Lista de Abreviaturas

Lista de Abreviaturas aa Aminoácido

ABV Adraímicina, bleomicina e vincristina ACTG “AIDS Clinical Trial Group”

Ag Antígeno

aids Síndrome da Imunodeficiência Adquirida

BC-1 Linhagem celular de fluido ascítico humano duplamente infectada pelo EBV e HHV-8

BC-3 Linhagem celular de fluido ascítico humano infectada pelo HHV-8

BCBL “Body Cavity-Based Lymphoma” – linfoma de células B com efusão em cavidades

BCBL-1 Linhagem celular obtida de linfoma de células B com efusão em cavidades

Bcl-2 “B-cell leukemia/lymphoma-2”

BCP-1 Linhagem celular de sangue periférico humano infectada pelo HHV-8 bp Pares de bases nitrogenadas "base pair"

CDC “Center for Diseases Control and Prevention”, Atlanta, EUA CD4+ Linfócito T CD4 positivo

CS Grupo controle sadio CMV Citomegalovirus CV Carga viral

DEPC Dietilpirocarbonato DMSO Dimetilsufóxido

DNA Ácido desoxirribonucléico DNAse Enzima DNAse

dNTPs “Deoxinucleosides triphosphates” DST Doenças sexualmente transmissíveis EBV Vírus Epstein Barr

EBNA-1 Antígeno nuclear de virus Epstein Barr EDTA Etileno diamino tetracético ácido

ELISA Ensaios imunoenzimáticos “Enzyme Linked Immunosorbent Assay” EtBr Brometo de etídio

FLICE “Fas-associated death domain-like interleukin-1(β) converting enzyme” FLIP Proteína inibitória da FLICE

FMUSP Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo g Força centrífuga

GPCR Receptor acoplado da proteína G

HAART "Highly active antiretroviral therapy", terapia antiretroviral combinada Hae III Haemophilus aegiptius

HHV-6 Herpesvirus humano tipo 6 "Human herpesvirus 6" HHV-8 Herpesvírus humano tipo 8 "Human herpesvirus 8" Hinf I Haemophilus influenzae

HIV Vírus da Imunodeficiência Humana

HIV/aids Grupo de pacientes infectado pelo HIV sem SK HIS Hibridização “in situ”

HSH Homens que fazem sexo com homens HSV Vírus herpes simplex

IAL Instituto Adolfo Lutz IF Imunofluorescência

IFI-Lítico Imunofluorescência indireta ao Ag-Lítico do HHV-8 IFN Interferon

IL-6 Interleucina 6 IP Inibidor de Protease IRD “Internal Repeat Domain”

IIER Instituto de Infectologia Emílio Ribas Kb Quilo pares de bases nitrogenadas KDa Quilo Dalton

KS-1 Linhagem celular de fluido ascítico humano infectada pelo HHV-8 KSHV “Kaposi’s sarcoma herpesvirus”

LNA-1 Antígeno nuclear relacionado à latência tipo 1

LANA Antígeno nuclear relacionado à latência do vírus HHV-8 LUR “long unique region”

M “marker”

M Molar

MCD-HIV “Multicentric Castleman’s disease” associada ao HIV mg Miligrama

mL Mililitro mM Milimolar

MM Mieloma Múltiplo mn Mononuclear

Mse I Micrococcus species

N Normal

ng Nanograma

nm Nanômetro

nM Nanomol

Nsi I Neisseria sicca

OR “odds ratio” - Razão de chances Nt Nucleotídeo

ORF “Open reading frame” - região aberta de leitura pb Pares de bases

p53 Proteína de 53 KDa

PBS Solução salina tamponada com fosfato

PCR “polymerase chain reaction”- reação em cadeia da polimerase PEL “primary effusion lymphoma”- linfoma de efusão em cavidades PH Concentração hidrogênio-iônica

PHLS Public Health Laboratory Service of London pM Picomol

PM Peso Molecular

PMA “Phorbol myristate acetate” QT Quimioterapia

RDA “Representational Difference Analysis” RFLP “restriction fragment length polymorphism” RNA Ácido ribonucléico

RNAm Acido ribonucléico mensageiro

SINAN Sistema de Informações de Agravos de Notificação SDS Dodecil sulfato de sódio

SDS-PAGE Dodecil sulfato de sódio - Eletroforese em gel de poliacrilamida SK Sarcoma de Kaposi

SK/aids Grupo de pacientes com Sarcoma de Kaposi associado à infecção HIV/aids

SK

class. Grupo de pacientes com SK Clássico SPSS “Statistical Package for Social Sciences” TAE Tampão TRIS-acetato EDTA

Taq I Thermus aquaticus

tat Proteína transativadora do HIV TE Tampão TRIS-HCl EDTA Th2 Resposta de célula T tipo 2 TNF-αααα Fator de necrose tumoral- alfa

TR “terminal repeat” ou regiões repetitivas Tris-HCl Tampão Tris-ácido clorídrico

UDI Usuário de droga intravenosa UV Ultra violeta

V Volts

v/v Volume a volume

vBcl-2 “viral B-cell leukemia/lymphoma-2” vcyc Ciclina D – viral homóloga

VEGF “vascular endothelial growth factor” vFLIP Proteína viral inibitória da FLICE vGPCR Receptor acoplado a proteína G viral vIRF-1 Interferon viral

vIL-6 Interleucina 6 viral

vMIP-I,II,III Proteínas virais inflamatórias semelhantes às de macrófagos tipos I, II e III vNCAM Molécula de adesão viral

vP 16 Proteína de capsídeo viral de 16 KDa VR1 Região hipervariável 1

VR2 Região hipervariável 2 WB “Western blot”

λλλλ Comprimento de onda – lambda g Microgramas

L Microlitros M Micromoles

Lista de Figuras

Figura I – Representação esquemática do HHV-8 06

Figura II - Aspecto morfológico de partículas completas do HHV-8 07 Figura III - Representação esquemática do genoma do HHV-8 08 Figura IV - A Representação esquemática das proteínas

expressas pela célula infectada pelo HHV-8; B Representação esquemática do mecanismo da patogênese do SK (A e B)

11

Figura V- Amostras representativas do rendimento de DNA obtido com a técnica de extração com fenol/clorofórmio, de diferentes espécimes biológicos, quando submetidos à eletroforese em gel de agarose a 1,2%

28

Figura VI - Amostras representativas do padrão eletroforético de produtos de PCR de beta-globina humana (banda de 268 pb) em gel de agarose a 2,0%

29

Figura VII - Localização das ORFs K1, 25, 26, K8.1 e 73 no genoma de HHV-8

29 Figura VIII - Amostras representativas dos produtos de PCR

“nested” da ORF 26 do genoma do HHV-8 (banda de 211 pb), quando submetidos a eletroforese em gel de agarose a 2%, corado com EtBr

33

Figura IX - Amostras representativas dos produtos de PCR “nested” da ORF K1 do genoma do HHV-8 (banda de 247 pb), quando submetidos a eletroforese em gel de agarose a 2%, corado com EtBr

33

Figura X - Amostras representativas dos produtos de PCR “nested” das ORFs K8.1, 73 e 25 do genoma do HHV-8 (bandas de 537, 547 e 213 pb, respectivamente) quando submetidos a eletroforese em gel de agarose a 2%, corado com EtBr

33

Figura XI - Perfil de restrição enzimática obtido com a PCR-RFLP de produtos da ORF K1 (VR1) de HHV-8, subtipos A, B e C, quando submetidos ao SDS-PAGE

35

Figura XII - Perfil de restrição enzimática obtido com a PCR-RFLP de HHV-8, subtipo E , quando submetidos ao SDS-PAGE

35 Figura XIII - Padrão de fluorescência observado no ensaio de

imunofluorescência indireta para pesquisa de anticorpos dirigidos a antígenos de fase latente LANA) e lítica do HHV-8 (IFI-Lítico) utilizando células BCBL-1 latentemente infectadas (A), estimuladas com forbol éster (B), soro de paciente com sarcoma de Kaposi e controle negativo (C)

Lista de Gráficos

Gráfico 1- Gráfico representativo da distribuição de freqüências e proporções dos resultados de PCR positivos em sangue, segundo o Grupo e as ORFs avaliadas

49 Gráfico 2 - Gráfico representativo da distribuição de freqüências e

proporções dos resultados de PCR positivos em saliva, segundo Grupo e as ORFs avaliadas

52 Gráfico 3 - Gráfico representativo de freqüências e proporções

dos resultados de PCR positivos em Urina, segundo o Grupo e as

ORFs avaliadas

55 Gráfico 4 - Gráfico representativo de freqüências e proporções

dos resultados positivos em Biópsia, segundo Grupo e as ORFs avaliadas

58 Gráfico 5 - Gráfico representativo do número de cepas de HHV-8

dos subtipos A, B, C e E, detectadas pela técnica de PCR-RFLP da casuística em estudo

Lista de Tabelas

Tabela 1 - Distribuição de freqüência e proporção de algumas variáveis categorizadas como dicotômicas para os casos pertencentes ao grupo SK/aids (n=76)

41 Tabela 2 - Média e desvio padrão de algumas variáveis contínuas

do grupo SK/aids (n=76) 41

Tabela 3 - Distribuição das freqüência e proporção de casos para

algumas variáveis laboratoriais obtidas no grupo HIV/aids (n=19) 42 Tabela 4 - Média e desvio padrão de algumas variáveis contínuas

do grupo HIV/aids (n=19) 43

Tabela 5 - Distribuição das freqüências e proporções dos resultados obtidos com as PCRs em sangue, segundo o Grupo e as Combinações das ORFs

45 Tabela 6 - Distribuição das freqüências e proporções dos

resultados obtidos com as PCRs em Saliva, segundo Grupo e as Combinações das ORFs

46 Tabela 7 - Distribuição das freqüências e proporções dos

resultados obtidos com as PCRs em Urina, segundo Grupo e as Combinações das ORFs

47 Tabela 8 - Distribuição das freqüências e proporções dos

resultados nas PCRs em Biópsia, segundo Grupo e Combinações das ORFs.

48 Tabela 9 - Distribuição das freqüências e proporções de

resultados POSITIVOS em sangue, segundo o Grupo e as ORFs

avaliadas

49 Tabela 10 - Nível descritivo (p-valor) referente às comparações

das ORFs dentro dos GRUPOS SK/aids e HIV/aids para sangue 50 Tabela 11 - Nível descritivo (p-valor) referente às comparações

das ORFs entre os GRUPOS SK/aids e HIV/aids para sangue 51 Tabela 12 - Distribuição das freqüências e proporções de

resultados POSITIVOS em Saliva, segundo o Grupo e as ORFs avaliadas

52 Tabela 13 - Nível descritivo (p-valor) referente às comparações

das ORFs dentro dos GRUPOS SK/aids e HIV/aids para SALIVA 53 Tabela 14 - Nível descritivo (p-valor) referente às comparações

das ORFs entre os GRUPOS SK/aids e HIV/aids para SALIVA 54 Tabela 15 - Distribuição de freqüências e proporções dos

resultados positivos em Urina, segundo o Grupo e as ORFs

avaliadas

Tabela 16 - Nível descritivo (p-valor) referente às comparações

das ORFs dentro dos GRUPOS SK/aids e HIV/aids para URINA 56 Tabela 17 - Nível descritivo (p-valor) referente às comparações

das ORFs entre os GRUPOS SK/aids e HIV/aids para URINA 57 Tabela 18 - Distribuição das freqüências e proporções dos

resultados positivos em Biópsia, segundo o Grupo e as ORFs avaliadas

58 Tabela 19 - Nível descritivo (p-valor) referente às comparações

das ORFs dentro do GRUPO SK/aids para BIÓPSIA 59 Tabela 20 - Distribuição das freqüências e proporções dos casos,

segundo o Subtipo de HHV-8 e Cor da pele dos pacientes 61 Tabela 21 - Distribuição das freqüências e proporções dos casos,

segundo o Subtipo de HHV-8 e Origem étnica dos pacientes 62 Tabela 22 - Distribuição das freqüências e proporções dos casos,

segundo o Subtipo de HHV-8 e Localização do SK 63 Tabela 23 - Níveis descritivos obtidos dos ajustes de regressão

logística quando considerado o Grupo e a Cor da pele 64 Tabela 24 - Razão de Chances ("Odds Ratio") avaliadas em Cor

da pele 64

Tabela 25 - Níveis descritivos obtidos dos ajustes de regressão

logística quando considerado o Grupo e o Risco 65 Tabela 26 - Razão de Chances ("Odds Ratio") avaliadas em

Risco 65

Tabela 27 - Níveis descritivos obtidos dos ajustes de regressão logística quando considerado o Grupo e a contagem de células CD4

65 Tabela 28 - Níveis descritivos obtidos dos ajustes de regressão

logística quando considerado o Grupo e reatividade na IFI-LANA 66 Tabela 29 - Razão de Chances ("Odds Ratio") avaliadas em

IFI-LANA 66

Tabela 30 - Níveis descritivos obtidos dos ajustes de regressão

logística quando considerado o Grupo e a reatividade na IFI-Lítico 67 Tabela 31 - Razão de Chances ("Odds Ratio") avaliadas em

Lista de Quadros

Quadro I – Alguns genes do HHV-8 semelhantes aos genes presentes em outros vírus e no DNA humano, proteínas codificadas e propriedades funcionais.

10 Quadro II – Descrição das proteínas codificadas pelos genes

ORF K1, ORF 25, ORF 26, ORF K8.1 e ORF 73 de HHV-8. 30

Quadro III – Relação das regiões do genoma de HHV-8 pesquisadas, nome e seqüência dos "primers" e tamanho dos produtos das PCRs

32 Quadro A. Dados epidemiológicos clínicos e laboratoriais do

grupo SK/aids (n=76) 122

Quadro B - Resultados obtidos nas PCRs "nested" ORF 26, ORF

K1, ORF K8.1, ORF 73 e ORF 25 em sangue periférico, material

de biópsia, saliva e urina do grupo SK/aids (n=76)

128 Quadro C. Pacientes do grupo SK/aids que apresentaram

codificação NE (não existe), por não ter sido possível a coleta dos espécimes biológicos assinalados

131 Quadro D. Dados epidemiológicos, clínicos e laboratoriais do

grupo HIV/aids, sem SK (n=19) 132

Quadro E. Resultados obtidos nas PCRs "nested" ORF 26, ORF

K1, ORF K8.1, ORF 73 e ORF 25 em sangue periférico, saliva e

urina no grupo HIV/aids sem SK (n=19)

133 Quadro F. Dados epidemiológicos, clínicos e laboratoriais dos

pacientes do grupo SK class. (n= 4) 134

Quadro G. Resultados obtidos nas PCRs "nested" ORF 26, ORF

K1, ORF K8.1, ORF 73 e ORF 25 em sangue periférico, material

de biópsia, saliva e urina no grupo SK class (n=4)

135 Quadro H. Dados epidemiológicos e laboratoriais do grupo

controle sadio, HIV soronegativo (n=11) 136

Quadro I - Resultados obtidos nas PCRs "nested" ORF 26, ORF

K1, ORF K8.1, ORF 73 e ORF 25 em sangue periférico, saliva e

urina de pessoas sadias sem Risco epidemiológico para adquirir viroses, grupo controle sadio CS (n= 11)

Resumo

Desde a descoberta do herpes vírus humano tipo 8 (HHV-8) como o agente etiológico do sarcoma de Kaposi (SK) nas suas diferentes formas clínico-epidemiológicas, vários estudos vêm sendo conduzidos com o intuito de determinar as vias de transmissão desse vírus em populações endêmicas e de risco epidemiológico. Em regiões endêmicas, a transmissão viral foi relacionada à transmissão horizontal de mães para filhos e entre irmãos e a sexual principalmente, nos casos de SK/aids. Com o objetivo de determinar segmentos do genoma viral em fluídos biológicos e consequentemente seu potencial infectante foi conduzido o presente trabalho. Foram avaliados quanto à presença de segmentos localizados em posições estratégicas do genoma do HHV-8 em sangue, saliva e urina de 76 pacientes com SK/aids, 19 pacientes com HIV/aids, 4 casos de SK clássico e 11 indivíduos sadios (HIV-soronegativos, sem SK). Foram utilizadas as técnicas de PCR “nested” para as ORF K1, ORF 25, ORF 26, ORF K8.1 e ORF 73 em DNA extraído de material de biópsia de lesão de SK (controle positivo), células do sangue periférico, saliva e urina. Os resultados de PCR positivo para o HHV-8 foram analisados quanto a variáveis epidemiológicas, clínicas e laboratoriais. Foram consideradas como variáveis: sexo, cor, origem étnica, tempo de infecção por HIV e de acompanhamento do SK, terapia ARV e para SK, contagem de células CD4+ e sorologia para o HHV-8 (IFI-LANA e IFI-Lítico). Os testes estatísticos de regressão logística e de razão de chances foram usados para detectar as associações estatisticamente significantes entre as PCRs positivas e as variáveis estudadas nos grupos SK/aids e HIV/aids. Os subtipos do HHV-8 foram também determinados pela técnica de PCR-RFLP da ORF K1 (VR1). Os resultados obtidos mostraram a detecção de DNA/HHV-8 em 80,2% do material de biópsia, 69,7% no sangue, 59,2% na saliva e 21,0% na urina de pacientes com SK/aids. No grupo HIV/aids, a PCR para o HHV-8 resultou positiva em 47,4% dos casos no sangue e em 26,3% na saliva e urina. Já no grupo SK clássico 100% das biópsias e salivas resultaram PCR positiva, 67% do sangue e 33% das urinas. A avaliação sorológica revelou 73,3% de reatividade para IFI-LANA e 85,3%

para a IFI-Lítico no grupo SK/aids, enquanto o grupo HIV/aids mostrou reatividade de 15,8% para IFI-LANA e 47,4% para IFI-Lítico; todos os pacientes apresentaram resultados reagentes nas duas sorologias para o HHV-8 no grupo de SK clássico. No grupo controle sadio não houve reatividade na sorologia para o HHV-8, com exceção de um caso, que mostrou ser reagente na IFI-LANA. Foi possível realizar a subtipagem do HHV-8 em amostras de 69 pacientes, sendo detectadas 27 cepas do subtipo A, 13 do subtipo B, 28 do subtipo C e 1 do subtipo E. Após as análises estatísticas foi verificado que as PCRs que identificam as regiões ORF 26,

ORF K8.1 e ORF 73 foram as que apresentaram melhor desempenho na

identificação de DNA/HHV-8. Houve associação entre a reatividade de IFI-Lítico e a presença do vírus no sangue periférico, assim como a reatividade para IFI-LANA e a detecção de DNA/HHV-8 na saliva. Houve uma tendência dos subtipos B e C de HHV-8 serem detectados em pacientes com infecção profunda ou disseminada de SK. Estes resultados sugerem que a boca pode ser um sítio de latência da infecção por HHV-8 e confirmam a atuação de sangue, saliva e urina como fluídos potencialmente infectantes.

Abstract

Since the discovery of the human herpesvirus 8 (HHV-8) as the etiological agent of Kaposi’s sarcoma (KS), several studies have been conducted in order to determine routes of virus transmission, mostly in endemic and at risk populations. The main of the present study was to determine target segments of the HHV-8 genoma and consequently infected bodily fluids. DNA sequences of ORF K1, ORF 25, ORF 26, ORF K8.1 and

ORF 73 strategically localized in viral genoma were searched using nested

PCR techniques in KS lesions (positive control), blood, saliva, and urine from 76 KS/aids patients, 19 HIV/aids patients, 4 classic KS patients, and among 11 healthy individuals (HIV-1 seronegative, without KS). HHV-8 subtypes were determined by PCR-RFLP of the ORF K1 (VR1), and HHV-8 antibodies by IFA-LANA and IFA-Lytic assays. The results obtained were analyzed according to epidemiological, clinical and laboratorial data, and the χ2 _test,

logistic regression and odds ratio were applied to identify statistical association among variables in KS/aids and HIV/aids groups. The results obtained showed HHV-8 DNA in 80.2% of biopsies, 69.7% of blood, 59.2% of saliva, and 21% of urines from KS/aids group. Among HIV/aids patients, 47.4% resulted PCR positive in blood, 26.3% in saliva and urine. In classic KS cases, all biopsies and saliva resulted PCR positive, 67% in blood, and 33% in urine. The serology in KS/aids group showed 73.3% frequency of anti-latent antibodies, and 85.3% frequency of anti-lytic antibodies, while in HIV/aids group the frequencies were 15.8% and 47.4%, respectively. All classic KS cases resulted HHV-8 seroposite, while all individuals from control group resulted HHV-8 seronegative. Molecular characterization of 69 HHV-8 strains disclosed: 27 of subtype A, 13 of subtype B, 28 of subtype C, and 1 of subtype E. The ORF 26, ORF K8.1 and ORF 73 were the best segments for identifying HHV-8 DNA in bodily fluids. It was observed an association between antibodies to lytic antigens and the presence of HHV-8 in blood, and antibodies to latent antigens and the detection of HHV8 DNA in saliva of KS/aids patients. Indeed, HHV-8 subtypes B and C were detected mostly in disseminated KS cases. Taken together, the results obtained suggest that

the mouth could be one site of HHV-8 latency, and confirm that blood, saliva and urine were potentially infectious bodily fluids.