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Estudo do comportamento da biodegradação em solo de blendas compatibilizadas de PLA/PBAT e seus efeitos genotóxicos e mutagênicos

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PAULA ALESSANDRA PALSIKOWSKI

ESTUDO DO COMPORTAMENTO DA BIODEGRADAÇÃO EM SOLO DE BLENDAS COMPATIBILIZADAS DE PLA/PBAT E SEUS EFEITOS

GENOTÓXICOS E MUTAGÊNICOS

CAMPINAS Julho de 2015

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA

PAULA ALESSANDRA PALSIKOWSKI

ESTUDO DO COMPORTAMENTO DA BIODEGRADAÇÃO EM SOLO DE BLENDAS COMPATIBILIZADAS DE PLA/PBAT E SEUS EFEITOS

GENOTÓXICOS E MUTAGÊNICOS

Orientadora: Profa. Dra. Ana Rita Morales

Co-orientadora: Profa. Dra. Maria Aparecida Marin-Morales

Dissertação de Mestrado apresentada à Faculdade de Engenharia Química da Universidade Estadual de Campinas para a obtenção do título de Mestra em Engenharia Química.

CAMPINAS Julho de 2015

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RESUMO

Os polímeros biodegradáveis, como o PLA e o PBAT, são considerados uma opção viável para minimizar os efeitos do grande descarte de resíduos sólidos. Este trabalho apresenta o estudo da biodegradação em solo do poli (adipato-co tereftalato de butileno) (PBAT) e poli (ácido lático) (PLA) e de suas blendas compatibilizadas por um extensor de cadeia. As amostras foram caracterizadas mediante Difração de Raios-X (DRX), análise termogravimétrica (TGA), Calorimetria Diferencial Exploratória e Espectroscopia de Infravermelho (FTIR). Para avaliar a degradação, as amostras foram enterradas em solo em condições controladas em laboratório. As amostras degradadas foram regularmente retiradas de solo e analisadas por inspeção visual e pela alteração na massa molar por Cromatografia de Permeação em Gel (GPC). A biodegradabilidade destes materiais também foi avaliada pela quantificação da taxa de mineralização. Visualmente foram observadas mudanças na coloração, trincas e fragmentação. Após 360 dias de degradação foram observados apenas pequenos fragmentos de PBAT com manchas pretas, as blendas 25/75 e 75/25 estavam fragmentadas, enquanto que o PLA apresentou apenas trincas. A massa molar ponderal média do PLA foi a que mais diminuiu em 360 dias de degradação. Os resultados evidenciaram uma forte influência da presença do extensor de cadeia na massa molar do PBAT e das blendas. O PBAT apresentou a maior taxa de mineralização, seguido pela blenda 25/75, enquanto que a blenda 75/25 e o PLA apresentaram uma taxa de mineralização menor. As curvas do DSC e DRX revelaram um aumento na cristalinidade durante o processo de degradação. O FTIR mostrou pequenas variações nas bandas antes e depois da degradação. O estudo da ecotoxicidade dos resíduos resultantes da degradação dos polímeros no solo permitiu avaliar os efeitos citotóxicos, genotóxicos e mutagênicos por meio de bioensaios com o organismo teste Allium cepa germinado nos solos onde ocorreu a degradação dos materiais. Com base nos resultados obtidos, os materiais estudados não se mostraram fitotóxicos, genotóxicos e tampouco mutagênicos para as células meristemáticas. As blendas compatibilizadas do PLA com o PBAT não apresentaram vantagens no processo de biodegradação em relação aos polímeros originais.

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ABSTRACT

Biodegradable polymers, as PLA and PBAT, are considered a feasible option to minimize the effects of high disposal of solid waste. This work presents the study of biodegradation in soil of poly (adipate co-terephthalate of butylene) (PBAT) and poly (lactic acid) (PLA) and their blends compatibilized with a chain extender. The samples were characterized by X-ray diffraction (XRD), Thermogravimetric analysis (TGA), Differential Scanning Calorimetry (DSC) and Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR). To evaluate the degradation, the samples were buried in soil in controlled laboratory conditions. Degraded samples were regularly taken from soil and analyzed by visual inspection and by the changes in molecular weight by Gel Permeation Chromatography (GPC). The biodegradability of these materials was assessed by quantifying the rate of mineralization. Visually it was observed changes in color, cracks and fragmentation. After 360 days of degradation it was observed only small fragments of PBAT stained in black, and the 25/75 and 75/25 blends were broken, while the PLA showed only cracks. The ponderal average molecular weight of PLA was the must decreased in 360 days of degradation. The results showed a strong influence of the chain extender presence in changing the molecular weight of PBAT and the blends. The PBAT shows the higher mineralization rate, followed by the 25/75 blend, while the 75/25 blend and the PLA had a lower mineralization rate. The DSC and DRX curves revealed an increase of crystallinity during the degradation process. The FTIR showed slight changes at bands before and after degradation. The study of ecotoxicity of residues resulting from polymers degradation in soil allowed evaluate the citotoxy, genotoxy and mutagenic effects by the bioassays using the test organism Allium cepa germinated in soils where degradation of the materials took place. Based on the obtained results, the studied materials were not fitotoxic, genotoxic nor mutagenic for meristematic cells. The compatibilized blends of PLA with PBAT showed no advantage in the biodegradation process in relation to the original polymers.

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Dedico esta dissertação à minha família: meus pais Paulo e Paula, meu irmão Júnior (in memorian), e ao meu namorado Marcio.

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AGRADECIMENTOS

Primeiramente а Deus pelo dom da vida, pela minha família e amigos, pelas condições e capacitações que tenho, por tеr mе dado saúde е força pаrа superar аs dificuldades e iluminar-me nesta caminhada.

Agradeço à minha orientadora, Profª. Drª. Ana Rita Morales, por ter aceito orientar-me e ter me acolhido com carinho, paciência, amizade e incentivo. Agradeço pela confiança depositada, a motivação, o empenho e o apoio em todas as etapas deste trabalho. Agradeço também pela oportunidade de acompanhá-la em seu trabalho como professora, por acreditar em mim e por me ajudar nos momentos mais críticos.

À Profa. Dra. Maria Aparecida Marin-Morales pela sua orientação e colaboração. Agradeço pela oportunidade de poder conhecer e trabalhar no Laboratório de Mutagênese Ambiental, que além de grande infraestrutura, conta com uma equipe unida e atenciosa.

Agradeço à minha família, a qual amo muito, por todo o amor, carinho, apoio e incentivo que recebi durante esta jornada. Só cheguei até aqui porque vocês me educaram e ensinaram-me a ser o que sou hoje.

Agradeço ao meu namorado, Marcio, por ser minha fonte de encorajamento, por tornar minha vida mais feliz e cheia de esperança. Agradeço pelo amor, carinho, paciência, compreensão e incentivo.

À minha madrinha Ivone, uma mulher guerreira, carinhosa, dedicada e atenciosa. Sei que tenho um longo caminha pela frente, mas tenho o maior orgulho em seguir os seus passos.

Ao Coral Unicamp Zíper na Boca por tornarem os dias longe de minha família mais agradáveis. Agradeço principalmente à minha amiga Gabi, muito obrigada pela amizade, pelo carinho, pela companhia e pelas orientações quando me senti sem rumo, pela paciência com que sempre me ouviu e aconselhou. Você foi um anjinho de Deus na minha vida.

Ao Ivanei, por ter sido sempre tão prestativo em praticamente todas as etapas do meu trabalho, pela paciência, amizade e colaboração nos testes de mineralização.

À Patrícia, por ter sido tão atenciosa e disposta em me ajudar.

À Carol, por fornecer os materiais processados e por me ensinar e ajudar na preparação das amostras.

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Ao Matheus, sempre muito solícito, agradeço pelo grande apoio para a realização das análises com Allium cepa, pelo acompanhamento, pela sua inteira disponibilidade para fazer a revisão do texto, e pelo grande aprendizado proporcionado.

À Laís, sempre muito atenciosa e prestativa, agradeço pelo acompanhamento desde o início dos trabalhos, me ensinando cada etapa com muita dedicação e paciência, pela sua inteira disponibilidade em sanar minhas dúvidas. Agradeço também a toda sua família por ter me acolhido com tanto carinho, atenção e prontidão. À dona Conceição, por se preocupar tanto com meu bem estar e à Laila pela ótima companhia.

Aos amigos da UNICAMP- Jefferson, Marina, Patrícia, Carol, Mayara, Paulo, Renato, Gabriel, Joice, Gustavo e Laura e da UNESP- Laís, Matheus, Cleiton, Raquel, Maria Tereza, Baihal, Franco, Michele, Jorge, Letícia, pela agradável companhia e bons momentos compartilhados.

À Ju Lorernzi. Muito obrigada pela sua amizade, por me ajudar quando resolvi vir pra Campinas, pelas informações e conselhos, pelo grande auxílio com vidrarias e equipamentos durante a realização dos experimentos e pela força quando precisei de ajuda.

Às minhas colegas de república Samantha, Thaís, Jéssica, Laura, Maristela, Paula e Marília pela ótima companhia e pelos bons momentos de descontração.

À Prof. Dra. Lúcia Helena Innocentini Mei, por conceder o espaço de seu Laboratório de Microbiologia em Materiais (MICROMAT) para a realização de parte desse trabalho.

Agradeço à Teresa, Márcia, Aline e demais funcionários da Faculdade de Engenharia Química.

Ao Disney, Juliana e Fábio, pelo apoio e atenção durante a realização das análises termogravimétrica e de calorimetria diferencial exploratória no Laboratório de Análise e Caracterização de Materiais-FEQ-UNICAMP.

Ao Thiago Ruffino, do Instituto de Química-UNICAMP, pelos esclarecimentos e apoio para a realização da análise de Cromatografia por Permeação em Gel.

À Fapesp (Projeto 2014/09883-5), e ao CNPq, pelo apoio financeiro.

Agradeço à todas as pessoas do meu convívio que acreditaram e contribuíram, mesmo que indiretamente, para a conclusão deste trabalho.

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xv LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Consumo aparente de plásticos no Brasil ... 1

Figura 2- Estrutura química do PLA ... 6

Figura 3- Estrutura química do poli (adipato-co tereftalato de butileno) ... 7

Figura 4- (a) Reação do grupo epóxido com hidroxila formando éter e (b) Reação do grupo epóxico com carboxila formando éster ... 10

Figura 5- Reação proposta entre poliésteres e extensor de cadeia. ... 11

Figura 6- Previsão do mecanismo de reação entre o PLA e o Joncryl. ... 12

Figura 7- Previsão do mecanismo de reação entre o PBAT e o Joncryl ... 13

Figura 8- Mecanismo geral de biodegradação de plásticos sob condições aeróbicas. ... 14

Figura 9- Reação de hidrólise do PLA ... 15

Figura 10- Teste de mineralização do PLA e celulose em pó a 30º C em solo esterilizado e inoculado por fungos. ... 16

Figura 11- Mecanismo proposto para degradação hidrolítica do PBAT ... 17

Figura 12- Cisões da cadeia do PBAT ... 17

Figura 13- Teste de mineralização do PBAT e celulose em pó a 30ºC em solo esterilizado e inoculado por fungos. ... 18

Figura 14- Aberrações cromossômicas em células meristemáticas de Allium cepa... 22

Figura 15- Alterações nucleares observadas em células meristemáticas de Allium cepa após exposição à agentes químicos. ... 23

Figura 16- Sementes de Allium cepa germinadas em solubilizado de PBAT ... 35

Figura 17- (a) Curva de TGA e (b) DTGA das amostras de PLA, PBAT e suas blendas. ... 37

Figura 18- Curvas do primeiro aquecimento da análise de DSC de PLA, PBAT e de suas blendas... 39

Figura 19- Curvas de resfriamento da análise de DSC de PLA, PBAT e de suas blendas ... 42

Figura 20- Curvas do segundo aquecimento da análise de DSC de PLA, PBAT e de suas blendas ... 44

Figura 21- Difratogramas do (a) PLA, (b) blenda 75/25, (c) blenda 25/75 e (d) PBAT antes da degradação e após 360 dias de degradação. ... 46

Figura 22- Espectro FTIR do PLA antes (em preto) e depois de 360 dias de degradação (em cinza). ... 50

Figura 23- Espectro FTIR do PBAT antes (em preto) e depois de 360 dias de degradação (em cinza). ... 51

Figura 24- Espectro FTIR da blenda 25/75 antes (em preto) e depois de 360 dias de degradação (em cinza). ... 52

Figura 25- Espectro FTIR da blenda 75/25 antes (em preto) e depois de 360 dias de degradação (em cinza). ... 53

Figura 26- Aspecto visual das amostras após degradação em solo ... 55

Figura 27- Aspecto visual das amostras sem Joncryl após 30 dias de degradação em solo ... 56

Figura 28- Massa molar ponderal média (Mw) das amostras em função do tempo de degradação. ... 58

Figura 29- Percentual da massa molar ponderal média (Mw) das amostras em função do tempo de degradação em relação à massa molar ponderal média inicial ... 59

Figura 30- Curvas de GPC do PLA sem ser biodegradado e após biodegradação ... 61

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Figura 32- Curvas de GPC da blenda 25/75 sem ser biodegradado e após biodegradação ... 62 Figura 33- Curvas de GPC do PBAT sem ser biodegradado e após biodegradação ... 63 Figura 34- Teste de mineralização dos materiais testes e da celulose conforme norma ASTM D5988-12 a 28o C ... 64 Figura 35- Índice de germinação obtido com sementes de Allium cepa submetidos à tratamentos realizados com PLA, PBAT e blendas destes dois compostos ... 67 Figura 36- Índice mitótico obtido da análise das células de Allium cepa submetidas a

tratamentos realizados com PLA, PBAT e blendas destes dois compostos ... 68

Figura 37- Índice de alterações cromossômicas (genotoxicidade) obtido da análise das células

de Allium cepa submetidas a tratamentos realizados com PLA, PBAT e blendas destes dois compostos ... 69

Figura 38- Índice de mutagenicidade obtido da análise das células de Allium cepa submetidas a

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1- Características do solo ... 30

Tabela 2- Espessura, densidade e massa das amostras utilizadas para o teste de ecotoxicidade. 33 Tabela 3- Dados quantificados para o preparo do solubilizado ... 34

Tabela 4. Temperaturas de degradação e percentagem de resíduo. ... 38

Tabela 5- Dados do primeiro aquecimento da análise de DSC ... 41

Tabela 6- Dados do resfriamento da análise de DSC ... 43

Tabela 7- Dados do segundo aquecimento da análise de DSC ... 45

Tabela 8. Picos dos difratogramas das amostras de PLA, PBAT e das blendas 25/75 e 75/25 antes e após 360 dias de degradação ... 48

Tabela 9- Grau de cristalinidade das amostras e ângulo dos picos antes e após a degradação obtidas pela análise de DRX ... 48

Tabela 10- Graus de cristalinidade obtidos pelas técnicas de DRX e DSC. ... 49

Tabela 11. Análise do espectro de infravermelho das amostras antes e depois da degradação .. 53

Tabela 12- Dados obtidos pela análise de GPC para as amostras em diferentes tempos de degradação ... 57

Tabela 13- Percentagem de mineralização dos filmes de PLA, PBAT e das blendas e celulose em pó, em função do tempo de incubação em solo a 28 oC ... 65

Tabela 14- Frequência de aberrações cromossômicas e anormalidades nucleares avaliadas em células meristemáticas de Allium cepa submetidas a tratamentos realizados com PLA, PBAT e blendas destes dois compostos ... 71

Tabela 14- Frequência de aberrações cromossômicas e anormalidades nucleares avaliadas em células meristemáticas de Allium cepa submetidas a tratamentos realizados com PLA, PBAT e bendas destes dois compostos (continuação) ... 72

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

% C - grau de cristalinidade das amostras (DRX) Å - Angstron (10-10 metro)

ABIPLAST– Associação Brasileira da Indústria do Plástico ABNT- Associação Brasileira de Normas Técnicas

ABRELPE - Associação Brasileira das Empresas de Limpeza Pública e Resíduos Especiais

ASTM - American Society for Testing and Material Ba(OH)2 - hidróxido de bário

BaCl2 – cloreto de bário C - carbono

CO2 - dióxido de carbono

CR(%) = Capacidade de retenção máxima de água; Cu – cobre

Da – Daltons

DNA- Ácido desoxirribonucleico DRX - difração de raios-X

DSC - calorimetria diferencial de varredura

DTG - derivada da variação de massa em função da temperatura FTIR - espectroscopia do infravermelho por transformada de Fourier GMA - metacrilato de glicidila

GPC – cromatografia por permeação em gel Ia - resultado da integração dos picos de difração IAC- Índice de Alterações Cromossômicas Ic - resultado da integração do halo amorfo IM- Índice Mitótico

IMut- Índice de Mutagenicidade KOH – hidróxido de potássio kV- quilo Volt (tensão)

Kα – pico de radiação característico mA - micro Ampére (corrente)

MEV - Microscopia Eletrônica de Varredura MMS - metil metano sulfonato

Mn - massa molar numérica média

MpCO2 - massa de dióxido de carbono produzido (mg) Ms - massa de solo seco

MtCO2 - massa de dióxido de carbono teórico Mu - massa de solo úmido

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xx

Mw - massa molar poderal média NaOH - hidróxido de sódio nm – nanômetro (10-9 metro) O2 - molécula de oxigênio

PBAT - poli (adipato-co tereftalato de butileno) pcr – partes por cem partes de resina

PDI - índice de polidispersividade PE - polietileno

PET - poli (tereftalato de etileno) PLA - poli (ácido lático)

PLLA- poli (L-ácido lático) PS - poliestireno

QC100 - Quantidade de água necessária para corrigir 100g de solo T5% - temperatura na qual ocorre perda de 5% em massa

Tc – temperatura de cristalização Tcc – temperatura de cristalização a frio Tf - temperatura de fusão

Tg - temperatura de transição vítrea TGA - análise termogravimétrica THF – tetrahidrofurano

Tmáx - temperatura na qual a taxa de perda de massa é máxima TRIF - trifluralina

U (%) - Umidade do solo u.a. – unidade arbitrária

Vam: Volume de HCl 0,5 N utilizado na titulação do frasco contendo a amostra Vcn: Volume de HCl 0,5 N utilizado na titulação do frasco controle negativo

w - fração mássica do PLA

Xc1 - grau de cristalinidade das amostras no primeiro aquecimento (DSC) Xc2 - grau de cristalinidade das amostras no segundo aquecimento (DSC) Y: quantidade de carbono (mg) da amostra

ΔHc - entalpia de cristalização

ΔHcc - entalpia de cristalização a frio medido ΔHf - entalpia de fusão medido

ΔHf∞ - entalpia de fusão para um cristal com uma espessura infinita θ - ângulo de difração

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xxi SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO 1 1.1. Objetivos 4 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 5 2.1. PLA 5 2.2. PBAT 7 2.3. Blendas Poliméricas 8 2.4. Extensores de cadeia 10

2.5. Biodegradação do PLA e do PBAT 13

2.6. Ecotoxicidade 19 2.6.1. Fitotoxicidade 20 2.6.2. Genotoxicidade 20 2.6.3. Citotoxicidade 20 2.6.4. Aberrações cromossômicas 21 2.6.5. Anormalidades nucleares 22 2.6.6. Mutagenicidade 23 3. MATERIAIS E MÉTODOS 25 3.1. Materiais 25

3.2. Preparo das amostras 25

3.3. Caracterização das amostras 26

3.3.1. Análise termogravimétrica 26

3.3.2. Análise de Calorimetria Diferencial Exploratória (DSC) 26

3.3.3. Difração de Raio-X (DRX) 27

3.3.4. Espectroscopia de Infravermelho (FTIR) 28

3.4. Ensaios para avaliação da biodegradabilidade em solo 28

3.4.1. Caracterização do solo 28

3.4.2. Avaliação visual e monitoramento da massa molar 30

3.4.3. Método da Respirometria 31

3.4.4. Avaliação do potencial genotóxico e mutagênico, por meio de bioensaios com o organismo

teste Allium cepa 33

4. RESULTADOS E DISCUSSÕES 37

4.1. Análise termogravimétrica (TGA) 37

4.2. Calorimetria diferencial de varredura (DSC) 38

4.3. Difração de raio-X (DRX) 46

4.4. Espectroscopia do Infravermelho por Trasformada de Fourier (FTIR) 50

4.5. Avaliação visual e monitoramento da massa molar pela técnica de cromatografia por permeação

em gel (GPC) 54

4.6. Mineralização 64

4.7. Avaliação do potencial genotóxico e mutagênico, por meio de bioensaios com o organismo teste

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xxii

5. CONCLUSÕES 77

6. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS 79

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 81

APÊNDICE A – Análise termogravimétrica (TGA) 88

APÊNDICE B – Curvas de DSC 90

APÊNDICE C – Difratogramas de DRX 102

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1 1. INTRODUÇÃO

Desde a primeira produção em escala industrial de plásticos nos anos 1940, a produção, o consumo e a geração de resíduos sólidos plásticos têm aumentado consideravelmente (AL-SALEM et al, 2009). A Figura 1 representa o consumo aparente de plásticos no Brasil nos últimos anos. O consumo aparente é a soma do volume da produção com o das importações menos o volume exportado.

Figura 1- Consumo aparente de plásticos no Brasil

Fonte: ABIPLAST, 2015

De acordo com a Figura 1, o consumo aparente de plásticos diminuiu em 2014 (-2,6% em toneladas em relação a 2013). Tal comportamento está relacionado a alguns setores da economia brasileira como a desaceleração na atividade civil reduzindo, consequentemente, a demanda por insumos para essa indústria; a retração da produção da indústria automobilística, reduzindo a demanada por componentes plásticos. No entanto, setores como alimentos, bebidas e higiene pessoal apresentaram um desempenho melhor em relação às outras indústrias brasileiras demandantes de plásticos, influenciando positivamente no consumo aparente no ano de 2014 (ABIPLAST, 2015).

De acordo com Oliveira (2012) “a maioria dos artigos plásticos vendidos, especialmente as embalagens e outros bens não-duráveis, torna-se resíduo em menos de um ano, ou, no pior cenário, após um único uso”. O grande volume dos materiais

Em m ilh õ es d e t o n elad as

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plásticos descartados após o consumo e os impactos ambientais causados pela disposição incorreta dos resíduos, que geralmente não são biodegradáveis, permanecendo no ambiente por muitos anos, são apenas alguns dos problemas a serem citados. Além disso, os resíduos dos polímeros podem causar danos à saúde dos seres humanos e dos animais, principalmente por causa da liberação de substâncias tóxicas como aditivos utilizados na sua fabricação.

Entre os danos causados por produtos químicos, os efeitos genotóxicos e mutagênicos têm chamado atenção em razão à capacidade destes em induzir danos genéticos, causando vários problemas de saúde e afetando futuras gerações, visto que essas alterações podem ser hereditárias (LEME; MARIN-MORALES, 2009).

A grande quantidade de resíduos sólidos gerados pelo descarte de embalagens, a utilização de polímeros derivados do petróleo, o aumento da liberação de gases de efeito estufa e a futura escassez de petróleo são fatores discutidos em estudos que propõem alternativas para as questões ambientais (INOCENTINI-MEI; MARIANI, 2005). Os polímeros biodegradáveis ou plásticos ambientalmente degradáveis (PADs) destacam-se como substitutos aos plásticos convencionais nos segmentos onde reciclar é difícil, trabalhoso e resulta em materiais de baixo custo e desempenho (INOCENTINI-MEI; MARIANI, 2005).

De acordo com a norma ASTM D6400-04 um plástico biodegradável é um plástico que se degrada devido à ação natural de microrganismos, tais como bactérias, fungos e algas.

Os polímeros biodegradáveis de importância comercial podem ser produzidos a partir de fontes naturais ou do petróleo, destacando-se os produzidos por síntese química a partir de monômeros bio-derivados, como o poli (ácido lático) (PLA), e os produzidos a partir de petróleo bruto como poliésteres alifáticos e aromáticos, como o poli (adipato-co tereftalato de butileno) (PBAT) (CHANDRA; RUSTGI, 1998).

Atualmente, a principal aplicação do PLA (quase 70%) é em embalagens (JAMSHIDIAN et al., 2010). As aplicações do PLA poderiam ser mais amplas mediante a otimização de suas propriedades físicas, mecânicas e térmicas, o que levou aos estudos das blendas de PLA com o PBAT pelo nosso grupo de pesquisa.

Um dos principais objetivos de modificar as propriedades do PLA é torná-lo capaz de competir com outros polímeros mais flexíveis, tais como polietileno, polipropileno, polietileno tereftalato ou cloreto de polivinila (BALAKRISHNAN et al., 2010).

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O destino dos materiais após uso deve ser compatível com as opções que são disponibilizadas à comunidade. A situação do descarte de resíduos sólidos urbanos no Brasil mostra que o aterro sanitário é o mais utilizado, seguindo-se pelo aterro controlado e lixão, sendo compostagem e reciclagem alternativas de menor disponibilidade (ABRELPE, 2013).

De acordo com a Associação Brasileira de Empresas de Limpeza Pública e Resíduos Especiais (ABRELPE) (2013), 90,4% dos resíduos sólidos urbanos produzidos no Brasil em 2013 foram coletados, deixando de ser coletados mais de 20.000 toneladas/dia, consequentemente, tendo destino impróprio. Entre os resíduos sólidos urbanos coletados apenas 58,3% tiveram destinação final adequada, totalizando 28,8 milhões de toneladas que seguiram para lixões ou aterros controlados.

Nas usinas de compostagem as condições durante o processo são de alto teor de umidade e temperatura (entre 45 e 60º C), ou seja, atingindo-se temperaturas acima da temperatura de transição vítrea do PLA (52-58o C), propiciando sua degradação. O mesmo não acontece em solo e as embalagens ou resíduos do PLA descartados em lixões ou mesmo em aterros irão se degradar numa taxa muito lenta perdendo-se esta vantagem do material (RUDEEKIT et al., 2008). Como o PBAT tem sua Tg abaixo da temperatura ambiente, blendas de PLA com este polímero podem apresentar um favorecimento da degradação em solo.

Muitos estudos têm sido realizados sobre o processamento de PLA e PBAT, suas propriedades e suas blendas (SIGNORI et al., 2009; KUMAR et al., 2010; KUCHNIER; MORALES, 2014). Porém, muito pouco foi reportado sobre o comportamento de biodegradação em solo de suas blendas compatibilizadas, e o respectivo efeito toxicológico produzido.

Trabalhos realizados anteriormente pelo grupo de pesquisa indicaram que os resíduos gerados pela biodegradação por compostagem do PLA apresentaram um leve grau de toxicidade ao ambiente (SOUZA et al., 2013). Este efeito foi observado em estudos de genotoxicidade com o organismo teste Allium cepa. Os efeitos ecotóxicos de polímeros biodegradáveis, após compostagem ou degradação em solo são pouco estudados, sendo necessárias pesquisas adicionais, que possam trazer orientações para o destino destes materiais no ambiente.

Diante da relevância ambiental do estudo de polímeros biodegradáveis, suas aplicações e seus efeitos toxicológicos, este trabalho dá continuidade ao estudo de blendas com propriedades melhoradas através do uso de extensor de cadeia, com foco

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no processo de biodegradação em solo, mais compatível ao sistema brasileiro de descarte de resíduos.

1.1. Objetivos

Este trabalho tem como objetivo o estudo do comportamento de biodegradação em solo do PLA e do PBAT com adição de extensor de cadeia e de suas blendas compatibilizadas e a avaliação do potencial genotóxico e mutagênico dos resíduos da biodegradação, por meio de bioensaios com o organismo teste Allium cepa como bioindicador, verificando os danos causados em células meristemáticas radiculares.

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5 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1. PLA

O PLA é um polímero sintético biodegradável, derivado de fontes renováveis (JIANG; ZHANG, 2011), sendo o principal candidato no mercado emergente de bioplásticos. O PLA é um poliéster termoplástico produzido a partir do ácido lático, sendo que os métodos mais utilizados para sua produção é polimerização por condensação direta do ácido lático e a polimerização a partir da abertura do anel do lactídeo (o dímero cíclico do ácido lático) catalisada por Sn (II) (CARRASCO et al., 2010), sendo esta última a que resulta em polímeros com maiores massas molares (AURAS et al., 2004). Esta é a rota comercial mais eficiente para a obtenção do PLA de alta massa molar e foi patenteada pela Cargill em 1992 (KALE et al., 2006; RUDNIK, 2008; WENG et al., 2013).

Sua importância do ponto de vista ambiental está no fato do ácido lático necessário para produzir o PLA ser obtido por fermentação bacteriana dos carboidratos de produtos da agricultura como a sacarose e a glicose, sendo as fontes principais o milho, a cana de açúcar, batatas, mandioca e outras fontes renováveis de polissacarídeos (CARRASCO et al., 2010; KUMAR et al., 2010; JIANG; ZHANG, 2011; BRITO et

al., 2012; PIVSA-ART et al., 2013). Como o dióxido de carbono é absorvido pelas

plantas durante seu crescimento, a emissão de CO2 para a produção do PLA é reduzida quando comparada com outros polímeros convencionais (BOGAERT; COSZACH, 2000).

O PLA é um polímero que apresenta pouca susceptibilidade ao ataque de microrganismos no ambiente natural, sendo fortemente dependente das condições ambientais (HO; POMETTO, 1999; JAMSHIDIAN et al., 2010; TOKIWA; CALABIA, 2006). O PLA é considerado compostável, isto é, segundo a norma ASTM D6400-04, se degrada por processos biológicos durante a compostagem, produzindo dióxido de carbono, água, compostos inorgânicos e biomassa a uma taxa consistente com outros materiais compostáveis conhecidos, e que não deixa resíduos visualmente distinguíveis ou resíduos tóxicos (JAMSHIDIAN et al., 2010). Quando disposto nas condições de compostagem o PLA sofre primeiramente hidrólise tendo sua massa molar reduzida e depois é mineralizado a CO2 e H2O pelos microrganismos presentes após 45 a 60 dias a temperaturas entre 50 e 60 ºC. Estudos realizados em solo indicaram que o processo de

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degradação é muito lento, não iniciando para tempos menores que 6 semanas (JAMSHIDIAN et al, 2010; TOKIWA; CALABIA, 2006).

O PLA é um poliéster linear alifático, representado pela Figura 2. O PLA pode ser produzido a partir do L-acido lático, D-ácido lático e D-L-ácido lático. A quantidade de cada um destes estereoisômeros usados na produção do PLA influencia em suas propriedades mecânicas, cristalinidade e até mesmo na degradação (TÁBI et al., 2010). O PLA composto por mais de 93% de L-ácido geralmente é semicristalino, enquanto que PLA com composição entre 50 e 93% de L-ácido lático é estritamente amorfo (AURAS et al., 2004).

Figura 2- Estrutura química do PLA

Fonte: AL-ITRY et al., 2012

O PLA apresenta propriedades como rigidez e transparência semelhantes às de alguns polímeros a base de petróleo (JIANG; ZHANG, 2011; AL-ITRY et al., 2012), sendo uma alternativa aos polímeros convencionais como poliestireno (PS), polietileno tereftalato (PET) e polietileno (PE) (CARRASCO et al., 2010; TOKIWA; CALBIA, 2006; BALAKRISHNAN et al., 2010). Ele destaca-se por suas boas propriedades mecânicas como alta resistência e elevado módulo de elasticidade e é convenientemente processado em equipamentos industriais convencionais, com técnicas de processamento de polímeros já existentes (CARRASCO et al., 2010; PIVSA-ART et al., 2013). Apesar de todas suas vantagens, algumas propriedades do PLA como fragilidade, rigidez, baixa deformação de ruptura e baixa estabilidade térmica limitam sua aplicação em larga escala (AL-ITRY et al., 2012; JAMSHIDIAN et al., 2010).

Relatam-se largas aplicações do PLA no campo biomédico e farmacêutico devido às suas características de biocompatibilidade, sendo usado como material para implantes cirúrgicos, sistemas de administração de medicamentos e fibras para sutura (KUMAR et al., 2010; BRITO et al., 2012; JAMSHIDIAN et al., 2010). O PLA também pode ser aplicado na confecção de fibras para indústria têxtil, sacolas plásticas,

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filmes para agricultura, embalagens e itens de descarte rápido, como talheres e copos descartáveis (WENG et al., 2013; JAMSHIDIAN et al., 2010; BRITO et al., 2012).

2.2. PBAT

O poli (adipato-co tereftalato de butileno) (PBAT) é um copoliéster alifático aromático produzido a partir do petróleo, derivado principalmente de 1,4-butanodiol, ácido adípico e ácido tereftálico (ARRUDA et al., 2012; FUKUSHIMA et al., 2012). A fórmula estrutural do PBAT é representada pela Figura 3:

Figura 3- Estrutura química do poli (adipato-co tereftalato de butileno)

Fonte: Adaptado de Xiao et al., 2009

Ele é totalmente biodegradável em solo e em meio aquoso (AL-ITRY et al., 2012; JIANG; ZHANG, 2011), degradando-se em apenas algumas semanas por enzimas que ocorrem naturalmente (GU et al., 2008) e é certificado como compostável de acordo com as especificações da norma ASTM D6400-04, sendo que seu tempo de degradação depende do comprimento médio da cadeia dos blocos aromáticos (JIANG & ZHANG, 2011).

Os polímeros que possuem heteroátomos em sua estrutura e os que apresentam cadeias alifáticas são conhecidos por serem susceptíveis à ação biológica, já os compostos aromáticos são resistentes à ação de bactérias e fungos e à hidrólise, geralmente permanecem inalterados no ambiente, e apresentam um excelente padrão de propriedades físicas. O PBAT apresenta na sua cadeia polimérica uma estrutura aromática, porém, a existência dos heteroátomos, carbonila e cadeia alifática favorecem a ação de degradação (RUDNIK, 2008; FUKUSHIMA et al., 2012). O PBAT é resultado de estudos combinando unidades aromáticas e alifáticas na mesma cadeia de poliéster observando-se biodegradabilidade e bom desempenho pelo controle da proporção molar dos monômeros no copolímero (FUKUSHIMA et al., 2012). De acordo com Witt et al. (1997) e Yuan et al. (2009) copoliésteres alifáticos/aromáticos

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com unidades aromáticas entre 35 e 55% em mol proporcionam ótima biodegradabilidade e propriedades físicas. O PBAT vendido pela BASF com o nome comercial Ecoflex é considerado um copolímero aleatório ideal com 44% dos mols da unidade BT (RUDNIK, 2008).

O PBAT apresenta boa capacidade de processamento e boas propriedades mecânicas, semelhante às do polietileno (KIJCHAVENGKUL et al., 2010; ARRUDA

et al., 2012). O PBAT é biocompatível, flexível e possui maior alongamento na ruptura

que muitos poliésteres biodegradáveis (FUKUSHIMA et al., 2012; WENG et al., 2013). Devido às suas características, o PBAT tem despertado interesse em aplicações médicas e industriais, principalmente na área de embalagens (RUDNIK, 2006; FUKUSHIMA et al., 2012), filmes para agricultura, embalagem para alimentos, sacolas de compra e sacos para adubos (RUDNIK, 2008). As principais limitações do PBAT para tais aplicações são suas pobres resistências térmicas e mecânicas (FUKUSHIMA et

al., 2013).

2.3. Blendas Poliméricas

Uma blenda polimérica é uma mistura física de dois ou mais polímeros a fim de se obter um novo material com propriedades diferentes e superiores aos componentes individuais sendo que, geralmente, sua obtenção é mais barata e mais rápida que o desenvolvimento de novos monômeros e/ou novas rotas de polimerização (UTRACKI, 2003; HE et al., 2004). As blendas poliméricas possuem como vantagem em relação aos polímeros puros que suas propriedades podem ser adaptadas pela combinação dos componentes poliméricos, mudando a composição das mesmas (KUDVA et al., 1999; UTRACKI, 2003; HE et al., 2004; RUDNIK, 2008).

Do ponto de vista termodinâmico, todos os polímeros possuem alguma solubilidade em outros polímeros, porém essa solubilidade é geralmente muito baixa (OLABISI et al., 1979). As blendas podem ser classificadas como miscíveis, parcialmente miscíveis ou imiscíveis.

As blendas miscíveis são homogêneas ao nível molecular, e as suas propriedades finais são, geralmente, a média das propriedades dos componentes puros que fazem parte da sua constituição (UTRACKI, 2003; QUENTAL et al., 2010).

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Quental et al. (2010) afirmam que a maioria dos polímeros formam misturas heterogêneas, com exceção de alguns casos em que ocorrem interações específicas e fortes entre os diferentes componentes.

Blendas parcialmente miscíveis são homogêneas em condições específicas, como para determinadas composições e temperaturas e heterogêneas, quando apresentam separação de fases, embora estas fases sejam compostas pelos polímeros de origem da blenda (QUENTAL et al., 2010).

Nas blendas imiscíveis, a ausência de uma interação forte e favorável leva a uma separação de fases (ROSTAMI, 2001) e suas propriedades são as mesmas dos constituintes da blenda.

O termo compatibilidade é encontrado na literatura com vários significados. De acordo com Sabzi e Boushehri (2006) uma blenda compatível é uma blenda polimérica imiscível que exibe propriedades físicas uniformes macroscopicamente, para isso os componentes devem apresentar uma adesão interfacial onde esta adesão é mantida por forças intermoleculares, entrelaçamento de cadeias ou ambos. Para Utracki (2003) a compatibilidade é definida como a habilidade dos componentes poliméricos coexistirem tanto como moléculas miscíveis ou como fases morfologicamente distintas, mas com a interface estabilizada. Quental et al. (2010) ao estudar compatibilidade encontrou como uma das definições que uma blenda é compatível desde que atinja uma propriedade útil, caso contrário tem-se a incompatibilidade.

A maioria das blendas disponíveis comercialmente de polímeros imiscíveis são compatibilizadas por algum mecanismo específico. Existem várias formas de melhorar a compatibilidade, entre elas está a adição de uma pequena quantidade de um terceiro componente miscível em ambas as fases ou pela adição de um copolímero precisamente adaptado, em que um componente é miscível com uma das fases e o outro componente com a outra fase (UTRAKI, 2003).

O PLA tem sido utilizado em conjunto com vários polímeros, na produção de novas blendas, sendo o PBAT um destes (GU et al., 2008; SIGNORI et al., 2009; XIAO

et al., 2009; KUMAR et al., 2010; YEH et al., 2010; AL-ITRY et al., 2012; LIN et al.,

2012; WENG et al., 2013). O potencial do PBAT está relacionado ao seu fácil processamento e sua degradação completa no solo, em meio aquoso, e sob condições de compostagem e anaeróbicas (KIJCHAVENGKUL et al., 2010). De acordo com Al-Itry

et al. (2012), a adição do PBAT pode modificar as propriedades frágeis do PLA,

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propriedades físicas e morfológicas da blenda desempenham um papel importante na degradação.

O PLA foi reportado como sendo pouco compatível com o PBAT devido à sua imiscibilidade (YEH et al., 2010; AL-ITRY et al., 2012).

Para melhorar a miscibilidade entre os dois polímeros, alguns aditivos têm sido estudados tais como 1,6-hexanodiol diglicidil éter (DONG et al., 2013), glicidil metacrilato (GMA) (KUMAR et al., 2010), titanoato de tetrabutila (LIN et al., 2012) e anidrido maleico (MAH) (YUAN et al., 2009). Destaca-se a incorporação de aditivos extensores de cadeia, dentre eles o Joncryl® ADR-4368 que já vem sendo estudado pelo grupo de pesquisa e é o compatibilizante utilizado neste trabalho. Estudos indicaram que este aditivo promove melhorias na estabilidade térmica e nas propriedades mecânicas do PLA e do PBAT (AL-ITRY et al., 2012; KUCHNIER, 2014).

2.4. Extensores de cadeia

Os extensores de cadeia, em geral, são moléculas de cadeia bi ou poli-funcionais, termicamente estáveis e acessíveis (AL-ITRY et al., 2012). Eles promovem o aumento da massa molar dos polímeros a partir de reações com os grupos terminais de cadeia funcionalizados, podendo promover ramificações de polímeros lineares e melhorar a resistência térmica (ARRUDA et al., 2012).

Entre os extensores de cadeia descritos na literatura, os que contêm grupos epóxidos multifuncionais têm sido muito utilizados para poliésteres. Os grupos epóxidos reagem com ambos os grupos finais nucleofílicos –OH e –COOH dos polímeros (AL-ITRY et al., 2012; ARRUDA et al., 2012), conforme Figura 4.

Figura 4- (a) Reação do grupo epóxido com hidroxila formando éter e (b) Reação do grupo epóxico com

carboxila formando éster

Fonte: Adaptado de BRITO et al., 2012

De acordo com Villalobos et al. (2006) o Joncryl ® ADR-4368 é um extensor de cadeia oligomérico que possui nove grupos epóxidos. Segundo eles, a ação do Joncryl

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® se inicia com a extensão da cadeia e depois com a formação de grandes cadeias ramificadas. Este processo pode levar a formação do ponto de gel, no qual há uma formação excessiva de ramificações.

Xiao et al. (2009), Al Itry et al. (2012); Dong et al. (2013) e Kuchnier (2014) estudaram os efeitos da adição de extensor de cadeia nas blendas PLA/PBAT. Foi observado que estas blendas puras eram incompatíveis, com pobre adesão interfacial entre a matriz e a fase dispersa. A incorporação de Joncryl ® melhorou significativamente a compatibilidade das blendas e proporcionou estabilização das misturas, provavelmente devido às ligações ésteres na interface PLA/PBAT, em que os grupos epóxidos podem reagir com os grupos –COOH e –OH das cadeias do PLA e do PBAT durante o processo de fusão, conforme esquematizado na Figura 5.

Figura 5- Reação proposta entre poliésteres e extensor de cadeia.

P1 e P2 representam as cadeias de PLA e/ou PBAT, n=7. X representa as cadeias poliméricas (de P1 e/ou P2) reagidas e o grupo epóxido remanescente. Fonte: Dong et al., 2013

Dong et al. (2013) afirmam que, se P1 e P2 apresentados no esquema da Figura 5, são o mesmo tipo de polímero, então um homopolímero estendido ou ramificado é gerado. Se P1 e P2 forem polímeros diferentes então um copolímero em bloco ou enxertado é formado, que é o que ocorre na interface das blendas. Esses copolímeros formados in situ (ou seja, PLA-b-PBAT ou PLA-g-PBAT) na interface são responsáveis por aumentar a compatibilidade entre as fases PLA e PBAT.

Kuchnier (2014) analisou blendas de PLA e PBAT com e sem extensor de cadeia processados em drais e em reômetro de torque. Foi obtido como resultado das análises morfológicas, dos testes de resistência a tração e de resistência ao impacto que a adição do extensor de cadeia promoveu a compatibilidade entre os polímeros.

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Al Itry et al. (2012) estudaram o efeito do extensor de cadeia na degradação térmica da blenda 80%PLA/20%PBAT e reportaram em seu trabalho que o extensor aumenta a resistência térmica do material além de poder ser utilizado para ligar cadeias clivadas, aumentando a massa molar do polímero, sendo esse efeito mais pronunciado no PLA.

O extensor de cadeia Joncryl ® é utilizado para compensar as cisões das cadeias que ocorrem devido à degradação. Conforme descrito anteriormente, o anel epóxido do Joncryl ® pode reagir com os grupos hidroxila e carboxila dos poliésteres durante o processamento por fusão. A ligação resultante envolve reações de abertura do anel epóxi e a criação de ligações covalentes através da formação do grupo lateral hidroxila. O sistema resultante representa um conjunto complexo de reações simultâneas devido à degradação/extensão de cadeia/ramificação (AL-ITRY et al., 2012).

As Figuras 6 e 7 apresentam os mecanismos propostos para degradação por reação de transferência de hidrogênio, esterificação do grupo ácido carboxílico, eterificação do grupo hidroxila e abertura do anel epóxi para o PLA e para o PBAT, respectivamente.

Figura 6- Previsão do mecanismo de reação entre o PLA e o Joncryl.

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Figura 7- Previsão do mecanismo de reação entre o PBAT e o Joncryl

Fonte: Adaptado de Al-Itry et al., 2012

2.5. Biodegradação do PLA e do PBAT

Segundo Shah et al. (2008) biodegradação é qualquer mudança física ou química de um polímero resultante de fatores ambientais como luz, calor, umidade, condições químicas ou atividades biológicas. A biodegradabilidade não depende da origem da matéria prima – se é petroquímica ou de fontes renováveis (WITT et al., 2001).

Durante a biodegradação, exoenzimas de microrganismos quebram polímeros formando moléculas de cadeias curtas, ou seja, oligômeros, dímeros e monômeros, que são pequenas o suficiente para passar pelas membranas semipermeáveis externas de microrganismos e então serem utilizadas como fontes de carbono e energia. Quando os produtos finais são CO2, H2O ou CH4, a degradação é chamada mineralização (SHAH et

al., 2008). A Figura 8 representa o mecanismo de degradação de polímeros por

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Figura 8- Mecanismo geral de biodegradação de plásticos sob condições aeróbicas.

Fonte: Adaptado de Shah et al., 2008

Vários fatores podem afetar a degradabilidade dos polímeros devido à complexidade do sistema reacional, entre eles estão fatores associados ao polímero, como: massa molar, cristalinidade, área superficial, tipos de grupos funcionais presentes na estrutura e a presença ou não de plastificantes ou aditivos; e as características do meio como: umidade, temperatura, pH, tipos de microrganismos presentes e presença de aditivos, catalisadores ácidos ou básicos (AURAS et al., 2004; TOKIWA; CALABIA, 2006; RUDNIK, 2008; SHAH et al., 2008; AL-ITRY et al., 2012).

Segundo Auras et al. (2004) a cisão hidrolítica ocorre principalmente nas regiões amorfas entre as regiões cristalinas. Tokiwa e Calabia (2006) estudaram a degradação do PLA e observaram que a parte cristalina é mais resistente à degradação do que a parte amorfa, e a taxa de degradação diminui com o aumento da cristalinidade.

Geralmente, poliésteres com altas massas molarares apresentam menores taxas de biodegradabilidade do que aqueles com baixas massas molares. Altas massas molares resultam na diminuição da solubilidade dos polímeros em água, tornando-os desfavoráveis ao ataque microbiológico pois as bactérias requerem que o substrato seja assimilado através da membrana celular para depois ser degradado pelas enzimas celulares (TOKIWA; CALABIA, 2006; SHAH et al., 2008).

A degradação do PLA no meio ambiente é um processo complexo e relativamente lento, pois ele é altamente resistente ao ataque de microrganismos em solo (JAMSHIDIAN et al., 2010). Depois de vários meses exposto ao solo úmido o

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PLA começa a se degradar por hidrólise, que é a primeira etapa de degradação. Nesta primeira etapa ocorrem cisões aleatórias não enzimáticas na cadeia dos grupos ésteres, levando a uma redução na massa molar (AURAS et al., 2004; RUDNIK, 2008). Esta reação é auto catalisada pelos grupos terminais carboxílicos, uma vez que esta etapa pode ser acelerada por ácidos ou bases. A fragilização do polímero ocorre nessa etapa com redução na massa molar (AURAS et al., 2004). A degradação hidrolítica do PLA está representada na Figura 9.

Figura 9- Reação de hidrólise do PLA

Fonte: o Autor (2015)

O PLA pode ser digerido por microrganismos presentes no ambiente, desde que esteja desintegrado, porém, por possuir moléculas grandes demais para passar pelas membranas celulares, estes microrganismos não são capazes de fazer a bioassimilação do polímero antes que o processo de degradação hidrolítica esteja completo e o polímero seja reduzido a oligômero (AURAS et al., 2004; SHAH et al., 2008). Essa característica é útil principalmente em materiais que são utilizados para armazenar alimentos que ficam em contato direto (RUDNIK, 2008).

Em geral, temperaturas elevadas, aproximadamente 60 ºC, que são as temperaturas encontradas em algumas etapas da compostagem, causam uma degradação mais rápida do PLA, levando menos de um mês para que ocorra a degradação (AURAS

et al., 2004; JAMSHIDIAN et al., 2010; WENG et al., 2013).

Estudos realizados por Tokiwa e Calabia (2006) mostraram que os microrganismos capazes de degradar o PLA não estão amplamente distribuídos no

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ambiente natural, e por isso o PLA é menos susceptível ao ataque microbiológico em ambiente natural do que outros poliésteres alifáticos sintéticos e de origem microbiana. Estudos realizados por Torres et al. (1996) mostraram que entre 14 fungos testados, apenas dois deles: Fusarium Moniliforme e Penicilliu Roqueforti puderam assimilar DL-ácido lático, ou oligômeros racêmicos parcialmente solúveis.

Saadi et al. (2011) avaliaram o grau de mineralização do PLLA em solo e em composto esterilizados e inoculados com cinco fungos diferentes a 30 º C, em composto esterilizado e inoculado com fungos e em composto real (composto por fungos e bactérias) a 58 ºC. Eles observaram que o grau de mineralização em solo e em composto a 30 ºC foi de 9% e 5%, respectivamente, enquanto que em composto inoculado e em composto real a 58 ºC, o grau de mineralização foi de 90% para ambas condições. Eles concluíram que a degradação do PLLA é mais rápida em composto real do que em composto inoculado, isso ocorre devido à sinergia entre fungos e bactérias e principalmente devido à diversidade de enzimas liberadas no meio. Apesar do tempo de biodegradação ser diferente, o grau de mineralização alcançado foi o mesmo no final do teste (220 dias).

A Figura 10 apresenta os resultados obtidos para a biodegradação do PLLA e da celulose em solo esterilizado e inoculado com cinco fungos diferentes a uma temperatura de 30 ºC.

Figura 10- Teste de mineralização do PLA e celulose em pó a 30º C em solo esterilizado e inoculado por

fungos.

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Do estudo descrito anteriormente, foi observado que o PLLA apresentou maior grau de mineralização a 58 ºC do que a 30 ºC. Segundo Saadi et al. (2011) o PLLA no estado borrachoso permite uma melhor absorção de água na matriz polimérica. Os oligômeros solúveis podem então ser liberados por hidrólise no meio de degradação e, finalmente, ser assimilado pelos fungos. Além disso, em altas temperaturas, a conformação das cadeias poliméricas é mais acessível às enzimas dos fungos.

O PBAT pode ser degradado tanto em solo quanto em condições de compostagem, por isso ele é usado como filme plástico biodegradável (WENG et al., 2013). A biodegradação do PBAT também é causada pela hidrólise (representada pela Figura 11) e degradação microbiológica. Segundo Kijchanvengkul et al. (2010), a estrutura BA do PBAT é mais susceptível a hidrólise que a estrutura BT, e a taxa de biodegradação da porção amorfa do PBAT é mais rápida que a porção cristalina.

Figura 11- Mecanismo proposto para degradação hidrolítica do PBAT

Fonte: o Autor (2015)

A estrutura BT é mais resistente à hidrólise porém, as funções carboxílicas próximas ao anel benzênico também podem reagir com a água e quebrar as ligações representadas na Figura 13 (AL-ITRY et al., 2012).

Figura 12- Cisões da cadeia do PBAT

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Em outro estudo Saadi et al. (2013) avaliaram o grau de mineralização do PBAT em solo e em composto esterilizados e inoculados com cinco fungos diferentes a 30 º C, em composto inoculado com fungos e em composto real (composto por fungos e bactérias) a 58 ºC. Eles observaram que o grau de mineralização em solo e em composto a 30 ºC foi de 11% e 10 %, respectivamente, enquanto que em composto inoculado e em composto real a 58 ºC, o grau de mineralização foi de 35% e 32%, respectivamente. Eles concluíram que o grau de mineralização está relacionado com a temperatura e que o meio não teve grande influência na biodegradação. A Figura 12 apresenta o resultado obtido por Saadi e colaboradores (2013) para o grau de mineralização do PBAT e celulose em solo a 30 ºC em função do tempo.

Figura 13- Teste de mineralização do PBAT e celulose em pó a 30ºC em solo esterilizado e inoculado

por fungos.

Fonte: Adaptado de Saadi et al., 2013

Weng et al. (2013) estudaram o comportamento de biodegradação de uma blenda e observaram que a taxa de degradação do PBAT e do PLA na blenda foram diferentes das taxas de degradação dos respectivos polímeros sozinhos.

Existem vários testes que podem ser utilizados para determinar o grau de degradação dos polímeros, entre eles estão os testes respirométricos, os quais determinam a quantidade de dióxido de carbono liberado durante a degradação, testes que avaliam a perda de massa ou mudanças nas propriedades físicas como resistência a tração e comparação de dados obtidos pelas técnicas de FTIR, DSC, MEV e DRX (SHAH et al., 2008)

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19 2.6. Ecotoxicidade

De acordo com a EPA (Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos), ecotoxicidade é o estudo dos efeitos tóxicos que químicos promovem sobre os organismos, populações e comunidades. Testes ecotoxicológicos são ensaios realizados para avaliar o efeito de diferentes concentrações ou tempo de exposição de uma dada substância química sobre os organismos de um determinado ambiente, em comparação com organismos não expostos aos mesmos agentes (FERNANDES et al., 2007; CARITÁ; MARIN-MORALES, 2008; RUDNIK, 2008).

Segundo Rudnik (2008), a ecotoxicidade de materiais poliméricos se refere ao potencial toxicológico dos resíduos, chorume e gases voláteis produzidos durante sua biodegradação no ambiente. O principal objetivo da avaliação ecotoxicológica de polímeros compostáveis é garantir que não sejam liberadas substâncias nocivas ao meio ambiente, durante e depois da degradação.

Bioensaios com vegetais superiores são recomendados para a avaliação, monitoramento e detecção de contaminantes no ambiente (FISKESJÖ, 1985). O teste com Allium cepa (cebola), desenvolvido por Levan em 1938, é bastante conhecido e indicado como teste padrão para avaliar o potencial citotóxico e genotóxico de produtos químicos, como efluentes industriais (GRANT, 1982; FISKESJÖ, 1985; CUCHIARA et

al., 2012). Este teste possui elevada sensibilidade e baixo custo, além de apresentar

vantagens como grande número de células em divisão, alta tolerância à diferentes condições de cultivo, fácil manipulação, boa correlação com outros sistemas-teste e número reduzido de cromossomos (2n=16) de grande tamanho (GRANT, 1982; FISKESJÖ, 1985; LEME; MARIN-MORALES, 2009).

As células da ponta da raiz da cebola podem ser usadas para avaliar alterações tais como morfologia e crescimento da raiz (pela determinação do índice mitótico), indução de micronúcleos e metáfases e anáfases anormais (LEME; MARIN-MORALES, 2009).

Testes citogenéticos são comumente usados em biomonitoramento para se avaliar os níveis de poluição ambiental e para avaliar os efeitos tóxicos e genotóxicos de substâncias dispersas no ambiente natural (MATSUMOTO et al., 2006).

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2.6.1. Fitotoxicidade

A fitotoxicidade é qualquer efeito adverso, observado em vegetais, em decorrência da exposição desses organismos a uma substância tóxica (RUDNIK, 2008). Bioensaios de germinação de sementes e de crescimento de plantas são as técnicas mais comumente utilizadas para se avaliar a fitotoxicidade de um composto (KAPANEN; ITAVAARA, 2001 apud. MITELUT; POPA, 2011).

Embora um produto possa não impactar negativamente no crescimento das plantas a curto prazo, a longo prazo ele pode se tornar fitotóxico devido ao acúmulo de compostos químicos no solo. Esses compostos acumulados, podem interferir no desenvolvimento da cultura e, consequentemente, levar a uma redução da produtividade daquele solo, por isso são realizados vários testes de fitotoxicidade em compostos finais de polímeros degradados (RUDNIK, 2008; MARIANI, 2010; MITELUT; POPA, 2011).

2.6.2. Genotoxicidade

Os agentes capazes de causar danos ao material genético são conhecidos como agentes genotóxicos. Entre as alterações citogenéticas, consideradas genotóxicas, estão as C-metáfases, metáfases com aderências, metáfases e anáfases com perdas cromossômicas e anáfases e telófases com pontes cromossômicas. A presença destas ou outras alterações, na divisão celular, pode indicar que a substância tem ação sobre o material genético (CARITÁ; MARIN-MORALES, 2008).

2.6.3. Citotoxicidade

O índice mitótico (IM) é utilizado como parâmetro para avaliar a citotoxicidade de vários agentes. Ele é caracterizado pela razão entre as células em divisão celular e o total de células observadas (LEME; MARIN-MORALES, 2009).

A redução ou aumento do índice mitótico, comparado ao controle negativo, são indicadores importantes usados no monitoramento da poluição ambiental, principalmente para a avaliação de contaminantes que apresentam potencial tóxico e mutagênico. Conforme Leme e Marin-Morales (2009), índices mitóticos significativamente menores que o controle negativo podem indicar ação danosa de produtos químicos sobre o crescimento e desenvolvimento dos organismos expostos. Por outro lado, índices mitóticos muito maiores que o controle negativo são resultado de

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um aumento na divisão celular, que também pode ser prejudicial aos organismos, por poderem levar a uma proliferação desordenada de células e culminar na formação de tecidos tumorais (CARITÁ; MARIN-MORALES, 2008).

2.6.4. Aberrações cromossômicas

Aberrações cromossômicas são caracterizadas tanto pela mudança na estrutura como no número de cromossomos da espécie. Essas alterações podem ocorrer espontaneamente ou como resultado da exposição a produtos químicos ou físicos (LEME; MARIN-MORALES, 2009).

As aberrações cromossômicas estruturais são resultantes de quebras nos cromossomos, seguidas ou não da união dos fragmentos em novas posições, o que resulta em uma alteração na forma e/ou no tamanho de um cromossomo. Compostos capazes de iduzirem alterações estrututais nos cromossomos são reconhecidos como de ação clastogênica. Já as aberrações cromossômicas numéricas são caracterizadas pela alteração no número de cromossomos característico da espécie. As alterações cromossômicas numéricas podem ser de dois tipos, as aneuploidias e as euploidias. As aneuploidias são alterações que envolvem perdas ou acréscimos de um ou poucos cromossomos nas células, enquanto que as euploidia são alterações que envolvem aumento ou diminuição de todo o lote cromossômico da célula. As substâncias indutoras de alterações cromossômicas numéricas são conhecidos como agentes com ação aneugênica (LEME; MARIN-MORALES, 2009).

As alterações cromossômicas são consequências da segregação anormal dos cromossomos durante o processo de divisão celular, podendo ocorrer espontaneamente ou por ação de agentes genotóxicos (ALBERTINI et al., 2000). As alterações como pontes e quebras cromossômicas são indicadores de uma ação clastogênica, enquanto que perdas, atrasos, aderência, multipolaridade e C-metáfases são resultantes de efeitos aneugênicos (LEME; MARIN-MORALES, 2009).

As C-metáfases, anáfases multipolares, perdas cromossômicas e células poliploides podem indicar problemas no fuso mitótico. A interrupção na formação do fuso ou a sua mal formação podem levar a uma segregação cromossômica inapropriada, formando células filhas poliploides ou aneuploides. Brotos nucleares podem ser decorrentes de processos de poliploidização, onde o material amplificado é expulsado do núcleo. Neste processo, primeiro se observa a formação de um broto nuclear com o

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material excedente e, posteriormente, esse material é encontrado no citoplasma, na forma de um micronúcleo (FERNANDES et al., 2007).

O teste de aberrações cromossômicas realizados com Allium cepa fornece informações importantes e é considerado um teste eficiente na verificação do potencial genotóxico dos materiais analisados (CARITÁ; MARIN-MORALES, 2008; MAURO et

al., 2014).

A Figura 14 apresenta alguns exemplos de aberrações cromossômicas em células de Allium cepa.

Figura 14- Aberrações cromossômicas em células meristemáticas de Allium cepa

Fonte: Adaptado de Leme e Marin-Morales (2009)

2.6.5. Anormalidades nucleares

Outras alterações celulares que podem ser consideradas como endpoints de genotoxicidade são anormalidades nucleares, como núcleo lobulado, brotos nucleares, células polinucleadas, entre outras (FERNANDES et al., 2007; LEME, MARIN-MORALES, 2009; MAZZEO et al., 2011; SOUZA et al., 2013). De acordo com Leme e Marin-Morales (2008, 2009), a presença de núcleos lobulados e células polinucleadas pode indicar um processo de morte celular, uma vez que essas anormalidades não são

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observadas em células F1 das raízes de Allium cepa. A Figura 15 mostra algumas anormalidades nucleares que podem ser encontradas nas células meristemáticas de

Allium cepa expostas a agentes genotóxicos.

Figura 15- Alterações nucleares observadas em células meristemáticas de Allium cepa após exposição à

agentes químicos.

Fonte: Adaptado de Leme e Marin-Morales (2009) 2.6.6. Mutagenicidade

O teste de micronúcleos é considerado um dos testes mais adequados para se avaliar o potencial mutagênico de substâncias químicas, por ser um teste simples e rápido e fornecer resultados confiáveis (FENECH, 2000; FERNANDES et al., 2007; FLORES; YAMAGUCHI, 2008).

Os micronúcleos (MN) são pequenos corpos extra nucleares que aparecem nas células filhas após o processo de divisão celular (ALBERTINI et al., 2000). Essas estruturas são facilmente visualizadas como uma estrutura similar ao núcleo principal, mas de tamanho reduzido (LEME; MARIN-MORALES, 2009; ALBERTINI et al., 2000).

Os micronúcleos podem ser formados devido a ações clastogênicas ou aneugênicas (ALBERTINI et al., 2000; FERNANDES et al., 2007). As ações clastogênicas são caracterizadas pela indução de quebras cromossômicas durante a divisão celular, enquanto que as ações aneugênicas decorrem da inativação de estruturas citoplasmáticas da célula, como o fuso mitótico, alterando a distribuição equitativa dos cromossomos, e consequentemente, induzindo aneuploidia ou poliploidia (ALBERTINI

et al., 2000; FENECH, 2000; FERNANDES, 2007).

No caso de células poliploides, os micronúcleos ou brotos nucleares podem surgir como resultado do processo de eliminação do DNA excedente do núcleo principal, numa tentativa de reestabelecer as condições normais de ploidia (FERNANDES et al., 2007; LEME; MARIN-MORALES, 2009).

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Dentre as pesquisas de toxicidade realizadas com polímeros biodegradáveis, as mais usuais são as de fitotoxicidade (MITELUT; POPA, 2011) e as desenvolvidas com bactérias (WITT et al., 2001). Não é comum o uso de plantas na avaliação de genotoxicidade e mutagenicidade de solos ou produtos de compostagem contaminados por produtos da biodegradação de polímeros, embora esses organismos possam se desenvolver nestes ambientes e serem expostos a esses contaminantes.

A ecotoxicidade do PLA em condições de compostagem foi estudada previamente pelo nosso grupo de pesquisa (SOUZA et al., 2013). O teste foi realizado com o organismo Allium cepa exposto a solubilizados de composto com produtos de degradação do PLA. Por meio do índice mitótico foi observada uma inibição da divisão celular. Pelo índice de alterações cromossômicas foi observada a indução de efeitos genotóxicos. Em relação ao índice de mutagenicidade, não foram registrados resultados estatisticamente significativos, em relação ao controle. Os resultados indicaram um possível efeito aneugênico dos produtos de degradação do polímero (espécies resultantes da hidrólise do polímero e/ou resíduos de catalisador) presentes nas amostras dos solubilizados.

A ecotoxicidade do PLA, do PBAT e do extensor de cadeia Joncryl® é um tema pouco explorado, mas que necessita de maior aprofundamento nos estudos.

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25 3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Materiais

Para a realização deste estudo, foram utilizados os seguintes polímeros:

 Poli (adipato-co tereftalato de butileno) PBAT - Ecoflex® F BX 7011, fornecido pela BASF com 44% de unidades BT por mol. Tg=-29 oC, Tf=110-120 oC. Densidade = 1,27 g/cm3.

 Poli (ácido lático) (PLA) da NatureWorks®, de código Ingeo 4042D, foi fornecido pela empresa PLM. Tg = 52-58 oC; Tf = 150 oC. Densidade = 1,24 g/cm3. Massa molar média 74.000 g/mol. Segundo informação do fabricante (Natureworks) o teor de unidades D-ácido lático no PLA 4042D é 4,25 ±0,55 %.

 Extensor de cadeia Joncryl ADR-4368 fornecido pela BASF, possui uma cadeia oligomérica sólida e funcionalidade igual a 9. Densidade de 1,08 g/cm3 e Tg= 54ºC.

3.2. Preparo das amostras

Foram selecionados os materiais: PLA, PBAT e as blendas 75/25 (contendo 75% em massa de PLA e 25% de PBAT) e 25/75 (contendo 25% em massa de PLA e 75% de PBAT), todos com a adição de 1 pcr de extensor de cadeia Joncryl ADR-4368 a partir dos resultados obtidos nos estudos prévios de compatibilidade realizados por Kuchnier (2014).

Inicialmente os grânulos de PLA e PBAT foram secos, sendo que os grânulos de PLA ficaram em estufa por quatro horas a uma temperatura constante de 80º C e os grânulos de PBAT foram secos em estufa por um período de 40 minutos em uma temperatura constante de 70º C.

Após a secagem dos grânulos, as amostras foram processadas utilizando-se um reômetro de torque HAAKE Rheomix 600P (etapa realizada por Kuchnier). Todas as amostras foram processadas com velocidade de rotação de 120 rpm, por 5 minutos e temperatura de 180 °C.

As amostras, recebidas como massas disformes processadas no reômetro, foram colocadas entre duas placas de aço inox, sob a forma de um “sanduíche”, entre duas

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