UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Estudo Farmacognóstico e Determinação da
Atividade Biológica de Caesalpinia pyramidalis Tull. e
Schinopsis brasiliensis Engl. frente a cepas de
Staphylococcus aureus MRSA Multirresistentes
Antonio Marcos Saraiva
Antonio Marcos Saraiva
Estudo Farmacognóstico e Determinação da Atividade Biológica
de Caesalpinia pyramidalis Tull. e Schinopsis brasiliensis Engl.
frente a cepas de Staphylococcus aureus MRSA Multirresistentes
Orientadora: Profª. Dra. Maria Nelly Caetano Pisciottano Co-Orientador: Prof. Dr. Haroudo Satiro Xavier
Recife – 2007
Dissertação de Mestrado, submetida ao
Programa de Pós-graduação do
Departamento de Ciências Farmacêuticas do
Centro de Ciências da Saúde da
Universidade Federal de Pernambuco, como requisito à obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Saraiva, Antônio Marcos
Estudo farmacognóstico e determinação da atividade biológica de Caesalpinia pyramidalis Tull. e Schinopsis brasiliensis Engl. frente a cepas de Staphylococcus aureus MRSA multirresistentes / Antônio Marcos Saraiva. – Recife : O Autor, 2007.
XXI, 110 folhas : il., fig., tab., gráf., quadros.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCS. Ciências Farmacências, 2007.
Inclui bibliografia, anexos e apêndice.
1. Caesalpinia pyramidalis Tull – Estudo farmacognóstico . 2. Schinopsis brasiliensis Engl. – Estudo farmacognóstico. 3. Staphylococcus aureus MRSA multirresistentes. I. Título.
615.33 CDU (2.ed.) UFPE
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Reitor
Prof. Amaro Henrique Pessoa Lins
Vice-Reitor
Prof. Gilson Edmar Gonçalves e Silva
Pró-Reitor para Assuntos de Pesquisa e Pós-Graduação
Anísio Brasileiro de Freitas Dourado
Diretor de Centro de Ciências da Saúde
Prof. José Thadeu Pinheiro
Vice-Diretor de Centro de Ciências da Saúde
Prof. Márcio Antônio de Andrade Coelho Gueiros
Chefe de Departamento de Ciências Farmacêuticas
Profº. Dra. Jane Sheila Higino
Vice-Chefe de Departamento de Ciências Farmacêuticas
Prof. Samuel Daniel de S. Filho
Coordenador de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
Prof. Dr. Pedro José Rolim Neto
Vice-Coordenador de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
DEDICATÓRIA
Este trabalho é dedicado em especial ao nosso criador, que foi quem iniciou esta jornada, e também em Memória de Antonio Saraiva Neto, meu pai, e José Martins da Silva, grande amigo e irmão.
À minha mãe, Betinha Saraiva que acreditou e não desistiu de mim, me apoiando nos estudos, quanto tudo influenciava para o contrário e bancando meus estudos, no momento mais conturbado de nossas vidas.
À minha esposa Cristiane Lopes, pelo companheirismo, amizade, apoio e compreensão nos momentos de ausência do lar.
Às minhas Irmãs, Margareti, Maria da Saúde, Glecia e Glaudey pelo carinho e amizade que superaram a ausência destes onze anos, sendo que no início houve uma grande perda em nossas vidas, e claro aos meus sobrinhos: o trio parada dura: Rhaênio, Rhaeny e Rhaênia; a dupla dinâmica: Marquinhos e Matheus; e aos pequenos: Vitória, Alexandre e Henrique, todo o carinho do tio Ninho.
Aos meus tios, excepcionalmente a Cornélio Marcolino, Socorro Marcolino, Beto Marcolino, Manuel Marcolino e José Marcolino (em memória), pela amizade, dedicação e ensinamentos que me fortaleceram em toda minha vida.
Aos meus avós: (em memória) Vicente Saraiva e Antônia Gomes; João Marcolino e Almerinda de Jesus, que são anjos em minha vida, trazendo a pura, limpa e cristalina alegria, nos ensinamentos e na vida.
Aos meus sogros, Luís Lopes e Ivã Maria, que também fizeram parte desta nova caminhada, pelo apoio e amizade.
À Profª. Dra. Nelly Caetano, que faz parte de minha vida desde 1999, quando me orientou na Iniciação Científica (1999-2001), até hoje me ensina e me auxilia na pesquisa e nos estudos científicos e ensino.
Ao Prof. Dr. Haroudo S. Xavier, que tão bem me recebeu em seu Laboratório e o disponibilizou-me para que se realizassem todos os ensaios que assim fosse necessários, como também sempre se dispôs a compartilhar seus conhecimentos, orientando-me e ensinando-me.
Ao Ms. Risonildo Pereira, aos Farmacêuticos Rogério Ribeiro, Admário Gonçalves, À mestranda Mirtes Gonçalves e a técnica Edna de Menezes por todo o suporte técnico e profissional no desenvolvimento da pesquisa.
Ao Ms. José Guedes, a Mestra Jovita Braga e Dra. Karina Randau pela ajuda, companheirismo e dedicação na elaboração deste trabalho.
AGRADECIMENTOS
Em especial a Deus, minha esposa Cristiane Lopes, minha mãe Betinha Saraiva e meu pai Antonio Saraiva, que foram sempre um espelho de dignidade, garra e fé para mim, onde eu procurava refletir minha imagem. As minhas irmãs Margareti, Maria da Saúde, Glecia e Glaudey, ao meu tio, Cornélio Marcolino, enfim a todos os meus familiares pela ajuda nos trabalhos e na vida, pela força com uma palavra amiga e confortadora, pela compreensão nos momentos de estresse dos trabalhos árduos, que é para o pesquisador brasileiro, enfim, pelo companheirismo em todos os momentos.
Á Profª. Nelly Caetano, minha Orientadora e ao Prof. Haroudo S. Xavier, meu co-Orientador, pela amizade, auxílio e orientação nos estudos que propiciaram a formulação e desenvolvimento desta Dissertação.
Aos Amigos e Colegas do Laboratório de Análises Microbiológicas1 e do Laboratório de Farmacognosia2: Risonildo P. Cordeiro1, Admário Marques1, Edna Menezes1, Mirtes Gonçalves1, Rogério Ribeiro Soares1, Fabrício Mendes1, Verônica W. Pereira2, Diogo Florencio2, Jovita Braga2, José Guedes Sena Filho2, Karina Randau2, Evani Lemos2, Clébio Pereira2, Kesia Pontual2, Eliane2 pelo companheirismo, amizade e apoio nesta longa jornada do mestrado.
A todos os Colegas de Mestrado, pelo companheirismo, dedicação e amizade.
Aos Professores do Curso de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas-UFPE, pela dedicação, comprometimento e disponibilidade de compartilhar seus conhecimentos com todos os alunos.
À Profª. Dra. Agnes M. S. Figueiredo, e em seu nome a todos aqueles de fazem parte do Laboratório de Biologia Molecular de Bactérias, Instituto de Microbiologia, UFRJ, por classificarem a clonacidade das cepas de S. aureus .Multirresistentes (cepas do estudo de dissertação do Prof. Ms. Risonildo Pereira Cordeiro) estudadas frentes aos estratos de
Caesalpinia pyramidalis Tull. e Schinopsis brasiliensis Engl.
À Profª. Dra. Rejane Pimentel (UFRPE) pela amizade, dedicação e ajuda na elaboração deste trabalho.
À Profª. Dra. Ivone Antônia de Souza, pelo profissionalismo e apoio na realização deste trabalho.
Á Prof. Dra. Rita de Cássia Pereira, e em seu nome a todos que fazem parte da Empresa Pernambucana de Pesquisa Agropecuária (IPA), por classificar as espécimes, lá enviadas e depositadas.
Aos Membros da Banca Examinadora: Profª. Dra. Nelly Caetano (Presidente da Banca), Dra. Karina Randau, Profª. Dra. Janete Magali de Araújo, Prof. Dr. Harouldo S. Xavier, Profª. Dra. Rejane Magalhães de Mendonça Pimentel por participarem da banca de defesa de minha dissertação.
EPÍGRAFE (
A Porta do Tempo
A Porta do Tempo
A Porta do Tempo
A Porta do Tempo)
Quando a tampa do tempo destampa e o vento vai
Mas a porta do tempo é sem tampa e o vento vem
Quem tá leve voa, quem tem o pé no chão não cai
Quando a tampa do tempo destampa o bem querer
Acende as estrelas, a lua, o sol dourado
O futuro é o presente, não nega o passado
A têmpera do movimento eternizado
Universo no tempo destampado
Quando a porta do tempo destampa a alegria
Só se vê revoada de passarinho na vida
e o passarinho da vida é a alegria.
Quando a tampa do tempo destampa o tempo
E a chuva carinhosa renova a terra,
Agradece os animais, a pedra bruta,
O mar, as grutas e a luta dos ancestrais
Quando a porta do tempo destampa a emoção
que os olhos enchem os rios que enchem o mar
O choro às vezes lava o coração
e o coração limpo é pérola
Com a graça de Deus estou vivendo,
pela graça de Deus o sol clariando
Quero chegar na clareza mas onde estou comigo está
Meu jaboti, meu papagaio, minha juriti, meu sabiá
A lua, o sol, o sol que é o mesmo clarão,
brilho que a lua nos dá
Rios, pontes, porteiras, estrada aberta
Rios, pontes, ladeiras, caminho de chegar
Com a graça de Deus estou vivendo,
pela graça de Deus o sol clariando
No início da vida abriu-se o tempo
Tempo que não vai retornar
Quem entrou na roda do tempo é
pra ser só o tempo é quem dirá
A palavra do tempo é a prática
A semente que no homem brota
Com chuva ou com sol há de nascer
Nasceu não tem volta
Com a graça de Deus estou vivendo,
pela graça de Deus o sol clariando
Quando a vida destrancou a porta
Do tempo derramou semente
Da água, do fogo, do vento,
Minerais, vegetais, bicho e gente
Quanto tempo não se sabe ainda
Pro tempo o eterno é um segundo
Enquanto houver planta florida
É tempo de gente no mundo
Enquanto houver água tem vida
E é tempo de gente no mundo
Com a graça de Deus estou crescendo,
pela graça de Deus o sol clariando
Compositor: Juraildes da Cruz
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS / SIGLAS... XI LISTA DE FIGURAS... XIV LISTA DE TABELAS... XVI LISTA DE QUADROS... XIII LISTA DE GRÁFICOS... XIX RESUMO... XX ABSTRACT... XXI
1. INTRODUÇÃO... 23
1.1. As plantas como “Antibióticos Naturais”... 25
1.2. Staphylococcus aureus... 27
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA... 30
2.1. Caesalpinia pyramidalis Tull. – Caesalpinaceae... 31
2.1.1. Botânica... 31
2.1.2. Uso popular... 32
2.2.3. Estudos fitoquímicos... 32
2.2.4. Atividade antimicrobiana... 36
2.2. Schinopsis brasiliensis Engl – Anacardiaceae... 36
2.2.1. Botânica... 37
2.2.2. Uso popular... 39
2.2.3. Estudos fitoquímicos... 39
2.2.4. Atividade antimicrobiana... 41
2.3. Staphylococcus aureus - MRSA Multirresistentes... 42
2.3.1. Histórico de Resistência... 43 3. OBJETIVO... 46 3.1. Objetivo Geral... 47 3.2. Objetivo Específico... 47 4. CONCLUSÃO... 48 5. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA... 51 6. ANEXOS 6.1. Anexo I 6.2. Anexo II 6.3. Anexo III 6.4. Anexo IV 7. APÊNDICE
7.1. Artigo I - Antimicrobial Activity and Phytochemical Screening of
Schinopsis brasiliensis Engl (Anarcadiaceae) Resumo
Abstract Introduction
Material And Methods Plant Material
Crude Extract Preparation Microorganisms
Plate-Hole Diffusion Assay
Phytochemical Profile Results
Discussion References
7.2. Artigo II - Antimicrobial Activity And Phytochemical Profile Of
Caesalpinia Pyramidalis Tull (Fabaceae) Abstract
Introduction
Material and Methods Plant Material
Crude Extract Preparation Microorganisms
Plate-Hole Diffusion Assay
Minimum Inhibitory Concentration (MIC) Phytochemical Profile
Results Discussion References
7.3. Artigo III - Determinação da Atividade Antimicrobiana de
Schinopsis brasiliensis Engl. (Anacardiaceae) frente a cepas de Staphylococcus aureus MRSA Multirresistentes
Resumo Introdução
Materiais e Métodos Coleta e Identificação Preparação dos Extratos Bactérias
Preparação dos Inóculos
Técnica Poços / Difusão Em Agar
Determinação da Concentração Mínima Inibitória
Cromatografia em Camada Delgada (CCD) / Estudo Fitoquímico Bioautografia
Resultados
Atividade Antimicrobiana Discussão
Referência Bibliográfica
7.4. Artigo IV - Determinação da Atividade Antimicrobiana de
Caesalpinia pyramidalis Tull. (Fabaceae) frente a Cepas de Staphylococcus aureus MRSA Multirresistentes
Resumo Introdução
Materiais e Métodos Coleta e Identificação Preparação dos Extratos Bactérias
Preparação dos Inóculos
Determinação da Concentração Mínima Inibitória
Cromatografia Em Camada Delgada (CCD) / Estudo Fitoquímico Bioautografia
Resultados
Atividade Antimicrobiana Discussão
XI
LISTA DE ABREVIATURAS / SIGLAS
µg.mL-1 - micrograma por mililitro
µl - Microlito
AcOH - Ácido acético
AM - Código da Coleção do Laboratório de Análises Microbiológicas –
Depto. de Ciências Farmacêuticas - UFPE
ATCC - American Type Culture Collection
B. subtilis - Bacillus subtilis
BCA - Braúna Casca extraída em Acetato de etila
BCM - Braúna Casca extraída em Metanol
BCVM ou BVCM - Braúna Casca da Vagem extraído em Metanol
BFA - Braúna Folha extraída em Acetato de etila
BFH - Braúna Folha extraída em Hexano
BFLA - Braúna Flor extraída em Acetato de etila
BFLH - Braúna Flor extraída em Hexano
BFLM - Braúna Flor extraída em Metanol
BFM - Braúna Folha extraída em Metanol
Bp - Pares de base
BPVM - Braúna Pó da Vagem extraída em Metanol
BRA - Braúna Casca da Raiz em Acetato de etila
BRM - Braúna Casca da Raiz extraída em Metanol
BSM - Braúna Semente extraída em Metanol
BuOH - Butanol
C. albicans - Candida albicans C. pyramidalis - Caesalpinia pyramidalis
cAM373 - código de Staphylococcus aureus
CA-MRSA e CA-SAMR
- Staphylococcus aureus cepa comunitária
CDC - Center for Disease Control Prevention
CEB ou BEC - Clone epidêmico Brasileiro
Cip - Ciprofloxacina
COL - Clones de S. aureus de Multirresistente
DMSO - Dimetilsulfóxido
DNA - Desoxirribonucleotídeo
Dnase - Enzima Desoxirribonuclease
E. coli - Escherichia coli E. faecalis - Enterococcus faecalis
Eri - Eritromicina
EtOAc - Acetato de Etila
EUA - Estados Unidos da América
FDA - Food and Drug Administration
Gen - Gentamicina
GISA - Staphylococcus aureus com sensibilidade intermediária aos
glicopeptídeos
XII
Hex - Hexano
M. smegmatis - Mycobacterium smegmatis
Mdr - Multidrogas Resistência
Me2CO - Acetona
mec - Gene que codifica a PBP
mecA - Gene que codifica a PBP2’ ou PBP2a
MeOH - Metanol
mg.mL-1 - miligramas por mililitro
MH - Muller Hinton
MIC ou CMI - Concentração Mínima Inibitória
Mm - milímetro
MRSA252 - Clones de S. aureus de Multirresistente
MRSA - Staphylococcus aureus Meticilina Resistente
MSSA476 - Clones de S. aureus de Multirresistente
MSSA - Staphylococcus aureus Meticilina Sensibilidade
Mu50 - Clones de S. aureus de Multirresistente
MW2 - Clones de S. aureus de Multirresistente
N. crassa - Neurospora crassa
N315 - Clones de S. aureus de Multirresistente
NaCl - Cloreto de Sódio
NCCLS - National Committee for Clinical Laboratory Standards
NCTC8325 - Clones de S. aureus de Multirresistente
NNISS - National Nosocomial Infections Survellance Systen
NT - Não Testado
Oxa - Oxacilina
OMS - Organização Mundial de Saúde
PBP - Proteína Fixadora de Penicilina
PBP2’ ou PBP2a - Proteína Fixadora de Penicilina de menor afinidade
Pen - Penicilina
S. aureus - Staphylococcus aureus S. brasiliensis - Schinopsis brasiliensis S. haemolyticus - Staphylococcus haemolyticus
SCCmec - Staphylococcus Chromossomal Cassete
Si - Sílica
Szt - Sulfametoxazol/Trimetroprima
Tet - Tetraciclina
TLC - Cromatografia em camada delgada
TSST - Toxinas da Síndrome do Choque Tóxico
UFC - Unidade Formadora de Colônia
UFPE - Universidade Federal de Pernambuco
UV - Ultravioleta
v/v - Volume/volume
Van - Vancomicina
VanA - Gene de resistência à vancomicina
VAnB - Gene de resistência à vancomicina
XIII VISA - Staphylococcus aureus com sensibilidade intermediária a Vancomicina
VRSA - Staphylococcus aureus Resistente a Vancomicina
XIV
LISTA DE FIGURAS Revisão Bibliográfica
Figura 1 - Hábito de Caesalpinia pyramidalis Tull... 31
Figura 2 - Folhas, Flores e Vagem de Caesalpinia pyramidalis... 32
Figura 3 - Hábito de Schinopsis brasiliensis Engl... 37
Figura 4 - Folhas e Flores de Schinopsis brasiliensis... 38
Figura 5 - Vagem de Schinopsis brasiliensis... 38
Anexo I
Figura 1 - Poços/difusão em agar - ATCC 6538 - CCM e CCA
Figura 2 - Poços/difusão em agar - ATCC 6538 - CFLM e CSM
Figura 3 - Poços/difusão em agar - ATCC 6538 - CVM e CVA
Figura 4 - Poços/difusão em agar – Clone Esporádico, AM-594 - BCM e BCA.
Figura 5 - Poços/difusão em agar – Clone Epidêmico Brasileiro, AM-723 - CFM e CFA
Figura 6 - Poços/difusão em agar – Clone Pediátrico, AM-922 - CVM e CVA
Figura 7 - Poços/difusão em agar – Clone Pediátrico, AM-942 - CVM e CVA
Figura 8 - Poços/difusão em agar – Clone Esporádico, AM-594 - BFM e BFA
Figura 9 - Poços/difusão em agar – Clone Pediátrico, AM-922 - BCM e BCA
Figura 10 - Poços/difusão em agar - ATCC 6538 - BFM e BFA.
Figura 11 - Poços/difusão em agar – Clone Pediátrico, AM-942 - BRM e BRA
Figura 12 - Poços/difusão em agar – Clone Pediátrico, AM-922 - CCM e CCA.
Figura 13 - Poços/difusão em agar – Clone Epidêmico Brasileiro, AM-723 - CFLM e CSM.
Anexo II
Figura 1 - Bioautografia – BFLA-CFLA-CFA-CCA-BFA
Figura 2 - Bioautografia – BFM-BCM-BRA-BFLM-BCA
Figura 3 - Bioautografia – BFA.
Figura 4 - Bioautografia – CFM-CFLM
Anexo III
Figura 1 - CCD – Pesquisa de Catequinas – Schinopsis brasiliensis
Figura 2 - CCD – Pesquisa de Catequinas Caesalpinia pyramidalis.
Figura 3 - CCD – Pesquisa de Monoterpenos - Schinopsis brasiliensis
Figura 4 - CCD – Pesquisa de Monoterpenos - Caesalpinia pyramidalis
Figura 5 - CCD – Pesquisa de Polifenois – Schinopsis brasiliensis
Figura 6 - CCD – Pesquisa de Polifenois - Caesalpinia pyramidalis.
Figura 7 - CCD – Pesquisa de Açúcares Redutores – Schinopsis brasiliensis.
Figura 8 - CCD – Pesquisa de Açúcares Redutores - Caesalpinia pyramidalis.
Figura 9 - CCD – Pesquisa de Terpenos – Schinopsis brasiliensis e
Caesalpinia pyramidalis
Figura 10 - CCD – Pesquisa de Monoterpenos – Schinopsis brasiliensis BFLM .
XV
Figura 11 - CCD – Pesquisa de Polifenois – Schinopsis brasiliensis BFLM
Anexo IV
Figura 1 - Placa de Oxacilina CMI 256 µg.ml-1
.
Figura 2 - Placa de Oxacilina CMI 128 µg.ml-1
Figura 3 - Placa de Tetraciclina CMI 64 µg.ml-1
.
Figura 4 - Placa de Schinopsis brasiliensis – BFM - CMI 0,5 mg.mL-1
Figura 5 - Placa de Schinopsis brasiliensis – BRM - CMI 0,5 mg.mL-1
Figura 6 - Placa de Schinopsis brasiliensis – BCA - CMI 1 mg.mL-1.
Figura 7 - Placa de Schinopsis brasiliensis – BCA - CMI 0,5 mg.mL-1
Figura 8 - Placa de Schinopsis brasiliensis – BRM - CMI 1 mg.mL-1.
Figura 9 - Placa de Caesalpinia pyramidalis – CRM - CMI 1 mg.mL-1.
Figura 10 - Placa de Caesalpinia pyramidalis – CRM - CMI 0,5 mg.mL-1
Figura 11 - Placa de Controle – meio Agar Muller Hinton
Figura 12 - Placa de Controle – DMSO 5%.
Apêndice 7.3 - Artigo III
Figura 1 - Bioautografia de Schinopsis brasiliensis – BFM, BCM, BFLM e BCA.
Figura 2 - Bioautografia de Schinopsis brasiliensis – BFA e BFLA.
7.4 - Artigo IV
Figura 1 - Bioautografia de Caesalpinia pyramidalis – CFM e CFLM
XVI
LISTA DE TABELAS
Anexos
Tabela 1 - Síglas dos anexos (I, II, III e IV)
Apêndice
7.1 - Artigo I - Antimicrobial Activity and Phytochemical
Screening of Schinopsis brasiliensis Engl. (Anacardiaceae)
Tabela 1 - Part of the Plant used and the yield (%)
Tabela 2 - Chromatography condition of phytochemistry screening of S.
brasiliensis
Tabela 3 - Results of the phytochemical analyses
Tabela 4 - Antimicrobial activities of the n-hexane, ethyl acetate and methanol extracts.
Tabela 5 - Minimum inhibitory concentration (MIC) of the microorganism
7.2 - Artigo II - Antimicrobial Activity and Phytochemical Profile
of Caesalpinia pyramidalis Tull (Fabaceae)
Tabela 1 - Part of the Plant used and the yield (%).
Tabela 2 - Chromatography condition of phytochemistry screening of
Caesalpinia pyramidalis.
Tabela 3 - Results of the phytochemical analyses
Tabela 4 - Antimicrobial activities of the n-hexane, ethyl acetate and methanol extracts.
Tabela 5 - Antimicrobial activities of the n-hexane, ethyl acetate and methanol extracts.
7.3 - Artigo III - Determinação da Atividade Antibacteriana de
Schinopsis brasiliensis Engl. (Anacardiaceae) frente a cepas de Staphylococcus aureus MRSA Multirresistentes
Tabela 1 - Extratos de Schinopsis brasiliensis (Baraúna)
Tabela 2 - Cepas de Staphylococcus aureus
Tabela 3 - Sistemas cromatográficos utilizados para screening fitoquímico de
Schinopsis brasiliensis Engl
Tabela 4 - Atividade antimicrobiana dos extratos extraídos em metanol de
Schinopsis brasiliensis sobre cepas de Staphylococcus aureus
MRSA Multirresistente - Clone Epidêmico Brasileiro (BEC).
Tabela 5 - Atividade antimicrobiana dos extratos extraídos em acetato de etila de Schinopsis brasiliensis sobre cepas de Staphylococcus aureus MRSA Multirresistente - Clone Epidêmico Brasileiro (BEC).
Tabela 6 - Atividade antimicrobiana dos extratos extraídos em metanol sobre cepas de Staphylococcus aureus MRSA Multirresistente - Clone Pediátrico
Tabela 7 - Atividade antimicrobiana dos extratos extraídos em acetato de etila de Schinopsis brasiliensis sobre cepas de Staphylococcus aureus MRSA Multirresistente - Clone Pediátrico
Tabela 8 - Atividade antimicrobiana dos extratos extraídos em metanol de
Schinopsis brasiliensis sobre cepas de Staphylococcus aureus
XVII ATCC.
Tabela 9 - Atividade antimicrobiana extratos extraídos em acetato de etila de
Schinopsis brasiliensis sobre cepas de Staphylococcus aureus
MRSA Multirresistente - Clone Esporádico, MSSA e Padrões ATCC.
Tabela 10 - Valores dos Rfs, referente às zonas de inibição dos extratos de
Schinopsis brasiliensis obtidos nas bioautografias em CCD, frentes
a S. aureus ATCC 6538
7.4 - Artigo IV - Determinação da atividade antimicrobiana de
Caesalpinia pyramidalis Tull. (Fabaceae) frente a cepas de Staphylococcus aureus MRSA Multirresistentes
Tabela 1 - Extratos de Caesalpinia pyramidalis (Catingueira)
Tabela 2 - Cepas de Staphylococcus aureus
Tabela 3 - Sistemas cromatográficos utilizados para screening fitoquímico de
Caesalpinia pyramidalis Tull
Tabela 4 - Atividade antimicrobiana dos extratos extraídos em metanol de
Caesalpinia pyramidalis sobre cepas de Staphylococcus aureus
MRSA Multirresistente - Clone Epidêmico Brasileiro (BEC).
Tabela 5 - Atividade antimicrobiana dos extratos extraídos em acetato de etila de Caesalpinia pyramidalis sobre cepas de Staphylococcus aureus MRSA Multirresistente - Clone Epidêmico Brasileiro (BEC).
Tabela 6 - Atividade antimicrobiana dos extratos extraídos em metanol sobre cepas de Staphylococcus aureus MRSA Multirresistente - Clone Pediátrico
Tabela 7 - Atividade antimicrobiana dos extratos extraídos em acetato de etila de Caesalpinia pyramidalis sobre cepas de Staphylococcus aureus MRSA Multirresistente - Clone Pediátrico.
Tabela 8 - Atividade antimicrobiana dos extratos extraídos em metanol de
Caesalpinia pyramidalis sobre cepas de Staphylococcus aureus
MRSA Multirresistente - Clone Esporádico, MSSA e Padrões ATCC.
Tabela 9 - Atividade antimicrobiana extratos extraídos em acetato de etila de
Caesalpinia pyramidalis sobre cepas de Staphylococcus aureus
MRSA Multirresistente - Clone Esporádico, MSSA e Padrões ATCC.
Tabela 10 - Valores dos Rfs, referente às zonas de inibição dos extratos de
Caesalpinia pyramidalis obtidos nas bioautografias em CCD,
XVIII
LISTA DE QUADROS
Revisão Bibliográfica
Quadro 1 - Levantamento bibliográfico dos isolados de Caesalpinia pyramidalis Tull...
33
Quadro 2 - Levantamento bibliográfico dos isolados de Schinopsis brasiliensis
XIX
LISTA DE GRÁFICOS
Apêndice 7.3 - Artigo III
Gráfico 1 - Atividade antimicrobiana de Schinopsis brasiliensis frente a S. aureus - Conc. 10 mg.mL-1 – Extratos de extração Metanólica
Gráfico 2 - Atividade antimicrobiana de Schinopsis brasiliensis frente a S. aureus
- Conc. 10 mg.mL-1 – Extratos de extração em Acetato de Etila.
Gráfico 3 Atividade antimicrobiana de Schinopsis brasiliensis frente a S. aureus - Conc. 5 mg.mL-1 – Extratos de extração Metanólica
Gráfico 4 Atividade antimicrobiana de Schinopsis brasiliensis frente a S. aureus - Conc. 5 mg.mL-1 – Extratos de extração em Acetato de Etila
7.4 - Artigo IV
Gráfico 1 - Atividade antimicrobiana de Caesalpinia pyramidalis frente a S.
aureus - Conc. 10 mg.mL-1 – Extratos de extração Metanólica
Gráfico 2 - Atividade antimicrobiana de Caesalpinia pyramidalis frente a S.
aureus - Conc. 10 mg.mL-1 – Extratos de extração em Acetato de Etila.
Gráfico 3 Atividade antimicrobiana de Caesalpinia pyramidalis frente a S.
aureus - Conc. 5 mg.mL-1 – Extratos de extração Metanólica.
Gráfico 4 Atividade antimicrobiana de Caesalpinia pyramidalis frente a S.
XX
RESUMO
O aumento da resistência bacteriana aos antibióticos é uma ameaça à saúde da população mundial, aumentando as recorrências por doenças infecciosas, devido ao surgimento de bactérias multirresistentes que dificulta e onera o tratamento antimicrobiano. Um exemplo importante destes germes, é o S. aureus MRSA que no Brasil, como em outras partes do mundo, são os microorganismos frequentemente isolados, tendo sua maior prevalência a nível hospitalar, sendo também uma importante causa de infecções na comunidade. A ocorrência de S. aureus MRSA multirresistentes susceptíveis só a vancomicina, constitui um grave problema a resolver, ainda mais, com o surgimento recente de cepas de S. aureus com susceptibilidade intermediária e resistentes a vancomicina. Deste fato, é de fundamental importância, a pesquisa de compostos alternativos, principalmente a partir de plantas medicinais que constitui uma fonte inesgotável de novas moléculas. No presente trabalho, foram escolhidas duas plantas para estudar o perfil fitoquímico e antimicrobiano:
Caesalpinia pyramidalis Tull. (Catingueira), das leguminosas e Schinopsis brasiliensis
Engl. (Baraúna ou braúna), das anacardiáceas, ambas as famílias com representantes de reconhecida atividade biológica, incluída a antimicrobiana. Neste sentido foi estudada a atividade dos extratos secos (por extração hexanólica, em acetato de etila ou metanol) da folha, casca do caule, casca da raiz, flor, vagem e semente da Braúna e Catingueira inicialmente frente a padrões ATCC de bactérias Gram negativas e Gram positivas, confirmando-se uma melhor ação para Staphylococcus aureus. Na segunda etapa os ensaios foram realizados com 22 cepas de Staphylococcus aureus, 18 isolados clínicos MRSA multirresistentes identificados como Clones Epidêmicos, 2 isolados S. aureus MSSA e 2 cepas padrões ATCC. Dos resultados obtidos para as plantas em estudo, a Schinopsis
brasiliensis apresentou melhor atividade sobre as cepas de S. aureus, inclusive os clones
epidêmicos mais resistentes. Os extratos secos de extração metanólica foram mais ativos com dados de CMI para a flor e raiz de Braúna de 125 µg.mL-1 quanto que pela técnica de poços foram obtidos para uma das cepas de Staphylococcus aureus MRSA multirresistente (CEB) halos da ordem de 20 mm. Os extratos secos de extração por acetato de etila mostraram-se menor ação, o que pode ser atribuído à uma difusão diminuída no agar. Nos testes, os antibióticos usados como padrão foram tetraciclina e oxacilina na determinação das CMI e tetraciclina na técnica de poços, confirmando a oxacilina o caráter MRSA ou MSSA das cepas e a tetraciclina seu perfil de resistência. Os dois diluentes utilizados DMSO à 50% e Tween 80 à 4% não apresentaram nenhuma inibição. Concluindo, considera-se que as plantas em estudo e particularmente a Schinopsis brasiliensis apresentou uma atividade promissora sobre as cepas de S. aureus MRSA inclusive os clones multirresistentes, considerando-se que em parte esta atividade é justificada pela presença de flavonóides e, especialmente, ácidos fenólicos que foram detectados experimentalmente por bioautografia confirmando dados da literatura e por “screening” fitoquímico.
Palavras Chaves: Schinopsis brasiliensis, Caesalpinia pyramidalis, Atividade
Antimicrobiana, Staphylococcus aureus MRSA multirresistentes, Clone Epidêmico Brasileiro, Clone Pediátrico, Clone Esporádico, Bioautografia.
XXI
ABSTRACT
The increase of bacterial resistance to antibiotics is a threat to the health of the global population, expanding the recurrence of infectious diseases due to the emergence of multiresistant bacteria, which makes the antimicrobial treatment difficult and costly. An important example of these germs is the MRSA Staphylococcus aureus which in Brazil, and also in other parts of the world, are the microorganisms frequently isolated, in the majority of cases at hospital level, being also an important cause of infections in communities. The occurrence of multiresistant MRSA S. aureus susceptible only to vancomycin represent a serious problem to be resolved, moreover since the appearance of recent strains of S. aureus with intermediate susceptibility and resistant to vancomycin. This fact is of fundamental importance for the study of alternative compositions, particularly on the base of medicinal plants which represent an unexhausted source of new molecules. In the present work, two plants have been chosen to study their phytochemical and antimicrobial action of medical plants: Schinopsis brasiliensis Engl. (Baraúna or Braúna), Anacardiaceae, both families with representatives of well known biological activity, including an antimicrobial one. In this sense has been studied the activity of dry extracts (by hexanolic extraction, in ethyl acetate extraction and methanol extraction) of the leaf, the bark of the Stem, the bark of Roots, the flower, the bean (fruit) and seed of Braúna and Catingueira. Initially, in accordance with ATCC standards of negative Gram and positive Gram bacteria in which a better action against S. aureus was confirmed. In the second phase the tests were performed with 22 strains of S. aureus,18 multiresistant MRSA clinic isolates identified as Epidemic Clones, 2 MSSA S. aureus isolates and 2 ATCC strains. The results obtained from the plants in study, S. brasiliensis presented better activity against the strains of MRSA S. aureus including the more resistant epidemic clones. The dry metanolic extracts were more active with CMI data for the flower and root of Braúna of 125 µ g.mL-1 inasmuch as inhibition zones in the order of 20 mm obtained by the techniques of wells were found regarding one of the strains of multiresistant Methicillin-Resistant S. aureus (BEC). The dry extracts obtained by ethyl acetate demonstrate less action, which can be attributed to a diminished diffusion in the agar. In the tests, the antibiotics used as a standard were tetracycline and oxacilin in the determination of MIC and tetracycline in the techniques of wells, which confirmed attribution to oxacilin the MRSA or MSSA character regarding the strains and to tetracycline its resistant profile. The two dilutants used, DMSO of 50% and Tween 80 to 40%, did not present any inhibition. As a conclusion, it may be considered that the plants under study and particularly S. brasiliensis presented a promising activity towards the MRSA S. aureus strains including the multiresistant clones. It has been considered that in part this action is justified by the presence of the flavonoids and especially phenolics acids which were experimentally detected by bioautography which confirmed data of literature and by phytochemical screening.
Key Words: Schinopsis brasiliensis, Caesalpinia pyramidalis, Antimicrobial activity, Multiresistant Staphylococcus aureus MRSA, Brazilian Epidemic Clone, Pediatric Clone, Sporadic Clone, Bioautography.
Saraiva, A. M.; Estudo Farmacognóstico e Determinação da Atividade Biológica de Caesalpinia pyramidalis Tull. e
Schinopsis brasiliensis Engl. frente a cepas de Staphylococcus aureus MRSA Multirresistentes
24 1. INTRODUÇÃO
Na área farmacêutica, os extrativos vegetais continuam sendo uma rica fonte de novas moléculas que podem ser utilizadas como protótipos para o desenvolvimento de fármacos e como fonte de matérias-primas farmacêuticas, tanto para a obtenção de fármacos (princípios ativos), como para a obtenção de adjuvantes (SIMÕES; SCHENKEL, 2002; VORAVUTHIKUNCHAI; KITPPIPIT, 2005).
Na indústria farmacêutica, as plantas têm também contribuído significativamente, seja pelo uso de matérias-primas para o preparo de chás ou através do isolamento de várias substâncias bioativas, cuja complexidade de muitas estruturas químicas inviabilizaria técnica e economicamente sua síntese orgânica (TROVÃO et al, 2004). O desenvolvimento de fármacos derivados de fontes naturais tem centrado esforços em novas categorias de anticancerígenos, agentes antimicrobianos e antivirais. Estes fármacos representam respectivamente 51 %, 78% e 70% de todos os fármacos aprovados pelo FDA (Food and Drug Administration) e outros Órgãos similares no período de 1983-94. Assim, dos 520 novos fármacos aprovados pelo FDA neste período, 30 vieram diretamente de fontes naturais, 120 são semi-sintéticos derivados destas e 46 são sintéticos obtidos a partir de um protótipo natural. O compreendido restante, produto de origem essencialmente sintético (BAHIA, 2002).
O emprego das plantas medicinais, especialmente na América do Sul e outros países em desenvolvimento, contribui, significativamente, para os cuidados básicos da saúde (HOLETZ, 2002). Atualmente, a medicina tradicional é aceita como uma forma alternativa no cuidado da saúde, sendo reconhecida a sua importância pela própria OMS (AKERELE, 1992). O Brasil é o país com maior potencial para pesquisas com espécies vegetais, pois detém a maior e mais rica biodiversidade do planeta, distribuída em seis biomas distintos (NOLDIN et al, 2006). Sendo que ainda hoje se tem pouco conhecimento desta amplitude biológica (TROVÃO et al, 2004.).
Entre os ecossistemas ricos em variedades vegetais, destaca-se a floresta amazônica, a mata atlântica, o cerrado e a caatinga. Estima-se, assim, que existam cerca de 55.000 espécies floridas, ou seja, cerca de 50% das espécies tropicais (BAHIA, 2002).
O Nordeste Brasileiro, onde está localizada a maior parte da região semi-árida do país, é coberto por uma vegetação denominada caatinga (TROVÃO et al, 2004), do tupi-guarami: “floresta branca” (LEAL et al, 2003), com plantas fisiologicamente adaptadas às condições de deficiência hídrica. A caatinga, como outras vegetações, também passa por um extenso processo de devastação ambiental, provocado pelo uso indiscriminado dos seus recursos
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25 naturais, sendo ainda mais grave por ser um ecossistema, considerado menos valorizado, uma vez que, até anos recentes era taxado pobre em biodiversidade (TROVÃO et al, 2004).
Desta forma, só na ultima década passou-se a estudá-lo mais detalhadamente e até hoje pouco se conhece das suas potencialidades, existindo espécies nesta área que sequer foram descritas e pouco ou quase não se sabe dos seus aspectos fisiológicos (MANSUR; BARBOSA, 2000).
Assim, no semi-árido brasileiro, região que ocupa 11,5% do território nacional, estima-se haver oito mil espécies vegetais sendo que destas 318 espécies pertencentes a 42 famílias botânicas são endêmicas da caatinga. Diante desta vasta biodiversidade e da necessidade da descoberta de novas moléculas bioativas, resulta de fundamental importância, o estudo farmacológico da flora dessa região (NOVAIS et al, 2003).
1.1 – As plantas como “antibióticos naturais”
O problema da resistência microbiana torna-se cada vez mais preocupante comprometendo-se o futuro de novas drogas antimicrobianas. Por isso, ações devem ser dirigidas buscando minimizar esse problema, tais como um maior controle no uso de antibióticos; contínuas pesquisas para melhor entender os mecanismos genéticos de resistência, e por ultimo ampliar os estudos para obtenção de novas drogas naturais, semi-sintéticas ou semi-sintéticas. Deve-se ainda considerar o problema da baixa imunidade por parte dos pacientes e o surgimento de cepas bacterians multirresistentes que acarretam infecções com alta mortalidade, principalemente, em hospitais (NASCIMENTO et al, 2000; STAPLETON et al, 2004).
Há uma considerável necessidade por novas classes de agentes antimicrobianos para contra-atacar o rápido aumento da transmissão das multi-drogas resistência (mdr), através de compartilhamento genético de bactérias patogênicas, ou não, ao homem, podendo ocorrer entre bactérias da mesma família ou de famílias diferentes. Em particular, a ocorrência e proliferação de mdr em Staphylcoccus aureus meticilina resistente (MRSA) é uma das maiores causas de interesse, no âmbito clínico, justificado diretamente pelo baixo efeito dos agentes terapêuticos que podem ser usados frente a estes organismos (GIBBONS et al, 2002).
Historicamente, o uso dos extratos das plantas medicinais e aromáticas como antiséptico é reconhecido desde antiguidade, enquanto que desde o início do século XX, os pesquisadores tentam caracterizar esta propriedade no laboratório (DORMAN; DEANS, 2000).
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26 Muitas das propriedades terapêuticas das plantas são relatadas pela população, sendo confirmadas em sua maioria nos estudos científicos. Tais propriedades proporcionam o desenvolvimento de vários fármacos, sejam estes obtidos por síntese a partir de molécula protótipo ou através do isolamento.
Devido a todos estes aspectos, vê-se um interesse crescente na utilização e pesquisa de plantas medicinais, para fins terapêuticos, aliadas ainda a boa aceitabilidade destes produtos no mercado farmacêutico e as altas cifras que circundam a comercialização de fitomedicamentos, desde a ultima década (SIMÕES; SCHENKEL, 2002).
Os metabólitos secundários biossintetizados e estocados nos vegetais tem uma importante função em sua defesa contra os predadores em geral (herbívoros e microorganismos), proteção contra raios UV, atração por polinizadores ou animais dispersores de sementes (SIMÕES et al, 2004). Dentre estes metabólitos, temos as fitoalexinas, que agem em defesa da planta contra o ataque dos vários parasitas, entre eles, os microorganismos. Desta forma as fitoalexinas geralmente apresentam atividade antibacteriana e antifúngica, sendo freqüentemente usadas na profilaxia e na cura de doenças causadas por microorganismos (SAKAGAMI et al, 1998).
Os componentes bioativos oriundos de plantas são correntemente investigados como intermediários para o desenvolvimento de quimioterápicos que podem ser aplicados no tratamento das infecções, algumas das quais causadas por microorganismos que rapidamente desenvolvem mecanismo de resistência aos antibióticos usuais (HIMEJINA; KUBO, 1991 e KUBO et al, 1992).
Quanto aos componentes, com potencial ação antibiótica, destacam-se os resultados obtidos com óleos essenciais ricos em mono e sesquiterpenos, alcalóides, ácidos fenólicos, flavonóides, taninos, cumarinas, triterpenos, entre outros que apresentam atividade antimicrobiana frente a bactérias Gram-positivas, bactérias Gram-negativas, Mycobacterium, leveduras e fungos filamentosos (NEPOMUCENO et al, 2003 e CECHINEL FILHO; YOUNES, 1998). Justificando a pesquisa de novos constituintes como elemento essencial para a descoberta e desenvolvimento de novos fármacos (BONJAR, 2004).
As pesquisas dirigidas à obtenção de novas drogas com atividade antimicrobiana ocorrem em diversas partes do mundo, sendo que boa parte destas, se referem a ativos oriundos de vegetais. Assim resulta, importante principalmente no Brasil, com a grande diversidade de sua flora, fazer um “screening” das espécies vegetais, principalmente aquelas de uso popular, evidenciando por testes laboratoriais a atividade em primeiro termino dos extratos brutos e prosseguindo com um estudo fitoquímico para avaliar as propriedades das
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27 diferentes frações obtidas. No tratamento de infecções comuns, muitas plantas são utilizadas no Brasil sob forma de extrato bruto, infusões ou emplastos, porém sem nenhuma evidência científica da sua eficácia (PESSINI et al, 2003).
Ainda interessa a ação dos extratos das plantas, por um efeito de interação sinérgica aos antibióticos de uso terapêutico. O sinergismo é determinado experimentalmente mediante uma curva de morte e as técnicas utilizadas, envolvem o uso de várias concentrações das duas drogas (antibiótico e substância isolada) e observação, usando um critério pré-estabelecido, para verificar a potencialização da inibição do crescimento microbiano, em comparação aos compostos isolados, (sinergismo) ou redução deste (antagonismo) (WANG et al, 2003; STERMITZ et al, 2000).
1.2 - Staphylococcus aureus
As bactérias Gram positivas são as maiores causadoras de infecções adquiridas tanto na comunidade quanto hospitalares. A resistência aos agentes antimicrobianos é prevalente entre as muitas destas bactérias, em numerosos países do globo (PALOMBO; SEMPLE, 2002). Dentre as bactérias Gram positivas, destaca-se o gênero Staphylococcus, sendo os S. aureus seu principal representante, justificado pela importância clínica, devido à prevalência e resistência destas cepas aos antimicrobianos utilizados na terapêutica das infecções que afetam os homens.
Os Staphylococcus aureus são cocos dispostos em forma de “cachos de uva”, produtores de pigmentos amarelo-dourado, caracterizando-se por ser coagulase, Dnase e catalase positivos. Estes microorganismos são patógenos humanos e de outros mamíferos, e integram a flora da pele (comensais), embora como patógenos oportunistas possam causar infecções. O S. aureus é um patógeno que pode ser encontrado na flora de 30 a 70% da população (LINDSAY; HOLDEN, 2004), colonizando a pele úmida em diferentes regiões (narinas, axilas, períneo e intestino) de pessoas saudáveis onde podem permanecer colonizando por longos períodos sem causar nenhuma patologia infecciosa, porém em determinadas circunstâncias e conjuntamente a seus fatores de virulência exibem sua patogenicidade, podendo invadir o organismo do indivíduo provocando infecções freqüentemente agudas e piogênicas. Assim, entre as infecções da pele provocadas por este, destaque-se pela freqüência: o furúnculo, a celulite, o impetigo, bem como infecções cirúrgicas, pós-operatórias (CORBELLA et al, 1997).
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28 O genoma estafilocócico consiste do cromossomo circular (de aproximadamente 2800 bp), com profagos, plasmídeos e transposons. Os genes que determinam a virulência e resistência aos antibióticos são encontrados no cromossomo e também nos elementos extra-cromossomais, que podem ser transferidos entre cepas da mesma espécie, ou entre outras espécies de Gram-positivas através dos elementos extra-cromossomais (LOWY, 1998).
Staphylococcus aureus produz duas toxemias graves: a síndrome da pele escaldada, pela a ação de toxinas esfoliativas e a síndrome do choque-tóxico – TSST, além de ser responsável por intoxicações alimentares, cuja origem está relacionada à produção de superantígenos, as enterotoxinas (CORDEIRO, 2004).
Ainda, S. aureus apresenta uma variedade relativamente grande de proteínas extracelulares e polissacarídeos, alguns dos quais correlacionados com sua virulência. Resultando em efeitos combinados de muitos fatores expressos no curso da infecção (PEREIRA, 2002), que juntamente com seu amplo arsenal genético, lhes dão a possibilidade de adaptar-se as variações bruscas, como ficou demonstrado com a emergência das infecções por cepas de MRSA multirresistentes, desde os anos 90 (JONGE et al, 1994).
A importância das infecções nosocomiais produzidas por S. aureus, principalmente S. aureus Meticilina Resistente (MRSA), é bem reconhecida pela sua freqüência, morbidade, mortalidade e principalmente pela dificuldade de tratamento. Recentemente tem emergido, a nível comunitário, o S. aureus meticilina resistente de origem comunitário, que se denomina CA – MRSA (Sigla em inglês) ou CA-SAMR (sigla em português e espanhol). Este agente microbiano é um patógeno emergente e suas infecções são consideradas como enfermidades emergentes. Estas enfermidades são aquelas que têm surgido recentemente na população ou já existentes com pequenos casos, mas aumentaram rapidamente em incidência e/ou em extensão geográfica (NASCIMENTO et al, 2000).
Historicamente, a emergência de cepas de S. aureus com altos níveis de resistência a penicilina foi seguido pelo desenvolvimento e aumento da resistência as penicilinas semi-sintéticas (meticilina, oxacilina, nafcilina), aos macrolídeos, as tetraciclinas, as aminoglicosídeos determinando que a terapêutica das infecções estafilocóccicas constituam um desafio global (SADERI et al, 2005).
No Brasil, os S. aureus são os microorganismos mais freqüentemente isolados e sua prevalência ocorre em maior proporção a nível hospitalar, acima de 80% e cerca de 70% dos isolados comunitários apresentam resistência as penicilinas naturais, e por extensão, à ampicilina e amoxicilina (TAVARES et al, 2000). Nos resultados obtidos dos isolados oriundos das infecções hospitalares, a prevalência do isolamento de cepas MRSA varia de 40
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29 a 80% nos hospitais brasileiros. Estes isolados são geralmente resistentes a múltiplos antibióticos (aminoglicosídeos, cloranfenicol, tetraciclina, lincosamidas, macrolídeos, quinolonas, sulfametoxazol/trimetoprima), com grande susceptibilidade a rifampicina.
De outra parte, estudos realizados no Brasil descreveram um clone de S. aureus MRSA multirresistente (Clone Epidêmico Brasileiro – BEC) em hospitais do Sul, Sudeste, Norte e Nordeste do país (TEIXEIRA et al, 1996 e FIGUEIREDO et al, 1991), clone que se expandiu para outros países da América Latina (Argentina, Chile, Uruguai) e também a Europa (Portugal, Itália e República Tcheca) (OLIVEIRA et al, 2001 e SOLA et al, 2002).
A resistência destas bactérias aos antimicrobianos é ainda de grande interesse econômico, cujo impacto eleva os custos com a saúde pública e privada, visto o maior tempo de internação, o uso de drogas mais potentes e caras (PALOMBO; SEMPLE, 2002) além de causar maior sofrimento ao doente e seus familiares.
O estudo sobre conhecimento dos mecanismos de resistência dos S. aureus MRSA multirresistentes, tanto aos antibióticos, de uso clínico, quanto aos germicidas, aplicados na limpeza e descontaminação do ambiente hospitalar, está sendo realizado em vários países. São estudos que visa ao entendimento do processo pelo qual o S. aureus penetra e sobrevive no ambiente hospitalar, fato fundamental para o implemento de ações de controle das infecções. De início, foi elucidado o sequenciamento do genoma, mapeando as de bases do DNA bacteriano das várias cepas de S. aureus multirresistente de origem hospitalar e comunitária (cepas N315, Mu50, MW2, MRSA252, MSSA476, COL e NCTC8325), subseqüentemente estão sendo estudados os genes que são responsáveis pelos fatores de virulência e resistência que determina a patogenicidade das infecções estafilococcicas. De qualquer forma ainda não foram identificados os genes ou combinações de genes necessários para provocar a infecção, ou quais destes seriam alvos de novas terapias. Sendo assim, foi de fundamental importância o trabalho realizado pelos cientistas em sequenciar o genoma bacteriano (LINDSAY; HOLDEN, 2004) e também toda descoberta de novos agentes antibacterianos com mecanismos de ação diferentes daqueles presentemente existentes (BREITHANPT et al, 1999).
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31 2. – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 - Caesalpinia pyramidalis Tull. – Caesalpinaceae
A Caesalpinia pyramidalis é uma Leguminosae (Fabaceae), subfamília Caesalpinioideae e gênero Caesalpinia L. distribuídas nas regiões tropicais e subtropicais (BARROSO, 1991 e MELO-PINNA et al, 1999), árvore endêmica do sertão nordestino que habita em lugares pedregosos (SILVA et al, 1998), conhecida popularmente como: “catingueira” “pau-de-porco”, “catinga de porco”, (BRAGA, 1960), “pau-de-rato”, “mussitaiba” e “catingueira-das-folhas-largas” (UMBUZEIRO (b), 2005). Dentre o gênero Caesalpinia, a espécie mais conhecida é a Caesalpinia echinata “pau-brasil”, cuja madeira teve grande importância no início da colonização do Brasil (BAHIA, 2002).
2.1.1 – Botânica
A catingueira é uma arvore que atinge até 4 metros de altura (Figura 1) com folhas bipinadas, 5-11 folíolos, sésseis, alternos, obtusos e oblongos. As flores são amarelas, dispostas em racemos pouco maiores ou tão longos quanto às folhas e sua vagem é achatada de cor escura (BRAGA, 1960) (Figura 2). A Catingueira é uma das plantas sertanejas cujos gomos brotam às primeiras manifestações de umidade, pelo qual é dita como anunciadora de períodos chuvosos (SILVA et al, 1998).
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32 Figura 2. Folhas, Flores e Fruto de Caesalpinia pyramidalis.
2.1.2 – Uso Popular
Referentes ao uso, a madeira é recomendada para lenha, carvão e estaca (SILVA et al, 1998), enquanto que as folhas fendadas constituem boa forragem (BRAGA, 1960), sendo considerado como excelente alimento animal, por conter alto valor protéico e menor de fibras (ZANINE et al, 2005).
Na medicina popular as flores, folhas e cascas são usadas no tratamento das infecções catarrais, nas diarréias e disenterias (BRAGA, 1960), ainda apresenta ação antipirética e como diurética (MENDES et al, 2000).
2.2.3 – Estudos Fitoquímicos
No levantamento bibliográfico da espécie foi assinalado o isolamento de vários metabólitos secundários, destacando-se polifenois e terpenóides (Quadro 1) mostra as principais substâncias isoladas e caracterizadas.
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33 Quadro 1. Levantamento bibliográfico dos isolados de Caesalpinia pyramidalis Tull.
SUBSTÂNCIAS ISOLADAS PARTE DA PLANTA REFERÊNCIA
O O OH CO2H H HO OH HO OH
ÁCIDO 4-O-β −β −β −β − D-GLICOPIRANOSILOXI-(Z)-7-HIDROXICINÂMICO O O H CO2H HO HO OH HO OH
ÁCIDO 4-O-β −β −β −β − D-GLICOPIRANOSILOXI-(Z)-8-HIDROXICINÂMICO
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34 O OMe OH OH 4,4'-DIHIDROXI-2-METOXICHALCONA O OH OH O OH OH OH OH O O CAESALFLAVONA (Biflavonóide) O O OH OH OH O O OH OH H H OH AGASTIFLAVONA O O OH OH OH OCH3 OH O O OH PODOCAPUSFLAVONA Folha Bahia (2005)
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35 HO OH O H CO2CH3 GALATO DE METILA O O OH OH OH R R = OH (KAEMPFEROL) R = H (APIGENINA) OCH3 HO CH3O O O H H OCH3 OH OCH3 SIRINGARESINOL ESTIGMASTEROL HO β− β− β− β−SITOSTEROL H H H HO OH HO LUPEOL Folha Bahia (2002)
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36 2.2.4 – Atividade Antimicrobiana
Estudos realizados com extratos em acetato de etila, das folhas e caule de C. pyramidalis frente a cepas de S. aureus e E. coli pelo o método de difusão em disco, obtendo halos da ordem de 10 mm apenas para a cepa de S. aureus (NOVAIS et al, 2003).
Assim mesmo, no Instituto de Antibiótico - UFPE num “screening” de plantas superiores, a C. pyramidalis foi estudada frente as sete cepas seguintes: S. aureus, B. subtilis, M. smegmatis, E. coli, E. faecalis, C. albicans e N. crassa, verificando-se atividade somente sobre as três primeiras (CHIAPPETA; MELLO, 1984/5).
2.2 - Schinopsis brasiliensis Engl. – Anacardiaceae
A Schinopsis brasiliensis Engl. da família Anacardiaceae, é o principal representante, do gênero Schinopsis, nativo do Brasil. Dentre as anacardiáceas, nativos brasileiros, destacam-se as espécies de Anacardium (cajueiros), Schinus (aroeira), árvores de madeira dura que produzem alergia em indivíduos susceptíveis. Muitas anacardiáceas produzem taninos, utilizados na indústria de curtumes (Schinus, Schinopsis e Rhus) (JOLY, 2002). A S. brasiliensis é uma espécie característica das caatingas e de grande valor econômico para a região nordestina. Sua distribuição, embora com poucos indivíduos, se dá por toda a região da caatinga, deste a Bahia até Paraíba (PRADO et al, 1995). É uma árvore endêmica brasileira, popularmente conhecida por “braúna”, “baraúna” (CARDOSO, 2005), “braúna-do-sertão” e “braúna-parda” (UMBUZEIRO (a), 2005), “quebracho”, “chamacoco”, “chamucoco” (INSTITUTO PLANTARUM), dentre as árvores de valor econômico, a unidade de dispersão da espécie S. brasiliensis, apresenta dificuldade quanto ao processo de germinação (PRADO et al, 1995), sendo que este fato juntamente ao uso abusivo de sua madeira, contribuiu para que a braúna fosse considerada pelo “First Report National for the Convention on Biological Diversity (CBD)” como uma espécie ameaçada de extinção (CARDOSO, 2001).
A maioria dos estudos sobre a Braúna deve-se ao caráter alergênico evidenciado por intensa dermatite de contato em indivíduos sensíveis. Este caráter alergênico se deveria à presença de alquil e alquenil fenois, presente em muitas das espécies da família e que foram encontrados nesta espécie por CARDOSO et al (2005). Ainda são citadas atividades citotóxica e antimicrobiana (CARDOSO, 2001).
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37 2.2.1 – Botânica
A Schinopsis brasiliensis Engl. (Figura 3) é uma árvore de copa arredondada e densa, altura de 8-12 m na caatinga do Nordeste e de 12-22 m no pantanal mato-grossense, de ramos providos de espinhos rígidos de até 3-5 cm de comprimento, de tronco mais ou menos cilíndrico de 40-70 cm de diâmetro, com casca áspera de cor cinza-escura (INSTITUTO PLANTARUM, 2006), folhas arguloso-pecioladas, subcoriáceas, verde-escura na face superior e pálida na inferior, compostas, 10 multijugas; folíolos oblongos, obtusos no ápice, emarginados, oblíquo-agudos na base. As flores em panículas (Figura 4), enquanto que a drupa tem 3 cm de comprimento e de cor castanho-clara (BRAGA, 1960). Os frutos são vagens (Figura 5) de natureza lenhosa, grossa e em forma de foice, arredondadas, cobertas por pêlos finos (GONZAGA et al, 2003) de 2,5-3,5 cm de comprimento, contendo uma única semente (INSTITUTO PLANTARUM, 2006).
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38 Figura 4. Folhas e Flores de S. brasiliensis.
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39 2.2.2 – Uso Popular
A Baraúna fornece madeira de excelente qualidade, pelo seu cerne muito duro, vermelho-castanho, de enorme resistência aos decompositores (PRADO et al, 1995), sendo ideal para o fabrico de móveis, na construção civil (GONZAGA et al, 2003), produção de postes, vigas e dormentes.
Na medicina popular a baraúna é usada como anti-histérica e nevrostênica (BRAGA, 1960), também no tratamento das verminoses de animais (CARDOSO, 2001) e antiséptico da pele.
2.2.3 – Estudo Fitoquímico
No levantamento bibliográfico a cerca das propriedades fitoquímicas da espécie foi assinalado o isolamento de vários metabólitos secundário, destacando-se os terpenóides, lignanas e polifenois, como as principais substâncias isoladas e caracterizadas (Quadro 2).
Quadro 2. Levantamento bibliográfico dos isolados de Schinopsis brasiliensis Engl.
SUBSTÂNCIAS ISOLADAS PARTE DA PLANTA REFERÊNCIA
C (CH2)19 CH3 O O O CH3 H3C 6-EICOSANIL-2-HIDROXI-4-METOXIBENZOATO DE METILA ALQUIL FENOL β− β− β− β−SITOSTEROL H H H HO Caule Cardoso et al (2005)
Saraiva, A. M.; Estudo Farmacognóstico e Determinação da Atividade Biológica de Caesalpinia pyramidalis Tull. e
Schinopsis brasiliensis Engl. frente a cepas de Staphylococcus aureus MRSA Multirresistentes
40 5α, 8α −α, 8α −α, 8α −α, 8α −EPIDIOXIERGOSTA -6,22-DIEN-3-ββββ-OL O O HO O H CICLOARTENONA 24-METILENO-CICLOARTENONA O H O H H H ESTIGMAST-4-EN-3-ONA ESTIGMAST-4-EN-3-ONA-6 ββββ-OL H O OH H H Caule Cardoso (2001) HO O H O H CO2CH3 GALATO DE METILA Caule Cardoso et al (2004)
Saraiva, A. M.; Estudo Farmacognóstico e Determinação da Atividade Biológica de Caesalpinia pyramidalis Tull. e
Schinopsis brasiliensis Engl. frente a cepas de Staphylococcus aureus MRSA Multirresistentes
41 CHO OCH3 OH VANILINA OH CH3 H3C HO CO2CH3 2,4-DIHIDROXI-3,6-DIMETIL-BENZOATO DE METILA O CO2CH3 CH3 OH O OH Cl CH3 Cl CH3O2C H3C 3,5-DICLORO-6-(6-HIDROXI-4-METOXI-3-METOXICARBONIL -2-METIL-FENOXI)-2-HICROXI-4-METIL OCH3 HO CH3O O O H H OCH3 OH OCH3 SIRINGARESINOL Caule Cardoso et al (2003) 2.2.4 - Atividade Antimicrobiana
Foram realizados estudos prévios de “screening” de várias plantas superiores, dentre estas, a braúna, os estudos aconteceu no Departamento de Antibióticos da UFPE, por (CHIAPPETTA et al, 1982/3), que evidenciou atividade da Schinopsis brasiliensis sobre cepas de S. aureus e M. smegmatis.
Saraiva, A. M.; Estudo Farmacognóstico e Determinação da Atividade Biológica de Caesalpinia pyramidalis Tull. e Schinopsis brasiliensis Engl. frente a cepas de Staphylococcus aureus MRSA Multirresistentes
42 2.3 - Staphylococcus aureus - MRSA Multirresistentes
As doenças infecciosas são as principais causas de mortes prematuras no mundo, matando milhares pessoas por dia (AQIL et al, 2005). Assim, das 57 milhões de mortes anual em todo o mundo, estima-se que 15 milhões (mais de 25%) destas aconteçam devido às doenças infecciosas (MORENS et al, 2004).
O crescimento da resistência bacteriana aos antibióticos é uma ameaça a população mundial, aumentando as recorrências por doenças infecciosas, devido ao surgimento de bactérias multirresistentes que dificulta o tratamento quimioterápico (AQIL et al, 2005). A resistência dos S. aureus aos antibióticos tem bases genéticas, porem outros fatores favorecem também sua emergência, como o uso abusivo dos antimicrobianos seja pela administração indiscriminada como pela automedicação (WITTE et al, 1997).
Os S. aureus tem sido reconhecido ao longo dos tempos como um dos maiores patógenos humanos responsáveis por grande parte das infecções ocorridas ao homem. Há indicação que esta bactéria patogênica afeta aos humanos desde a pré-história. Anteriormente, a era dos antibióticos, os S. aureus foram à razão de alta mortalidade em hospitais da cidade de Boston.
A versatilidade estratégica deste microorganismo, os números de fatores de virulência, a capacidade de sobreviver e multiplicar-se em diversos ambientes, tornou o S. aureus um grave problema para a saúde pública. Assim, sua capacidade de adaptar-se foi repetidamente mostrada pela emergência das cepas de S. aureus que adquiriram um mecanismo de resistência virtualmente a todos os agentes antimicrobianos brevemente depois da introdução destas drogas na terapêutica clínica (OLIVEIRA et al, 2002).
As cepas de S. aureus MRSA multirresistentes, representam um grande problema no controle das infecções adquiridas no hospital. Algumas destas cepas mostram a capacidade de propagarem-se desde a introdução no hospital. Diferentes estirpes de MRSA identificadas pelo seu fenótipo têm-se propagado de uma região a outra nos hospitais britânicos. Estudos multi-cêntricos conduzidos pela Paul Ehrlich Society for Chemotherapy, têm mostrado que a freqüência de MRSA entre as infecções por S. aureus adquiridas nos hospitais da Alemanha aumentou de 1,7% para 8,7% entre 1990 e 1995 (WITTE; EDMOND, 1997).
De 1980 a 1990, Montelli e Levy documentaram uma alta incidência de resistência entre microorganismos, em microbiologia clínica no Brasil (NASCIMENTO et al, 2000) e em particular, por S. aureus MRSA, levando ao conhecimento do clone de S. aureus (MRSA) multirresistente (Clone Epidêmico Brasileiro) que foi isolado e identificado primeiramente em hospitais do Sul, Sudeste, Norte e Nordeste (TEIXEIRA et al, 1996 e FIGUEIREDO et al,