RESEARCH ARTICLE Pub. 1197
ISSN 1679-9216
Received: 18 December 2013 Accepted: 8 June 2014 Published: 23 June 2014 ¹Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Universidade de Passo Fundo (UPF), Passo Fundo, RS, Brazil. ²M.V. Autônoma, Porto Alegre, RS.
3Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), Porto Alegre, RS. CORRESPONDENCE: L.R Santos
[luruschel@upf.br - Tel.: +55 (54) 3316-8485]. Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária (FAMV) - UPF. BR 285, Bairro São José. CEP 99052-900 Passo Fundo, RS, Brazil.
Perfi l de resistência a antimicrobianos por Salmonella Heidelberg
isoladas de abatedouro avícola em 2005 e 2009
Antimicrobial Resistance Profi le of Salmonella Heidelberg Isolated from a Poultry Slaughterhouse in 2005 and 2009
Ligiani Mion¹, Fernanda Lúcia Colla2, Isabel Cristina Cisco¹, Bruna Webber¹, Luísa Neukamp Diedrich¹,
Fernando Pilotto¹, Laura Beatriz Rodrigues¹, Vladimir Pinheiro do Nascimento3 & Luciana Ruschel dos Santos¹
ABSTRACT
Background: Salmonella spp. is recognized as being one of the most common bacterial causes of food-borne illness spread
on poultry production due to easy adaptation to environment and diffi cult to eradicate. In poultry production system antimi-crobials are added in feed as growth promoters in continuous and sub-therapeutic doses, inducing a selective pressure and consequent antimicrobial resistance. This management causes public health problems to disseminate resistant pathogens through food chain and reduce the options of treatment of bacterial infections.
Materials, Methods & Results: The samples were isolated in a poultry slaughterhouse under Federal Inspection in a
monitoring, research and quantifi cation project of Salmonella spp in critical control points in slaughterhouse. Adapted methodology was used for quantifi cation of Salmonella as follows: swabs and cages were placed in 50 mL of peptone water buffered 1% (PW 1%) and incubated at 37ºC for 12 h; for the analysis of water 100 mL were inoculated in 50 mL of peptone water buffered in triple concentration and incubated at 37ºC for 12 h; the chickens and carcasses were packed in sterile bags with a capacity of 4000 mL, added 150 mL of peptone water buffered 1%, agitated manually for one minute and the rinsing broth incubated by 12 h at 37ºC. After hatching were made decimal dilutions Rapapport Vassiliadis broth (RV), inoculated 1 mL in 9 mL of RV broth until 10-3 dilution and incubation for 12 h at 41°C in a water bath with
agita-tion. After this period 100 µL of RV broth were seeded in Agar Rambach and Agar XLD and the plates incubated at 37ºC for 12 h. Salmonella-like growth were placed in Agar Rambach and confi rmed as Salmonella to biochemical tests (TSI, LIA, urea broth) and assayed for polyvalent antiserum to Salmonella. The fi nal identifi cation of the samples was carried out by the Polymerase Chain Reaction (PCR, Premi® Test Salmonella DSM). Were selected 20 samples of Salmonella
Heidelberg isolated in 2005 (14 samples) and 2009 (6 samples) for antimicrobial susceptibility testing by diffusion in agar front of amoxicillin with clavulanic acid, ampicillin, cephalothin, ciprofl oxacin, chloramphenicol, gentamicin, enrofl oxina, cephalexin, streptomycin, ceftiofur, doxycycline and neomycin. It was observed that 46,1% of the samples isolated in 2005 were resistant to an antimicrobial while 100% of the isolates in 2009 were resistant to at least four antimicrobial. Isolated samples in 2005 were resistant to ceftiofur (38.4%), ampicillin (23.0%), cephalexin (15.3%) and cephalothin (7.6%) while 100% of the isolates in 2009 were resistant to these antimicrobials. It was concluded that samples of Salmonella Heidelberg isolated in 2009 were phenotypically more resistant to antimicrobials tested than isolated samples in 2005.
Discussion: S. Heidelberg resistance can be related to the indiscriminate use of antimicrobials in poultry industry. Multiple
resistance bacteria like Salmonella can be transferred from animal products to consumers and causes public health problems. Antimicrobial sensitivity tests enable the identifi cation of antimicrobials that have action against pathogenic microorgan-isms like Salmonella, reinforce the importance of achieving these tests for the defi nition of appropriate programs of use of antimicrobials in livestock production.
Keywords: antimicrobial resistance, Salmonella Heidelberg, poultry slaughterhouse. Descritores: resistência a antimicrobianos, Salmonella Heidelberg, abatedouro avícola.
INTRODUÇÃO
O uso rotineiro de antimicrobianos em animais de produção é um fator importante de desenvolvimento e disseminação de resistência bacteriana que pode ser transferida para seres humanos via cadeia alimentar [6]. Na avicultura industrial a adição de antibióticos e quimioterápicos na ração em pequenas concentrações e de forma contínua proporciona um aumento signifi ca-tivo do ganho de peso e melhora a conversão alimentar [13,15,19]. Entretanto, este manejo é considerado sub-terapêutico, pois a dose de fármaco utilizada é inferior àquela empregada no tratamento de doenças bacterianas, o que favorece a resistência antimicrobiana e diminui a ação destes fármacos no tratamento de infecções em humanos e animais [11,14].
Dentre as salmonelas que causam infecções em humanos, o sorovar Heidelberg parece ser mais invasi-vo e causar doenças de maior gravidade do que outros sorovares paratífi cos [17]. A crescente importância de Salmonella Heidelberg tem gerado estudos devido à frequente resistência deste sorovar ao ceftiofur e a redução da susceptibilidade aos antimicrobianos rela-cionados à ceftriaxona (cefalosporina de terceira gera-ção). Tais fatos podem limitar as opções de tratamento de gestantes e crianças que desenvolvem salmonelose extra-intestinal por S. Heidelberg e representar uma preocupação extra com relação à saúde pública [9].
O objetivo do trabalho foi avaliar a ação de 12 antimicrobianos frente a amostras de Salmonella Heidelberg isoladas em abatedouro avícola nos anos de 2005 e 2009 e a provável progressão da resistência bacteriana frente a estes princípios ativos, utilizados tanto na produção animal como no tratamento de hu-manos infectados.
MATERIAIS E MÉTODOS
As amostras foram isoladas em abatedouro de frangos de corte sob Inspeção Federal durante a condução de um projeto de monitoria, pesquisa e quantifi cação de Salmonella spp. em pontos críticos de controle em frigorífi cos. Foram amostrados oito pontos do fl uxograma de abate com coletas de
swa-bs (cloacais e de gaiolas), água da escaldagem e do chiller e frangos antes e depois da escaldagem, da
depenagem e do resfriamento. As análises foram reali-zadas no Laboratório de Bacteriologia e Micologia do Hospital Veterinário da Universidade de Passo Fundo. Utilizou-se metodologia adaptada para quantifi cação
de Salmonella [10,12], como segue: swabs de cloaca e de gaiolas foram colocados em 50 mL de água
pep-tonada tamponada 1%1 (AP 1%) e incubados a 37ºC
por 12 h. Para as análises de água inoculou-se 100
mL da amostra em 50 mL de água peptonada1 com
concentração tripla e incubou-se a 37ºC por 12 h. Os frangos e carcaças foram acondicionados em sacos estéreis com capacidade para 4000 mL, adicionados
150 mL de AP 1%1, agitados manualmente por um
minuto e o caldo de rinsagem incubado por 12 h a 37ºC. Após incubação foram feitas diluições decimais da AP 1% em caldo Rapapport Vassiliadis1 (RV),
sendo inoculado 1 mL de AP 1%1 em 9 mL de caldo
RV1 até a diluição 10-3 e os caldos RV1 incubados por
24 h a 41ºC em banho-maria, com agitação. Após este
período 100 µL de cada diluição de caldo RV1 foram
semeados com alça de Drigalski em Agar Rambach2 e
Agar XLD1, em duplicata, e as placas incubadas a 37ºC
por 24 h. Colônias compatíveis com Salmonella spp foram reisoladas em Agar Rambach2, incubadas a 37ºC
por 24 h e submetidas a provas bioquímicas de TSI1,
LIA1, SIM1, caldo uréia1 e agar nutriente1 para
sorolo-gia com anti-soro polivalente O para Salmonella1. A
identifi cação fi nal das amostras foi realizada utilizando Premi®Test3 Salmonella. Foram selecionadas 20
amos-tras de Salmonella Heidelberg isoladas em 2005 (14 amostras, denominadas EB) e em 2009 (6 amostras, denominadas SL). As amostras EB foram isoladas de carcaças antes e depois do chiller e de swabs de cloaca enquanto as amostras SL foram isoladas de frangos após a depenagem e da água do chiller. Os testes de sensibilidade a antimicrobianos foram realizados pela técnica de disco-difusão [8] frente aos seguintes prin-cípios ativos: Amoxicilina com Ácido Clavulânico 30 µg; Ampicilina 10 µg; Cefalotina 30 µg; Ciprofl oxacina 5 µg; Cloranfenicol 30 µg; Gentamicina 10 µg; Enro-fl oxina 16 µg; Cefalexina 30 µg; Estreptomicina 10 µg; Ceftiofur 30 µg; Doxiciclina 1µg e Neomicina 30 µg.
RESULTADOS
As amostras de Salmonella Heidelberg isoladas em 2009 foram 100% resistentes aos princípios ativos que haviam apresentado ação sob este sorovar em 2005 (Figura 1). Em nosso estudo, 46,1% das amostras isoladas em 2005 foram resistentes a pelo menos um princípio ativo enquanto 100 % das amostras isola-das em 2009 apresentaram resistência a pelo menos quatro princípios ativos. Os isolados em 2005 foram
resistentes a ceftiofur (38,4%), ampicilina (23,0%), cefalexina (15,3%), cefalotina (7,6%) e neomicina (7,6%) e os isolados em 2009 a ampicilina, cefaloti-na, cefalexina e ceftiofur (100%), neomicina (66,6%) e gentamicina (50%). Dos três aminoglicosídeos testados (gentamicina, neomicina e estreptomicina),
apenas a estreptomicina apresentou 100% de efi cácia, enquanto a gentamicina e a neomicina apresentaram 50% e 33,4% de ação, respectivamente. As amostras isoladas nos anos de 2005 e 2009 foram 100% sensí-veis a enrofl oxacina, ciprofl oxacina, cloranfenicol e estreptomicina.
Figura 1. Progressão da resistência antimicrobiana de sorovares de Salmonella Heidelberg
isolados em abatedouro avícola em 2005 e 2009. Legendas: EB: amostras isoladas de carcaças antes e depois do chiller e de swabs de cloaca, em 2005; SL: amostras isoladas de frangos após a depenagem e da água do chiller, em 2009.
DISCUSSÃO
O uso terapêutico de antimicrobianos tem um papel importante na prevenção da disseminação de doenças entre os animais, no tratamento de animais doentes, na promoção do crescimento e na prevenção da transmissão de agentes zoonóticos. Entretanto, desde que a aplicabilidade destes fármacos em animais de produção tornou-se rotineira observa-se o cresci-mento da resistência antimicrobiana aos mais variados agentes antimicrobianos nos diferentes seguimentos de produção animal [5], o que fi cou evidente com os resultados do nosso estudo. A progressão de resistência antimicrobiana na produção animal tem sido observada também para Escherichia coli e enterobactérias lactose negativa, isoladas de diversos estágios de criação de frangos de corte [16], com amostras resistentes ao ácido nalidíxico, ampicilina, cefalotina e cloranfenicol, de-monstrando que estas bactérias podem ser reservatórios de genes de resistência à antibióticos de importância em medicina veterinária e humana [20].
Neste sentido, um estudo sobre sensibilidade antimicrobiana de Streptococcus suis tipo II isolados de suínos, mostrou percentuais crescentes de resistência, principiados por cloranfenicol, cefalotina e penicilina (3,5%), oxacilina (7,1%), ampicilina (7,1%), gentami-cina (35,7%), tetraciclina e sulfazotrim (85,7%) [3]. Outro trabalho com amostras de Salmonella spp. isola-das de carcaças suínas identifi cou 66,7% de resistência a um ou mais princípios ativos, 33,3% de resistência intermediária e 23,3% de amostras multirresistentes (resistentes a pelo menos três antimicrobianos), sendo 16,7% ao cloranfenicol [18]. Em nosso estudo, o clo-ranfenicol, citado como um dos fármacos de eleição para a terapêutica de salmonelose em humanos [1], apresentou 100 % de efi cácia frente aos isolados de
S. Heidelberg em 2005 e 2009.
Já a crescente resistência de Salmonella Heidelberg ao ceftiofur e redução da susceptibilidade aos antimicrobianos relacionados à ceftriaxona [2], bem como a limitação de tratamento de infecções em gestantes e crianças [17] está em consonância com
nosso estudo, onde os isolados de S. Heidelberg em 2005 apresentaram 38,4% de resistência ao ceftiofur, índice ampliado consideravelmente dentre os isolados de 2009, quando 100% das amostras foram resistentes a este princípio ativo. Nossos resultados reforçam a im-portância da carne de frango como uma fonte potencial de Salmonella Heidelberg resistentes e multirresisten-tes a antimicrobianos [4].
As tetraciclinas são uma das classes de antimi-crobianos mais utilizados terapeuticamente em animais de produção [21]. Em nosso estudo identifi cou-se 7,6% de resistência a doxiciclina entre os isolados de 2005 e 33,3% entre os isolados de 2009, demonstrando que o uso contínuo das tetraciclinas tem ampliado os índices de resistência a esta droga e tornando mais restritas as opções terapêuticas disponíveis. Neste contexto, o alto nível de resistência múltipla revela um risco potencial para a saúde pública e pode difi cultar o tratamento de doenças em animais e humanos [7,22] agravando quadros clínicos que poderiam ser curáveis. Assim, destaca-se a necessidade da adoção de estratégias para redução da contaminação por Salmonella spp. na cadeia
alimentar, embasadas no uso prudente de antibióticos e no monitoramento da resistência a antimicrobianos na produção animal a fi m de prevenir e diminuir o desenvolvimento e a difusão desta resistência.
CONCLUSÃO
Ocorreu progressão da resistência antimicro-biana de sorovares de Salmonella Heidelberg isolados em abatedouro de aves no período de quatro anos, uma vez que 46,1% das amostras isoladas em 2005 foram resistentes a um princípio ativo e todos os isolados em 2009 foram resistentes a pelo menos quatro princípios ativos.
SOURCES AND MANUFACTURERS ¹Difco® Microbiologia. Sparks, USA.
2Merck® KGaA, Darmstadt, Alemanha.
3Premi®Test, R-Biopharm AG, Darmstadt, Germany
Acknowledgements. Ao CNPq, por ter fi nanciado esta pesquisa. Declaration of interest. The authors report no confl icts of
interest. The authors alone are responsible for the content and writing of the paper.
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