hifas, e C. dubliniensis de formar tubos germinativos (Asbeck et al., 2009; Barbedo & Sgarbi,
2010; Gutiérrez et al., 2002).
2.2.1.2 Produção de Proteínas
Espécies de Candida exibem a capacidade de produzir proteínas que
promovem adesão ao tecido do hospedeiro ou entre si, na forma de biofilme (Park et al., 2005).
2.2.1.3 Quorum sensing
O Quorum sensing é um mecanismo de comunicação química entre as células microbianas. Espécies de Candida possuem a capacidade de se comunicar através de farnesol, tirosol e dodecol, que podem regular a expressão de genes importantes de sobrevivência e fatores de virulência (Jacobsen et al., 2012; Santana et al., 2013; Cottier & Mühkschlegel, 2009; Mayer et al., 2013; Hogan & Sundstron, 2009).
2.2.1.4 Formação de Biofilme
A capacidade de formar biofilmes é um importante fator de virulência. O biofilme é considerado um agregado de microrganismos, geralmente multiespécies, envoltos por uma matriz extracelular. Essa estrutura tridimensional permite que as células fiquem mais protegidas, aumentando a capacidade de ser mais resistente a agentes antimicrobianos, devido à dificuldade de penetração na matriz extracelular, e a ação do sistema imunológico, além de permitir o aumento da expressão gênica de mecanismos de resistência a antifúngicos e favorecer o quorum sensing, comunicação entre as células (Santana et al., 2013). É importante ressaltar que quando as células estão em um biofilme, elas podem expressar muitos fatores de virulência ao mesmo tempo. No caso de biofilmes de Candida, as células se encontram em quase sua totalidade na forma de hifas, expressando proteínas de adesão e se comunicando por
quorum sensing (Larkin et al., 2017).
2.3 Plantas medicinais e a possibilidade de novas alternativas terapêuticas
Os usos das plantas como terapia no tratamento de saúde desempenham um papel importante no desenvolvimento de fármacos, já que muitos medicamentos comerciais conhecidos hoje são derivados de produtos naturais, como por exemplo, vinblastina, vincristina, paclitaxel, cromolyn, galegina (modelo para a síntese de metformina), bisguanidina, papaverina (verapamil), morfina, codeína, quinino, reserpina, efedrina, salbutamol, salmetrol, entre outros, utilizados para diversas finalidades. De acordo com um levantamento de compostos derivados de plantas
utilizados como fármacos feito pela OMS, foi indicado que, de 122 compostos identificados, 80% foram utilizados para fins terapêuticos, demonstrandoque ainda há muito o que se estudar sobre as plantas medicinais (Cragg & Newman, 2013).
Como dito anteriormente, o uso de plantas medicinais é amplamente difundido, e encontra-se em expansão pelo mundo (WHO, 2004). Desde 1978, a Organização Mundial da Saúde já reconhece o uso de fitoterápicos como uma prática no tratamento da saúde, surgindo nessa mesma época no Brasil a primeira portaria acerca da política de plantas medicinais e fitoterápicos, que em seu item 2.4.3, define o estudo das plantas medicinais como uma das prioridades de investigação clínica (Farmacopéia Brasileira, 2005).
No Brasil, estudos que envolvem a área de comprovação de plantas medicinais são de grande importância, principalmente pela valorização do uso das mesmas, incentivada pelo Ministério da Saúde, com programas de incentivo junto às unidades básicas de saúde do país, com a implementação da Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos e da Política Nacional de Práticas Integrativas e Complementares no Sistema Único de Saúde (SUS), ambas destinadas a garantir, aos usuários do Sistema Único de Saúde (SUS), opções ampliadas de tratamento à saúde e acesso a plantas medicinais e produtos fitoterápicos com eficácia, qualidade e segurança. (Ministério da Saúde, 2006, Balbino & Dias, 2010).
A resistência de microrganismos contra drogas antimicrobianas está rapidamente se tornando um grande problema de saúde pública, especialmente quando se trata de infecções em pacientes imunocomprometidos. Apesar da gama de antimicrobianos disponíveis comercialmente, microrganismos como Staphylococcus
aureus MRSA (meticilina resistente) tem desenvolvido estratégias moleculares para a
expressão de resistência às drogas já existentes, dificultando o tratamento e levando muitos pacientes a óbito. Portanto, novos métodos para controle de infecções microbianas têm se tornado necessários (Klevens et al., 2007).
A sensibilidade aos agentes antifúngicos administrados em pacientes com infecções causadas por Candida spp., também podem variar de acordo com a espécie encontrada. Apesar da maior parte das Candida spp. serem sensíveis aos antifúngicos tradicionais, os tratamentos prolongados ou intermitentes com esses medicamentos podem selecionar os colonizadores locais. A Candida glabrata e Candida krusei apresentam resistência natural ao Fluconazol e a Candida parapsilosis, tem
demonstrado baixa sensibilidade a caspofungina (Pfaller, 2012; Singh-Bahak et al., 2012)
Em decorrência dos dados encontrados na literatura sobre o aumento da resistência à antimicrobianos, novas abordagens têm sido relatadas no controle desses microrganismos, como por exemplo o uso de substâncias vegetais. As plantas são consideradas fontes pouco exploradas ainda para o desenvolvimento de produtos comerciais. Acredita-se que cerca de 10% das plantas foram estudadas até agora como compostos antimicrobianos (Savoia, 2012; Cragg & Newman, 2013).
Os compostos vegetais derivados do metabolismo secundário de plantas são divididos em flavonóides, terpenos, alcalóides, fenólicos, polifenóis e cumarinas. Acredita-se que os flavonóides, devido a sua natureza química e posição dos anéis, agem formando complexos com proteínas extracelulares, solúveis e membranas bacterianas. Os alcaloides, devido a sua alta permeabilidade às membranas plasmáticas, se acumulam no interior da célula, intercalando o DNA, impedindo transcrição de genes que são alvos da RNA polimerase. Os terpenos são citados por possuir forte ação na atividade contra microrganismos, agindo, de forma ainda não elucidada, na ruptura das membranas por compostos lipofílicos. Os Fenólicos e polifenois possuem propriedades potenciais antioxidantes, e agem em envelopes bacterianos, mais especificamente na parede celular. Outros podem se ligar a proteínas e enzimas do metabolismo bacteriano, alterando suas funções e levando a morte dos patógenos (Savoia, 2012).
Na literatura há uma série de extratos de plantas e óleos essenciais que demonstraram atividade antifúngica e antibacteriana in vitro, sendo necessárias mais pesquisas acerca de suas atividades in vivo, assim como outros efeitos celulares potencialmente presentes em extratos e óleos essenciais. Em vista disso, pesquisas com plantas medicinais, em especial a Mentha spp., tem contribuído para a descoberta de novos compostos ou componentes bioativos com potencial antimicrobiano.
De acordo com os dados encontrados na literatura, o uso de bioprodutos e moléculas naturais derivadas de plantas podem ser um importante aliado no controle de muitos microrganismos. As ações desses produtos podem não ser somente no controle de crescimento destes, mas também na diminuição dos seus fatores de virulência, ou como coadjuvantes na ação dos antifúngicos tradicionais (Nikoomanesh et al., 2019). Estudos apontam que óleos essenciais e outros compostos vegetais
agem em biofilmes microbianos, um importante fator de virulência de fungos e bactérias (Cobrado et al., 2012; Savoia, 2012). Existem estudos mostrando a atividade na diminuição de formação de hifas em Candida albicans (Boni et al., 2016). Outros fenólicos são citados como produtos que agem em bombas de efluxo, diminuindo a resistência de algumas espécies de bactérias (Cherigo et al., 2008; Savoia, 2012). Outras, como as furanonas (derivado de alga marinha) e extratos de própolis, pimentão, broto de feijão, camomila e alho, agem interferindo no mecanismo de
quorum sensing de bactérias (Rasmussen et al., 2005, Savoia, 2012).
Sendo assim, as plantas são fontes de inúmeros compostos como flavonóides, alcalóides, taninos e terpenóides, citados por apresentarem propriedades antimicrobianas ou contra algum fator de virulência que possa amenizar os sintomas de doenças infecciosas, podendo serem usados como alternativas na prevenção e tratamento de infecções, associado a antibacterianos comerciais (sinergismo) e desenvolvimento de compostos alternativos e complementares que possam auxiliar na terapêutica dessas doenças (Rodrigues et al., 2014). O desenvolvimento de pesquisas sobre atividade antimicrobiana de plantas para a produção de novos medicamentos que visam à redução de efeitos colaterais e da resistência dos microrganismos é uma tendência mundial (Al-Mariri, 2013). Estudos com plantas medicinais objetivam a busca de novas drogas capazes de apresentar maior espectro de ação, menor índice de resistência e menor toxicidade (Alvarenga et al., 2007, Sardi et al., 2013). Em vista disso, pesquisas com espécies vegetais, tem contribuído para a descoberta de novos compostos antimicrobianos que serão de grande importância em decorrência dos inúmeros casos relatados de resistência a alguns fármacos (Sartorato et al., 2004).
2.4 Mentha spp. e suas propriedades terapêuticas
Plantas do gênero Mentha são conhecidas popularmente por suas propriedades terapêuticas e são utilizadas milenarmente. Esse gênero pertencente à família Lamiaceae e compreende em torno de 30 espécies reconhecidas mundialmente. São plantas de fácil cultivo e adaptadas a diferentes condições agro-climáticas. São plantas que atingem até 60 cm de altura, herbáceas e perenes. Suas folhas possuem tricomas glandulares, produtores de óleos essenciais, derivados de seu metabolismo secundário. Entre as espécies mais conhecidas desse gênero estão: M. arvensis, M. aquática, M. citrata, M. longifólia, M. piperita, M. pulegium, M.
rotundifolia e M. spicata (Lorenzi & Mattos, 2008; Deschamps et al., 2008; Horky et
al., 2019).
As características fenotípicas e bioquímicas de Mentha spp. podem variar de acordo com a espécie, sendo que os compostos encontrados em suas partes e derivados do metabolismo secundário, como os óleos essenciais, podem ser influenciados por condições agroclimáticas, sazonalidade, idade da planta, região geográfica, altitude, ritmo circadiano, temperatura, disponibilidade hídrica, disponibilidade de nutrientes, poluição atmosférica, época de floração, herbivoria, e incidência de raios UV (Deschamps et al., 2008; Gobbo Neto & Lopes, 2007, Horky et al., 2019, Busato de Feiria et al., 2016).
Mentha spp. são consideradas plantas aromáticas devido ao seu odor e
sabor agradável, proporcionados por compostos presentes na planta. Esse gênero é muito utilizado na indústria alimentícia e farmacêutica como agente aromatizante e saborizante, se tornando plantas de grande interesse econômico devido a sua produção de óleos essenciais. O Mentol, composto terpênico, é o principal composto de interesse comercial dessa planta, sendo utilizado por vários setores da indústria, como alimentícia, farmacêutica, cosmética e agronômica (Deschamps et al., 2007; Grulova et al., 2015, Horky et al., 2019; Busato de Feiria et al., 2016)
Óleos essenciais são misturas complexas de compostos químicos produzidos pelo metabolismo secundário das plantas e são produzidos em baixas quantidades pela mesma. A hortelã pimenta (Mentha piperita) produz em torno de 0,1-1% de óleo essencial volátil e essa quantidade pode variar de acordo com a época do ano e outros fatores. Entre os compostos mais encontrados nas espécies de Mentha estão o mentol (em torno de 50%), mentona (31%), mentofurano e acetato de mentila (10%) (Kamatou et al., 2013; Abbaszadeh et al., 2014; Singh et al., 2015)
Entre suas propriedades terapêuticas são citados tratamentos populares para febre, distúrbios digestivos, problemas respiratórios, broncodilatadores e carminativas. As atividades biológicas citadas na literatura incluem atividades antimicrobianas, antioxidantes, anti-inflamatórias, antiviral e antialérgica (Horky et al., 2019). Indicações populares de uso, facilitam na busca direcionada para o desenvolvimento de estudos científicos que comprovem o uso empírico de produtos naturais.
A dez anos atrás o programa nacional de plantas medicinais e fitoterápicos teve como objetivo implementar e regulamentar o uso seguro de plantas medicinais e
fitoterapia no Sistema Único de Saúde. Em 2009, o ministério da saúde divulgou uma lista com 71 espécies vegetais com indicações de uso (RENISUS), incentivando o estudo científico para a busca de confirmação científica de toxicidade, segurança e eficácia de uso. A Mentha piperita é uma das espécies incluídas na lista do RENISUS, mostrando seu potencial terapêutico (RENISUS-MS, 2019). Além da importância nacional da planta do presente estudo em âmbito nacional, a FDA (Food and Drug
Administration) considerou a planta segura para consumo (Chrysargyris et al., 2017).
Entre os estudos mais encontrados na literatura com plantas do gênero
Mentha, estão estudos que envolvem atividades anti-inflamatórias e antibacterianas,
sendo que as concentrações de inibição são variáveis, isso possivelmente ocorre devido à complexidade de produção do óleo essencial e esse fator ser diretamente influenciado por alterações ambientais e agro-climáticas (Horky et al., 2019; Hussain et al.,2010; Busato de Feiria et al., 2016).
Estudos de Singh et al. (2011) mostraram atividade contra S. aureus, S.
pyogenes, E. coli e K. pneumoniae, demonstrando que o óleo essencial e diferentes
tipos de extratos vegetais, produzem efeito antibacteriano não seletivo para Gram positivos e negativos. O mesmo estudo também mostrou que Mentha piperita exibe capacidade de eliminação de radicais livres pelo teste de DPPH, apresentando atividade antioxidante.
Heydari et al. (2018), mostraram que óleos essenciais de Mentha piperita e
M. arvensis apresentam atividade antibacteriana contra Bacillus subtilis, B. cereus, S. aureus e S. epidermidis, sugerindo uma atividade mais forte de M. piperita.
Outros autores como Snoussi et al. (2015) mostram que não somente a atividade antimicrobiana é importante, mas também a atividade contra mecanismos de virulência, como formação de biofilme e anti-quorum sensing. Os autores mostraram clara ação anti-bacteriana contra espécies de Vibrio em concentração baixas para S. spicata.
Bouyahya et al. (2017) mostraram ação antibacteriana contra S. aureus, P.
aeruginosa, B. subtilis, P. mirabilis e E. coli, sugerindo que os microrganismos Gram
negativos são mais resistentes à ação do óleo essencial do que as bactérias Gram positivas.
Além de atividade contra bactérias, os óleos essenciais se mostram ativos contra fungos do gênero Candida. Segundo Córdoba et al. (2019) o óleo essencial de
testadas. (MIC 90). Piras et al. (2019) testaram atividade contra a formação de tubos germinativos de Candida albicans e mostraram que os óleos essenciais de M. spicata e M. pulegium exibiram ação contra a formação desse mecanismo de virulência em concentrações baixas, se comparado à CIM dos óleos (Concentração inibitória mínima). Outros estudos como o de Benzaid et al. (2019) mostram que o óleo essencial de Mentha piperita é ativo contra biofilmes em formação e maduro de C.
albicans, além de diminuir a expressão de genes envolvidos na produção de proteínas
SAP e HWP1, responsáveis por codificar proteínas aspartil proteinases e formação de hifas, responsáveis pela adesão do fungo e formação de biofilmes.
Outros estudos indicaram óleos essenciais de espécies de Mentha spp., como importantes no controle de crescimento de Candida spp. Santos et al. (2012) relataram atividade anti-Candida contra as espécies C. tropicalis, C. krusei e C.
albicans. Duarte et al. (2005) mostraram atividade contra a formação de biofilme de C. albicans.
Além de fungos unicelulares, espécies de Mentha também exibiram atividade contra fungos filamentosos, como demonstrado por Dukic et al. (2003) em
T. mentagrophytes, T. rubrum, T. tonsurans, M. canis e E. flocosum.
Na literatura foram encontrados vários artigos relatando a ação antimicrobiana de Mentha spp. Entre as espécies de Mentha mais citadas está a
Mentha piperita. A ação antimicrobiana de Mentha spp. está relacionada, muito
provavelmente, com a presença de terpenóides em sua composição, e é sugerido que as ações sinérgicas desses componentes existentes no óleo essencial promovam a ação antifúngica em menor concentração que os compostos isolados da Mentha spp. (Garzoli et al., 2015; Stringaro et al., 2018).
Os artigos encontrados na literatura relatando a ação antimicrobiana de extratos e óleos essenciais de Mentha contra microrganismos Gram positivos e negativos, fungos unicelulares e pluricelulares, mostram que essa espécie tem potencial no desenvolvimento de produtos que possam, não somente inibir o crescimento dos microrganismos, mas também, diminuir a expressão de seus fatores de virulência (Bardaweel et al., 2018; Trevisan et al., 2017; Mamadalieva et al., 2017).
3 PROPOSIÇÃO
O Objetivo geral desse trabalho foi investigar a ação antimicrobiana e o efeito biológico de óleos essenciais: Mentha arvensis e Mentha piperita sobre
microrganismos orais e espécies de Candida. Para isso os objetivos específicos desse trabalho incluíram:
1) Avaliar a composição dos óleos essenciais obtidos comercialmente através de Cromatografia Gasosa com detector de Espectrometria de Massas (EMS) acoplado;
2) Detectar a atividade antimicrobiana in vitro dos óleos essenciais (CIM -Concentração Inibitória Mínima e CMM - -Concentração Microbicida Mínima) dos óleos essenciais Mentha arvensis e Mentha piperita em Candida spp. e Streptococcus spp.;
3) Avaliar da influência dos óleos essenciais sobre a produção de tubos germinativos quantitativamente, após exposição das leveduras aos óleos essenciais;
4) Analisar a morfologia macroscópica e microscópica de células de
Candida albicans após a exposição aos óleos essenciais qualitativamente;
5) Avaliar o efeito dos óleos essenciais sobre a célula de Candida albicans, através de técnicas de citometria de fluxo e Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET);
6) Analisar o efeito dos óleos essenciais Mentha arvensis e Mentha piperita em biofilmes de Streptococcus mutans (UA 159), Candida albicans (SC 5314), em formação e maduro uniespécie e multiespécie através de densidade óptica;
7) Analisar o efeito dos óleos essenciais Mentha arvensis e Mentha piperita sobre biofilme misto de Candida albicans e Staphylococcus aureus;
8) Analisar a integridade dos biofilmes em formação e maduro de Candida
albicans (SC5314) após exposição aos óleos essenciais por Microscopia Eletrônica
de Varredura (MEV);
9) Analisar o efeito dos óleos essenciais de Mentha arvensis e Mentha
piperita em biofilme maduro de Candida albicans por microscopia confocal a laser,
com a finalidade de avaliar o metabolismo das células presentes no biofilme após o tratamento de 5 minutos e 24 horas com óleos essenciais de Mentha spp. e adição de soro fetal bovino;
10) Analisar os efeitos citotóxicos dos óleos essenciais de Mentha arvensis e Mentha piperita sobre células epiteliais humanas da linhagem HaCat;
11) Avaliar efeito in vivo dos óleos essenciais de Mentha arvensis e Mentha
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Local da Pesquisa
As análises experimentais foram levadas a efeito utilizando-se as estruturas da Área de Microbiologia e Imunologia, os laboratórios de Microscopia Eletrônica de Varredura e Transmissão e a Área da Patologia Oral– Departamento de Diagnóstico Oral e Morfologia– FOP/UNICAMP, Piracicaba – São Paulo.
As análises cromatográficas foram feitas utilizando-se a estrutura do CPQBA (Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas/UNICAMP, Paulínia- São Paulo).
4.2 Óleos essenciais
Os óleos essenciais utilizados para o desenvolvimento dos experimentos foram das espécies de Mentha arvensis (Cornmint) e Mentha piperita (Peppermint). Os óleos essenciais foram adquiridos comercialmente através da empresa Sigma
Aldrich®. Os óleos foram armazenados em vidro âmbar em geladeira a (4°C).
Informações técnicas:
Cornmint oil: LOTE MKBN3278V Peppermint oil: LOTE MKBQ6281V
4.3 Cromatografia Gasosa
Os óleos essenciais passaram por uma análise de qualificação e quantificação dos compostos presentes nas amostras por cromatografia gasosa.
5.3.2. Cromatografia Gasosa (CG)
Foi utilizado cromatógrafo gasoso Hewlett-Packard 5890 Serie II, equipado com detector seletivo de massas Hewlett40 Packard 5971, injetor split/splitless, utilizando-se uma coluna capilar HP-5 (25m x 0,2mm x 0,33μm). Temperaturas: injetor = 220°C, detector = 280°C, coluna = 60°C, 3°C.min-1, 240°C (7 minutos). Vazão do gás de arraste (He super seco) = 1,0 mL.min-1. A análise dos dados da CG foi realizada de acordo com a equação de Van den Dool e Kratz para a obtenção do Índice de Retenção seguida de comparação dos índices de retenção e picos cromatográficos obtidos e os encontrados na literatura.
IR= índice de retenção;
Ts= tempo de retenção da substância analisada;
Tcn= tempo de retenção do n-alcano (que elui após a substância analisada);
Tcn-1= tempo de retenção do alcano (que elui antes da substância analisada);
Cn-1= número do alcano (que elui antes da substância analisada).
4.4 Microrganismos
Para rastreamento da atividade antimicrobiana da Mentha arvensis e
Mentha piperita foram selecionadas cepas padrões (linhagem tipo ATCC - American Type Culture Collection) recomendadas para testes com antimicrobianos pelo CLSI
(Clinical and Laboratory Standards Institutes), cepas de interesse medico e/ou acadêmico de diversas espécies de Candida spp., obtidas da coleção Holandesa (CBS), da coleção Americana (ATCC) e do Banco da Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiróz, C. albicans (SC 5314), C. parapsilosis (CBS 604), C. albicans (ATCC 90028), C. tropicalis (CBS 94), C. guilliermondii (CBS 566), C. krusei (ATCC 6258), C.
albicans (CBS 562), C. lusitaniae (IZ 06), C. lusitaniae (4031), C. krusei (CBS 573), C. dubliniensis (CBS 7987), C. tropicalis (ATCC 750), C. rugosa (IZ 12), C. parapsilosis
(ATCC 22019); C. utilis (CBS 5609) e C. glabrata (IZ 07), provenientes da Micoteca do Laboratório de Microbiologia e Imunologia da FOP/UNICAMP (ATCC) foram usadas nesta pesquisa.
Cepas de Streptococcus Orais: Streptococcus gordonii Challis;
Streptococcus mitis NCTC 12261; Streptococcus mutans UA159; Streptococcus sanguinis SK36; Streptococcus salivarius ATCC 7073; Streptococcus oralis ATCC
10557 (Coleção de microrganismos do Laboratório de Microbiologia e Imunologia da FOP/UNICAMP);
Cepas clínicas de Candida albicans, provenientes da cavidade bucal e/ou próteses dentárias de pacientes, adultos, capazes, portadores de prótese bucal, que receberam atendimento odontológico na Clínica de Prótese da Faculdade de Odontologia de Alfenas, da Universidade de Alfenas, gentilmente cedidas pelo Prof. Dr. Marcelo Fabiano Gomes Boriollo (Projeto Aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Humana - Unifenas, Protocolo nº 83/2008), atualmente armazenadas em biorrepositório na Faculdade de Odontologia de Piracicaba (FOP UNICAMP). A
utilização de isolados clínicos teve como finalidade comparar a susceptibilidade e comportamento das amostras de leveduras com microrganismos de referência sob o tratamento com os óleos essenciais, compostos isolados e combinações sinérgicas desses compostos. Comitê de ética número: 150/15.
Staphylococcus aureus ATCC 25923 (Coleção de microrganismos do
Laboratório de Microbiologia e Imunologia da FOP/UNICAMP).
4.5 Determinação da CIM (Concentração Inibitória Mínima) e CMM (Concentração Microbicida Mínima)
O método de microdiluição foi utilizado para determinar a concentração inibitória mínima (CIM) e concentração microbicida mínima (CMM) seguindo a padronização da CLSI (The Clinical & Laboratory Standards Institute) descrita no documento M27-A3 (CLSI, 2008) para leveduras e M2-A6 (CSLI, 2003) para bactérias. Amostras de Candida spp. e Streptococcus spp. foram analisadas quanto a sensibilidade aos óleos essenciais de Mentha arvensis e Mentha piperita (concentração inicial testada 16 mg/mL). Como padrão comparativo foram feitos experimentos com os antimicrobianos comerciais: Fluconazol (Sigma Aldrich®), na concentração inicial 64 µg/mL para leveduras e Clorexidina (Sigma Aldrich®), com concentração inicial de 15 µg/mL para bactérias do grupo dos Streptococcus.
Em uma microplaca (Global Trade) estéril de 96 poços foram adicionados 100 µL meio RPMI-1640 (Sigma Aldrich®) para leveduras ou Müller-Hinton (BD®) para bactérias, e 100 µL do óleo essencial, na concentração desejada, diluído em TWEEN 80 (Synth) a 0,01% e meio de cultura. As diluições seriadas foram feitas da concentração inicial de cada grupo de tratamento. Posteriormente, foram adicionados aos compartimentos da placa 100 µL de inóculo preparado com solução salina ajustando-se a turbidez correspondente a 0,5 na escala McFarland, a uma absorbância de 0,08 a 0,10 à 530nm para leveduras ou 625nm para bactérias no espectrofotômetro, concentração final de células na placa será de 2,5x103 UFC/mL para leveduras e 5,0x105 UFC/mL para bactérias. As placas foram incubadas por 24h, 37°C e aerobiose para leveduras, por 24h, 37°C e 10% CO2 para os Streptococcus orais. A Concentração Inibitória Mínima (CIM) foi definida como a menor concentração do óleo capaz de inibir o crescimento visível do microrganismo. Foram feitos três experimentos independentes de cada teste.
Para a determinação da concentração microbicida mínima (CMM), alíquotas de 10 µL do tratamento, ou seja, dos compartimentos da placa foram plaqueadas em meio de cultura sólido SDA (Sabouraud Dextrose Ágar) para leveduras e BHI (Brain Heart Infusion) ágar para as bactérias, incubadas 24h, 37°C e aerobiose para leveduras e por 24h, 37°C e 10% CO2 para os Streptococcus orais, para posterior determinação das Unidades Formadoras de Colônias (UFC). A CMM foi identificada pelo não crescimento de colônias a partir da CIM (Concentração Inibitória Mínima) (Gullo et al., 2012).
4.6 Avaliação da inibição de formação de hifas
Os óleos essenciais de Mentha arvensis e Mentha piperita foram testados quanto a sua capacidade de inibir a formação de hifas em C. albicans (SC 5314), de acordo com o método descrito por Tsang et al. (2012).
4.6.1 Efeito dos óleos essenciais de Mentha spp. em meio sólido Os efeitos dos óleos essenciais foram analisados a partir de 10 µL de células em suspensão (2,5x103 UFC/mL) em meio sólido (SDA) contendo 10% de SFB (Cultilab) para induzir a formação de hifas, suplementado com concentrações subCIM (uma concentração abaixo da CIM) de óleo essencial que foram selecionadas a partir dos testes de microdiluição seriada de sensibilidade à antifúngicos. Placas foram incubadas por 4 dias à 37°C e a morfologia das colônias fotografadas.
4.6.2 Efeito dos óleos essenciais de Mentha spp. em meio líquido Os efeitos dos óleos essenciais foram testados a partir de 2,5x103 UFC/mL em meio Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) líquido contendo 10% de SFB (Cultilab) suplementado com concentrações subCIM e subBiofilme (Concentração < ou = a 50% da formação do biofilme, obtidas no ensaio de biofilme, descrito no item 4.10 do presente trabalho)de óleo essencial que foram selecionadas a partir dos testes de microdiluição seriada de sensibilidade a antifúngicos. As células foram incubadas a 37°C sob agitação (180rpm) por 16h em incubadora shaker (Nova Instruments). Para avaliação do efeito dos óleos essenciais na morfologia celular de
C. albicans foram feitas lâminas a partir de 10 µL de suspensão celular, as mesmas
foram fixadas pelo calor, coradas pelo método de GRAM, visualizadas em microscopia óptica no aumento de 40x e fotografadas.
4.7 Teste de Inibição do Tubo germinativo
As colônias de C. albicans SC 5314 foram obtidas de uma cultura overnight em SDA (18-24h) e ajustadas em PBS para concentração de 5x107 UFC/mL, ajustadas em câmara de Neubauer. A suspensão celular foi adicionada a uma solução de óleo essencial diluído na concentração subCIM em YPD suplementado com SFB (Cultilab) (1:2). A contagem de tubos germinativos foi realizada em microscópio óptico (Nova Instruments) no aumento de 40x no tempo de 6 horas de incubação em estufa de aerobiose a 37° C e os resultados foram expressos em porcentagem. A definição utilizada para tubo germinativo é uma célula portadora de um crescimento arredondado com um comprimento maior ou igual ao diâmetro da célula progenitora, não constringido na base. Foram feitos três experimentos independentes (Consolaro et al., 2005).
4.8 Análise da ação de óleos essenciais sobre leveduras de Candida
albicans através de Citometria de fluxo
A técnica utilizada foi a descrita por Freitas et al. (2013), na qual as células das leveduras foram analisadas quanto ao seu comportamento e complexidade interna, integridade da membrana citoplasmática, potencial de membrana citoplasmática e a presença de espécies reativas ao oxigênio (ROS), para isso as amostras foram tratadas com os fluorocromos: Iodeto de Propídio (IP), iodeto de 3,3’-dihexiloxacarbocianina DIOC6(3) e 123-dihidrorodamina (DHR-123). Comprimento de onda do IP: excitação a 536nm e emissão a 623nm (FL2); Comprimento de onda do DIOC6(3): excitação a 484nm e emissão a 501nm (FL1); Comprimento de onda da DHR-123: excitação a 500nm e emissão a 536nm (FL1); Aparelho utilizado: Facscalibur BD (Departamento de Diagnóstico Oral, Área de Patologia, FOP UNICAMP).
Os fluorocromos foram utilizados em experimentos separados, a fim de não haver inferência de fluorescência nos canais do equipamento.
Incubação: As leveduras (1x106 células/mL) foram cultivadas por 16 horas na presença dos óleos essenciais na concentração subCIMe subBiofilme (<ou = a 50% de inibição de atividade metabólica do biofilme) obtida através do teste de sensibilidade à antifúngicos.
Tratamento com IP (Iodeto de Propídeo): Em seguida, as células foram centrifugadas, transferidas em suspensão para PBS (pH 7,0), e tratadas com o fluorocromo: IP, Iodeto de Propídio, na concentração de 0,5 µl para 500 µl de inóculo em PBS, a partir da solução mãe de 1 mg/ml em água destilada;
Tratamento com DiOC6(3): Os microrganismos tratados foram expostos
ao corante DiOC6(3), na concentração de 0,5 µl para 500 µl de inóculo em PBS, a partir de uma solução mãe de 10 µg de DIOC6 (3) em 1 ml de DMSO. A amostra foi incubada por 15 minutos no escuro, fixadas com solução de 3% de PBS paraformol. Tratamento com DHR-123: As células foram centrifugadas e transferidas para solução de PBS (pH 7), 2x. Em seguida foram expostas a 20 µl de DHR-123 para 500 µl de inóculo em PBS, adquiridos da solução mãe de DHR-123 na concentração de 0,5 mg/ml de DMSO. As células foram incubadas por 10 minutos no escuro, fixadas com solução de 3% de PBS paraformol.
Todas as amostras foram lidas por citometria de fluxo, obtendo-se 10.000 eventos para cada experimento independente. Além dos grupos de tratamento com os óleos essenciais foram analisadas células não coradas, que serviram de controle da autofluorescência (Freitas et al., 2013). Os ensaios foram feitos em 2 experimentos independentes e em duplicata.
4.9 Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)
Com a finalidade de avaliar o efeito dos óleos essenciais na morfologia celular de Candida albicans, foi escolhida a metodologia de MET, que permite a visualização dos possíveis danos que os óleos essenciais podem causar as leveduras. Após o crescimento overnight em SDA de C. albicans SC5314, as células foram ajustadas a 1x106 UFC/mL e foram incubadas juntamente com os óleos essenciais nas concentrações subCIM, após 24 horas de incubação, a amostra foi centrifugada por 6 minutos a 13.000 rpm (centrífuga eppendorf) para a formação de pellet. Os
pellets foram ressuspendidos em fixador Karnovsky (anexo 3) e incubados por 36
horas. Após o período de fixação, a amostra foi lavada com solução salina 0,9% para remoção do fixador, centrifugada e lavada com tampão fosfato de Sorensen 0,1M (anexo 2). Em seguida, tratadas com tetróxido de ósmio 1% (anexo 6) por 4 horas, seguido de 3 lavagens de 5 minutos de tampão Sorensen 0,1M, desidratadas com Acetona (Merck) 30%, 50%, 70%, 90% e 100%, com 5 minutos cada, e então, as amostras foram incluídas gradativamente em resina Dr Spurr (anexo 4) até a inclusão
