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Fungos micorrízicos arbusculares (Glomeromycota) em um contínuo de restinga e caatinga, na reserva de desenvolvimento sustentável Estadual Ponta do Tubarão-RN

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Academic year: 2021

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(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SISTEMÁTICA E EVOLUÇÃO. FUNGOS MICORRÍZICOS ARBUSCULARES (GLOMEROMYCOTA) EM UM CONTÍNUO DE RESTINGA E CAATINGA, NA RESERVA DE DESENVOLVIMENTO SUSTENTÁVEL ESTADUAL PONTA DO TUBARÃO, RN. KÁSSIA JÉSSICA GALDINO DA SILVA. ________________________________________________. Dissertação de Mestrado Natal/RN, março de 2017.

(2) KÁSSIA JÉSSICA GALDINO DA SILVA. FUNGOS MICORRÍZICOS ARBUSCULARES (GLOMEROMYCOTA) EM UM CONTÍNUO DE RESTINGA E CAATINGA, NA RESERVA DE DESENVOLVIMENTO SUSTENTÁVEL ESTADUAL PONTA DO TUBARÃO, RN. Dissertação. apresentada. Graduação. em. ao. Sistemática. Curso e. de. Evolução. Pósda. Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte das exigências para obtenção do grau de Mestre.. Linha de Pesquisa: Taxonomia, Sistemática e Ecologia. Orientadora: Profa. Dra. Raquel Cordeiro Theodoro. Coorientador: Prof. Dr. Bruno Tomio Goto. Natal – RN 2017.

(3) Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson - -Centro de Biociências - CB. Silva, Kássia Jéssica Galdino da. Fungos micorrízicos arbusculares (Glomeromycota) em um contínuo de restinga e Caatinga, na reserva de desenvolvimento sustentável Estadual Ponta do Tubarão - RN / Kássia Jéssica Galdino da Silva. - Natal, 2017. 77 f.: il. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de pós-graduação em Sistemática e Evolução. Orientadora: Profa. Dra. Raquel Cordeiro Theodoro.. 1. Sazonalidade - Dissertação. 2. Diversidade - Dissertação. 3. Ecótono - Dissertação. 4. Salinidade - Dissertação. 5. FMA Dissertação. I. Theodoro, Raquel Cordeiro. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título. RN/UF/BSE-CB. CDU 502.15.

(4) KÁSSIA JÉSSICA GALDINO DA SILVA. FUNGOS MICORRÍZICOS ARBUSCULARES (GLOMEROMYCOTA) EM UM CONTÍNUO DE RESTINGA E CAATINGA, NA RESERVA DE DESENVOLVIMENTO SUSTENTÁVEL ESTADUAL PONTA DO TUBARÃO, RN. Dissertação. apresentada. Graduação. em. ao. Sistemática. Curso e. de. Evolução. Pósda. Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte das exigências para obtenção do grau de Mestre.. Aprovada em: 06 de Março de 2017. Comissão Examinadora:. Dra. Danielle Karla Alves da Silva (UNIVASF). Dr. Iuri Goulart Baseia (UFRN). Dra. Raquel Cordeiro Theodoro (UFRN - Orientadora).

(5) DEDICATÓRIA. Ao meu pai, Raimundo Galdino (in memoram) dedico..

(6) “Aquele que vive esteticamente espera tudo de fora. Daí a angústia enfermiça com que muita gente fala do que há de terrível no fato de não ter encontrado seu lugar no mundo. A angústia demonstra sempre que o indivíduo espera tudo desse lugar, nada de si mesmo”. Soren Kierkegaard.

(7) AGRADECIMENTOS. Agradeço aos órgãos financiadores desse projeto, seja com a concessão da bolsa ou de auxílios financeiros: CAPES, PPg (Pró-Reitoria de Pós-Graduação UFRN), PPGSE (Programa de Pós-Graduação em Sistemática e Evolução). Á minha orientadora, profª Dra. Raquel Cordeiro Theodoro por toda orientação e mais que isso, apoio (financeiro e moral), amizade e comprometimento a esse trabalho. Não poderia ter orientadora melhor. Ao meu Coorientador profº Dr. Bruno Tomio Goto, por todos esses anos de contribuição. A banca de qualificação profª Dra. Maria Tereza Barreto e profº Dr. Alexandre Fadigas, com seus conselhos e críticas bem utilizadas nesse trabalho final. A banca de defesa profª Dra. Danielle Karla Alves da Silva e profº Dr. Iuri Goulart Baseia, por terem aceitado tão prontamente o convite e por todos os pontos levantados que serão de grande ajuda. A minha família, em especial minha mãe Iracema Francisca da Silva Galdino, pelo apoio e auxilio na falta de bolsa e pelo cuidado comigo. Aos meus colegas e ex-colegas de laboratório (LBM, LAVIMI e LBF) que ajudaram em todos os momentos: José Alex, Conceição Castro, Matheus Zatti, Felipe Gomes, Ingrid Góes, Thales Domingos, Adler Santana, Xocthil Margarito, Aretha Melo, Ana Clarissa, Nathalia Mendonça, Julimar Freitas Neto, Rafaela Gomes, Cintia de Maria, Miguel Dorcino, Rhudson Cruz, enfim, todos da micologia ambiental e médica da UFRN. Em especial agradeço aos meus amigos Marcus Issler e Danilo Miguel, que foram a campo e deram uma mão no trabalho pesado, sem vocês seriam uns kilos a mais pra carregar..

(8) Ao Ruy Lima, por toda correção no texto, pelas dúvidas tiradas e por todo apoio. Assim como a sua esposa Gabriela Araújo. Ao José Luiz por ajuda na estatística e em tudo que já precisei na graduação e mestrado. À todos os amigos, que mesmo não ajudando na produção cientifica, foram uteis para manter a sanidade da mente em momentos difíceis. Ao Victor Schinaider, que sem ele este último ano de mestrado não teria sido tão suportável. Por todo amor e incentivo quando preciso. À Deus por ter me sustentado e por me dar mais do que preciso e espero. Não teria conseguindo chegar até aqui, se o Senhor não tivesse me sustentado..

(9) RESUMO A zona costeira é caracterizada por uma transição entre biomas ou fitofisionomias, apresentando condições ambientais estressantes. No Rio Grande do Norte tal transição. se. dá. pela. sobreposição. (ecótono). entre. restinga. e. caatinga,. fitofisionomias distintas, caracterizadas por formações mosaicas. Além das próprias adaptações das espécies vegetais a essa zona de interface, outro fator importante para a sobrevivência das espécies vegetais são os fungos micorrízicos arbusculares (FMA), simbiontes obrigatórios importantes para a estabilização do sistema soloplanta. Diante dessa importância ecológica, este trabalho objetivou identificar a diversidade da comunidade de FMA em um contínuo de restinga e caatinga ao longo do litoral do RN, na Reserva de Desenvolvimento Sustentável Estadual Ponta do Tubarão, Macau/Guamaré, RN. Foram realizadas duas coletas de solo, uma no fim do período após chuva e outra no período seco, bem como avaliação de fatores abióticos do solo e sua influência sobre a comunidade de FMA, cuja diversidade foi aferida pela morfologia dos esporos. Foram identificadas 24 espécies, destas 12 são exclusivas da restinga, uma (1) exclusiva de caatinga e 11 ocorrem em ambas as áreas. Quanto à dinâmica sazonal, o período seco demonstrou uma maior abundância dos esporos, e no período chuvoso espécies esporocárpicas, com formação. em. aglomerado. de. cachos. de. esporos,. foram. frequentemente. encontradas. Os fatores ambientais que mais influenciaram a distribuição das espécies foram a salinidade e o pH. A salinidade, assim como os demais aspectos químicos do solo averiguados, se mostrou homogênea, sendo encontrados alguns sítios específicos mais salinos, os quais apresentaram uma baixa riqueza de espécies. Tal resultado sugere um significativo impacto de uma das principais atividades econômicas do RN, as salinas, na biodiversidade de FMA no solo. PALAVRAS-CHAVE: FMA, Diversidade, Ecótono, Salinidade, Sazonalidade..

(10) ABSTRACT. The. coastal. zone. is. characterized. by. a. transition. between. biomes. or. phytophysiognomies and may present stressful environmental conditions. In Rio Grande do Norte State (Brazil), this transition occurs due to the overlap (ecotone) between restinga and caatinga, distinct phytophysiognomies, characterized by mosaic formations. In addition to the flora adaptations to this interface, another important factor for the survival of plant species is the arbuscular mycorrhizal fungi (AMF), which are important symbionts that are relevant for the stabilization of the soil-plant system. In view of its ecological importance, this work aimed to identify the diversity of the AMF community in a restinga and caatinga continuum along the Northeastern coast, in the Ponta do Tubarão Sustainable Development Reserve, in Macau / Guamaré Counties, RN, Brazil. Two soil collection were carried out, one at the end of the period after rainfall and another in the dry period for AMF species identification by spore morphology. The soil abiotic factors and their influence on the AMF community were assessed. Twenty - four species were identified, 12 of which are exclusive to restinga, one (1) to caatinga and 11 occurred in both areas. As for the seasonal dynamics, the dry period showed a greater abundance of spores, and in the rainy season sporocarpic species, with agglomerates forming bunches of spores, were frequently found. The environmental factors that most influenced the distribution of the species were salinity and pH. The salinity, as well as the other chemical aspects of the soil verified, was homogeneous, being found some specific sites more saline, which presented a low species richness. This result suggests a significant impact of one of the main economic activities of the RN, the salines, on the biodiversity of AMF in the soil. Key-words: AMF, Diversity, Ecotone, Salinity, Seasonality..

(11) LISTA DE FIGURAS Figura 01. Estruturas intra e extra radiculares para colonização da raiz, reprodução do esporo e distribuição dos nutrientes para a planta .............................................. 15 Figura 02. Esquema da formação da micorriza arbuscular e simbiose com cianobactérias, estabelecimento da interface simbiótica ......................................... 21 Figura 03. Inserção dos primers: SSUmAr e SSUmCf (na porção 18S), LSUmAr e LSUmBr (na porção 28S); atingindo assim, uma região amplificada de cerca de 1800 pb, cuja cobertura vai do SSU, ITS1e2, 5.8S e LSU ................................................ 29 Figura 04. Árvore proposta em 2001 por Schuessler et al., mostrando o monofiletismo do grupo e desmembrando dois filos (Chytridiomycota e Zygomycota) ................................................................................................................................... 31 Figura 05. Mapa dos biomas brasileiros .................................................................. 32 Figura 06. Área da RDSE Ponta do Tubarão e seus limites ................................... 37 Figura 07. Caracterização da vegetação da RDSE Ponta do Tubarão ................... 38 Figura 08. Transectos de coleta na RSDE Ponta do Tubarão. R1 e R2: restinga; E1 e E2: restinga com região de Ecótono; C1 e C2: caatinga ...................................... 39 Figura 09. Fotos dos locais de coleta, na RSDE Ponta do Tubarão. A-B: restinga, sendo A estação pós chuvosa e B estação seca; C-D: caatinga, sendo C estação pós chuvosa e D estação seca; E-F: restinga com região de Ecótono, sendo E estação pós chuvosa e F estação seca ................................................................... 40 Figura 10. A – Coleta de solo rizosférico (RDSE Ponta do Tubarão); B – montagem de cultura armadilha na casa de vegetação da UFRN; C – peneiramento úmido e centrifugação em sacarose; D – separação dos esporos em ácido lático; E – Montagem de lâminas em PVLG e PVLG + Melzer; F – identificação das espécies de acordo com as chaves de identificação; G – Paradentiscutata maritima (espécie encontrada nesse estudo) ........................................................................................ 41 Figura 11. Presença das espécies em cada área, com sua representação em número de esporos encontrados .............................................................................. 44 Figura 12. Proporção da representação das famílias encontradas na caatinga e na restinga .................................................................................................................... . 44.

(12) Figura 13. Número de esporos por espécie em cada estação de coleta representando a abundância das espécies na restinga e na caatinga .................... 45 Figura 14. Análise de RDA de correlação entre a matriz ambiental e a riqueza e abundância das espécies ......................................................................................... 47 Figura 15: A-F Acaulospora sp.2, A-C: esporos montados em PVLG. D-F: esporos montados em PVLG + reagente Melzer. Siglas: (orn) ornamentação em forma de sulcos com espinhos no seu interior, primeira camada da parede externa, (ex) parede externa, (ex1) primeira camada da parede externa, (ex2) segunda camada da parede externa, (in) parede interna, (med) parede média, (med1) primeira camada da parede média, (med2) segunda camada da parede média, (sac) sáculo esporífero .................................................................................... ............................. 49 Figura 16: A-F Dentiscutata hawaiiensis, A-C: esporos montados em PVLG. D-F: esporos montados em PVLG + reagente Melzer. Siglas: (ex) parede externa, (ex1) primeira camada da parede externa, (ex2) segunda camada da parede externa, (in) parede interna, (med) parede média, (med1) primeira camada da parede média, (med2) segunda camada da parede média, (bs) bulbo suspensor, (hif) hifa do bulbo suspensor .................................................................................... ............................. 51 LISTA DE TABELAS Tabela 01: Espécies de FMA encontradas ao longo de todo estudo e suas respectivas famílias .................................................................................................. 43.

(13) LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ºC. Graus Celsius. μl. Microlitro. Al. Alumínio. ARISA. Automated Ribossomal Intergenic Spacer Analysis. DNA. Deoxyribonucleic Acid. DGGE. Denaturing Gradient Gel Elecrophoresis. EMPARN. Empresa de Pesquisa Agropecuária do RN. FMA. Fungo Micorrízico Arbuscular. IBGE. Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística. IDEMA. Instituto de Desenvolvimento Sustentável e Meio Ambiente. ITS. Internal Transcribed Spacer. Kg. Kilograma. LSU. large subunit. m. Metro. MA. Micorriza Arbuscular. Mg. Magnésio. mm. Milímetro. MMA. Ministério do Meio Ambiente. N. Nitrogénio. Na. Sódio. NaCl. Cloreto de Sódio. OTU. operational taxonomic unit. P. Fósforo. PCA. Principal Component Analysis. PCR. Polymerase Chain Reaction. pH. Potencial hidrogeniônico. PPBIO. Programa de Pesquisa em Biodiversidade. PVLG. Polyvinyl alcohol-lactic acid-glycerol. RAPD. Random Amplified Polymorphic DNA.

(14) RDA. Redundancy Analysis. RDSE. Reserva de Desenvolvimento Sustentável Estadual. RISA. Ribossomal Intergenic Spacer Analysis. RFLP. Restricion Fragment Length Polymorphism. RN. Rio Grande do Norte. rRNA. RNA ribossomal. SSR. Single Sequence Repeats. SSU. Small Subunit. T-RFLP. Terminal Restricion Fragment Length Polymorphism. UC. Unidade de Conservação. UFRN. Universidade Federal do Rio Grande do Norte.

(15) SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ...................................................................... .............. 14. 1.1 FUNGOS MICORRIZICOS ARBUSCULARES: CONCEITO, IMPORTÂNCIA E TAXONOMIA ......................................................... 14. 1.2 CONTÍNUO RESTINGA-CAATINGA ............................................ 31. 2. OBJETIVOS ........................................................................................ 36. 2.1 OBJETIVO GERAL ....................................................................... 36. 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................... 36. 3. MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................. 37. 3.1 ÁREA DE ESTUDO E COLETA DE SOLO ................................... 37. 3.2 ANÁLISES TAXONÔMICAS ......................................................... 41. 3.3 ANÁLISES ECOLÓGICAS ............................................................ 42. 4. RESULTADOS .................................................................................... 43. 4.1 TAXONOMIA ................................................................................. 43. 4.2 ÍNDICES DE BIODIVERSIDADE .................................................. 46. 4.3 DESCRIÇÃO DE ESPÉCIES ........................................................ 47. 5. DISCUSSÃO ....................................................................................... 52. 6. CONCLUSÃO ..................................................................................... 57. 7. REFERÊNCIAS ................................................................................... 58. 8. ANEXO ................................................................................................ 70.

(16) 14. 1. INTRODUÇÃO 1.1 FUNGOS MICORRÍZICOS ARBUSCULARES: CONCEITO, IMPORTÂNCIA E TAXONOMIA Os. Fungos. Micorrízicos. Arbusculares. (FMA),. pertencentes. ao. filo. Glomeromycota (SCHUESSLER et al., 2001), são simbiontes obrigatórios da maioria das raízes de plantas, colonizando desde Briófitas e Pteridófitas à Angiospermas e Gimnospermas (SMITH; READ, 2008), estima-se que essa associação micorrízica seja encontrada em aproximadamente dois terços de todas as espécies de plantas, incluindo plantas lenhosas e árvores tropicais (TOWNSEND et al., 2010). Há registros desses fungos em diversos habitats do planeta, (EMBRAPA, 2006; SIQUEIRA et al., 2002), tais como: áreas árticas (CABELLO et al., 1994), desérticas (YANG et al., 2008), floresta boreal (ÖPIK et al., 2008), tropical (GOTO et al., 2011) e ecossistemas de lagos (SUDOVÁ et al., 2015), o que demonstra que se trata de uma relação altamente difundida e bem sucedida (SMITH; READ, 2008). Evidências fósseis e moleculares apontam que a relação simbiótica entre espécies vegetais e fungos micorrízicos é antiga, datada de 450 a 600 milhões de anos. Esporos com formação scutellosporóides semelhantes aos de Gigasporales foram encontrados e datados em cerca de 400 milhões de anos (DOTZLER et al., 2009); o que indica que tal simbiose provavelmente foi um fator crucial para a colonização e estabelecimento das plantas vasculares no ambiente terrestre, (HELGASON; FITTER 2005; DOTZLER et al., 2009; SOUZA et al., 2007; REDECKER et al., 2000; SCHUESSLER et al., 2001; MAIA et al., 2010), uma vez que esta associação é essencial para o desenvolvimento e nutrição da planta, à medida que esta obtém nutrientes por meio da extensão do micélio fúngico no solo, proporcionando um maior alcance das raízes e, portanto uma maior área de contato com o seu substrato. O termo Micorriza “Arbuscular” (MA) faz referência à estrutura característica do grupo, os arbúsculos, responsáveis por transportar os nutrientes obtidos no solo para o simbionte vegetal. O arbúsculo é formado através da diferenciação de hifas intra radiculares que se instalam no córtex das raízes do simbionte vegetal, invaginando o tecido vegetal, disponibilizando os nutrientes obtidos pelas hifas.

(17) 15. extras radiculares (figura 01), as quais formam a extensão radicular que a planta tanto precisa; em troca a planta cede cerca de 20% dos seus carboidratos e lipídios (o produto assimilado) para o fungo (SIQUEIRA et al., 2002; BAGO et al., 2003; MARX, 2004; SMITH; READ, 2008; PARNISKE, 2008; CAVALCANTE et al., 2009).. Figura 01. Estruturas intra e extra radiculares para colonização da raiz, reprodução do esporo e distribuição dos nutrientes para a planta. (Fonte: Parniske, 2008) A emissão de moléculas sinalizadoras por parte da planta promove a colonização do simbionte vegetal pelos FMA. Um dos sinalizadores é a estrigolactona, que estimula o metabolismo do fungo aumentando o crescimento da hifa extra radicular, a qual entra em contato com a raiz e estabelece assim a MA (figura 01). Os mecanismos que irão promover a colonização e a comunicação entre os simbiontes são pouco conhecidos (COSTA et al., 2000), mas sabe-se que moléculas de origem vegetal, chamadas de fatores de ramificação induzem a intensa ramificação de hifas, tal indução se dá em situações limitantes de fósforo no substrato (BUÉE et al., 2000; LAMBAIS; RAMOS 2010). O crescimento das hifas é em direção à raiz, embora algumas, por algum motivo ainda não conhecido, destoem desse comportamento (SBRANA; GIOVANNETI, 2005;, LAMBAIS; RAMOS 2010)..

(18) 16. É importante salientar que essa sinalização poderá ser recebida por qualquer microrganismo que estiver ao seu alcance na rizosfera, sendo estes patógenos ou não. A associação é, portanto, tão benéfica para a planta a ponto que mesmo com o risco de um “hospedeiro indesejado” também receber o estímulo hormonal, esta estratégia de simbiose vem ocorrendo por pelo menos 400 milhões de anos (DOTZLER et al., 2009). A formação da micorriza arbuscular em regiões de clima semiárido, como em áreas de dunas, restinga (JANOS, 1980; CORDAZZO; STÜRMER, 2007) e caatinga (SOUZA et al., 2003; HELGASON; FITTER, 2005; GOTO, 2009), é de extrema importância para a estabilidade destes biomas, por aumentarem a tolerância das plantas a estresses ambientais bióticos e abióticos, como salinidade e estresse hídrico, bastante intensos nesses ambientes (SMITH; READ, 2008; MAIA; CAVALCANTE, 2005), protegendo também contra patógenos e herbívoros, assim como aumentando a resistência a metais tóxicos (NEWSHAM et al., 1995). Um exemplo dessa ajuda contra patógenos foi descrito por Newsham e seus colaboradores (1995), com plantas de Vulpia sp., para as quais foi analisado seu crescimento com e sem esporos de Glomus sp., sendo estas plantas também submetidas ao fungo patógeno Fusarium oxysporum. A espécie de fungo micorrízico em si não foi vista como incrementadora do crescimento da espécie de planta que era herbácea, mas na ausência do FMA e presença do patógeno, o crescimento era reduzido, na presença dos dois fungos, o crescimento ocorria em níveis normais, protegendo assim as plantas dos efeitos do patógeno. Os FMA viabilizam a absorção de macronutrientes, como o Nitrogênio (N) e o Fósforo (P), e também micronutrientes. Como elemento de baixa mobilidade no solo, o P geralmente se encontra em depósitos de águas nos solos, lagos, rios e oceanos, muitas vezes é visto como o responsável por inibir a formação de ectomicorrizas, e com isso torna-se um dos principais nutrientes de interesse nos estudos de endo e ectomicorriza. Esse interesse é principalmente dado pela mobilidade baixa do elemento no solo, sendo o solo, em especial o brasileiro, de baixo pH e baixa disponibilidade de fósforo (Kasuya et al., 2010). Também se pode falar do N e P como nutrientes alvos nos estudos, pois os mesmos são os elementos que mais limitam o crescimento vegetal (TOWNSEND et al., 2010)..

(19) 17. A importância deste macronutriente (fósforo) foi muito bem elucidada por Yano-Melo e colaboradores (2003), os quais observaram o aumento da absorção de P pela planta como um dos principais efeitos dos FMA levando a maior tolerância das plantas ao estresse salino. Assim, os autores evidenciaram que, na presença de FMA, os índices de P aumentam enquanto os de Na e NaCl diminuem no simbionte vegetal. Plantas associadas ao fungo micorrízico também possuem resistência ao estresse hídrico, apresentando taxas diferenciadas de abscisão durante a seca, transpiração, resistência estomática e crescimento (Maia; Cavalcante, 2005). A identificação e definição das espécies de FMA são, tradicionalmente, feitas por meio da morfologia dos esporos. Estudos moleculares apontam que o filo possua reprodução sexuada (GASPAROTTO et al., 2010), porém, a forma assexuada é a única que se conhece morfologicamente, inviabilizando o uso do conceito biológico de espécie. A reprodução assexuada se dá por meio da divisão dos esporos quando associados às raízes, motivo pelo qual são organismos simbiontes. obrigatórios,. já. que. sua. multiplicação. e. propagação. ocorrem. exclusivamente quando em simbiose. A identificação “clássica” de FMA é feita com base na morfologia dos esporos assexuados ou glomerosporos, diferenciando as espécies por suas paredes, camadas, ornamentações, entre outros caracteres A partir da estrutura reprodutiva assexuada, os esporos, chamados de glomerosporos (GOTO; MAIA, 2006; GOTO, 2009). Os esporos, além de estrutura de reprodução, são unidades de sobrevivência multinucleados, alvos também para taxonomia molecular (KUHN et al., 2001). A presença de vários núcleos (vários genomas) no mesmo esporo resulta em um DNA ribossomal,. principal. alvo. dos. estudos. moleculares,. altamente. polimórfico. (GASPAROTTO et al., 2010). Tal característica poderia ser uma evidência de reprodução sexuada, assim como também a capacidade de fusão de hifas e troca de material genético (REDECKER, 2000). Os critérios usados para identificação morfológica são: forma, dimensão dos esporos; forma de inserção da hifa no esporo, número, espessura e coloração das camadas da parede do esporo, presença ou ausência de bulbo, assim como da placa germinativa (ou escudo germinativo) (GERDEMANN; TRAPPE, 1974; GOTO;.

(20) 18. MAIA, 2006; GOTO, 2009). Dependendo do estágio de desenvolvimento do esporo, chegar ao nível de espécie fica inviável, por não termos o amadurecimento do esporo na fase de crescimento vegetativo (GASPAROTTO et al., 2010), faltando assim caracteres informativos. As formas de glomerosporos descritos são: glomóide, radial glomóide, gigasporóide, acaulosporóide, entrofosporóide e scutellosporóides (GOTO, 2009), sendo resumido atualmente em três: acaulosporoides, glomoides sensu lato e gigasporoides sensu lato. Esses tipos variam de acordo com a formação dos esporos, sendo na parte terminal, apical, lateral, ou dentro de uma hifa (MAIA et al., 2010). Já os tipos de camadas das paredes são: evanescente, laminada, unitária, flexível, amorfa, expansiva, germinativa, coriácea, chanfrada e membranosa (GOTO, 2009; MAIA et al., 2010), podendo-se encontrar em um esporo, uma mesma camada sendo mais de um tipo, como por exemplo: expansiva e laminada. Os primeiros representantes de Glomeromycota a serem publicados foram duas espécies do gênero Glomus (Glomerales), Glomus microcarpum e Glomus macrocarpum (Tul. & C. Tul.), em 1844. Desde então muitos outros fungos que formavam micorriza, foram sendo classificados dentro do Filo Zygomycota. Em 1851 essas duas espécies foram transferidas para outro gênero de Zygomycota, Endogone, por seus autores, e entre os anos de 1844 a 1962, o gênero Glomus foi sinonimizado com Endogone. O segundo gênero de FMA publicado para Zygomycota, foi Sclerocystis (Berk. & Broome) em 1873, e atualmente é um gênero da ordem Glomerales, em Glomeromycota. Entre os anos de 1963 e 1990 houve uma grande revisão da família Endogonaceae. (Gerdemann. &. Trappe,. 1974),. e. como. resultados. foram. determinados sete gêneros, além da criação de mais dois gêneros de FMA (Gigaspora, Acaulospora) e a classificação dos representantes de Glomus como gênero à parte de Endogone. Sendo os táxons então definidos por: Glomus, Sclerocystis, Gigaspora, Acaulospora, Endogone e Modicella. Dos setes, quatro são gêneros atuais de FMA (Glomus, Sclerocystis, Gigaspora, Acaulospora). Em 1974 Gerdemann & Trappe desenvolveram critérios para chave de identificação de espécies de FMA, que até hoje são utilizados para identificação das espécies desse grupo..

(21) 19. O gênero Entrophospora (Ames & Schneider) foi proposto em 1979, pela transferência da espécie Glomus infrequens para o novo gênero. Já Scutellospora surge em 1986, a partir de observações em determinadas espécies de Gigaspora, cuja parede interna possuía a característica germinativa. Gigaspora ficando, portanto, com espécies que não possuem parede interna ou parede típica para germinação (GOTO, 2009). Em 1989 foi criada à família Glomeraceae (Pirozynski & Dalpé) que agrupava Glomus e Sclerocystis, devido o modo de formação dos esporos. Também nessa época, de grande revisão do filo Zygomycota, foi descrita a ordem Glomales (Morton & Benny), em 1990, agrupando todos os gêneros que formavam Micorriza Arbuscular em um grupo monofilético. De 1990 a 2001 tivemos um período de descrição de novas espécies e dois novos gêneros (Archaeospora e Paraglomus). A ordem Glomales do filo Zygomycota era então composta por cinco famílias e sete gêneros: Glomeraceae (Glomus), Acaulosporaceae. (Entrophospora. e. Acaulospora),. Archaeosporaceae. (Archaeospora), Paraglomeraceae (Paraglomus) e Gigasporaceae (Gigaspora e Scutellospora). Passaram-se 157 anos entre a primeira descrição de uma espécie que formava micorriza arbuscular até que esses fungos simbiontes fossem elevados ao nível de filo (Glomeromycota) em 2001 por Schuessler et al., por meio de evidências moleculares da subunidade (SSU) de RNA ribossomal (rRNA) comprovando o monofiletismo do grupo. A principal característica biológica do filo para sua descrição é a simbiose obrigatória, seja com raízes de plantas (FMA) ou com cianobactérias, caso do único representante do filo que não forma Micorriza Arbuscular, a espécie Geosiphon pyriformis (Kütz) F. Wettst., ordem Archaeosporales (figura 02). Em 2004 foi proposta a criação do gênero Pacispora (Oehl & Sieverding), incluso na família Glomeraceae, com base morfológica e no modo de germinação dos esporos (glomóide). Walker e colaboradores, também em 2004, propõem a criação do gênero Gerdemannia na também proposta família Gerdemanniaceae, com base em análises SSU rDNA, e características morfológicas. Em 2006 temos a proposta de Spain et al., do gênero Appendicispora, dentro da família Archaeosporaceae, com bases morfológica..

(22) 20. Walker et al., desfaz sua proposta da família Ambisporaceae (WALKER et al., 2007), para propô-la como Appendicisporaceae, gênero Appendicispora, devido ao principio de prioridade do Código Internacional de Nomenclatura Botânica, pois a denominação de gênero dada por Spain et al. (2006) na proposta anterior do gênero Appendicispora. O gênero Otospora é proposto dentro da família Diversisporaceae, em 2008 por Palenzuela et al., no mesmo ano Oehl et al., concluíram que Scutellospora é um gênero polifilético, baseados em dados morfológicos e sequências de genes de rRNA 18S e 25S, reorganizando as espécies de Scutellospora em três novas famílias e cinco novos gêneros: Scutellosporaceae (Scutellospora),. Racocetraceae. (Racocetra,. Cetraspora). e. Dentiscutataceae. (Dentiscutata, Fuscutata, Quatunica). Mais tarde Morton e Msiska (2010), colocam apenas o gênero Racocetra como um clado bem sustentado, com base em análises moleculares de genes 25S rRNA e β-tubulina. Oehl et al., (2011a) propõem um revisão das ordens Glomerales e Diversisporales, criando como resultado da revisão os gêneros: Simiglomus, Septoglomus e Viscospora. No mesmo ano Oehl et al., (2011b), também propõem o gênero Orbispora, na família Scutellosporaceae e da ordem Gigasporales, classe Archaeosporomycetes, Paraglomeromycetes, com bases moleculares utilizados sequências parciais de β-tubulina e rRNA (SSU e LSU) (Oehl et al., 2011c), em dados não agrupados diferente de Morton & Msiska (2010), afirmando a validade de sua publicação em 2008. Oehl et al. (2011f) demonstraram que Entrophospora não é monofilético e sua espécie tipo, E. infrequens está mais relacionada com as espécies do gênero Claroideoglomus, colocando a família Entrophosporaceae para a ordem Glomerales, e espécies ancestrais de Claroideoglomus para o gênero criado Albahypha (Diversisporaceae), propondo a criação dos gêneros Tricispora (Entrophosporaceae) e Sacculospora, dentro da família, Sacculosporaceae..

(23) 21. Figura 02. Esquema da formação da micorriza arbuscular e simbiose com cianobactérias,. estabelecimento. da. interface. simbiótica.. (Fonte:. Parniske, 2008) Até 2010 tínhamos descritas 217 espécies no mundo, sendo 119 registradas no Brasil (SOUZA et al., 2010). Destas, 75 espécies foram registradas na caatinga no inventário de Maia et al. (2010). Já no mesmo ano, Goto et al. (2010) registraram adicionalmente 4 novas espécies para a caatinga. Com relação a outro tipo de vegetação brasileira, a mata atlântica, foram encontradas 37 espécies em áreas de dunas marítimas (STRÜMER et al., 2010), no entanto, esses dados se limitavam apenas às regiões sul e sudeste, apresentando os gêneros Gigaspora e Scutellospora com maior frequência, seguidos por Glomus e Acaulospora, o registro de uma espécie de cada um dos gêneros Paraglomus e Archeospora. Até o ano de 2012, não havia nenhum registro de espécie de FMA no estado do Rio Grande do Norte. O primeiro registro aconteceu nos trabalhos de Goto e Oehl (2012) com a publicação da espécie Glomus trufemii (B.T. Goto, G.A. Silva & F. Oehl), coletada em dunas do RN. Em 2014, uma nova espécie foi descrita em amostras de solo coletadas na reserva Parque Estadual Dunas do Natal, considerado o maior parque urbano sobre dunas do Brasil (IDEMA, 2015). Esta nova espécie recebeu o epiteto específico fazendo menção a cidade do Natal:.

(24) 22. Rhizophagus natalensis ≡ Rhizoglomus natalense (Błaszk., Chwat & B.T. Goto) Sieverd., G.A. Silva & Oehl. Goto. et. al.. (2015). também. descreveram. uma. nova. família. para. Glomeromycota, a Intraornatosporaceae, possuindo dois gêneros, Intraornatospora e. Paradentiscutata,. movendo. Racocetra. intraornata,. para. Intraornatospora. intraornata. Dentro de Paradentiscutata, duas espécies novas foram descritas, Paradentiscutata bahiana, coletada na Serra da Jibóia/BA e Paradentiscutata maritima, coletada em dunas dos estados da Paraíba e do Rio Grande do Norte. Em 2016, um inventário feito para área de dunas marítima (vegetação de restinga), na reserva Parque Ecológica Dunas de Genipabu, Rio Grande do Norte registrou 46 espécies de FMA, distribuídas em 10 famílias: Glomeraceae (12), Acaulosporaceae (7) Dentiscutataceae (7), Diversisporaceae (2), Gigasporaceae (5), Scutellosporaceae (4), Ambisporaceae (3), Racocetraceae (3), Intraornatosporaceae (2) e Sacculosporaceae (1) (JOBIM; GOTO 2016). Atualmente o filo Glomeromycota é composto por aproximadamente 280 espécies e destas, 153 são encontradas no Brasil e classificadas em: cinco (5) classes, cinco (5) ordens, 15 famílias e 38 gêneros (www.mycobank.org; http://glomeromycota.wix.com/lbmicorrizas) (OEHL et al., 2011b; GOTO et al., 2012; BLASZKOWSKI et.al., 2015). Técnicas moleculares têm sido cada vez mais usadas nos estudos de diversidade genética de FMA e nas descrições de espécies. Tais metodologias são vantajosas devido à rapidez, sensibilidade e especificidade, além de serem mais informativas, em termos filogenéticos, que a avaliação morfológica dos esporos. Segundo Gasparotto et al. (2010) estas técnicas também são vantajosas pois não estão sujeitas a variações fenotípicas, à ação do ambiente, ao estágio de desenvolvimento e a outros fatores que possam afetar a morfologia do organismo e levar á uma descrição equivocada. A PCR (Polymerase Chain Reaction – reação em cadeia da polimerase) começou a ser empregada nas últimas décadas para avaliar a biodiversidade de FMA (GASPAROTTO et al., 2010), sendo as sequências de rDNA e os espaçadores intergênicos os principais alvos de tais estudos. Contudo, ainda existem dados limitados em relação á Glomeromycota, já que muitas espécies não possuem ainda.

(25) 23. suas sequências depositadas em bancos de dados de acesso livre para comparação e análises filogenéticas. A espécie Rhizoglomus intraradices (N.C. Schenck & G.S. Sm.) Sieverd., G.A. Silva & Oehl, por exemplo, é a única espécie cujo genoma foi totalmente sequenciado (MARTIN et al., 2008). A extração de DNA é o início para os estudos moleculares, sendo essencial a obtenção de um DNA de qualidade (íntegro) e de quantidade suficiente para que haja amplificação das regiões desejadas. Para os FMA os métodos de extração podem ser a partir de um único esporo (COLOZZI-FILHO; CARDOSO, 2000), ou extração de raízes colonizadas com lise celular direta por meios físicos e químicos (KOIDE, 2005). A extração direta de um único esporo foi proposta por Colozzi-Filho & Cardoso (2000), e consiste em uma técnica simples e necessária para descrição de espécies por se ter certeza de estar amplificando uma única espécie para sequenciamento, já que o mesmo fragmento de raiz pode conter diversas espécies de FMA além de outros microrganismos. A técnica consiste na limpeza e perfuração do esporo (por simples ruptura celular com auxilio de uma agulha estéril), para liberação do seu conteúdo citoplasmático, e consequentemente do DNA, em água estéril. Ao quebrar o esporo, deve-se armazena-lo a -20º C até seu uso na PCR. Apesar de a lise celular direta ser utilizada amplamente, alguns compostos que comprometem a qualidade do DNA podem permanecer na reação de PCR, pois não há passagem de precipitação e lavagem deste DNA. Assim, diversas substâncias orgânicas inibidoras da PCR, como ácidos húmicos, DNases e taninos podem ser extraídas junto do extrato do esporo. Por isso, deve-se ter muito cuidado na limpeza dos esporos antes da sua quebra para a extração do DNA, dando-se preferência para o uso de água ultrapura e agulhas estéreis. O PCR realizado a partir de um único esporo, apesar de específico, é extremamente pouco sensível, sendo necessária a amplificação de vários esporos para se ter um resultado positivo. Com a obtenção de DNA, seja do solo ou dos esporos diretamente, técnicas baseadas na amplificação de regiões específicas, são necessárias para analisar as informações genéticas. PCR, DGGE (Denaturing Gradient Gel Elecrophoresis – eletroforese em gel com gradiente desnaturante), clonagem e sequenciamento, são exemplos das metodologias utilizadas nos estudos de diversidade genética. O.

(26) 24. pirosequenciamento, uma metodologia mais moderna, pode ser utilizado em estudos desse tipo, no entanto, seu alto custo é um fator limitante. A PCR reside na amplificação de uma região de interesse do DNA, e as técnicas de identificação molecular utilizam-se dessa metodologia como um fator indispensável. São utilizados, geralmente, iniciadores da PCR, primers para amplificar genes que transcrevem RNA ribossomais (rDNA) e seus espaçadores (ITS). A grande vantagem de se usar estas regiões como marcadores moleculares reside no fato de elas possuírem sequências altamente conservadas (LSU – Large Subunit ou 28S e SSU – Small Subunit ou 18S) (figura 03), possibilitando o desenho de primers que reconheçam um grande número de espécies de FMA. Além disso, por ser uma região multicópia no genoma, a sensibilidade da técnica é favorecida (DÉBAUD et al., 1999). A região conservada (18S, 5.8S e 28S) está intercalada por espaçadores de sequências divergentes, com alta variabilidade, sendo polimórficas em tamanho e sequências, e portanto muito informativas (GASPAROTTO et al., 2010), permitindo assim a análise de diversos níveis taxonômicos distintos e discriminação de espécies. A respeito dessa escolha, segundo Gasparotto et al. (2010), por ser altamente conservado, o 18S é mais indicado para comparação entre organismos filogeneticamente mais distantes, quando comparado ao 28S, relativamente mais variável. Contudo, em muitas comparações entre gêneros distintos o 28S pode apresentar poucos caracteres informativos, sendo mais indicado nestes casos o uso dos espaçadores internos transcritos ou ITS. Esta região conservada (18S e 28S), no entanto, pode ser mal usada, pois sua conservação é tão alta que pode não ser suficiente para fazer a distinção entre espécies e outros taxa filogeneticamente próximos. Os estudos filogenéticos são prejudicados nesse ponto, assim como pelo número cada vez maior de sequências depositadas no banco de dados sem a devida identificação. Outros genes e regiões são estudados, como o gene codificador da βtubulina, genes ribossômicos mitocondriais, genes envolvidos na reprodução e o gene codificador do fator de alongamento 1-alfa. Porém, ainda são poucos os marcadores moleculares, que não o rDNA, que são usados em estudos filogenéticos, sendo que a maioria das sequências depositadas são de LSU e SSU,.

(27) 25. regiões conservadas que muitas vezes não diferenciam espécies crípticas. Assim, deve-se ter mais investimento em projetos genomas de espécies de diferentes famílias de FMA a fim de se criar um banco de dados mais completo, para a realização de filogenias, com um maior número de sequencias possível. Variações da técnica de PCR, como o double PCR (repetição do primeiro PCR usando o seu produto como molde) e o Nested PCR (produto do primeiro PCR serve de molde para um segundo PCR com primers mais internos) vem sendo aplicadas com o intuito de aumentar a sensibilidade da amplificação do material genético proveniente de um único esporo. No Nested PCR temos geralmente o uso de primers universais para fungos para a primeira reação e na segunda utilizamos primers específicos para FMA. Essa estratégia também é vantajosa para quando se tem pouca quantidade DNA para amplificar ou quando há o risco de se ter contaminante nas amostras, já que os primers internos são específicos. Outras técnicas devem ser utilizadas com o produto amplificado da PCR, entre elas temos a clonagem e sequenciamento, principalmente quando se quer determinar quais espécies estão associadas à planta. A clonagem é feita a partir dos fragmentos amplificados de diversas espécies distintas para se obter a diversidade de sequências de uma amostra. Os produtos de PCR são individualizados por meio de sua ligação a vetores, como plasmídeos seguido de transformação de células competentes de bactérias (geralmente se usa a Escherichia coli). Constrói-se então uma pequena biblioteca de sequências amplificadas a partir do material ambiental (solo). Estes clones são então sequenciados e comparados aos bancos de dados, para se aferir a riqueza de espécies do local. Essa variedade de técnicas tem se tornado ferramentas mais constantes nos estudos de diversidade genética tanto de fungos endomicorrízicos (MA, por exemplo), como em fungos ectomicorrízicos. As sequências geradas são usadas como unidades taxonômicas operacionais (OTU - operational taxonomic unit), ou táxons virtuais, cujas sequências são depositadas mesmo sem termos o material biológico. Tal abordagem demonstra a grande potencialidade da biologia molecular para o estudo da diversidade genética e descoberta de novas espécies. Neste cenário, a limitação da descrição e identificação morfológica é vencida pela identificação molecular, o que vem trazendo importantes avanços na taxonomia dos fungos em geral, revelando a existência de.

(28) 26. muitas espécies crípticas, que morfologicamente são consideradas uma única espécie. O contrário, também pode acontecer em alguns casos, nos quais mais de duas espécies morfológicas distintas podem representam, na verdade, uma grande plasticidade fenotípica de uma única espécie. Os resultados de diversos estudos levaram à conclusão de que as técnicas existentes de cultivo eram ineficientes para isolar estas espécies e que a diversidade genética de microrganismos na natureza é muito maior do que se esperava (GASPAROTTO et al., 2010). Todavia, não tão caro como o sequenciamento de última geração, o sequenciamento convencional requer recursos financeiros para sua execução; dependendo do tamanho amostral e do objetivo do estudo (se de cunho ecológico, requer um tamanho amostral grande), fica inviável usar a clonagem e sequenciamento. Assim sendo, as técnicas que estão sendo utilizadas para estudos de diversidade genética em relação à distribuição espacial de microrganismos são entre outras: o DGGE, RFLP (Restricion Fragment Length Polymorphism), RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), RISA (Ribossomal Intergenic Spacer Analysis), etc. (GASPAROTTO et al., 2010). A análise genética com a finalidade de gerar um padrão da representação da diversidade é chamada de fingerprint. A diferenciação do tamanho e até mesmo da sequência dos amplicons gerados pode ser feita por técnicas de eletroforese com ou sem componentes desnaturante. Estas técnicas permitem a detecção de pequenas mudanças na composição das comunidades, além de fácil execução, análise e viabilidade econômica (GASPAROTTO et al., 2010). O DGGE é uma técnica capaz de separar sequências de ácidos nucléicos de mesmo tamanho, ou tamanho diferentes, porém diferindo na composição das bases (SOUZA et al., 2010) pois ocorre em um gradiente de desnaturação. Pode ser usada no estudo de diversidade genética de Fungos Micorrízicos usando primers específicos para determinado grupo de FMA. Por exemplo, o DGGE foi utilizado para diferenciar isolados geográficos do gênero Gigaspora, como Gigaspora albida, Gigaspora gigantea, e Gigaspora margarita (SOUZA et al., 2004) RISA é a técnica que usa a variação existente nos espaçadores intergênicos das regiões 18S-5.8S -28S, o ITS1 e o ITS2. Os amplicons obtidos formam um.

(29) 27. padrão de fragmentos, de tamanhos diferentes, visualizados em gel de poliacrilamida, e podem ser purificados e sequenciados para se ter a informação mais precisa das diferenças nas sequências. Esta técnica possui uma versão automatizada, a ARISA (Automated RISA) cuja resolução e tempo de análise foram maximizados, pois são usados primers fluorescentes e a eletroforese se dá em capilar (sequenciador de DNA). No RISA ou ARISA, a variação detectada é apenas quanto ao tamanho do produto de PCR, já o DGGE é mais sensível, pois também detecta a variação nas bases que constituem uma sequência. A técnica de RFLP (Restricion Fragment Length Polymorphism) usa a detecção de fragmentos comuns para indivíduos da mesma espécie ou espécies próximas, sendo de interesse taxonômico. Sua grande vantagem consiste no fato de ser reprodutível, porém apresenta baixa resolução para se diferenciar espécies de FMA filogeneticamente próximas (REDECKER et al., 2000). Além do RFLP, temos uma técnica que é sua variante, o T-RFLP (Terminal Restricion Fragment Length Polymorphism), que pode ser utilizado para amostras ambientais (espécies que se encontram no solo ou colonizando raízes), pois os primers são marcados com um fluoróforo, de forma que somente fragmentos terminais, produzidos pela digestão com enzimas de restrição, são detectados. Com o sequenciador automático de DNA os fragmentos podem ser visualizados em forma de picos e sua abundância indicada pela altura e área do pico. As enzimas de restrição utilizadas são de fundamental importância ao serem escolhidas, como no RFLP, sendo utilizadas de duas a quatro enzimas diferentes no mesmo estudo. A marcação do fluoróforo é feita tanto no primeiro primer como no segundo (sense e antisense), para se gerar dois fragmentos terminais (REDECKER et al., 2000). O uso de um sequenciador com eletroforese capilar proporciona a avaliação de muitas amostras e ainda permite a recuperação dos fragmentos para obtenção das sequências e geração de OTU. No entanto, para se identificar as sequências, deve-se combinar a técnica com a clonagem e posterior sequenciamento, aumentando o seu custo. Estudos que utilizaram essa técnica conseguiram detectar que plantas em um mesmo ambiente são colonizadas por comunidades distintas de FMA (VANDENKOORNHUYSE et al., 2003), ou seja, diferente grupos de espécies colonizando espécies vegetais distintos..

(30) 28. Já o RAPD, usa iniciadores randômicos para amplificação, compostos por de 8 a 12 nucleotídeos, amplificando diferentes porções do DNA e gerando amplicons de tamanhos distintos, mas como esses primers não são específicos, podemos também amplificar o DNA do simbionte vegetal ou de outro fungo que não seja micorrízico por exemplo. Por isso, seu uso é restrito para avaliar culturas puras. Com o sequenciamento das bandas geradas podemos construir primers específicos para FMA. Temos também a SSR (Single Sequence Repeats), cujos primers são homólogos a região que flanqueia os chamados microssatélites, pequenas sequências repetitivas (1-6 nucleotídeos) in tandem (uma ao lado da outra) ao longo do genoma dos eucariotos. Nessa técnica podemos usar um único primer homólogo a uma região de microssatélite (Ex.: (ATT) 5). A amplificação com esses primers gera padrões de bandas que pode discriminar espécies e mesmo isolados geográficos (GASPAROTTO et al. 2010). Como no RAPD, por serem inespecíficos, tais primers devem apenas ser usados em culturas puras para posterior construção de primers específicos que permitirão estudos de diversidade genética populacional, uma vez que o número de repetições de microssatélites é altamente polimórfico. Um exemplo do uso de microssatélites no estudo de diversidade fúngica foi a busca por tais elementos no genoma de Rhizoglomus intraradices. Mathimaran e colaboradores (2008) detectaram 842 microssatélites, do quais 100 foram selecionados para desenho de primers, e 18 alelos testados em 8 culturas puras monospóricas de R. intraradices. Sete dos isolados puderam ser discriminados por pelo menos 5 alelos distintos e um os isolados do fungo pode ser descriminado pelos 18 alelos. Muitos primers universais para fungos (panfúngicos), de anelamento nas regiões 28S e 18S foram desenvolvidos, ex.: ITS4 e ITS5, (WHITE et al., 1990). No entanto, uma das principais exigências para os estudos usando a molecular em FMA é o uso de primers específicos, ou seja, iniciadores que amplifiquem apenas membros de Glomeromycota e não outros membros do reino Fungi. O desenho e o uso desses primers específicos, excluindo o DNA de outros fungos, bactérias e vegetais, é o foco de muitos trabalhos (REDECKER et al., 2000; LEE et al., 2008; KRÜGER et al., 2009, GASPAROTTO et al., 2010; SILVA et al., 2011). Temos.

(31) 29. atualmente aproximadamente 44 primers desenhados especificamente para FMA (REDECKER, 2000; KRÜGER et al., 2009; GASPAROTTO et al., 2010; SILVA et al., 2011). Krüger et al. (2009) desenharam conjuntos de primers específicos para caracterização de amostras potencialmente contaminadas com DNA de outros organismos (fungos, bactérias, planta, etc). A região amplificada por tais primers é uma região de cerca de 1.800 pb. Os autores se basearam em cerca de 1.000 sequências disponíveis de Glomeromycota, e desenharam dois conjuntos de pares de primers, os SSUmAf + LSUmAr e os SSUmCf + LSUmBr (figura 03). Cada conjunto possui variações, que podem ser utilizadas de acordo com as famílias de fungos micorrízicos trabalhados, tanto em reações de PCR como de Nested PCR. Apesar do grande esforço para o desenho de primers específicos, muitos deles apresentam problemas com a especificidade, podendo amplificar outros filos de fungos, ou não amplificando todos os táxons contidos no grupo de FMA em questão, como no caso dos conjuntos de primers desenhados por Krüger et al., (2009) que dependendo do par de primer usado só iremos amplicar espécies da família Glomeraceae ou como por exemplo os primers AML1 e AML2 de Lee et al., (2008) que amplificam todos os membros do filo Glomeromycota com a exceção de Archeospora trappei (GASPAROTTO et al., 2010).. Figura 03. Inserção dos primers: SSUmAr e SSUmCf (na porção 18S), LSUmAr e LSUmBr (na porção 28S); atingindo assim, uma região amplificada de cerca de 1800 pb, cuja cobertura vai do SSU, ITS1e2, 5.8S e LSU. (Fonte: Krüger et al, 2009 modificado)..

(32) 30. Um ponto muito importante para as análises taxonômicas em FMA é a concordância entre as identificações morfológica e molecular. Silva et al. (2011), utilizaram os primers ALB1 e GiITS1 (Lanfranco et al. 1999), para 18 isolados que morfologicamente compreendiam sete (7) espécies e observaram que dos 11 isolados ditos pertencentes ao gênero Gigaspora, 2 foram identificados de forma errônea, ou seja, a morfologia não coincidia com as análises moleculares e filogenéticas. O principal exemplo do impacto da biologia molecular em análises filogenéticas foi a própria descrição do filo Glomeromycota como um filo único, completamente separado de Zygomycota (figura 04) (SCHUESSLER et al., 2001). O trabalho usou a biologia molecular para propor o monofiletismo dos fungos micorrízicos que estavam restritos à ordem Glomales, e por meio de evidências moleculares acabaram por incluir no novo filo a espécie Geosiphon pyriformis, o único representante de Glomeromycota que não faz simbiose com raízes de plantas. Quando descrito, o filo contava com os seguintes táxons: quatro ordens e sete famílias: Archaeosporales (Archaeosporaceae e Geosiphonaceae), Diversisporales (Diversisporaceae, Acaulosporaceae e Gigasporaceae), Glomerales (Glomeraceae) e Paraglomerales (Paraglomeraceae). A árvore proposta no trabalho de descrição do filo, também coloca os filos Chytridiomycota e Zygomycota como grupos polifiléticos (figura 04).

(33) 31. Figura 04. Árvore proposta em 2001 por Schuessler et al., mostrando o monofiletismo do grupo e desmembrando dois filos (Chytridiomycota e Zygomycota). (Fonte: Parniske, 2008). 1.2. CONTÍNUO RESTINGA-CAATINGA O nome caatinga tem origem no Tupi-Guarani e significa “mata branca” ou “floresta branca” (LEAL et al., 2003), característica marcante da vegetação na estação seca, quando as folhas caem e restam apenas os troncos brancos retorcidos. A vegetação da caatinga é um mosaico de arbustos espinhosos e floresta sazonalmente. seca,. composta. por. distintas. fisionomias. vegetais,. também. denominadas de “caatingas” no plural (LEAL et al., 2003; 2005); ricas em recursos genéticos, com altos níveis de biodiversidade e endemismo. Mostra-se como uma formação florestal entre as matas secas, representada pelo modelo arbóreo, estacional, caducifólio, xerófilo, garranchento, espinhoso, próprio da região semi-.

(34) 32. árida do nordeste (FERNANDES, 2007), cujo clima é caracterizado pelo longo período de seca e sazonalidade anual, solo raso e pedregoso (MMA, 2005; FERNANDES, 2007; OLIVEIRA-FILHO, 2009). A caatinga é um bioma exclusivo do território brasileiro, ocupando a região Nordeste (figura 05), englobando os estados de Alagoas, Bahia, Ceará, Maranhão, Pernambuco, Paraíba, Rio Grande do Norte, Piauí, Sergipe e a região norte do estado de Minas Gerais (LEAL et al., 2003; MMA, 2007). Trata-se da única ecorregião de floresta tropical seca do mundo, possuindo sobreposição com florestas úmidas, semiúmidas e restinga (LEAL et al., 2003). Sua conservação é um dos maiores desafios da ciência brasileira uma vez que as unidades de conservação cobrem menos de 2% do seu território, o qual sofre um extenso processo de alteração e deterioração ambiental provocado pelo uso insustentável dos seus recursos naturais (LEAL et al., 2003).. Figura 05. Mapa dos biomas brasileiros. (Fonte: IBGE modificado) Assim, a caatinga tem sofrido um crescente investimento e incentivo à pesquisa e a proporção de estudos no bioma tem aumentado exponencialmente. O Programa de Pesquisa em Biodiversidade (PPBio no Semiárido) é o grande.

(35) 33. responsável por esse quadro, já que através do seu incentivo e financiamento, foram publicados cerca de 363 artigos entre os anos de 2005 a 2016, aos quais encontramos inventários de diversidade de fauna, flora e microbiota. Destes artigos, cerca de 1/3 são sobre diversidade, taxonomia e ecologia de fungos no semiárido, demonstrando a alta biodiversidade da região. O bioma Mata Atlântica é caracterizado por ser um hot spot de biodiversidade (RIZZINI, 1997), sendo formado por dois tipos vegetações principal, a Floresta Atlântica (termo geral para formações de florestas sempre verdes até florestas semidecíduas) e a vegetação costeira (dunas, mangues e restinga) (ZANGARO; MOREIRA, 2010), cuja área é distribuída ao longo da costa leste do Brasil e de forma menos frequente no interior da região sul e sudeste alcançando 18 estados brasileiros, assim como parte da Argentina e Paraguai, ocupando 15% do território brasileiro (OLIVEIRA-FILHO; FONTES, 2000). Ao longo dos anos a mata atlântica tem sido degradada, restando apenas 8% de sua formação original, resultando em perda de diversidade, fragmentação de habitat e consequentemente perda das áreas caracterizadas como restinga (MMA, 2007). A restinga é uma formação vegetal mosaica, podendo se dispor em um gradiente de estabilização de solo arenoso, ocorrendo geralmente em solos rasos ou depósitos de areia profundos, com regimes de água variados. Trata-se de um complexo florístico com predominância arbustiva com valor regional principalmente para a região do nordeste brasileiro (FERNANDES, 2007). Por isto, ela não se caracteriza como uma unidade, nem circunscreve apenas um bioma específico, formando inúmeros complexos de ecossistemas (MMA, 2007). Segundo a classificação de OLIVEIRA-FILHO (2009) a restinga ocorre sobre depósitos de areia estabilizados do Domínio Atlântico e com regimes de água variados. Já no regime das fitofisionomias campestres, temos as restingas sobre dunas instáveis e costões e marismas nos estuários subtropicais (OLIVEIRA-FILHO, 2009). Ocupando a zona costeira do Brasil, a restinga possui sobreposição territorial com os biomas amazônico e mata atlântica, mantendo também interface com outros importantes biomas como a caatinga, o cerrado e o Pampa. Essa sobreposição ocorre, pois, as zonas marginais entre duas áreas distintas acabam por sobrepor suas formações vegetações e influências geológicas, formando zonas de transição..

(36) 34. Se estendendo ao longo de 95% do território do RN, a caatinga, representa a principal formação vegetal do interior e parte do litoral estado (IDEMA, 2015), ocorrendo geralmente após mangues. A restinga, junto com outros tipos vegetais da mata atlântica, como mangue, brejos de altitudes, cobre os outros 5%, atingindo originalmente 16 municípios do litoral (RIZZINI, 1997) e hoje restrita a remanescentes preservados em áreas de UC (unidades de conservação), como a maior reserva de mata atlântica em parque urbano do país, o Parque Estadual Dunas de Natal. A mobilidade dos nutrientes no solo em regiões do semiárido é baixa, já que esta região possui longo período de seca (FERNANDES, 2007). A restinga, por exemplo, que possui sedimentos arenosos, acaba proporcionando um ambiente muito seco para a vegetação, já que sua granulometria permite o escoamento da água da chuva com facilidade. A baixa retenção da água no solo influencia diretamente na morfologia interna e externa da vegetação, selecionando inúmeras adaptações ao longo da história evolutiva dessas plantas possibilitando a colonização deste ambiente. Os mecanismos adaptativos para obtenção de água, nutrientes e estabilidade em ambientes estressantes são os que garantem a manutenção em diversos tipos de ecossistemas (alagados, salinos, dunas, altitudes, estuários, etc). Um destes mecanismos é o mutualismo entre planta e outros organismos. As plantas que possuem simbiose com fungos e bactérias, na rizosfera conseguem obter nutrientes ou mesmo fixar macronutrientes. Dentre estes microrganismos se destacam as bactérias dos gêneros Rhizobium, Bradyrhizobium e Azorhizobium, fixadores de Nitrogênio,. conseguindo. não. somente absorver. o. nutriente. e. realizar. a. desnitrificação como fixa-lo para os vegetais (TOWNSEND et al., 2010), O estudo dos FMA é importante para conservação e preservação dos simbiontes vegetais em suas condições ambientais. Os aspectos que influenciam essa relação, os benefícios e qual comunidade estão colonizando as diferentes espécies vegetais são os tópicos encontrados nos estudos de diversidade. Os aspectos físico-químicos do solo, como a disponibilidade de nutrientes, formação do substrato, entre outros, são de grande influência na diversidade que se encontra no ambiente. O papel ecológico dos fungos micorrízicos é altamente.

(37) 35. importante para o equilíbrio de ecossistemas, fixação das raízes do simbionte vegetal no substrato e estabilização dos sedimentos (SIQUEIRA et al., 2002; SMITH & READ, 2008). A zona de transição de um bioma para outro ou a área de interface (marginais) entre dois ou mais biomas são conhecidas como Ecótono. O termo Agreste, muito empregado no Rio Grande do Norte, Paraíba e Pernambuco, representa esse tipo de transição entre as vegetações. Esta zona entre restinga e caatinga é formada por vegetação arbórea subúmida pelo alto grau de umidade que caracteriza as proximidades litorâneas, intermediárias entre as matas costeiras (mata atlântica/restingas) e a caatinga interiorana. Ecótonos são áreas dinâmicas que, com o tempo, podem mudar de largura e até de posição, em razão de influências geomorfológicas e mudanças ambientais, como o fenômeno da sucessão ecológica. Formando uma comunidade mista, sua diversidade pode ser considerada própria, tendo em vista espécies e características próprias (FERNANDES, 2007). Dentre os domínios fitogeográficos com maior ocorrência de FMA no mundo, a Mata Atlântica e a Caatinga brasileira se encontram na liderança, contendo 30% e 24%, respectivamente, de todas as espécies de FMA já descritas. Contudo, as áreas de estudo destes fungos no RN são exclusivas de vegetação de mata atlântica (floresta, restinga e tabuleiro costeiro), sendo inexistentes os estudos de levantamento de FMA na caatinga bem como no ecótono restinga-caatinga no RN. Apesar de a Mata Atlântica e a Caatinga serem importantes fonte de biodiversidade, o ecótono entre elas vem sendo negligenciado, não sendo citado dentre os principais ecótonos brasileiros pelo MMA (2005), que considera apenas as transições cerrado-amazônia, caatinga-amazônia e cerrado-caatinga. Tendo em vista que a escassez de informações a respeito da diversidade de FMA em zonas de contínuo entre restinga e caatinga na costa setentrional do Rio Grande do Norte, o presente estudo inventariou a diversidade de fungos micorrízicos arbusculares e avaliou a relação entre a diversidade e os dados ambientais abióticos ao longo desta área de transição, como fatores de maior influência na distribuição das espécies..

(38) 36. 2. OBJETIVOS 2.1 OBJETIVO GERAL ● Estudar a diversidade de FMA em uma zona de contínuo de restinga e caatinga levando em consideração a influência dos aspectos físico-químicos do solo.. 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ● Identificar morfologicamente as espécies da comunidade de FMA das áreas em estudo; ● Avaliar índices ecológicos de riqueza (Simpson), diversidade (Shannon-Wiener), equitabilidade (Pielou) e similaridade (Jaccard) de espécies ao longo do contínuo; ● Identificar as propriedades físicas e químicas do solo que influenciam a distribuição das espécies de FMA ao longo do contínuo ● Acrescentar dados para preservação da área de coleta, já que esta se trata de uma unidade de conservação..

(39) 37. 3. MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 ÁREA DE ESTUDO E COLETA DE SOLO A coleta ocorreu na Reserva de Desenvolvimento Sustentável Estadual Ponta do Tubarão (RDSE Ponta do Tubarão) (figura 06), compreendendo as comunidades de Diogo Lopes, Barreiras, Sertãozinho e Mangue Seco; (coordenadas 5º2'S e 5º16'S de latitude e 36º23'W. 36º32' de longitude), que abrange os municípios de Macau e Guamaré.. Figura 06. Área da RDSE Ponta do Tubarão e seus limites. (Fonte: IDEMA). Criada no ano de 2003 com quase 13 mil hectares de extensão, numa área costeira do extremo norte do estado do RN, a reserva possui remanescente de restinga e sua transição para caatinga (figura 07), formando um ecótono entre esses dois ambientes e suas fitofisionomias. O reconhecimento de restinga foi feito com base na classificação geológica e florística proposta por Mazzochini, 2014..

(40) 38. Figura 07. Caracterização da vegetação da RDSE Ponta do Tubarão. (Fonte: Mazzochini, 2014 modificado) Foram coletadas amostras de solo rizosférico em sete pontos aleatórios (plantas) com 0-20 cm de profundidade, acondicionados em sacos plásticos (média de 2Kg de solo por amostra), em seis transectos (150m) nas área de coleta: caatinga e restinga (figura 07, 08), totalizando 42 amostras em cada coleta, feitas no final do período chuvoso (03/Julho) e no período de seca (24/Novembro) no ano de 2015 (figura 09). As amostras foram levadas ao Laboratório de Biologia de Micorriza (LBM) para secagem em temperatura ambiente e 100g de cada foram encaminhadas para caracterização química e física (pH e os macros nutrientes P, N, Mg, Al, K) na Emparn e outras 50g foram destinadas à montagem de culturas armadilhas, para se obter a esporulação de esporos que no momento da coleta não estavam esporulando..

(41) 39. Figura 08. Transectos de coleta na RSDE Ponta do Tubarão. R1 e R2: restinga; E1 e E2: restinga com região de Ecótono; C1 e C2: caatinga. (Fonte: Google Earth).

(42) 40. Figura 09. Fotos dos locais de coleta, na RSDE Ponta do Tubarão. A-B: restinga, sendo A estação pós chuvosa e B estação seca; C-D: caatinga, sendo C estação pós chuvosa e D estação seca; E-F: restinga com região de Ecótono, sendo E estação pós chuvosa e F estação seca. (Fonte: autoria própria).

(43) 41. 3.2. ANÁLISES TAXONÔMICAS Foram separados 100g de cada amostra para extração dos glomerosporos, por meio do método de peneiramento úmido (GERDMANN; NICOLSON, 1963) usando duas peneiras com abertura na malha de 150 mm/um e 63 mm/um, centrifugação em água e sacarose 50% (JENKIS, 1964). Os esporos separados em lupa óptica montados em lâminas com PVLG (ácido polivinílico lacto glicerol) e PVLG + reagente de Melzer, secos em estufa a 70ºC por aproximadamente 24h e encaminhados para subsequente visualização em microscópio óptico e identificação morfológica (figura 10), seguindo as chaves de Goto (2009), Schenck & Pérez (1990) e demais literaturas de descrições de espécies.. Figura 10. A – coleta de solo rizosférico (RDSE Ponta do Tubarão); B – montagem de cultura armadilha na casa de vegetação da UFRN; C – peneiramento úmido e centrifugação em sacarose; D – separação dos esporos em ácido lático; E – Montagem de lâminas em PVLG e PVLG + Melzer; F –.

Referências

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