TÍTULO: DESENVOLVIMENTO DE ARCABOUÇOS COMPOSTOS DE GELATINA E QUITOSANA COMO SUBSTITUTOS DÉRMICOS: CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO IN VITRO COM FIBROBLASTOS E CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS DE COELHOS.
TÍTULO:
CATEGORIA: EM ANDAMENTO
CATEGORIA:
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE
ÁREA:
SUBÁREA: Biomedicina
SUBÁREA:
INSTITUIÇÃO(ÕES): UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO - USP
INSTITUIÇÃO(ÕES):
AUTOR(ES): RAPHAELA MELLO ZAMUDIO
AUTOR(ES):
ORIENTADOR(ES): DANIEL ENRIQUE LÓPEZ ANGULO
ORIENTADOR(ES):
COLABORADOR(ES): CARLOS EDUARDO AMBRÓSIO, PAULO JOSÉ DO AMARAL SOBRAL
1. Resumo
A perda de tecidos e de órgãos por lesões ou doenças ainda é considerado um problema significativo em países em desenvolvimento. A engenharia de tecidos busca novos horizontes no desenvolvimento de análogos dérmicos, entre eles se encontra o arcabouço tridimensional. Este projeto desenvolveu um arcabouço tridimensional constituído de gelatina e quitosana reticulado com genipina G-Q-GEN e glutaraldeído G-Q-GLU. Esses arcabouços foram avaliados através de testes físico-químicos e biológicos. Biologicamente, a morfologia (microestrutura), porosidade, capacidade de absorção de água e biodegradabilidade in vitro foram analisadas. FTIR, DSC, TG e propriedades mecânicas permitiram caracterizar fisicamente os arcabouços. A citotoxicidade foi testada através do ensaio de viabilidade celular (MTT) e pelo grau de interação das células com o arcabouço. Resultados preliminares mostraram que ambos possuem padrão irregular e heterogêneo de poros, com variação no diâmetro médio (261,25 µm para G-Q-GLU e 364,47 µm para GEN), alta capacidade de absorção de água (>1500% G-Q-GLU e >2000% G-Q-GEN), e porcentagem de biodegradabilidade em 28 dias variando entre 54,4% (G-Q-GEN) e 77,8% (G-Q-GLU). O estudo de citotoxicidade demonstrou que o crescimento celular e adesão ao arcabouço foram satisfatórios.
2. Introdução
A engenharia biomédica procura progressivamente criar e desenvolver materiais inovadores, tanto na área da medicina veterinária quanto da medicina humana. Os arcabouços tridimensionais (scaffolds) são um exemplo, utilizados como substitutos dérmicos [1;2], devido as limitações dos tratamentos tradicionais de queimaduras e danos cutâneos [2;3]. Os arcabouços devem ser biocompatíveis e biodegradáveis, com alta porosidade e interligação dos poros [4;3]. Uma das principais células utilizadas nos substitutos dérmicos são os fibroblastos, constituintes predominantes da camada dérmica da pele, vitais para o processo de reparo tecidual. Outro tipo celular relevante são as células tronco, capazes de auto renovação e diferenciação multipotente. Dentro das células tronco, as células tronco mesenquimais são encontradas na pele, significativas nesse cenário [5]. Os arcabouços podem ser compostos de diversos materiais. Dois biopolímeros se sobressaem no âmbito biomédico pelo potencial de suporte à cicatrização: a quitina e o colágeno. O uso desses polímeros naturais é atrativo pela excelente biocompatibilidade e baixo custo de produção [6;7].
Desta forma, este estudo propõe a criação de um arcabouço feito com materiais acessíveis, reutilizados da indústria de alimentos (quitosana e gelatina) visando estimular e favorecer a regeneração celular e consequentemente a cicatrização cutânea, que será testado através do cultivo celular de fibroblastos e células mesenquimais.
3. Objetivos
Elaboração de um arcabouço composto de gelatina e quitosana, com o propósito de avaliar o seu potencial e desempenho biológico para o crescimento celular in vitro de fibroblastos e células mesenquimais de coelho.
4. Metodologia
A produção dos arcabouços foi realizada através de uma solução de gelatina (2%) e quitosana (1%) em 0,05M de ácido acético na proporção de 1:1 e congelada (-80o C) durante 2 horas. A esponja obtida foi reticulada com genipina (10%) e glutaraldeído e finalmente liofilizados por mais 18 horas [8]. Para a pesquisa das características físico-químicas as seguintes técnicas foram escolhidas: observação por microscopia eletrônica (MEV), (FTIR), (DSC), termogravimetria (TG); propriedades mecânicas por ensaio de compressão e capacidade de absorção de água. Para a análise das propriedades biológicas, o teste in vitro de biodegradabilidade em lisozima e estudo de viabilidade celular pelo ensaio MTT [brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5-difeniltetrazólio] (Sigma, St Louis, EUA) foram selecionados. A semeadura das células citadas nos arcabouços foi realizada em placas de 24 poços durante 28 dias. E por fim, a observação de crescimento celular por MEV será realizada para análise do crescimento celular dentro do arcabouço reticulado com glutaraldeído em 7 e 28 dias, bem como análise histológica dos arcabouços.
5. Desenvolvimento
A avaliação e quantificação de poros foi feita pelo software de visualização de imagens Image J 1.45s (NIH Image, EUA). Adicionalmente, propriedades mecânicas por ensaio de compressão foi realizada [9]. A capacidade de absorção de água foi feita utilizando PBS. Biologicamente, os arcabouços foram testados para biodegradabilidade em lisozima e para viabilidade celular pelo ensaio de MTT. E além disso foram semeados com fibroblastos e células mesenquimais durante 28 dias e analisados por MEV. As células utilizadas no ensaio de viabilidade celular e
Gráfico 2: Capacidade de absorção de água dos arcabouços de
G-Q-GLU e G-Q-GEN em PBS à temperatura de 37 oC e pH 7,4.
semeadura celular foram coletadas de três coelhos saudáveis, isoladas e mantidas em incubadora para crescimento celular.
6. Resultados Preliminares
Como resultado da análise morfológica dos arcabouços ambos apresentaram características físicas esponjosas, sendo leves e porosos, porém obtiveram cores visualmente diferentes. O arcabouço G-Q-GEN mostrou uma coloração esverdeada, revelando um tom verde-azulado quando submergido em PBS. Enquanto o arcabouço G-QGLU não apresentou mudanças de cor. A MEV também exibiu diferenças visíveis na microestrutura do arcabouço (Figura 1). O arcabouço G-Q-GLU obteve menos quantidade de poros comparado ao arcabouço G-Q-GEN (Tabela 1).
Os resultados mecânicos (Gráfico 1) revelaram que o arcabouço de G-Q-GLU obteve um módulo de compressão significantemente menor em termos numéricos comparado ao arcabouço de G-Q-GEN. Isto é, os arcabouços reticulados com genipina apresentaram mais rigidez, possuindo mais resistência na deformação quando submetido a tensão crescente.
Em relação da capacidade de absorção de PBS, o arcabouço G-Q-GEN se mostrou levemente maior que a do arcabouço G-Q-GLU (Gráfico 2).
Figura 1: Imagens de MEV do arcabouço G-Q-GEN (A) e do
arcabouço G-Q-GLU (B), aumento de 100x, respectivamente.
A
B
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 GEN GLU Mó du lo d e Co m pr es sã o (M Pa ) Teste de CompressãoGráfico 1: Módulo de compressão dos arcabouços
de G-Q-GEN e G-Q-GLU obtidos através do teste de compressão.
Tabela 1: Quantidade média dos poros, áreas superficiais
médias dos poros e diaêmetro médio dos poros dos arcabouços de G-Q-GLU e G-Q-GEN.
Arcabouço Quantidade média de poros Área superficial dos poros (µm2) Diâmetro médio dos poros (µm) G-Q-GLU 2433 395,34 261,25 G-Q-GEN 1321 585,66 364,47 0 1000 2000 3000 2 4 8 14 21 28 % Ab so rç ão d e ág ua Dias Capacidade Absorção PBS GLU GEN
Os resultados do teste in vitro de biodegradabilidade apontaram uma biodegradabilidade maior nos arcabouços G-Q-GLU, aumentando constantemente ao decorrer dos dias. Os arcabouços G-Q-GEN apresentaram uma biodegradabilidade mais baixa e menos constante ao decorrer dos dias.
7. Fontes Consultadas
1. WANG, X.; LI, Q.; HU, X.; MA, L.; YOU, C.; ZHENG, Y.; GAO, C. Fabrication and characterization of poly (l-lactide-co-glycolide) knitted mesh-reinforced collagen–chitosan hybrid scaffolds for dermal tissue engineering. Journal of the mechanical behavior of biomedical materials, vol. 8, pp. 204-215, 2012.
2. ZHONG, S. P.; ZHANG, Y. Z.; LIM, C. T. Tissue scaffolds for skin wound healing and dermal reconstruction. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology, vol. 2, n. 5, pp. 510-525, 2010.
3. AGARWAL, T.; RAJAN, N.; SOMNATH, M.; BEHERA, S.; KULANTHAIVEL, S.; MAITI, T.K.; BANERJEE, I.; PAL, K.; GIRI, S. Gelatin/Carboxymethyl chitosan based scaffolds for dermal tissue engineering applications. International Journal of
Biological Macromolecules, vol. 93, pp. 1499-1506, 2016.
4. O'BRIEN, F. J. Biomaterials & scaffolds for tissue engineering. Materials today, vol. 14, n. 3, pp. 88-95, 2011.
5. ZHANG B., LIU X., WANG Ch., Li L., MA L.; GAO Ch. Bioengineering Skin Constructs. MOE Key Laboratory of Macromolecular Synthesis and Functionalization, Department of Polymer Science and Engineering, Zhejiang University, Hangzhou, China. Stem Cell Biology and Tissue Engineering in Dental Sciences, 2015.
6. GORCZYCA, G.; TYLINGO, R.; SZWEDA, P.; AUGUSTINA, E.; SADOWSKA, M.; MILEWSKIA, S.; Preparation and characterization of genipin cross-linked porous chitosan– collagen gelatin scaffolds using chitosan–CO2 solution.
Carbohydrate Polymers, vol. 102, pp. 901–911, 2014.
7. OKORO, O. V.; SUN, Z.; BIRCH, J. Meat processing waste as a potential feedstock for biochemicals and biofuels–a review of possible conversion technologies. Journal of Cleaner Production, 2016.
8. LOPEZ, D. E. A; SOBRAL, P. J. A Characterization of gelatin/chitosan scaffold blended with aloe vera and snail mucus for biomedical purpose. International journal of biological macromolecules, v. 92, pp. 645-653, 2016.
9. ENCARNAÇÃO, I. C. Análise das propriedades físico-químicas e mecânicas de arcabouço poroso composto de PLGA, cerâmica bifásica e sinvastatina de liberação lenta para engenharia de tecido ósseo. 2016. Dissertação (Doutorado em Odontologia) – Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis.
