PROJECTO AGRO Nº 800 REDE NACIONAL PARA A CONSERVAÇÃO E UTILIZAÇÃO DE PLANTAS AROMÁTICAS E MEDICINAIS

(1)

Estudo das Actividades Biológicas: Microbiana e

Anti-oxidante

PROJECTO AGRO Nº 800 – REDE NACIONAL PARA

A CONSERVAÇÃO E UTILIZAÇÃO DE PLANTAS

(2)

1. Oxidação: é a reacção em que um corpo ou uma espécie química perde um ou vários electrões:

• Fe2+ _{→ Fe}3+ _{+ e}

-2. Redução: é a reacção em que um corpo ou uma espécie química aceita electrões.

• O₂ + 4e- _{→ 2O}

2-3. Oxidação é a reacção em que um composto se combina com um ou vários átomos de oxigénio

(3)

O que são radicais livres?

São fragmentos moleculares com um electrão desemparelhado na orbital de valência

H

H C

x x x x

R

H

C

É só o átomo de carbono que pode formar radicais livres? -Oxigénio

-Azoto -Enxofre

(4)

Os seres humanos dependentes do oxigénio para a sua sobrevivência correm sempre o risco de sofrerem danos devido à formação de radicais livres. Porquê?

O

+

X

_O

O

Princípio de Pauli: apenas os electrões com spin opostos podem formar um par de electrões.

(5)

O O O O O O + O O O e- _e- _e- _e -e- _e- _e- _e -O₂ O₂•- _H 2O2 OH • _H 2O 2H+ _H+ 2H+ 2H+ H+ H H H H H H H Oxigénio (estado

fundamental) superóxidoRadical

Peróxido de

hidrogénio hidroxiloRadical

1 2 3 4

H2O

H2O Há outros radicais oxigenados?

A produção de radicais hidroxilo é responsável por danos importantes nos sistemas biológicos porque este radical é um dos mais reactivos, atacando e danificando quase todas as moléculas dos seres vivos.

(6)

Principais fontes endógenas de espécies reactivas oxigenadas

1. NADPH oxidase

2. Cadeia respiratória mitocondrial 3. Peroxissomas

4. Citocromo P450 5. Xantina oxidase 6. Ciclo-oxigenases 7. Lipo-oxigenases

(7)

Principais fontes exógenas de espécies reactivas oxigenadas 1. Tóxicos ambientais 2. Radiações ionizantes 3. Radiações UV 4. Campos eléctricos 5. Xenobióticos pró-oxidantes 6. Citocinas pró-inflamatórias

(8)

Antioxidante: substância que, quando presente em concentrações pequenas

comparativamente às do substrato oxidável, impede ou atrasa significativamente a oxidação do substrato.

Antioxidante pode ser, então:

1. Substância capaz de inibir uma enzima oxidante específica

2. Substância capaz de reagir com agentes oxidantes antes que estes danifiquem outras moléculas

3. Substância capaz de formar complexos com iões metálicos perniciosos

4. Substância capaz de reparar sistemas como as proteínas transportadoras de ferro

NÃO EXISTE UM ANTIOXIDANTE UNIVERSAL

Antioxidante: substância que, quando presente em concentrações pequenas

comparativamente às do substrato oxidável, impede ou atrasa significativamente a oxidação do substrato.

Antioxidante pode ser, então:

1. Substância capaz de inibir uma enzima oxidante específica

2. Substância capaz de reagir com agentes oxidantes antes que estes danifiquem outras moléculas

3. Substância capaz de formar complexos com iões metálicos perniciosos

4. Substância capaz de reparar sistemas como as proteínas transportadoras de ferro

(9)

(10)

1. Quantificação e identificação dos compostos fenólicos 2. Quantificação da capacidade de desactivar radicais

3. Quantificação da capacidade para inibir ou parar a oxidação lipídica Avaliação antioxidante

Mecanismos de desactivação de radicais

1. Transferência de átomos de hidrogénio (X• _{+ AH → XH + A}•) e/

2. ou transferência de um electrão (X• _{+ AH → X}- _{+ AH}•+₎

Métodos que se baseiam na transferência de um electrão 1. Quantificação de fenóis totais pelo método Folin-Ciocalteu

2. Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC) ou método ABTS 3. Método DMPD (N,N-dimethyl-p-phenylenediamine)

4. Ferric ion reducing antioxidant power (FRAP) 5. Método de capacidade de redução do Cu(II)

(11)

Quantificação da capacidade para inibir ou parar a oxidação lipídica

1. Quantificação do desaparecimento de reagentes • Medição do consumo de oxigénio

• Doseamento dos ácidos gordos não oxidados 2. Quantificação da formação de produtos primários

• Medição do índice de peróxidos

3. Quantificação da formação de produtos secundários • Análise de compostos aldeídicos

• Dosagem de compostos voláteis

(12)

Origanum vulgare

Calamintha baetica Thymus mastichina

(13)

DPPH 1º colheita (12 m) 0,000 10,000 20,000 30,000 40,000 50,000 60,000 5 10 15 20 30 45 60 75 90 ₁₀5 120 135 150 165 180 Tempo (min) A c v ti v id a d e ( % ) Calamintha Tec Calamintha Papel Calamintha PEE Calamintha PPE Calamintha Vidro DPPH 1º colheita (18 m) 0,000 5,000 10,000 15,000 20,000 25,000 30,000 35,000 40,000 45,000 5 10 15 20 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 Te mpo (min) A c ti v id a d e ( % ) Calamintha Tec Calamintha Papel Calamintha PEE Calamintha PPE Calamintha Vidro

Conc.=2336mg/L

Calamintha baetica

DPPH 2º colheita (6 m) 0 10 20 30 40 50 5 10 15 20 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 Tempo (min) A c ti v id a d e ( % ) Calamintha Tecido Calamintha Papel Calamintha PEE Calamintha PPE Calamintha Vidro

•Raramente a actividade atinge 50% (actividade moderada) •Difícil estabelecer uma relação embalagem - actividade

(14)

DPPH 1º colheita (12 m) 0 10 20 30 40 50 60 5 ₁₅ ₃₀ ₆₀ ₉₀ 120 150 180 Tempo (min) A c ti v id a d e ( %

) Thymus mastichinaTecido

Thymus mastichina Papel Thymus mastichina PEE Thymus mastichina PPE Thymus mastichina Vidro DPPH 1º colheita (18 m) 0 10 20 30 40 50 60 70 5 10 15 20 30 45 60 75 90 105 120 135 Tempo (min) A c ti v id a d e ( % ) Thymus mastichina Tecido Thymus mastichina Papel Thymus mastichina PEE Thymus mastichina PPE Thymus mastichina Vidro DPPH 2º colheita (6 m) 0 10 20 30 40 50 60 70 5 ₁₀ ₁₅ ₂₀ ₃₀ ₄₅ ₆₀ ₇₅ ₉₀ 10 5 12 0 13 5 Tempo (min) A c ti v id a d e ( % ) Thymus mastichina Tecido Thymus mastichina Papel Thymus mastichina PEE Thymus mastichina PPE Thymus mastichina Vidro

Thymus mastichina

Conc.=2352mg/L

•Melhor actividade em 1ª colheita (18 meses) e 2ª colheita e 6 meses •Nalguns casos a actividade atinge 60%

(15)

Origanum vulgare

Tempo = 30 min

DPPH 1º colheita (12 m) 30 minutos 0,000 10,000 20,000 30,000 40,000 50,000 60,000 70,000 80,000 90,000 500 1000 2500 5000 Concentração (mg/L) A c ti v id a d e ( % ) Oregão Tecido Oregão Papel Oregão PEE Oregão PPE Oregão Vidro DPPH 1º colheita (18 m) 30 minutos 0,000 20,000 40,000 60,000 80,000 100,000 500 1000 2500 5000 Concentração (mg/L) A c ti v id a d e ( % ) _{Oregão Tecido} Oregão Papel Oregão PEE Oregão PPE Oregão Vidro DppH 2º colheita (6 m) 30 minutos 0,000 20,000 40,000 60,000 80,000 100,000 500 1000 2500 5000 Concentração (mg/L) A c ti v id a d e ( % ) _{Oregão Tecido} Oregão Papel Oregão PEE Oregão PPE Oregão Vidro

•Actividade aumenta com a concentração •Actividade pode atingir 80% (5g/L)

(16)

DPPH 1º colheita (12 m) 0 20 40 60 80 100 5 10 15 20 30 Tempo (min) A x c ti v id a d e ( % ) Oregão Tecido Oregão Papel Oregão PEE Oregão PPE Oregão Vidro DPPH 1º colheita (18 m) 0 20 40 60 80 100 5 10 15 20 30 Tempo (min) A c ti v id a d e ( % ) _{Oregão Tecido} Oregão Papel Oregão PEE Oregão PPE Oregão Vidro DPPH 2º colheita (6 m) 0 20 40 60 80 100 5 10 15 20 30 Tempo (min) A c ti v id a d e ( % ) _{Oregão Tecido} Oregão Papel Oregão PEE Oregão PPE Oregão Vidro

Origanum vulgare

Conc. = 5000 mg/L

•A actividade atinge 80%

•Só as amostras da 2ª colheita, 6 meses, embaladas em vidro parecem ter menor actividade (<80%)

(17)

DPPH Oregão Tecido 0,000 20,000 40,000 60,000 80,000 100,000 5 10 15 20 30 Tem po (m in) A c ti v id a d e ( % ) 1º colheita (12 m) 1º colheita (18 m) 2º colheita (6 m) DPPH Oregão Papel 0,000 20,000 40,000 60,000 80,000 100,000 5 10 15 20 30 Tem po (m in) A c ti v id a d e ( % ) 1º colheita (12 m) 1º colheita (18 m) 2º colheita (6 m) DPPH Oregão PEE 0,000 20,000 40,000 60,000 80,000 100,000 5 10 15 20 30 Tem po (m in) A c ti v id a d e ( % ) 1º colheita ( 12 m) 1º colheita ( 18 m) 2º colheita (6 m) DPPH Oregão PPE 0,000 20,000 40,000 60,000 80,000 100,000 Tem po (m in) A c ti v id a d e ( % ) 1º colheita (12 m) 1º colheita (18 m) 2º colheita ( 6 m) DPPH Oregão Vidro 0,000 20,000 40,000 60,000 80,000 100,000 5 10 15 20 30 Tem po (m in) A c ti v id a d e ( % ) 1º colheita (12 m) 1º colheita (18 m) 2º colheita (6 m)

Origanum vulgare

Conc. = 5000 mg/L

•Não aparece haver diferenças de actividade entre os tempos de colheita,

(18)

DPPH 1º colheita (12 m) 30 minutos 0 20 40 60 80 100 250 500 1000 1500 Concentração (mg/L) A c ti v id a d e ( % ) Thymbra capitata Tecido Thymbra capitata Papel Thymbra capitata PEE Thymbra capitata PPE Thymbra capitata DPPH 1º colheita (18 m) 0 20 40 60 80 100 250 500 1000 1500 Concentração (mg/L) A c ti v id a d e ( % ) Thymbra capitata Tecido Thymbra capitata Papel Thymbra capitata PEE Thymbra capitata PPE Thymbra capitata Vidro

Thymbra capitata

Tempo = 30 min

DPPH 2º colheita (6 m) 0,000 20,000 40,000 60,000 80,000 100,000 250 500 1000 1500 Concentração (mg/L) A c ti v id a d e ( % ) Thymbra capitata Tecido Thymbra capitata Papel Thymbra capitata PEE Thymbra capitata PPE Thymbra capitata Vidro

•A 500mg/L, a actividade atinge 60% •A actividade atinge 80% a 1500mg/L

(19)

DPPH 1º colheita (12 m) 0 20 40 60 80 100 5 10 15 20 30 Tempo (min) A c ti v id a d e ( % ) Thymbra capitata Tecido Thymbra capitata Papel Thymbra capitata PEE Thymbra capitata PPE Thymbra capitata Vidro DPPH 1º colheita (18 m) 0 20 40 60 80 100 5 10 15 20 30 Tempo (min) A c ti v id a d e ( m g /L ) Thymbra capitata Tecido Thymbra capitata Papel Thymbra capitata PEE Thymbra capitata PPE Thymbra capitata Vidro DPPH 2º colheita (6 m) 0,000 20,000 40,000 60,000 80,000 100,000 5 10 15 20 30 Tempo (min) A c ti v id a d e ( % ) Thymbra capitata Tecido Thymbra capitata Papel Thymbra capitata PEE Thymbra capitata PPE Thymbra capitata Vidro

Thymbra capitata

Conc. = 1500 mg/L

•A actividade atinge 80%

(20)

DPPH Orégão Tecido 0,000 20,000 40,000 60,000 80,000 100,000 5 10 15 20 30 Tem po (m in) A c ti v id a d e ( % ) 1º colheita (12 m) 1º colheita (18 m) 2º colheita (6 m) DPPH Orégão Papel 0,000 20,000 40,000 60,000 80,000 100,000 5 10 15 20 30 Tem po (m in) A c ti v id a d e ( % ) 1º colheita (12 m) 1º colheita (18 m) 2º colheita (6 m) DPPH Orégão PEE 0,000 20,000 40,000 60,000 80,000 100,000 5 10 15 20 Tem po (m in) A c ti v id a d e ( % ) 1º colheita (12 m) 1º colheita (18 m) 2º colheita (6 m) DPPH Orégão PPE 0,000 20,000 40,000 60,000 80,000 100,000 5 10 15 20 30 Tem po (m in) A c ti v id a d e ( % ) 1º colheita (12 m) 1º colheita (18 m) 2º colheita (6 m) DPPH Orégão Vidro 0,000 20,000 40,000 60,000 80,000 100,000 5 10 15 20 30 Tem po (m in) A c ti v id a d e ( % ) 1º colheita (12 m) 1º colheita (18 m) 2º colheita (6 m)

Thymbra capitata

Conc. = 1500 mg/L

•Não aparece haver diferenças de actividade entre os tempos de colheita, independentemente do tipo de embalagem

(21)

DPPH

• Ordem decrescente de actividade:

-Thymbra capitata: 80%, 1500mg/L, 30 min

-Não há diferenças nas actividades conforme o tipo de embalagem

-Origanum vulgare: 80% 5000mg/L, 30 min (2500mg/L: 39-64%, vidro e papel)

-O vidro parece induzir menor actividade (2500mg/L)

-Thymus mastichina: <36% 2500mg/L, 30 min

-Diferenças conforme o tipo de embalagem (geralmente, tecido com menor actividade

- Calamintha baetica: <20% 2300mg/L, 30 min

(22)

0,000 10,000 20,000 30,000 40,000 50,000 60,000 70,000 80,000 1º Colheita (12 m) 1º Colheita (18 m) 2º Colheita (6 m) Tempo A c ti v id a d e ( % ) Thymus mastichina Tecido Thymus mastichina Papel

Thymus mastichina PEE Thymus mastichina PPE Thymus mastichina Vidro 0,000 20,000 40,000 60,000 80,000 100,000 120,000 1º C olh eit a (1 2 m ) 1º C olh eit a (1 8 m ) 2º C olh eit a (6 m ) Tempo A c ti v id a d e ( % ) Oregãos Tecido Oregãos Papel Oregãos PEE Oregão PPE Oregãos Vidro 0,000 10,000 20,000 30,000 40,000 50,000 60,000 70,000 80,000 90,000 1º Colheita (12 m) 1º Colheita (18 m) 2º Colheita (6 m) Tempo A c ti v id a d e ( % )

Thymbra capitata Tecido Thymbra capitata Papel Thymbra capitata PEE Thymbra capitata PPE Thymbra capitata Vidro

0,000 10,000 20,000 30,000 40,000 50,000 60,000 70,000 80,000 90,000

1º Colheita (12 m) 1º Colheita (18 m) 2º Colheita (6 m) Tempo A c ti v id a d e ( % ) _{Calaminta Tecido} Calaminta Papel Calaminta PEE Calaminta PPE Calaminta Vidro

•As amostras de Calamintha baetica e Th. mastichina da 2ª colheita (6 meses de armazenamento) apresentam geralmente uma menor actividade.

•A altura da colheita e o tempo de armazenamento parece não influenciar as amostras de T. capitata

•As amostras de Origanum vulgare da 1ª colheita (18 meses de armazenamento) apresentam geralmente uma maior actividade.

TBARS

2336 2350

(23)

Poder Redutor 1º colheita (12 m) 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 2500 5000 7500 10000 Concentração (mg/L) A b s o rv e n c ia 7 0 0 n m Calamintha Tecido Calmintha Papel Calamintha PEE Calamintha PPE Calamintha Vidro

Poder Redutor 1º colheita (18 m)

0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600 0,700 0,800 2500 5000 7500 10000 Concentração (mg/L) A b s o rv e n c ia 7 0 0 n m Calamintha Tecido Calmintha Papel Calamintha PEE Calamintha PPE Calamintha Vidro

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 2500 5000 7500 10000 Concentração (mg/L) A b s o rv e n c ia 7 0 0 n m Calamintha Tecido Calmintha Papel Calamintha PEE Calamintha PPE Calamintha Vidro

Poder redutor

•Aparentemente a 1ª colheita (armazenada durante 18 meses) parece apresentar maior poder redutor

(24)

Poder Redutor 1º colheita (12 m) 0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 1000 1500 2000 3000 5000 Concentração (mg/L) A b s o rv e n c ia 7 0 0 n m Thymus mastichina Tecido Thymus mastichina Papel Thymus mastichina PEE Thymus mastichina PPE Thymus mastichina Vidro

0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 1000 1500 2000 3000 5000 Concentração (mg/L) A b s o rv e n c ia 7 0 0 n m Thymus mastichina Tecido Thymus mastichina Papel Thymus mastichina PEE Thymus mastichina PPE Thymus mastichina Vidro

Poder redutor

•Não parece haver diferenças entre tipo de armazenamento e colheita

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 1000 1500 2000 3000 5000 Concentração (mg/L) A b s o rv e n c ia 7 0 0 n m Thymus mastichina Tecido Thymus mastichina Papel Thymus mastichina PEE Thymus mastichina PPE Thymus mastichina Vidro

(25)

Poder Redutor 1º colheita (12 m) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 125 250 500 750 Concentração (mg/L) A b s o rv e n c ia 7 0 0 n m Oregão Tecido Oregão Papel Oregão PEE Oregão PPE Oregão Vidro

0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200 125 250 500 750 Concentração (mg/L) A b s o rv e n c ia 7 0 0 n m Oregão Tecido Oregão Papel Oregão PEE Oregão PPE Oregão Vidro

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 125 250 500 750 Concentração (mg/L) A b s o rv e n c ia 7 0 0 n m Oregão Tecido Oregão Papel Oregão PEE Oregão PPE Oregão Vidro

•As diferenças que se verificam são mais evidentes nas amostras da 1ª colheita, 18 meses de armazenagem

•As amostras armazenadas no vidro apresentaram maior actividade redutora.

Poder redutor

(26)

Poder redutor

0 0,5 1 1,5 2 2,5 125 250 500 1000 Concentração (mg/L) A b s o rv e n c ia 7 0 0 n

m Thymbra capitata_Tecido

Thymbra capitata Papel Thymbra capitata PEE Thymbra capitata PPE Thymbra capitata Vidro

0,000 0,500 1,000 1,500 2,000 125 250 500 1000 Concentração (mg/L) A b s o rv e n c ia 7 0 0 n m Thymbra capitata Tecido Thymbra capitata Papel Thymbra capitata PEE Thymbra capitata PPE Thymbra capitata Vidro

0 0,5 1 1,5 2 2,5 125 250 500 1000 Concentração (mg/L) A b s o rv e n c ia 7 0 0 n

m Thymbra capitata_Tecido

Thymbra capitata Papel Thymbra capitata PEE Thymbra capitata PPE Thymbra capitata Vidro

•Menor poder redutor nas amostras da 1ª colheita e armazenadas durante 18 meses •Menor actividade nas amostras armazenadas em vidro da 1ª colheita e armazenadas durante 18 meses

(27)

Poder redutor

• Ordem decrescente de actividade:

Thymbra capitata Origanum vulgare Thymus mastichina Calamintha baetica Tal como no DPPH

•

Comparação entre métodos

:

• Não é possível fazer porque

(28)

Toxi

Toxi-

-Infecções

Infecções

alimentares

Conhecem-se mais de 250 doenças deste tipo.

Estas doenças têm origem microbiana.

Os sintomas traduzem-se por diarreia e vómitos.

Mais de 90% destas doenças por ano são provocadas por:

Staphylococcus aureus ,

Salmonella

spp

.

Clostridium perfringens,

Campylobacter

spp

., Listeria monocytogenes,

Vibrio parahaemolyticus, Bacillus cereus

,

entero-patogénicas

Escherichia coli

e

Shigella

spp.

São doenças infecciosas causadas pelo consumo de alimentos ou água contaminados.

(29)

Staphylococcus aureus

Gram

+

_cocci

Coagula o plasma de coelho

Produz uma enterotoxina termo – resistente

Em

alimentos

:

1. Mal cozinhados ou em carnes muito manuseadas (aves

domésticas, presunto e outros produtos de charcutaria)

2. Produtos lácteos e doçaria

(30)

Bacillus cereus

Sindroma emético (acompanhado de vómitos).

Alimento

Alimento implicadoimplicado: Arroz cozinhado mantido à temperatura

ambiente por períodos longos e antes de ser consumido é aquecido rapidamente

Sindroma diarreico (os vómitos estão ausentes)

Alimentos implicados

Alimentos implicados: grande variedade de alimentos, incluindo carne e

vegetais, molhos, massas, sobremesas e produtos lácteos. Bacilos Gram+

Esporulados β-hemoliticos

(31)

Estirpes

bacterianas

e determinação

e

determinação

da

actividade

antibacteriana

4 estirpes de

Staphylococcus aureus

(CFSA1; CFSA2; CFSA3; CFSA4).

3 estirpes de

Bacillus cereus

(C1010; C1060; C1062).

A actividade antibacteriana foi determinada através do método de

difusão em agar no meio Brain Heart Infusion. O óleo essencial foi

eluído em 2-propanol. Colocou-se 4 µl do óleo essencial em cada disco.

(32)

Antibacterial activity of

Origanum

spp and

Calamintha baetica

essential oils

25.00±0.00 18.33±1.15 24.00±0.00 24.00±1.00 24.66±0.57 27.00±1.41 26.00±1.00 Antibiotico 22.00±2.64 8.67±0.58

B. cereus

C1062 8.67±0.57 *

B. cereus

C1060 12.33±1.52 8.67±0.56

B. cereus

C1010 18.33±2.88 9.33±0.58 CFSA4 13.33±2.08 7.67±0.58 CFSA3 16.50±4.80 8.75±0.35 CFSA2 11.25±3.25 5.50±1.06 CFSA1