UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE VETERINÁRIA
ESPECIALIZAÇÃO EM ANÁLISES CLÍNICAS VETERINÁRIAS
GIARDÍASE – REVISÃO LITERÁRIA
FABIANA BARBOSA DO NASCIMENTO
Orientador: Profª. Drª. Silvia Gonzalez Monteiro
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL FACULDADE DE VETERINÁRIA
ESPECIALIZAÇÃO EM ANÁLISES CLÍNICAS VETERINÁRIAS
Título do trabalho: Giardíase – Revisão literária Autor: Fabiana Barbosa do Nascimento Monografia apresentada à Faculdade de Veterinária como requisito parcial no curso de Especialização em
Análises Clínicas Veterinárias Orientadora: Sílvia Gonzalez Monteiro
“Deus nos concede, a cada dia, uma página da vida nova no livro do tempo. Aquilo que colocarmos nela, corre por nossa conta.” Chico Xavier
RESUMO
Giardíase é uma doença caracterizada por diarréia aguda e crônica, que ocorre tanto em animais como em seres humanos. Giardia spp. é um gênero de extrema importância, devido ao seu alto poder zoonótico. O seu diagnóstico não pode ser feito de acordo com seu hospedeiro, devido aos vários genótipos encontrados através de estudos mais aprofundados quanto a sua biologia molecular. O objetivo do presente trabalho é esclarecer quais são os melhores métodos de diagnósticos, principais métodos em biologia molecular, suas vantagens e desvantagens.
Palavras-chave: Giardia spp; giardíase; diagnóstico. ABSTRACT
Giardiasis is an illness characterized for acute and chronic diarrhea, which occurs in such a way in animals as in human beings. Giardia sp. is a genus of extreme importance, due to its high potencial as zoonosis. Its diagnosis cannot be done in accordance with its host, as there are many “assemblages” found through studies considering its molecular biology. The objective of the present work is to clarify which are the best diagnosis methods, main methods in molecular biology, its advantages and disadvantages.
Key-words: Giardia spp.; giardiasis; diagnosis
Lista de ilustrações
Figura 1 - Trofozoíto de Giardia spp. ...8
Figura 2 - Ciclo de Giardia spp. ...9
Figura 3- Trofozoíto de Giardia spp. no intestino ...10
Figura 4 - Cisto de Giardia spp. corado com iodo ...17
SUMÁRIO 1 -INTRODUÇÃO ... 6 2 -Revisão de literatura ... 7 2.1-Características do parasita... 7 2.2- Patogenia...8 2.3- Ciclo de vida...8 2.4- Metabolismo...10 2.5- Espécies...11 2.6- Genótipos...11 2.7- Tipagem... 12
2.8- Análise eletroforética de proteínas...12
2.9- Epidemiologia...13
2.10- Diagnóstico... 14
2.11- Tratamento...19
2.12 – Profilaxia ...20
1 INTRODUÇÃO
Giardia sp. é um protozoário que parasita o intestino, tanto de animais como de humanos. O principal fator de contaminação é a ingestão de água contaminada (MILLER, 2007). É responsável por aproximadamente 1 bilhão de casos de diarréia que ocorrem no mundo (TEODOROVIC, 2007)
Existem vários métodos para o diagnóstico de Giardia, e a escolha varia de acordo com a sensibilidade e a especificidade desejada. O diagnóstico pode ser feito pela visualização direta dos cistos nas amostras de fezes (HUBER, 2003) ou pela visualização de trofozoítos que podem ser encontrados nos exames coprológicos diretos, porém como são muito frágeis, serão encontrados em casos de fezes diarréicas (DRYDEN, 2006). Os testes indiretos de diagnósticos estão sendo mais difundidos devido a sua alta sensibilidade e os mais utilizados são os testes de imunoabsorção de antígenos parasitários solúveis, tais como ELISA (HUBER, 2003) e PCR real time (GUY, 2004; BRINKMAN, 2006; VERWEIJ, 2003; SCHUURMAN, 2007).
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Características do parasita
Pertence a ordem Diplomonadida, tem motilidade ativa e se multiplica no intestino (BECK, 2005). O trofozoíta é piriforme, bilateral, simétrico e mede aproximadamente 10-12 µm de comprimento por 5-7 µm de largura. Possui quatro pares de flagelos e uma estrutura ventral encontrada exclusivamente no gênero Giardia, chamado disco ventral ou disco adesivo, estrutura que permite adesão do parasita no intestino (Figura 1).
O cisto de Giardia é oval, mede de 8-12 µm de comprimento e 7-10 µm de largura e possui uma parede exterior de glicoproteína que denota a forma cística. Possui dois a quatro núcleos, flagelos axonêmicos, alguns ribossomas e fragmentos dos discos ventral (GUIMARÃES; SOGAYAR; FRANCO, 1999) Existem vários genótipos diferentes de Giardia spp., porém todos são visualmente idênticos na microscopia óptica (TROUT, 2006)
2.2 Patogenia
Após a infecção, ocorre diarréia devido ao dano que os trofozoítos causam na mucosa intestinal, a resposta imune do hospedeiro, a alteração da bile e alteração da flora intestinal. Giardia spp. pode induzir a apoptose de pequenas células epiteliais intestinais. O rompimento da zona de oclusão aumenta a permeabilidade intestinal, resultando em má absorção (SCORZA, 2004)
2.3 Ciclos de vida
O ciclo evolutivo se dá em dois estágios: forma cística e forma trofozoítica (Figura 2). A contaminação ocorre pela ingestão de água ou alimentos contaminados pela forma cística. Os trofozoítos são liberados no intestino onde ocorre a fissão binária, onde algumas formas se fixam na mucosa do intestino e outras evoluem a cistos que são eliminados nas fezes (GONZÁLEZ & CERONI, 2008). Os cistos que forem excretados nas fezes dos hospedeiros podem permanecer viáveis por vários meses (GUIMARÃES; SOGAYAR; FRANCO, 1999). Segundo SCORZA (2004), a contaminação pode ser fecal-oral, pela ingestão direta de fezes contaminadas, pela ingestão de alimentos e água contaminados ou por fômites contaminados.
Figura 2. Ciclo de Giardia sp.
Fonte: http://www.kattenplaza.nl/afbeeldingen/Giardia_files/giardia_cyclus.jpg
Figura 3. Trofozoíto de Giardia sp. no intestino. Fonte: http://www.cdfound.to.it/img/giardia-06-400x.jpg
2.4 Metabolismo
É um protozoário microaerófilo que coloniza o trato intestinal de hospedeiros vertebrados. Possui metabolismo fermentativo e apesar disso, os trofozoítos de Giardia consomem oxigênio, necessitando de mecanismos de detoxificação. É desprovido de glutationa, expressa altas concentrações de proteínas ricas em cisteína como defesa antioxidante (ANJOS, 2005).
2.5 Espécies
O gênero Giardia pode ser dividido em três espécies: Giardia duodenalis, presente nos mamíferos, pássaros e répteis; Giardia muri presente nos roedores, pássaros e répteis e Giardia agilis parasitando anfíbios. Alguns estudos com microscopia eletrônica propõem a existência de mais duas espécies: G. pisittaci e G. ardeae, detectadas em papagaios e garça-real-azul. Segundo esse mesmo estudo Giardia lamblia e Giardia intestinalis são sinônimos de Giardia duodenalis e o uso desses nomes só aumentam a confusão na literatura científica (GUIMARÃES; SOGAYAR; FRANCO, 1999).
2.6 Genótipos
O hospedeiro de origem não pode ser usado como critério de classificação das espécies, visto que a única espécie encontrada tanto em mamífero quanto em animais vertebrados, de um modo geral, é a Giardia lamblia (BECK et al., 2005). Ultimamente tem sido reconhecido Giardia duodenalis (G. lamblia) como um complexo de espécies geneticamente distintas e caracterizadas. Existem 7 genótipos (“assemblages”) identificados. Os sete são reconhecidos da seguinte forma: Giardia duodenalis, assemblage A e B, únicas espécies capazes de contaminar humanos, porém encontradas em larga escala em outros
mamíferos; C e D, isolados dos cães; E, isolada dos rebanhos bovino, ovinos e em suínos; F isolada dos felinos e G, isolada de ratos (WINKWORTH et al., 2008; MISKA et al., 2009).
SOUZA (2007) sequenciou seis linhagens genéticas principais ( A, B, C, D, E e F ) a partir de um estudo com humanos, cães, gatos, bugios, bezerros, chinchilas, avestruzes, cachorros-do-mato e onça pintada; dentre esses genótipos (assemblages) existiam sub-genótipos. O sub-genótipo AII foi identificado apenas nas amostras de humanos, enquanto que AI foi identificado nas amostras de origem animal (gato, bezerro, onça-pintada). Os isolados de humanos, bugios, chinchilas e avestruzes foram caracterizados como pertencentes ao sub-genótipo BIV. Os demais assemblages foram identificados em apenas um tipo de hospedeiro. Os assemblages C e D foram encontrados nas amostras de cães e cachorro-do-mato, assemblage F apenas em gatos e assemblage E em bezerros.
2.7 Tipagem
Para a identificação dos assemblages de Giardia sp., os genes utilizados são o β – giardin proteína considerada única na Giardia spp. (WINKWORTH et al, 2008; GUY, 2004) e ssu-rRNA (subunidade ribossomal RNA) (TROUT, 2008).
2.8 Análises eletroforética de proteínas
A maioria dos estudos sobre giardíase utiliza gel de sulfato de acrilamida na eletroforese (SDS-PAGE) para a análise dos padrões de proteínas encontrados em vários tipos de Giardia. O conhecimento desses padrões de proteínas pode ajudar no conhecimento da virulência, antigenicidade, infectividade e resistência às drogas (GUIMARÃES; SOGAYAR; FRANCO, 1999).
2.9- Epidemiologia
A giardíase é cosmopolita, sendo principalmente encontradas em zonas tropicais e temperadas (BECK, 2005) como causa de doenças gastrointestinais em vertebrados. (SCORZA, 2004). Em Viçosa-MG, foram identificadas elevadas concentrações de protozoários (incluindo Giardia spp) em mananciais abastecedores; na água filtrada de estações de tratamentos, em efluentes de filtros lentos, nos esgotos sanitários, em fezes de animais contaminados, além de uma considerável prevalência nas fezes de um contingente populacional urbano estudado (HELLER, 2004).
Em lhamas de fazendas de Maryland nos EUA, foi detectada a presença desse flagelado do genótipo (Assemblage) A, utilizando a técnica te PCR, com primers específicos para genes ss-r RNA (TROUT, 2008). O parasita acomete mamíferos, aves, anfíbios, répteis e mais frequentemente humanos, sendo considerado o protozoário mais comum na América do Norte. As maiores prevalências são encontradas nos animais jovens principalmente até um ano de idade (BECK, 2005; ANDERSON, 2004).
2.10 Diagnóstico
O diagnóstico da giardíase pode ser feito de diversas maneiras. As formas mais utilizadas são os exames coprológicos que possibilitam a identificação dos cistos do parasita na avaliação microscópica. A técnica mais utilizada para visualização dos cistos é a flutuação em sulfato de zinco a 33%, porém é uma técnica pouco sensível se realizada uma única vez, demonstrando sensibilidade de até 70% devido à liberação de cistos nas fezes ser intermitente (ANDERSON, 2004). Quando o número de análises de fezes é triplicado, essa sensibilidade
diagnóstico desse parasito. Muitos “pseudoparasitas” como debris e restos de plantas, podem ser confundidos com Giardia por técnicos menos experientes. A identificação também está comprometida devido a ausência de micrômetros nos microscópios utilizados frequentemente, incapacitando a observação de cistos entre 8 a 10 µm. Algumas soluções de flutuação podem causar alteração na forma ou destruir os cistos, dificultando também sua visualização (DRYDEN, 2006).
Em exames de fezes contendo muco, podem ser encontrados trofozoítos, identificados através de exame direto acrescido de uma gota de lugol para facilitar a visualização. Caso não se observe a presença de trofozoítos no exame direto, um exame de flutuação com solução de sulfato de zinco com densidade de 1.18 a 1.20 deve ser realizado, pois essa é a técnica de eleição para diagnóstico de cistos de Giardia. Soluções de flutuação com açúcar ou sal podem deformar os cistos. Se as fezes estiverem esteatorréicas, a técnica de formaldeído-éter deve ser a escolhida. Imunofluorescência indireta é uma técnica com 100% de especificidade em humanos, porém essa e especificidade não foram comprovadas em gatos (SCORZA, 2004).
A técnica de sedimentação por formaldeído–éter possui a vantagem de retirar gorduras e fibras presentes nas fezes facilitando a identificação do parasita, porém como nessa técnica não é analisada toda a amostra, devido a ser retirada apenas uma parte do sedimento para visualização por microscopia óptica, ocorre uma diminuição na possibilidade de encontrar os cistos (HUBER, 2003).
A confecção da solução de flutuação de sulfato de zinco a 33% deve ser com densidade controlada a 1,18, caso contrário pode acarretar a destruição do cisto. Embora essa técnica seja a mais utilizada e mais indicada, não descarta os outros problemas citados acima
(2006) foram realizados exames de fezes com as técnicas de flutuação em sulfato de zinco a 33%, flutuação com solução de açúcar de Sheater com densidade de 1,27 e SNAP (teste de presença de antígeno fecal do laboratório, Idexx) onde obteve-se 94 % de sensibilidade nos exames feitos com solução de flutuação com sulfato de zinco a 33%. Todas as amostras que foram submetidas ao SNAP deram positivas, mesmo não tendo sido encontrados cistos em outras técnicas. VIDAL & CATAPANI (2005) realizaram um estudo relacionando as vantagens e desvantagens do método de ELISA quando comparado a microscopia óptica e concluiu que o teste de ELISA é indicado quando se quer alta sensibilidade, pois foram encontrados resultados positivos mesmo em amostras negativas na microscopia. Porém, devido ao baixo custo, os autores recomendam o método de microscopia, corrigindo sua baixa especificidade em uma única amostra, com a realização de três amostras.
Em um estudo realizado em Santa Catarina, com fezes humanas, foi comparada a técnica de imuno-separação acoplada à imunofluorescência (IMS-IFA) com as técnicas de Faust e Lutz para o diagnóstico desse flagelado. Esse estudo demonstrou que na IMS-IFA, obteve-se maior sensibilidade e que a utilização dessa metodologia possibilita o processamento de várias amostras ao mesmo tempo, aumenta a recuperação de cistos de Giardia lamblia e reduz o tempo de estocagem das amostras (SOUZA et al., 2003). Segundo GUY (2004), os métodos de diagnósticos microscópicos, ELISA e técnicas de imunofluorescência, são testes qualitativos e não distinguem os diferentes genótipos do flagelado, além de não serem altamente sensíveis ao ponto de detectar a presença dessa parasita. Alguns testes rápidos de diagnóstico podem ser encontrados no comércio e ficam prontos em até 10 minutos, porém muitos falsos negativos podem ocorrer quando a amostra apresenta uma quantidade de parasita muito baixa (> 175 cistos/10 µm). Técnicas moleculares, como o PCR são alternativas para esse problema. A partir do uso e da
parasito, usando combinações de RFLP (restriction fragment lenght polymorphism), nested-PCR. A mais recente técnica utilizada é a PCR em tempo real que é uma técnica de alta sensibilidade e espeficificidade (GUY, 2004; BRINKMAN, 2006; VERWEIJ, 2003; MUNDIM, 2003). MÜLLER & STERLING (2007) demonstraram que a técnica de nested-PCR também possui alta sensibilidade e especificidade.
Em ensaios imunoenzimáticos com o teste ColorPac para Giardia/ Cryptosporidium ensaio rápido (Beckton and Dickinson, Sparks) e ProspecT para Giardia/Cryptosporidium ensaio em microplaca para detecção de Giardia e Cryptosporidium (Alexon-Trend, Ramsey) nas fezes, foram encontrados 98,7% e 98,1% de especificidade respectivamente e 100% de sensibilidade nos dois testes, no entanto foram encontrado 3 resultados falso positivos no teste ProspecT para Giardia e Cryptosporidium e no Colorpac 1 resultado falso positivo para Cryptosporidium, porém ainda não foram esclarecidos os motivos (KATANIK et al., 2001). O uso de ensaio em microplaca ProspecT mostra-se ser um excelente método devido a sua alta sensibilidade e especificidade e ao rapidez no resultado, podendo chegar a 90% de sensibilidade e 98,3% (MACHADO, 2000). A ocorrência de falsos positivos com o teste ColorPac resultou na retirada desses testes do mercado pelo fabricante (GUY, 2004).
Figura 4. Cisto de Giardia sp. corado com iodo. Fonte: www.dpd.cdc.gov/.../body_Giardiasis_il1.htm
2.11 Tratamento
O tratamento mais usado para a giardíase em caninos são o metronidazol, fenbendazole e febantel. Algumas cepas de Giardia isolada de humanos apresentam resistência ao metronidazol. O fenbendazole é menos eficaz do que o metronidazol. O albendazol possui efeito giardicida, porém causa problemas na medula óssea (ANDERSON, 2004). Em gatos o uso do albendazol causou neutropenia (SCORZA, 2004). A associação de praziquantel, palmoato de pirantel e febantel possui efeito giardicida em cães. O febantel após metabolizado forma uma série de metabólitos, dentre eles o fenbendazole, que possui efeito contra o flagelado (ANDERSON, 2004).
O uso de metronidazol na dose de 15 a 25 mg/kg, por via oral, BID por 5 a 7 dias e fenbendazole na dose de 50 mg/kg via oral, diariamente por 3 a 5 dias é usado frequentemente em gatos. Vômito, inapetência, toxicidade nervosa central, podem ocorrer com o tratamento com o metronidazol, porém a toxicidade nervosa só ocorre em tratamentos prolongados e em doses muito elevadas (SCORZA, 2004). Nitazoxanida (NTZ) é um anti-helmíntico veterinário conhecido pela sua ação contra Giardia lamblia, Entamoeba histolytica, Cryptosporidium parvum e pelo seu efeito em bactérias anaeróbias que infectam tanto homens quanto animais. Também demonstrou atividade in vitro contra Neospora caninum. Esta droga é utilizada frequentemente nos EUA para tratamento de mieloencefalopatia equina causada por Sarcocystis neurona e o tratamento de diarréia crônica causada por Giardia lamblia e Cryptosporidium parvum (SCORZA & LAPPIN, 2003).
Devido ao uso popular de plantas no tratamento das parasitoses intestinais, especialmente a giardíase, efeitos colaterais de drogas e ao aumento da resistência dos
naturais que tivessem propriedade giardicida e quais as possibilidades de terapias. Foi constatado nesse estudo que as espécies advindas das famílias Asteraceae, Fabaceae, Rutaceae e Verbenaceae possuem atividade giardicida (AMARAL, et al., 2006).
Spelmann (1985) realizou um estudo para analisar a eficácia do uso de tinidazol e metronidazol no tratamento de giardíase em humanos. A dose de tinidazol usada foi de 50 mg/kg chegando ao máximo de 2 g por paciente tratado. A dose de metronidazol utilizada foi de 60 mg/kg chegando ao máximo de 2,4 g por paciente. Os pacientes tratados com tinidazol tiveram uma eficácia de 94 % e com metronidazol de 56 %.
Segundo GARDNER & HILL (2001), secnidazol pode ser usado no tratamento para giardíase, podendo ser usado da mesma forma que o tinidazol, em dose única. A dose utilizada em humanos é de 2 g por paciente ou 30 mg/kg em crianças, sendo comprovado uma eficácia de 85% quando utilizado dessa forma em adultos e em crianças apresenta o mesmo efeito do uso de 7 a 10 dias de metronidazol. O uso de secnidazol pode levar ao aparecimento de distúrbios gastrointestinais, porém desaparecem quando suspenso o tratamento.
2.12 Profilaxia
O melhor meio de contaminação de Giardia spp. é através de água e alimentos contendo cistos. O uso de água filtrada, fervida e a desinfecção de áreas contaminadas diminuem a possibilidade de infecção por esse flagelado e outros parasitas gastrintestinais (SCORZA, 2004). No Brasil é encontrada para venda uma vacina chamada Giardia Vax que auxilia na eliminação dos cistos, diminuindo a contaminação do ambiente, diminui o potencial zoonótico da doença e garante imunidade por um ano (FORT DODGE, 2001).
O uso de vacina para Giardia spp. induz uma resposta imune específica em filhotes com uma rápida eliminação dos trofozoítos, mesmo que esteja com alto grau de contaminação, passando a ser uma forma de controlar os animais doentes e impedir a contaminação de animais sadios (OLSON, MORCK.; CERI, 1996).
A vacina reduz o número cistos e previne os sinais clínicos de giardíase em cães, foi licenciada no Canadá e consiste de trofozoítos inativados quimicamente. Essa vacina só deveria ser usada em casos de giardíase crônica em cães, ou quando o tratamento realizado não obtém sucesso (ANDERSON, 2004). O efeito da vacinação em felinos é desconhecido e não se sabe ainda se ela protege efetivamente os felinos de Giardia sp.
3 CONCLUSÃO
A Giardia é um parasito de extrema importância em saúde pública, devido ao seu alto poder zoonótico. O uso de água filtrada e/ou fervida, tanto para uso humano quanto para animais domésticos, diminui a possibilidade de contaminação, principalmente em crianças.
Deve-se escolher o exame de melhor sensibilidade e especificidade para diagnosticar giardíase, tanto em humanos quanto em animais. Nem sempre a técnica de maior sensibilidade é a de maior especificidade ou vice-versa, devendo se escolher a de maior facilidade de realização, de acordo com as condições financeiras do proprietário e o intuito desse diagnóstico. Análises extremamente específicas e sensíveis ainda não são viáveis para rotina clínica de algumas regiões, devido ao elevado custo.
O uso de soluções de flutuação produzidas inadequadamente ou análise da lâmina num tempo posterior a 10 minutos após o seu processamento pode levar a distorção dos cistos de Giardia sp., levando a diagnósticos errôneos. A solução da técnica de flutuação com sulfato de zinco a 33% deve ser confeccionada usando um hidrômetro para se obter uma densidade específica entre 1,18 e 1,21. Mesmo com tantas técnicas mais modernas, extremamente específicas e sensíveis, esta continua sendo a melhor opção, devendo ser realizado o exame de três amostras para aumentar a sensibilidade em até 96%.
É um gênero que apesar das evoluções em diagnóstico, necessita ainda muitos estudos para realizar a sua classificação genética.
A vacinação dos cães também é um fator a se considerar para diminuir o grau de infecção em animais e há a necessidade de estudos para avaliar o seu potencial em outras espécies animais.
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