Sabemos que as técnicas de cromatografia líquida de alta pressão são baseadas na interação entre uma fase móvel, composta por uma mistura de solventes adequados que carregará uma amostra pelo sistema, e uma fase estacionária composta por partículas sólidas porosas, superficialmente porosas ou até mesmo totalmente sólidas. Sabe-se também que na utilização da técnica de cromatografia líquid a, ao longo dos anos, com o avanço da química analítica e da tecnologia, desenvolveram-se uma série de mecanismos de separação, a partir da combinação de diferentes fases estacionárias e fases móveis, além de novas aplicações, de maneira a atender os desafios requisitados pelas novas legislações, bem como aumentar a qualidade das análises de produtos complexos em laboratório.
A seguir falaremos um pouco de cada mecanismo, assim será possível entender como e de que forma, eles o auxiliarão na sua rotina analítica.
Trata-se da utilização de uma matriz hidrofóbica ou de polaridade fraca combinada com o uso de solventes como água, acetonitrila e metanol com raras utilizações de tetrahidrofurano (THF). De maneira geral, esta técnica visa a separação de compostos de polaridade baixa e moderada, podendo separar alguns compostos de maior polaridade quando utilizados aditivos denominados pareadores iônicos, conforme abaixo.
Esta técnica é o completo oposto do mecanismo de fase reversa, utilizando solventes puramente orgânicos e isentos de água e uma fase estacionária de caráter mais polar, estas colunas são desenvolvidas para a separação de compostos de caráter polar.
Representação de uma fase estacionária em fase reversa, coluna ODS
As fases reversas podem ser constituídas a partir de diversas bases como sílica, polímeros diversos (álcool polivinílico, copolímero de estireno e divinilbenzeno, polimetacrilato, entre outros), carbono grafite e até óxidos de zircônio.
Algumas das fases estacionárias possuem funcionalidades que garantem comportamentos diversos e diferentes seletividades para as retenções de analitos tais como: grupos octadecil, octil, fenil, ciano e pentafluorfenil.
Quem trabalha com validações de métodos analíticos sabe que as colunas mais comuns e utilizadas são as colunas de sílica com funcionalidade de octadecil, conhecidas como colunas OctaDecylSilyl (ODS) ou como sua estrutura sugere, C18. Esta é uma fase estacionária excepcionalmente hidrofóbica, possibilitando a interação com a grande maioria dos analitos de diferentes polaridades e em diferentes pHs, sendo a fase mais indicada para o desenvolvimento de métodos de análise de compostos químicos na indústria farmacêutica.
Fase
normal:
Fase
reversa:
O termo HILIC significa cromatografia por interação hidrofílica, desenvolvida para permitir o trabalho de solventes de fase normal, com solventes de fase reversa.
Solventes de fase normal como hexano, são conhecidos pela sua agressividade com relação ao uso em equipamentos. Devida às características como sua alta volatilidade, existe uma probabilidade maior de ocorrência de fenômenos de cavitação e saturação dos desgaseificadores, em razão disto, seu uso deve ser evitado em alguns cromatógrafos.
Já os solventes na fase HILIC, além de proporcionarem a vantagem de trabalhar com agentes menos
voláteis e agressivos aos equipamentos, podem ser conciliados ao uso de cromatografia em fase
normal no mesmo cromatógrafo onde se trabalha fase reversa, evitando procedimentos tediosos de transição entre solventes de classes diferentes.
A fase HILIC, por utilizar solventes mais polares e usualmente na presença de soluções tamponadas, torna-se ideal para aplicações que envolvam espectrometria de massas com eletrospray, uma vez que a análise neste tipo de equipamento depende da ionização dos compostos a serem analisados e que não ocorre com eficiência em solventes apolares, frequentemente empregados em fases normais convencionais.
Fase
HILIC:
Analito
Analito
Camada
aquosa
Fase Móvel
＋
ACN
H
2O
Ligações de
hidrogênio
A sigla SEC significa cromatografia por exclusão de tamanho, trata-se de uma técnica perfeita para análises de macromoléculas. Essa técnica pode ser separada em dois subgrupos: a GPC (cromatografia por permeação em gel) que se resume na utilização de uma fase estacionária à base de copolímero de estireno e divinilbenzeno com solventes orgânicos fortes como THF ou clorofórmio de modo a analisar polímeros apolares como poliestireno e a GFC (cromatografia por filtração em gel), onde emprega fases aquosas com fases estacionárias de sílica ou polímero (como polihidróximetacrilato), sendo utilizada na separação de proteínas e outros polímeros polares (polissacarídeos, polietilenoglico, entre outros) respectivamente.
Fases
para SEC:
A cromatografia iônica realiza a análise de grupos de ânions ou de cátions. As matrizes de caráter iônico com grupos funcionais como carboxilas ou amônio são capazes de interagir com cátions ou ânions respectivamente e proporcionam dados importantes para setores de análises de águas por exemplo.
Fases
Iônicas:
A MOLÉCULA LARANJA É MAIOR QUE O PORO
SEPARAÇÃO BASEADA EM TAMANHO
As fases de cromatografia por afinidade são pouco conhecidas, mesmo assim possuem seu valor científico. Trata-se de uma matriz de natureza qualquer na qual moléculas ou macromoléculas específicas são imobilizadas de maneira a capturar e reter compostos específicos, liberados sob certas condições específicas.
Esta técnica se faz altamente interessante para aplicações envolvendo analitos de comportamento muito próximo, apesar de suas diferenças estruturais, geralmente também empregada no estudo de proteínas específicas.
Cromatografia
por afinidade:
As matrizes à base de estireno e divinilbenzeno com funcionalidade de grupos sulfonato e diferentes contra-íons, é capaz de promover o reconhecimento das diferentes posições de hidroxilas de mono e dissacarídeos, sendo uma ótima opção para trabalhos de análises de açúcares em meio 100% aquoso.
Fases de Troca
de Ligantes:
As fases quirais são desenvolvidas para a separação de enantiômeros, estruturas quimicamente parecidas com orientações espaciais de diferentes maneiras a se complementarem como imagens especulares uma da outra, conforme figura a seguir.
As fases mais comuns de caráter quiral são a base de sílica e polissacarídeos (amilose ou celulose) modificados, podendo ser somente revestidos ou imobilizados. Apesar das fases revestidas serem mais populares pelo seu custo reduzido, é interessante salientar a importância das fases
imobilizadas devido a sua resistência a uma quantidade maior de solventes, aumentando a
chance de êxito durante um desenvolvimento de métodos analíticos.
As fases quirais podem ser encontradas com outras fases para aplicações específicas como as de sílica ligada às proteínas, coroas de éter e até mesmo moléculas quirais com sítios de troca iônica como as Chiralpak ZWIX da Chiral Tech ou sítios de complexação com metais, como a ORpak CRX-853 da Shodex.
Fases
quirais:
O
O
Cu
HO
CH3
O
O
R’
R
NH
silica
Exemplo de cromatografia quiral a partir de mecanismos de complexação Exemplo de enantiômeros H3C H2N H NH2 H CH3
Enantiomero “esquerdo” de anfetamina
(Levoanfetamina) Enantiomero ‘’direito’’ de anfetamina(Dextroanfetamina)
Jan Josef Van Deemter foi um físico alemão, diretamente ligado à cromatografia. Em uma de suas publicações (VAN DEEMTER et al. 1956) descreve-se o termo altura equivalente a um prato teórico em colunas de cromatografia (HETP) como um parâmetro capaz de expressar a eficiência de uma coluna. O termo prato teórico faz referência à outras operações unitárias mais antigas que a cromatografia, como a destilação. De maneira geral, cada estágio, ou prato, de uma torre de destilação é responsável por estabelecer um equilíbrio entre as fases líquida e gasosa que se encontram fluindo em sentidos contrários dentro do sistema e de maneira extremamente resumida, o seu aumento de quantidade é um dos parâmetros responsáveis pela melhoria de separação entre componentes. Com o aparecimento de colunas de destilação com recheios, fez-se necessário o desenvolvimento de um termo que indicasse a equivalência entre uma coluna de destilação convencional e uma coluna de destilação com preenchimento, como é descrito por exemplo por Mendes et al. (2009).
A POLÊMICA EQUAÇÃO DE VAN DEEMTER PODE SER EXPLICADA DE MANEIRA
SIMPLES A PARTIR DA DEFINIÇÃO DE TRÊS TERMOS:
Onde:
A: Difusão de Eddy ou efeito de caminhos múltiplos B: Difusão axial
C: Resistência à transferência de massa HETP: Altura equivalente à um prato teórico V: Velocidade linear
Em termos gerais o termo HETP deve ser o menor possível, significando em outras palavras que quanto menor a altura de “pratos”, mais destes podem ser posicionados dentro de um mesmo espaço, possibilitando a existência de mais estágios de separação.
A difusão de Eddy ou efeito de caminhos múltiplos faz referência aos diferentes caminhos prováveis que uma molécula pode percorrer. Sendo o único termo que não depende da velocidade com a qual os analitos se deslocam, este termo depende única e exclusivamente da qualidade de uma coluna.
Capitulo 2:
Quem foi Van Deemter e por quê precisamos saber?
HETP = A + B + C • V
A qualidade do empacotamento, o tamanho e formato das partículas de sílica que o compõe são os parâmetros mais relevantes dentro do estudo da difusão de Eddy. A tecnologia de empacotamento otimizada, em conjunto com a utilização de partículas esféricas, livres de imperfeições e menores, reduzem drasticamente este efeito diminuindo, portanto, o número de pratos teóricos.
A difusão axial ou randômica, como descrita por alguns autores, é definida como o espalhamento natural que os analitos apresentam ao passarem por um meio qualquer, afinal de contas, a cromatografia é regida por fenômenos de transferência de massas.
A difusão axial passa a ser um problema, quando o espalhamento inapropriado dos analitos gera o alargamento dos sinais observados, resultantes do aumento de HETP e consequente perda de eficiência. Estes efeitos são muitas vezes provenientes de excesso de volume morto diante de falhas de montagens ou conexões no HPLC ou tamanho de coluna excessivo.
É importante perceber que o termo “v” se apresenta no denominador da segunda parcela da equação. Com razão, quanto maior o fluxo empregado em uma coluna (e por consequência, a velocidade linear empregada na coluna), mais rápido o grupo de moléculas é carregado, reduzindo
Partículas grandes
velocidade linear passa a prejudicar a eficiência de uma fase estacionária ao se tratar do terceiro parâmetro, portanto, o controle do termo C gira em torno da utilização de velocidades lineares que atinjam o ponto ótimo da coluna, já que velocidades lineares muito baixas podem trazer efeitos de difusão axial à tona. Outros fatores que podem afetar o termo C são o tamanho de partículas, que devem ser o menor possível e a qualidade da sílica, que deve ser o mais esférica e menos rugosa o possível, como elaborado por Guiochon e Gritti ( 2007).
Naturalmente o conhecimento da equação de Van Deemter se faz necessário para a compreensão de qualidades diferentes entre fases estacionárias de diferentes fabricantes, porém mais do que isso, o conhecimento deste tipo de informação nos permite entender as diferenças entre uma partícula totalmente porosa e superficialmente porosa (também conhecida como de núcleo sólido).
Alargamento da banda de analito
Superficie de Sílica
Difusão de moléculas de analitos atráves da fase móvel estagnada nos poros da partícula de sílica. Diferentes profundidades de penetração de analito podem gerar alargamento de banda.
Fase Móvel estagnada
núcleo da estrutura, teoricamente reduzindo os efeitos de resistência de transferência de massas mesmo em tamanhos de partícula maiores. As partículas de sílica da série HALO desenvolvidas pela Advanced Materials Technologies conta ainda com uma distribuição de tamanho de partículas altamente uniformes e características estruturais relacionadas aos seus poros que reduzem o termo HETP através principalmente do termo C (Guiochon e Gritti 2007).
A ltur a de pr at os t eor ic os , μm
Efeito do tamanho e tipo de partícula de silica na altura de pratos teóricos em uma fase estacionária. Colunas: 50x4.6mm, partículas totalmente porosas C18, 5 μm, partículas totalmente porosas C18, 3.5 μm, partículas totalmente porosas C18, 1.8 μm, HALO C18 2.7 μm.
Soluto: naftaleno, fase móvel:60% ACN/ 40% água 24 °C
5 μm Partícula totalmente porosa
3.5 μm Partícula totalmente porosa
2.7 μm Partícula de Núcleo Sólido
Com o conhecimento adquirido neste livro, podemos entender a relevância da compreensão da curva de Van Deemter, bem como o motivo por se estudar o desenvolvimento de partículas de núcleo sólido. Como pode-se perceber, as partículas de núcleo sólido de 2.7 µm atingem uma altura de pratos teóricos tão baixa quanto uma partícula totalmente porosa de 1.8 µm, com o diferencial de possuir uma pressão de trabalho menor devido ao seu tamanho maior.
Referências
GUIOCHON, G; GRITTI, F. Comparative study of the performance of columns packed with several new fine silica particles Would the external roughness of the particles affect column properties? Journal of Chromatography A, 1166 (2007) 30–46.
MENDES, M. et al. HETP evaluation of structured packing distillation column. Braz. J. Chem. Eng. vol.26 no.3 São Paulo July/Sept. 2009.
VAN DEEMTER, J.J. et al. Longitudinal diffusion and resistance to mass transfer as causes of nonideality in chromatography. Chemical Engineenng Science,1956,Vol 6,pp 271.
The Theory of HPLC. Chromacademy. Disponível em https://www.chromacademy.com/lms/sco3/Theory_Of_HPLC_ Band_Broadening.pdf COMPOSTOS: 1. Uracil (t0) 2. Fenoron 3. Monuron 4. Fluometuron 5. Diuron
COMPARATIVO DAS SEPARAÇÕES OBTIDAS ATRAVÉS DE UMA HALO-5 FUSED-CORE C18 E UMA C18 DE PARTÍCULAS TOTALMENTE POROSAS DE 3μ
Minutos A bsor bancia em 254nm HALO-5 C18 (5 μm): N=18,500 P=166 Bar G0056 2 1 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3 4 5 3 μm C18: N=20,000 P=306 Bar
