Uso da quimiometria na determinação simultânea do teor dos fármacos em comprimido com dose fixa combinada empregado no tratamento de tuberculose

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE FACULDADE DE FARMÁCIA PÓS-GRADUAÇÃO EM DESENVOLVIMENTO E INOVAÇÃO TECNOLÓGICA EM MEDICAMENTOS. KELLY SIVOCY SAMPAIO TEIXEIRA. USO DA QUIMIOMETRIA NA DETERMINAÇÃO SIMULTÂNEA DO TEOR DOS FÁRMACOS EM COMPRIMIDO COM DOSE FIXA COMBINADA EMPREGADO NO TRATAMENTO DE TUBERCULOSE.. NATAL – RN 2017.

(2) KELLY SIVOCY SAMPAIO TEIXEIRA. USO DA QUIMIOMETRIA NA DETERMINAÇÃO SIMULTÂNEA DO TEOR DOS FÁRMACOS EM COMPRIMIDO COM DOSE FIXA COMBINADA EMPREGADO NO TRATAMENTO DE TUBERCULOSE.. Tese apresentada ao Programa de Pósgraduação em Desenvolvimento e Inovação Tecnológica em Medicamentos da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutora. Orientador: PROF. Dr. Tulio Flavio Accioly de Lima e Moura Coorientador: PROF. Dr. Euzébio Guimaraes Barbosa. NATAL – RN 2017.

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(5) Dedico este trabalho. Aos meus pais, Sivocy e Evandro, por me ensinarem a buscar sempre alcançar meus sonhos. Aos meus irmãos, Júnior, Keynne, Keylla e Kylza, as minhas sobrinhas Letícia, Maria Vitória, Larissa, Louise e sobrinhos Luis Vinícius e Leo Miguel que torcem pelo meu sucesso. Ao meu esposo, Artur, e meus cachorrinhos Peteka e Biscoito que suportaram minha ausência e me acompanharam diretamente nessa jornada. E a Bolacha (in memorian) minha fiel “escudeira”, que pelo pouco tempo que passou entre a gente me deu amor e companheirismo incondicional..

(6) AGRADECIMENTOS Concluída mais uma etapa de formação acadêmica e profissional é preciso expressar minha gratidão a todos que fizeram parte deste trabalho e contribuíram para o sucesso desta caminhada. À Deus Todo Poderoso e Misericordioso, pelas bênçãos diárias e pela força que sempre me acompanha e guia meus passos em todos os momentos. Aos Prof. Dr. Tulio Flavio Accioly de Lima e Moura e Prof. Dr. Euzébio Guimaraes Barbosa, pela orientação e ensinamentos. Ao professor, amigo e incentivador Prof. Dr. Said Gonçalves da Cruz Fonseca, pela presença e auxílio constantes, obrigada por seu carinho e por sua ajuda, sempre tão importante e necessária. Aos Profs. Luís Carlos Brigido de Moura e Mario Luís Ribeiro de Moura pela contribuição a este trabalho e pelas conversas amigáveis. As professoras Tereza, Janete, Romélia e Mirian, por fornecerem alguns materiais de consumo utilizados no trabalho. Aos técnicos, auxiliares técnicos e estagiários do CEDEFAR (Márcia, Igor, Tatiana e Larissa), da FARMÁCIA ESCOLA (Salete, Janete, Adriana, Beto, Eliane, Luthiane, Rafaela, Emidio), do LEFI (Ednaldo, Daiane, Maxciara e Lyghia) e da FAECE (Cristiano) pelo apoio durante a realização dos experimentos, pela amizade e compreensão no decorrer destes anos. Aos meus colegas do programa de Pós-graduação em Desenvolvimento e Inovação Tecnológica em Medicamentos, por suas importantes contribuições tanto no campo acadêmico como pessoal Luciana, Gabriel, Carol, Iris, Savana, Said, Daiane, Debora, Paula, Regina. Ao Programa de Pós-graduação em Desenvolvimento e Inovação Tecnológica em Medicamentos da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, especialmente ao corpo técnico e administrativo pelos serviços prestado. Às instituições financiadoras: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e ao Programa de Pós-graduação em Desenvolvimento e Inovação Tecnológica em Medicamentos, pelos auxílios concedidos para a realização desta pesquisa. Aos meus alunos que indiretamente me apoiaram nesta jornada. Aprendi muito com vocês. Em especial os alunos Lucicleide e Wagner que me ajudaram a conseguir uma parte dos medicamentos utilizados nessa tese. As professoras Rita e Adryana, por me concederem as liberações para que eu pudesse fazer as disciplinas e os experimentos para a conclusão da tese, além de confiança no meu trabalho..

(7) Ao corpo docente do curso de farmácia da FAECE e aos coordenadores dos demais cursos da faculdade obrigada por acompanharem essa jornada e me auxiliarem nos momentos que não pude está presente. A Erika, Eduardo, Renata, Narelle, Regina, Lygia, Adriana, Franzé, Teixeira Neto e Savana que abriram as portas de suas casas para me hospedar em algum dos quatro locais de disciplinas pelos quais passei. Muito obrigada! A Claysiane, pela construção de uma amizade e apoio durante o tempo decorrido para a realização deste trabalho. Ao Tiago pela ajuda com o meu computador. Ele sempre quebrava nos momentos mais cruciais. As minhas queridas amigas Angélica, Elisângela, Erika, Fabíola, Idelceana e Jamili, que sempre estão presentes na minha vida, incentivando e mostrando o real valor de uma amizade mesmo depois de muitos anos. Ao meu porto seguro, minha família: Meu pai Evandro, minha mãe Sivocy, meus irmãos Júnior, Keynne, Keylla e Kylza, aos meus cunhados e cunhada Geraldo, Luis, Sidney e Ednanda, as minhas sobrinhas Letícia, Vitória, Larissa, Louise e sobrinhos Vinícius e Leo pelo carinho, apoio, por se fazer todos os dias presentes em minha vida, compartilharem meus momentos de felicidade e ser fonte de apoio nos momentos difíceis. Obrigada por me ajudarem a vencer mais esta etapa da minha vida. Ao meu esposo, Artur, pela paciência nos momentos de aperreio, incentivo nos momentos de desânimo e compreensão quando estive triste e principalmente por ser essa pessoa amável que em todos os momentos soube me fazer sorrir. Amo muito você! A Peteka e Biscoito que mesmo “abandonados” nunca deixaram de me fazer festa e carinho quando voltava para casa. A Bolacha (in memorian) minha “pequenininha” que chegou e partiu em um momento muito delicado para me mostrar o quão forte eu era. Sentirei saudades sempre! A toda a minha família: avó, tios, tias, primos e primas pelo carinho, amizade e orações.. “ Uma andorinha só não faz verão. ” Aristóteles (384-322 a.C.) Obrigada!.

(8) “O que vale na vida não é o ponto de partida. e. sim. a. caminhada.. Caminhando e semeando, no fim terás o que colher. ” Cora Coralina.

(9) RESUMO A Organização Mundial de Saúde (OMS) sugere que o tratamento da tuberculose (TB) seja realizado através da terapia que consiste na associação de quatro fármacos: rifampicina, isoniazida, pirazinamida e etambutol. Com isso o tratamento é melhor aceito tendo uma maior adesão do paciente à terapia prescrita. Levando-se em consideração que a metodologia utilizada para o doseamento de um fármaco na presença de excipientes e outros fármacos é a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) que é sabidamente trabalhosa, de alto custo e destrutiva, foi proposta desse trabalho o desenvolvimento e validação de um modelo de calibração multivariada em associação com a técnica de espectroscopia no infravermelho próximo (NIR) para determinação simultânea de rifampicina, isoniazida, pirazinamida e etambutol que fosse mais simples, rápida, de baixo custo, não destrutiva e que não utilizasse solventes orgânicos, contribuindo assim com o meio ambiente. Sendo, portanto, ferramenta de otimização para o controle de qualidade deste medicamento. Nesse trabalho foi utilizado o método por NIR – PLS (regressão de mínimos quadrados parciais) onde as misturas dos quatro fármacos foram realizadas com base no planejamento experimental do tipo composto central elaborado pelo programa Statistica 13 (StatSoft Inc.). Essas misturas foram lidas na faixa de 10.000 a 4.000 cm-1 utilizando um espectrofotômetro Infravermelho (IRPrestige-21 - Shimadzu) com resolução de 4 cm-1, 20 varreduras, temperatura e umidade controladas. As análises envolvendo CLAE foram realizadas em um cromatógrafo (Hitachi – Elite Ultra), equipado com coluna C18 (15 cm x 4,6 mm – ACE-5) e (25 cm x 4,6 mm – Luna Phenomenex) e detector UV (matriz de diodo), utilizando o método de referência descrito na farmacopeia internacional 15ª edição. Ao final, todos os dados foram tratados por ferramentas computacionais de análise multivariada, utilizando PLS através do programa pirouette 3.11 (Infometrix, Inc.). As seleções de variáveis foram realizadas pelo programa QSAR modeling. Foi realizada validação cruzada pelo método leave-one-out e estimativa de figuras de mérito como linearidade, precisão e exatidão foram demonstradas nos quatro modelos propostos. Na avaliação das amostras comerciais pelos modelos de calibração multivariada em associação com a espectroscopia no infravermelho próximo (NIR) desenvolvidos foram capazes de determinar simultaneamente os quatro fármacos, apresentando dados estatisticamente equivalentes aos obtidos por CLAE. Palavras chave: Infravermelho próximo, controle de qualidade farmacêutico, rifampicina, isoniazida, pirazinamida, etambutol, produtos DFC.

(10) ABSTRACT The World Health Organization (WHO) suggests that treatment of tuberculosis (TB) should be done through a combination of four drugs: rifampicin, isoniazid, pyrazinamide and ethambutol. With this the treatment is better accepted having a greater adhesion of the patient to the prescribed therapy. Taking into account that the methodology used for the determination of a drug in the presence of excipients and other drugs is highperformance liquid chromatography (HPLC), which is known to be laborious, expensive and destructive. Validation of a multivariate calibration model in association with the near infrared spectroscopy (NIR) technique for the simultaneous determination of rifampicin, isoniazid, pyrazinamide and ethambutol that was simpler, faster, low cost, non destructive and did not use organic solventes, thus contributing to the environment. Therefore, it is an optimization tool for the quality control of this medicine. In this work, the NIR - PLS (partial least squares regression) method was used where the mixtures of the four drugs were performed based on the experimental design of the central composite type elaborated by the program Statistica 13 (StatSoft Inc.). These mixtures were read in the 10,000 to 4,000 cm-1 range using an infrared (IRPrestige-21 - Shimadzu) spectrophotometer with 4 cm-1 resolution, 20 sweeps, controlled temperature and humidity. The analyzes involving HPLC were performed in a chromatograph (Hitachi Elite Ultra) equipped with a C18 column (15 cm x 4.6 mm - ACE - 5) and (25 cm x 4.6 mm - Luna - Phenomenex) and UV detector (Diode array) using the reference method described in the International Pharmacopoeia 15th Edition. At the end, all data were treated by computational tools of multivariate analysis, using PLS through the program pirouette 3.11 (Infometrix, Inc.). The selections of variables were performed by the QSAR modeling program. Cross-validation was performed by the leave-one-out method and estimation of merit figures such as linearity, precision and accuracy were demonstrated in the four proposed models. In the evaluation of the commercial samples by the multivariate calibration models in association with the near infrared spectroscopy (NIR), they were able to simultaneously determine the four drugs, presenting data statistically equivalent to those obtained by HPLC. Keywords: Near-infrared spectroscopy, pharmaceutical quality control, rifampicin, isoniazida, pyrazinamide, etambutol, FDC products.

(11) LISTA DE QUADROS. Quadro 1 - Esquema básico para o tratamento da tuberculose de adolescentes e adultos 25 Quadro 2 – Regiões espectrais do infravermelho. 32.

(12) LISTA DE FIGURAS. Figura 1 - Estrutura química da isoniazida. 27. Figura 2 – Estrutura química da pirazinamida. 28. Figura 3 – Estrutura química do etambutol. 28. Figura 4 – Estrutura química da rifampicina. 29. Figura 5 – Representação da técnica de reflectância especular e difusa. 33. Figura 6 - Representação gráfica do planejamento do tipo composto central dos ativos rifampicina (rifa), isoniazida (iso), pirazinamida (pira), etambutol (eta) e excipientes (excip), demonstrando o conjunto de calibração (c) e o conjunto de validação (v). 45 Figura 7 - Espectros de infravermelho médio (MID), sendo evidenciadas as bandas características de grupos amina, amida, aromáticos, carbonila e álcool.. 50. Figura 8 - Espectros de infravermelho próximo (NIR), sendo evidenciadas as regiões A, B e C referentes a algumas bandas de combinações e sobretons.. 51. Figura 9 - Espectros de MID (A) e NIR (B) da mistura quaternária e do medicamento. As setas indicam as diferenças visuais detectadas.. 52. Figura 10 – Espectros de MID dos IFA: rifampicina, isoniazida, pirazinamida e etambutol. 54 Figura 11 - Espectros de MID dos materiais de revestimento: dióxido de titânio e óxido de ferro.. 54. Figura 12 - Espectros de MID dos diluentes, aglutinantes e desagregantes: celulose microcristalina, amido de milho, lactose, polivinilpirrolidona (k30 e k90), gelatina em pó, methocel, hipromelose, croscarmelose, aminoglicolato de sódio e alginato de sódio.. 55.

(13) Figura 13 - Espectros de MID dos deslizantes, lubrificantes e antioxidante: talco, dióxido de silício coloidal (aerosil), estearato de magnésio, lauril sulfato de sódio, macrogol 6000 e ácido ascórbico.. 55. Figura 14 – Análise do componente principal: (A) gráfico dos scores das misturas desenvolvidas; (B) destaque das misturas mais próximas ao medicamento. Figura 15 – Espectros de MID do comprimido e da mistura desenvolvida.. 56 57. Figura 16 – Cromatogramas obtidos por CLAE de acordo com a farmacopeia internacional: A: isoniazida, pirazinamida e etambutol e B: rifampicina.. 60. Figura 17 - Espectros da região do infravermelho próximo das amostras dos conjuntos de calibração, validação e os comprimidos DFC.. 61. Figura 18 - Validação interna cruzada utilizando o método leave-one-out para o modelo de quantificação da pirazinamida, etambutol, rifampicina e isoniazida.. 64. Figura 19 - Detecção de outliers para o modelo de quantificação da pirazinamida, etambutol, rifampicina e isoniazida.. 66. Figura 20 – Correlação entre os valores de concentração determinados por CLAE e os valores previsto por NIR para cada IFA empregando os modelos desenvolvidos. 67.

(14) LISTA DE TABELAS. Tabela 1 – Informações adicionais dos comprimidos DFC. 38. Tabela 2 – Condições analíticas empregadas para o doseamento dos insumos farmacêuticos ativos. 40. Tabela 3 – Variações dos valores (mg) dos insumos farmacêuticos ativos utilizados no preparo das misturas para o desenvolvimento dos modelos. 44. Tabela 4 – Quantidade utilizada dos insumos farmacêuticos ativos (mg) e a mistura dos excipientes (mg) na composição das amostras para o conjunto de calibração (1 - 31) e conjunto de validação (32 – 49).. 46. Tabela 5 - Teores (mg) dos insumos farmacêuticos ativos obtidos pelo método de referência para as amostras utilizadas na construção do modelo de calibração multivariada: conjuntos de calibração:1 a 31; validação: 32 a 49.. 58. Tabela 6 – Resumo dos parâmetros analisados para os modelos desenvolvido para quantificação da pirazinamida, etambutol, rifampicina e isoniazida.. 65. Tabela 7 – Valores encontrados no teste de precisão e exatidão do modelo de calibração desenvolvido por NIR. Tabela 8. 68. – Resultados da quantificação de isoniazida (iso), rifampicina (rifa),. pirazinamida (pira) e etambutol (eta) em amostras de medicamentos pelo método desenvolvido (NIR) e método farmacopeico (CLAE).. 70.

(15) LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS. 2RHZ/4RH Dois meses rifampicina (R), isoniazida (H), pirazinamida (Z) / 4 meses rifampicina e isoniazida AIDS. Síndrome da imunodeficiência adquirida. ANVISA. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. ASTM. American Society For Testing And Materials. BAAR. Bacilo Álcool-Ácido Resistente. BPF. Boas Práticas de Fabricação. CLAE. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. CLUE. Cromatografia líquida de ultra eficiência. CMD. Concentração Média Determinada. DAD. Detector de arranjo de fotodiodos. DFC. Doses Fixas Combinadas. DNA. Ácido Desoxirribonucleico. DP. Desvio Padrão. DPR. Desvio Padrão Relativo. FDA. Food and Drug Administration. FIR. Espectroscopia de Infravermelho Distante. ICS. International Chemometrics Society. IFA. Insumos Farmacêuticos Ativos. IV. Infravermelho. MID. Espectroscopia de Infravermelho Médio. MSC. Correção Multiplicativa de Sinal. NIR. Espectroscopia de Infravermelho Próximo. OMS. Organização Mundial de Saúde. PAS. Ácido p-aminossalicílico. PAT. Tecnologia de Processo Analítico. PCA. Análise de Componentes Principais. PLS. Regressão de Mínimos Quadrados Parciais. PNCT. Programa Nacional de Controle da Tuberculose. PRESS. Soma dos Quadrados de Erro de Previsão. RDC. Resolução da Diretoria Colegiada.

(16) RMSEC. Erros Quadráticos de Calibração. RMSECV. Soma dos Erros Quadráticos da Validação Cruzada. RMSEP. Erro Padrão de Previsão. RNA. Ácido Ribonucleico. smooth. Alisamento. SQR. Substância Química de Referência. SQRFB. Substância Química de Referência da Farmacopeia Brasileira. TB. Tuberculose. USP. United States Pharmacopeia. UV-VIS. Ultravioleta - Visível. VL. Variáveis Latentes.

(17) SUMÁRIO. 1.. INTRODUÇÃO. 19. 2.. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA. 21. 2.1.1.1.. Considerações gerais sobre a tuberculose. 21. 2.1.1.2.. Tratamento da tuberculose. 22. 2.1.1.3.. Fármacos tuberculostáticos. 26. 2.1.1.4.. Isoniazida. 26. 2.1.1.5.. Pirazinamida. 27. 2.1.1.6.. Etambutol. 28. 2.1.1.7.. Rifampicina. 28. 2.1.1.8.. Controle de qualidade de medicamentos na indústria farmacêutica. 29. 2.1.1.9.. Espectroscopia no infravermelho (NIR e MID) para análise de fármacos 31. 2.1.1.10. Quimiometria. 34. 2.1.1.11. Validação analítica. 36. 3.. 37. OBJETIVOS. 3.1.1.1.. Geral. 37. 3.1.1.2.. Específicos. 37. 4.. METODOLOGIA EXPERIMENTAL. 38.

(18) 4.1.1.1.. MATERIAIS:. amostra, padrões, reagentes, solventes utilizados,. Equipamentos e softwares. 38. 4.1.1.2.. MÉTODOS. 40. 4.1.1.3.. Métodos de referência PARA DETERMINAÇÂO do teor de rifampicina,. isoniazida, pirazinamida e etambutol (método cromatográfico). 40. 4.1.1.4.. Método por Infravermelho médio e próximo (NIR e MID). 42. 4.1.1.5.. Análises Preliminares: Espectroscopia. 42. 4.1.1.6.. Seleção dos excipientes. 42. 4.1.1.7.. Planejamento experimental. 43. 4.1.1.8.. Preparo das amostras para a construção do modelo multivariado. 46. 4.1.1.9.. Aquisição dos espectros de infravermelho. 47. 4.1.1.10. Desenvolvimento do modelo multivariado de calibração. 48. 4.1.1.11. Validação do método. 48. 4.1.1.12. Quantificação dos IFA nas amostras comerciais. 48. 5.. 49. RESULTADOS E DISCUSSÃO. 5.1.1.1.. Análises Preliminares: Espectroscopia. 49. 5.1.1.2.. Engenharia reversa do comprimido. 53. 5.1.1.3.. Métodos de referência (CLAE). 57. 5.1.1.4.. Modelos desenvolvidos por calibração multivariada. 61. 5.1.1.5.. Validação do método. 67. 5.1.1.6.. Quantificação dos IFA nas amostras comerciais. 69.

(19) 6.. CONSIDERAÇÕES FINAIS. 71. 7.. PERSPECTIVAS. 71. 8.. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 72.

(20) 19. 1. INTRODUÇÃO. A tuberculose (TB) é uma doença contagiosa grave, considerada milenar, causada por um dos agentes etiológicos: Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis e Mycobacterium africanum (MELO et al., 2009). Anualmente essa doença mata no mundo aproximadamente 3,0 milhões de pessoas, mais que a síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), a malária e as doenças tropicais combinadas (OMS, 2015). Trata-se de um dos principais problemas de saúde pública do mundo porque o contágio é facilitado por aglomerações humanas onde o bacilo é transmitido pelas vias áreas. A doença pode atingir todos os órgãos do corpo humano, porém se reproduz mais facilmente nos pulmões devido à alta concentração de oxigênio (PEÑA, BAQUERO-ARTIGÃO, MORENOPEREZ, 2009). Os primeiros tratamentos a que se tem referência no Brasil são datados do ano de 1907 e desde então muitas mudanças foram feitas. Vários tratamentos foram propostos e esquemas terapêuticos foram padronizados (CAMPOS, H.S., 2007). Em 2009, por recomendação da Organização Mundial de Saúde (OMS), uma nota técnica publicada pelo Ministério da Saúde propôs mudanças no esquema básico para o tratamento de TB. Foi introduzido a apresentação em comprimidos com dose fixa (reduzida) combinada dos 4 fármacos (4 em 1) para a fase intensiva do tratamento. A utilização de rifampicina (150 mg), isoniazida (75 mg), pirazinamida (400 mg) e etambutol (275 mg) na apresentação de comprimidos tem apresentado excelentes resultados pelo mundo quanto à efetividade devido principalmente à maior taxa de adesão ao tratamento (Ministério da Saúde, 2010). Essa associação medicamentosa tem se tornado alvo de muitos estudos devido principalmente a problemas com as doses fixas combinadas (DFC). Podendo, desta forma, se tornar um obstáculo para o controle de qualidade do medicamento distribuído. Medicamento com teores baixo dos insumos farmacêuticos ativos (IFAs) é um problema de importância vital na prevenção de risco na formação de resistência aos tuberculostáticos. Não se pode realizar programas efetivos de combate à tuberculose sem a garantia de que os medicamentos usados no tratamento sejam eficazes na promoção da cura. Para se garantir a eficácia, segurança, baixa toxicidade e melhor estabilidade destes medicamentos é necessário um controle de qualidade abrangente onde fabricantes e.

(21) 20. autoridades governamentais unam forças (SANTORO, 1988; BHUTANI, MARIAPPAN e SINGH, 2004). O padrão de qualidade é o ponto chave para o controle de medicamentos em uma indústria farmacêutica. Ele deve garantir a conformidade do medicamento com os parâmetros conhecidos, bem como sua inocuidade e eficácia do ponto de vista farmacológico (PRISTA, et al., 2009). Devido à complexidade de metodologias que quantifiquem fármacos associados de maneira simultânea, o controle de qualidade, que muitas vezes é demorado, pode trazer incertezas devido à possibilidade de degradação do produto e o alto custo. Assim, a busca de técnicas alternativas que minimizem as desvantagens da metodologia de referência, no que se refere ao controle em processo e ao produto final, são de grande valia. Avanços nas tecnologias e ferramentas analíticas que possam ser aplicadas em medidas de tempo real, análise de processo e produto final têm sido relatados na literatura, dando ênfase à importância do acompanhamento em processo da qualidade do produto final (WORKMAN, KOCK e VELTKAMP, 2007; WORKMAN, et al., 2011). Esse tipo de pesquisa vem sendo direcionada para responder aos quesitos de um processo bem compreendido que se encontra no guia de orientação para a indústria publicado pelo Food and Drug Administration (FDA) (FDA, 2004). No Brasil, a Resolução da Diretoria Colegiada (RDC) 17/2010 determina que as boas práticas de fabricação de um medicamento devem garantir um produto que tenha qualidade em sua produção e que seja controlado com padrões de qualidade apropriados (BRASIL, 2010). Visando aproximar a pesquisa à sua aplicação prática, e tentando seguir as recomendações para garantir a qualidade do medicamento pelo órgão regulamentador, o presente trabalho buscou, através da espectroscopia de infravermelho próximo e médio (NIR e MID) e analise multivariada, desenvolver métodos que possam monitorar a qualidade dos insumos farmacêuticos ativos (IFA) do comprimido DFC para o tratamento da tuberculose, obtendo medidas objetivas com um custo mais baixo, de forma não destrutiva, rápida e sem geração de resíduos químicos (TREVISAN E POPPI, 2006; LUYPAERT, MASSART, VANDER HEYDEN, 2007; SWARBRICK, 2007; MANTANUS et al., 2010)..

(22) 21. 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1.1.1. CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE A TUBERCULOSE A tuberculose é uma doença infecciosa grave sendo a principal causa de morte por doença infectocontagiosa em adultos no mundo. A doença está associada à pobreza, às más condições de vida e de habitação e à aglomeração humana (FERREIRA; GLASENAPP; FLORES, 2011; BRASIL, 2016). Os principais sintomas da tuberculose pulmonar são: tosse persistente, produtiva ou não (com muco e eventualmente sangue), febre vespertina, sudorese noturna e emagrecimento (BRASIL, 2011). A doença é causada pelo agente etiológico Micobacterium tuberculosis, que é um parasita intracelular facultativo e possui a capacidade de sobreviver e se multiplicar no interior de células fagocitárias, é resistente à ação de agentes químicos e sensível à ação de agentes físicos como o calor e a radiação ultravioleta, mas não ao congelamento e à dessecação (COELHO; MARQUES, 2006). Surgiu há cerca de 15.000 anos e por ter sido detectado em múmias egípcias 3.400 anos antes de Cristo, acredita-se que a tuberculose já comprometia a saúde do homem desde então (CAMPOS, 2006). A tuberculose é considerada um dos principais problemas de saúde pública no mundo, pois sua contaminação é favorecida em lugares aglomerados. A doença é causada por um bacilo de crescimento lento, aeróbio, álcool-ácido resistente (BAAR), sua transmissão se dá por vias áreas, a doença pode atingir todos os órgãos, mas ataca com mais frequência os pulmões, por motivo da alta concentração de oxigênio (PEÑA, BAQUERO-ARTIGÃO,. MORENO-PEREZ,. 2009;. FERREIRA;. GLASENAPP;. FLORES, 2011). A infecção acontece por meio da inalação de núcleos secos de partículas contendo bacilos expelidos pela tosse, fala ou espirro do doente com tuberculose ativa de vias respiratórias (pulmonar ou laríngea). Os doentes com baciloscopia de escarro positiva, são a principal fonte de infecção (BRASIL, 2011). A tuberculose é uma doença curável em praticamente 100% das novas ocorrências, desde que a pessoa seja sensível aos medicamentos antituberculose e que sejam obedecidos os princípios básicos da terapia (BRASIL, 2016). Mesmo sendo considerada uma doença curável calcula-se que nos últimos 100 anos a tuberculose tenha levado a óbito por volta de 100 milhões de indivíduos (FRIENDEN et al., 2003)..

(23) 22. Em termos internacionais, a OMS aponta que 22 países concentram cerca de 80,0% das ocorrências de tuberculose. Nesse contexto, o Brasil faz parte desse grupo, ocupando a 16ª posição em número absoluto de casos. A Índia, China e África do Sul são os países com maior carga da doença. Considerado o coeficiente de incidência, o Brasil ocupa a 22ª posição entre esses países. Em 2012, cerca de 8,6 milhões de pessoas tiveram tuberculose no mundo, mas observa-se que ocorreu uma diminuição no número de contaminados como também no número de mortes por tuberculose no mundo, pois em 1990, ocorreram 1,3 milhão de mortes causadas pela tuberculose, e em 2012, esse número foi de 940 mil, obtendo uma redução de 45% (OMS, 2013). No Brasil, a tuberculose ainda é considerada um sério problema da saúde pública, com profundas raízes sociais. A cada ano, são notificados aproximadamente 70 mil casos novos e ocorrem 4,6 mil mortes em decorrência da doença (BRASIL, 2016). Entretanto, o Brasil vem apresentando uma queda na incidência de tuberculose, bem como em sua taxa de mortalidade e número de novos casos (FIOCRUZ, 2016). A tendência de queda em ambos os indicadores vem-se acelerando ano após ano em um esforço nacional, o que pode determinar o efetivo controle da tuberculose em um futuro próximo, quando a doença poderá deixar de ser um problema para a saúde pública (BRASIL, 2016). O Brasil cumpriu os três objetivos para 2015 (diminuir pela metade a incidência, prevalência e mortalidade). Outros oito países considerados de alta carga também alcançaram as metas: Camboja, China, Etiópia, Índia, Myanmar, Filipinas, Uganda e Vietnã (OMS,2015). Nos últimos 10 anos, a incidência de casos de tuberculose no Brasil reduzida em 20,2%, passando de 38,7 casos/100 mil habitantes em 2006 para 30,9 casos/100 mil habitantes em 2015. Já a taxa de mortalidade passou de 2,2 óbitos para cada 100 mil habitantes, em 2014, contra 2,6 registrados em 2004 (ROCHA, 2016). Para o ano de 2016 o objetivo global estabelecido pela OMS é a eliminação da epidemia da tuberculose, tendo como meta a redução da incidência da tuberculose em 80% e nas taxas de mortalidade uma redução de 90%, de forma a reduzir os custos voltados para o tratamento da tuberculose até 2030 (OMS, 2015). 2.1.1.2. TRATAMENTO DA TUBERCULOSE No Brasil, o Programa Nacional de Controle da Tuberculose (PNCT) é responsável pelas normas de prevenção, diagnóstico, tratamento e pela distribuição dos.

(24) 23. medicamentos, que são fornecidos, gratuitamente, a todos os doentes registrados e acompanhados nas Unidades de Saúde (CAMPOS, 2007). A primeira ação efetiva do poder público no Brasil contra a tuberculose foi em 1907 e proposta por Oswaldo Cruz. Em 1920, criou-se a Inspetoria de Profilaxia da Tuberculose, que priorizou a descoberta e o tratamento adequado dos doentes. Em 1926, o Departamento Nacional de Saúde Pública criou modelo centralizado de ações profiláticas, hospitalares, laboratoriais, coordenadas pelo poder público. Até os anos de 1940, quando não tinha medicamento efetivo, o tratamento era hospitalar, com o uso de técnicas cirúrgicas, mais precisamente pneumotórax (CAMPOS, 2007). Na década de 40, a tuberculose foi considerada praticamente intratável e fatal, responsável pela mortalidade de 50% na forma pulmonar (FOX; ELLARD; MITCHISON, 1999). No entanto, ao longo dos anos 40 e 50 com o uso da quimioterapia antibiótica especifica foi permitido alterar o perfil epidemiológico da doença, ocorrendo uma queda dos índices de mortalidade ocasionados pela tuberculose, contudo propiciou o surgimento de bacilos resistentes ao fármaco, sendo superada por sua vez por aprofundamento dos estudos (FERNANDES; NASCIMENTO, ALMEIDA, 1993). Em 1946, com o uso da estreptomicina para tratamento da tuberculose, iniciou-se o desenvolvimento da moderna quimioterapia e foi quando houve a redução do número de mortes. Em 1948, o uso de estreptomicina foi associado ao ácido p-amino-salicílico (PAS) para obter-se a redução da resistência bacteriana ao uso desses fármacos isolados (FERREIRA;. GLASENAPP;. FLORES,. 2011).. Desenvolveu-se. assim,. uma. quimioterapia inovadora contra a tuberculose, onde o foco era a redução da resistência das bactérias para esses medicamentos quando usados de forma isolada e uma melhor eficácia para o tratamento da doença. Entre 1952 e 1967, foi explorado o uso da isoniazida isolada ou em associação com o PAS ou estreptomicina. Nos anos 70, novos estudos direcionavam para o uso de rifampicina ou pirazinamida em regime combinado com estreptomicina e isoniazida, com a finalidade de diminuir o reaparecimento da doença, demonstrando, também, que a inclusão de rifampicina e pirazinamida no esquema terapêutico poderia reduzir o curso do tratamento para seis meses (FOX; ELLARD; MITCHISON, 1999). Com esse esquema de tratamento foi possível verificar que a atividade esterilizante da pirazinamida limitouse aos primeiros dois meses de tratamento, durante a fase intensiva, enquanto que a da.

(25) 24. rifampicina permaneceu em toda a fase de continuação (FOX; ELLARD; MITCHISON, 1999; OMS, 2003). Em 1976, o período de tratamento moderno foi delimitado para seis a nove meses. E em 1979, o esquema foi novamente modificado, passando a ser composto pela rifampicina, pela isoniazida e pela pirazinamida, com 6 meses de duração (2RHZ / 4RH). Esse esquema, por sua vez, foi considerado mais eficaz e com uma menor toxidade, assim foi utilizado em todo o país, de forma pioneira em todo o mundo (CAMPOS, 2007). No Brasil, até o ano de 2009, o esquema terapêutico disponível e utilizado para o tratamento de primeira linha da tuberculose era composto por três fármacos (isoniazida, pirazinamida e rifampicina) empregados na primeira fase (dois meses de tratamento), seguido de isoniazida e rifampicina empregados na segunda fase (quatro meses de tratamento). Nesse mesmo ano, o Programa Nacional de Controle da Tuberculose, juntamente com o seu comitê técnico, reviu o sistema de tratamento e foi diagnosticado um crescimento da resistência primária a isoniazida (de 4,4% para 6,0%), assim a partir de 2010 houve a introdução do etambutol na primeira fase do tratamento (dois meses), como quarto fármaco na fase intensiva do tratamento seguido dos dois fármacos (isoniazida e rifampicina) na segunda fase (quatro meses de tratamento) com objetivo de prevenir a resistência bacilar aos fármacos antituberculose (BRASIL, 2011; FERREIRA; GLASENAPP; FLORES, 2011). A introdução do etambutol objetivou aumentar o sucesso terapêutico e evitar o aumento da multirresistência, pela maior adesão do paciente; todos os agentes são facilmente absorvidos após a administração oral, com ampla distribuição para a maioria dos tecidos e fluidos, incluindo o líquido cérebro-espinhal. (BRASIL, 2010; BRASIL 2016). Assim, de acordo com recomendação da OMS, a formulação farmacológica desse esquema passa a ser em comprimidos de doses fixas combinadas dos quatro fármacos nas seguintes dosagens na etapa inicial (fase de ataque): rifampicina 150 mg, isoniazida 75 mg, pirazinamida 400 mg e etambutol 275 mg e etapa secundária (fase de manutenção ou continuação) rifampicina 150 mg e isoniazida 75 mg. As dosagens especificadas por peso e faixa etária para adolescentes e adultos podem ser consultadas no quadro 01 (BRASIL, 2011)..

(26) 25. Quadro 1 - Esquema básico para o tratamento da tuberculose de adolescentes e adultos. Fase. Intensiva 2 Meses. Fármacos Faixa de Peso Comprimido em dose fixa e combinada 20Kg a 35Kg Rifampicina 150 mg. 36Kg a 50Kg Isoniazida 75mg >50Kg Pirazinamida 400mg Etambutol 257mg 20Kg a 35Kg. Rifampicina e Isoniazida Manutenção comprimido ou cápsula de 36Kg a 50Kg 4 meses 300/200mg ou de 150/100mg ou comprimidos de 150/75mg. >50Kg. Unidade/Dose 2 Comprimidos 3 Comprimidos 4 Comprimidos. 1 comprimido ou uma cápsula de 300/200mg ou 2 comprimidos de 150/75mg 1 comprimido ou uma cápsula de 300/200mg + 1 comprimidos ou uma cápsula de 150/75mg ou 3 comprimidos de 150/75mg 2 comprimidos ou uma cápsula de 300/200mg ou 4 comprimidos de 150/75mg. Fonte: Brasil, 2011.. Além do aumento da resistência primária da isoniazida, já ressaltada anteriormente, houve ainda o aumento da resistência dela quando associada à rifampicina (de 1,1% para 1,4%), isso entra também como uma das justificativas para a mudança do tratamento a terapia de comprimidos DFC, buscando, dessa forma,. a redução da. resistência aos fármacos utilizados no tratamento contra a tuberculose, já que o etambutol é um agente usado principalmente para impedir o aparecimento de multirresistência (BRASIL, 2011; BRAGA; BARRETO; HIJJAR, 2002; NOLAN; GOLDBERG, 2002; RABARIJAONA et al., 1999). Uma das vantagens dessa nova formulação DFC é a redução do número de comprimidos, o que favorece a uma melhor adesão do paciente ao tratamento e consequentemente a redução das taxas de abandono ao tratamento, isso também diminui as chances de o paciente ser seletivo na escolha dos fármacos administrados, evitando o risco de monoterapia (BRASIL 2011; NOLAN; GOLDBERG, 2002; RABARIJAONA et al., 1999)..

(27) 26. Com a diminuição do tempo do tratamento para seis meses houve a diminuição nas taxas de abandono conforme já ressaltado, mas, ainda assim, é comum o paciente iniciar e interromper o tratamento por diversos motivos. É considerado abandono aquele paciente que deixou de comparecer à unidade de saúde por mais de trinta dias consecutivos, fato que normalmente ocorre no início do tratamento, quando o paciente tem uma melhora significativa dos sintomas. Contudo, isso é um fator preocupante, tendo em vista que o paciente que não finaliza o tratamento não obtém a cura, e isso leva ao não rompimento da cadeia de transmissão, pois o paciente permanece sendo uma fonte de contágio. Outro agravante é que o abandono leva à resistência medicamentosa e à recidiva da doença, as quais impõem dificuldades ao processo de cura, aumentando o tempo e o custo do tratamento (MENDES; FENSTERSEIFER, 2004). Vários fatores podem estar ligados ao abandono do tratamento, sendo os principais os efeitos colaterais, uso irregular da medicação, baixo nível socioeconômico, internações por outras doenças, os hábitos de vida, falha dos profissionais na orientação ao paciente (OLIVEIRA; MOREIRA FILHO, 2000). Além do abando ao tratamento, que é um empecilho para a cura efetiva da doença, outro aspecto importante a ser ressaltado é no tocante a negligência em relação a doença, pois mesmo sendo uma doença antiga, descoberta há mais de 3.400 anos antes de Cristo, ela continua a atingir pessoas em todo o mundo. Assim, tem-se que tuberculose contribui para aumentar a desigualdade social e mesmo existindo investimento para pesquisas no tratamento da doença, os resultados dos estudos não são suficientes para eliminar e/ou controlar a enfermidade (BRASIL, 2010). Uma das justificativas para esse fato é que a doença tem baixo interesse da indústria farmacêutica devido ao pouco lucro e pouco potencial comercial, por isso a indústria farmacêutica tem relutado em investir nesse mercado (BRASIL, 2010; HARPER, 2007). É importante ressaltar que a Tuberculose é negligenciada tanto pelo poder público como também pela comunidade científica, por acreditar que a doença estaria controlada, contudo a tuberculose continua a vitimar várias pessoas em todo o mundo (NETTO, 2002). 2.1.1.3. FÁRMACOS TUBERCULOSTÁTICOS 2.1.1.4.ISONIAZIDA.

(28) 27. A isoniazida também conhecida por hidrazida do ácido 4-piridinacarboxílico é um pró-fármaco sintético com atividade tuberculostática. Depois de sua conversão a metabólito ativo inibe a síntese do ácido micólico interferindo na síntese da parece celular (MINNEMAN et al., 2006). Sua denominação comum internacional é isoniazidum, apresenta fórmula molecular C6H7N3O e massa molecular em g/mol de 137,14 (figura 1). Tem como características ser um pó cristalino de cor branca ou incolor, facilmente solúvel em água, ligeiramente solúvel em etanol, pouco solúvel em clorofórmio, praticamente insolúvel em benzeno e éter etílico. Contém no mínimo 98% e, no máximo, 102% de C6H7N3O em relação a substância dessecada (BRASIL, 2010.). Para identificação podese utilizar absorção no espectro de infravermelho comparando-se com espectro de isoniazida, substância química de referência (SQR). Pode-se também observar absorções características em 212 e 265 nm no espectro ultravioleta e por cromatografia liquida de alta eficiência apresenta pico de retenção igual ao da solução padrão preparada com isoniazida SQR (BRASIL, 2010). Figura 1 - Estrutura química da isoniazida. Fonte: Kelly Sivocy, 2017.. 2.1.1.5.PIRAZINAMIDA A pirazinamida, também conhecida por 2-pirazinacarboxamida, é um análogo sintético da nicotinamida atuando na interferência do gene que codifica a síntese do ácido graxo do bacilo interrompendo a síntese da parece celular bacteriana (MINNEMAN et al., 2006). Sua denominação comum internacional é pyrazinamidum, apresenta fórmula molecular C5H5N3O e massa molecular em g/ mol de 123,11 (figura 2). Tem como características ser um pó cristalino, branco ou quase branco, ligeiramente solúvel em água, pouco solúvel em etanol, éter etílico e clorofórmio. Contém no mínimo 99% e, no máximo, 101% de C5H5N3O em relação a substância anidra (BRASIL, 2010.). Para identificação pode-se utilizar absorção no espectro de infravermelho comparando-se com espectro de pirazinamida SQR, pode-se também observar máximo e mínimo idêntico a.

(29) 28. solução similar de pirazinamida SQR entre 200 a 400 nm no espectro ultravioleta, desenvolve coloração alaranjada quando em reação com sulfato ferroso e em presença de hidróxido de sódio a solução adquire cor azul escura. E, por aquecimento com hidróxido de sódio desprende-se odor característico de amônia (BRASIL, 2010). Figura 2 – Estrutura química da pirazinamida. Fonte: Kelly Sivocy, 2017.. 2.1.1.6.ETAMBUTOL O Cloridrato de (2S,2'S)-2,2'-(1,2-etanodiildiimino) bis-1-butanol (2:1) é um fármaco com efeito contra as micobactérias apresentando ação após 24 horas depois de administrada. Não se sabe ao certo o mecanismo de ação, mas acredita-se que interfere na síntese de polissacarídeos e síntese da parede celular (RANG et al., 2007). A denominação comum internacional é ethambutoli hydrochloridum, que apresenta formula molecular C10H24N2O2. HCl e massa molecular em g/mol de 277,23 (figura 3), tem como características ser um pó branco, cristalino, inodoro, sabor amargo e higroscópico, facilmente solúvel em água, solúvel em etanol e metanol, pouco solúvel em clorofórmio e praticamente insolúvel em éter etílico. Contém no mínimo 97% e, no máximo, 101% de C10H24N2O2. HCl em relação a substância dessecada (BRASIL, 2010). Para identificação pode-se utilizar absorção no espectro de infravermelho comparando-se com espectro de cloridrato de etambutol SQR. Desenvolve coloração azul quando em reação com sulfato cúprico e por último pode responder a reação de íon cloreto quando em solução aquosa a 10% (BRASIL, 2010). Figura 3 – Estrutura química do etambutol. Fonte: Kelly Sivocy, 2017.. 2.1.1.7.RIFAMPICINA.

(30) 29. A rifampicina é um agente antibacteriano da classe dos macrocíclicos complexos com atividade tuberculostática. Sua ação bacteriostática se dá devido à inibição da síntese do RNA bacteriano, interferindo com a polimerase do DNA dependente (CAÑADA, 2002). Pela denominação comum internacional é conhecida como rifampicinum, apresenta formula molecular C43H58N4O12 e massa molecular em g/mol de 822,94 (Figura 4). Tem como características ser um pó cristalino de cor castanho avermelhado a vermelho acastanhado, pouco solúvel em água, solúvel em metanol, pouco solúvel em acetona e etanol. Contém no mínimo 97% e, no máximo, 102% de C 43H58N4O12 (BRASIL, 2010). É bastante sensível a luz sendo, portanto, necessário ambiente de trabalho com baixa luminosidade (CAÑADA, 2002). Para identificação pode-se utilizar absorção no espectro de infravermelho comparando-se com espectro de rifampicina SQR, pode-se também observar absorções características em 237, 254, 334 e 475 nm no espectro ultravioleta e por reação de coloração com persulfato de amônio a 10% (BRASIL, 2010). Figura 4 – Estrutura química da rifampicina. Fonte: Kelly Sivocy, 2017.. 2.1.1.8. CONTROLE DE QUALIDADE DE MEDICAMENTOS NA INDÚSTRIA FARMACÊUTICA As Boas Práticas de Fabricação (BPF) são um conjunto de ações voltadas ao controle de qualidade na indústria farmacêutica que visam minimizar os riscos inerentes ao processo produtivo. São divididas em duas etapas, o controle de qualidade durante o processo e o controle de qualidade do produto final (BRASIL, 2010). A tecnologia de processo analítico (PAT) foi implementada pela FDA para estabelecer as BPF para o século XXI: “ Um sistema para projetar, analisar e controlar a.

(31) 30. fabricação através de medidas críticas de qualidade (durante o processo), com objetivo de certificar a qualidade do produto final (ICH, 2009) ”. Para cumprir com as novas exigências dos órgãos regulamentadores, a indústria farmacêutica precisa desenvolver metodologias que possam monitorar a qualidade inline/ on-line em um processo produtivo, principalmente em medicamentos em associação, em que há a mistura de dois ou mais fármacos na mesma forma farmacêutica e que demanda técnicas analíticas dispendiosas, como as descritas para o medicamento dose fixa combinada da tuberculose. Nas farmacopeias americana e internacional, os métodos analíticos para doseamento dos ativos em medicamentos para o tratamento de tuberculose normalmente são descritos para serem analisados individualmente ou associados apenas com três fármacos (USP, 2014; THE INTERNATIONAL PHARMACOPOEIA, 2015). Já na farmacopeia brasileira há poucas monografias que se referem ao doseamento simultâneo, porém, nenhumas destas monografias são de medicamentos antituberculostáticos (BRASIL, 2010). Várias são as técnicas analíticas voltadas para o controle de qualidade da indústria farmacêutica, sendo elas responsáveis tanto para o controle em processo como para o controle do produto final. Dentre elas, podemos destacar a cromatografia líquida de alta eficiência e a espectroscopia UV-VIS (ALCALÀ, et al., 2010). Uma das técnicas analíticas mais utilizadas para separação é a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), pois possui alto poder de resolução, separação rápida, monitoramento contínuo do eluente, fácil adaptação a determinadas análises quantitativas, pode ser utilizada em produtos não voláteis ou termicamente instáveis e é utilizada para uma ampla quantidade de substâncias (SKOOG; HOLLER; NIEMAN, 2002 e VOGEL, 2002). Vários trabalhos reportam a utilização de CLAE em análises multivariadas: Hassib, Farag e Elkady (2011) determinaram estearato de eritromicina e trimetoprim em comprimidos; Gallego e Arroyo em 2003 analisaram prednisolona, sulfacetamida e fenilefrena, e em 2002 analisaram dexametasona e trimetoprim; Carlucci et al., (2000) determinaram losartam e hidroclorotiazida. Süzen, Akay e Cevheroglu (1999) analisaram guaseifenesina e fosfato de codeína em comprimidos, dentre outros citados na literatura. Entretanto, ao se verificar o uso de CLAE no processo produtivo dentro de uma indústria farmacêutica, principalmente voltada para o PAT, essa metodologia passa a ser um.

(32) 31. problema, pois é trabalhosa, consome grandes quantidades de reagentes, várias manipulações analíticas são necessárias, geram resíduos químicos prejudiciais ao meio ambiente, além de serem destrutivas e serem realizadas por pessoas capacitadas (USP, 2014; THE INTERNATIONAL PHARMACOPOEIA, 2015, BRASIL, 2010). As técnicas espectrofotométricas no UV/VIS para identificação e quantificação de medicamentos está fundamentada na absorção da energia eletromagnética por moléculas que depende tanto da concentração quanto da estrutura da mesma (BRASIL, 2010). Apresenta como vantagens: oferecer resultado satisfatório, custo baixo, menor trabalho na preparação das amostras, menor tempo de análise e mínima geração de resíduos (SKOOG, et al., 2000). As regiões do espectro eletromagnético às quais pertencem a faixa de energia ultravioleta e visível está compreendida entre aproximadamente 200 a 800 nm, em que se pode verificar que muitos fármacos apresentam sinal intenso, sendo, portanto, sua determinação viável mesmo em concentrações pequenas (MADAN; DWIVEDI; SINGH, 2005; HARRIS, 2001). Porém, para determinadas análises onde os grupos responsáveis pela absorção da luz (cromóforos) apresentam semelhanças químicas há uma sobreposição espectral interferindo na seletividade da técnica, assim, é necessário a utilização de pré-processamento da amostra (SILVERSTEIN; WEBSTER, 1997), que normalmente adicionam etapas que poderiam interferir na validação do método. 2.1.1.9. ESPECTROSCOPIA NO INFRAVERMELHO (NIR E MID) PARA ANÁLISE DE FÁRMACOS A radiação no infravermelho (IV) só ocorre quando há interação da molécula com o campo eletromagnético oscilando em frequência semelhante (SKOOG et al., 2000). Os átomos dos compostos orgânicos vibram com elevada amplitude ao redor das ligações covalentes, desta forma, os compostos absorvem energia IV nas regiões do espectro, formando as bandas (SCHARDER, 1995; SKOOG et al.., 2000). A região do IV corresponde a parte do espectro eletromagnético que vai da faixa de 10000 a 100 cm-1, sendo dividida em três regiões conhecidas como: FIR – infravermelho distante, MID – infravermelho médio e NIR – infravermelho próximo. No quadro 2 são apresentados os limites para cada região, segundo Skoog et al., (2000). No MID as bandas correspondem as transições fundamentais e no NIR as absorções.

(33) 32. moleculares de sobretons e combinações do espectro estão correlacionadas às vibrações de ligações C-H, N-H, O-H entre outras (BARBOSA, 2008). Quadro 2 – Regiões espectrais do infravermelho. Região NIR (próximo) MID (médio) FIR (distante). Intervalo em número de ondas (cm-1) 12800 a 4000 4000 a 200 200 a 10. Intervalo em comprimentos de ondas (nm) 780 - 2500 2500 - 5000 5000 - 100000. Fonte: SKOOG, et al., 2000.. A espectroscopia no infravermelho como ferramenta analítica já é utilizada há bastante tempo dentro da área de controle de qualidade seja ela farmacêutica, alimento, química ou têxtil, sendo a espectroscopia no infravermelho médio (MID) responsável pela impressão digital de várias substâncias (SWARBRICK, 2007). Já a espectroscopia no infravermelho próximo (NIR) só passou a ser utilizada a partir da década de setenta, voltada para a área de agricultura (WILLIAMS; NORRIS, 1998). O desenvolvimento desta técnica só foi possível graças a evolução dos equipamentos mecânicos e ópticos como o espectrofotômetro com transformada de Fourier que coleta os dados em todas as frequências do espectro, sendo adquirido rapidamente e em melhor qualidade (STUART, 2004; COATES, 1999). Os espetros de IV podem ser adquiridos de duas formas: métodos de transmitância e de reflectância. Para a transmitância podem ser analisadas amostras líquidas, gasosas ou sólidas, que tem como base a absorção da radiação IV em número de ondas específicos enquanto passa através da amostra. Já o método de reflectância pode ser de duas formas: A reflexão interna como a reflectância total atenuada (ATR) e a reflexão externa que pode ser especular ou difusa (STUART, 2004; PARISOTTO et al., 2009). Na figura 5 é possível observar um esquema de como ocorre o espalhamento da radiação, e como ela é coletada pelos espelhos que direcionam para o detector na reflectância especular e difusa (DAVIDSON; PARRY-HILL; SUTTER, 2005)..

(34) 33. Figura 5 – Representação da técnica de reflectância especular e difusa. Reflectância especular. Reflectância difusa. Fonte: DAVIDSON; PARRY-HILL; SUTTER, 2005. O método por reflectância difusa tem sido utilizado como processo de inovação para análise e controle de qualidade dos IFA em função do baixo custo de análise, ser uma técnica não destrutiva, simples e rápida além de não gerar resíduos químicos (TREVISAN; POPPI, 2006; LUYPAERT, MASSART, VANDER HEYDEN, 2007; SWARBRICK, 2007; MANTANUS et al., 2010). Por esses motivos, a literatura é farta em descrever a utilização desse método tanto em NIR como em MID: Marson et al. (2016) utilizaram MID para quantificação simultânea de artesunato e mefloquina em comprimido DFC; no estudo de Chavez et al. (2015) foi realizado o desenvolvimento de métodos por NIR para determinar o conteúdo ativo de comprimidos farmacêuticos não revestidos associado a tecnologia PAT e ao conceito de quality by desing; uma abordagem de tecnologia analítica de processo para a produção de comprimidos dose fixa combinada de zidovudina e lamivudina usando NIR e imagens químicas foi desenvolvido por Grangeiro Júnior et al. (2015); Martelo-Vidal e Vazquez (2014) usaram NIR e ferramentas quimiométricas para determinar compostos polifenólicos em vinhos tintos; Silva et al. (2012) desenvolveram e validaram um método de calibração multivariada com NIR para determinação de amoxicilina em suspensões; Müller et al (2012) determinaram súlfur total em resíduos de destilação de petróleo com MID e método de seleção variável; Mazurek e Szostak (2011) avaliaram a influência da área de amostra na quantificação de diclofenaco de sódio por MID; Cordeiro et al. (2011) usaram determinação espectroscópica multivariada para doseamento da associação lamivudina/zidovudina; Em Müller et al. (2011) foi determinado simultaneamente o ácido clavulânico e amoxicilina em formulações farmacêuticas por espectroscopia no invravermelho; Rocha e Silva.

(35) 34. (2010) determinaram glicerol livre em biodiesel por NIR; o controle de etapas no processo de produção de comprimidos de paracetamol por NIR foi realizado por Blanco, Mestanza e Peguero (2010). Os avanços na utilização do NIR e MID dentro da área do medicamento só foram possíveis devido à associação com métodos quimiométricos de análise e calibração multivariada para superar os inconvenientes de sobreposição de bandas nas leituras dos espectros, principalmente em amostras contendo mais de um IFA e seus excipientes (ROGGO et al., 2007; POLLANEN et al., 2005).. 2.1.1.10.. QUIMIOMETRIA. A Sociedade Internacional de Quimiometria (International Chemometrics Society – ICS) tem a seguinte definição para quimiometria: “É a ciência relacionada a medidas realizadas em um sistema ou processo químico, obtendo informações sobre o estado do sistema. através. da. aplicação. de. métodos. matemáticos. ou. estatísticos”. (WIKIPEDIA.ORG). Essa ciência nasceu da necessidade de se analisar as várias respostas dadas pelos instrumentos analíticos (FERREIRA, et al., 1999; HOPKE, 2003). A quimiometria começou a ser utilizada no Brasil há um pouco mais de 30 anos, tendo nos cursos de química o seu maior aliado, porém, hoje em dia, sua utilização vai muito além do que foi proposto no início. É muito utilizada nas áreas de controle de qualidade da indústria farmacêutica, em psicometria (área da psicologia), em biometria (área da biologia) e em econometria (área da economia) (NETO, et al., 2006). Para o controle de qualidade na indústria farmacêutica, os métodos mais utilizados são: PCA (análise de componentes principais) para a análise exploratória não supervisionada e o PLS (quadrados mínimos parciais) para a construção dos modelos de calibração multivariada. A análise exploratória não supervisionada se baseia em métodos de reconhecimento de padrões para verificar as igualdades e/ou diferenças entre amostras de um determinado conjunto de dados (BEEBE, 1998). É utilizado como base principal a PCA, pois este procedimento matemático transforma os dados iniciais em um novo sistema de eixos, com um número reduzido de novas variáveis, chamadas de componentes principais (REICH, 2005; NETO, et al., 2006)..

(36) 35. A calibração multivariada tem como função estabelecer uma relação entre dois blocos de dados, quando houver uma dependência entre as propriedades que descrevem cada uma delas, como, por exemplo, as ligadas à lei de Lambert-Beer em que há uma constante de proporcionalidade entre a concentração e a intensidade de absorção (FERREIRA, et al., 1999). O método mais utilizado em análises farmacêuticas para a calibração multivariada é o PLS, no qual duas matrizes (uma relacionada aos sinais instrumentais - X e a outra às variáveis dependentes -y) são relacionadas e decompostas para serem feitas as previsões dos modelos e posteriormente a calibração (BARTHUS; MAZO; POPPI, 2005; MADAN; DWIVEDI; SINGH, 2005). Uma etapa antes de se escolher o método de PLS adequado é a transformação prévia dos dados, que serão utilizados na construção do modelo com o intuito de minimizar problemas como o espalhamento de luz, ruídos, desvios na linha de base, dentre outros. Os pré-processamentos mais utilizados são correção multiplicativa de sinal (MSC), alisamento (smooth), derivadas, centrar na média e escalonamento (FERREIRA, et al., 1999; REICH, 2005). O PLS pode ser realizado de duas formas: o PLS1 e o PLS2. O PLS1 consiste em utilizar na matriz de variáveis dependentes – y um único conjunto de dados, enquanto que no PLS2 pode-se utilizar dois ou mais conjunto de dados (BRERETON, 2000; SENA et al., 2004). Brereton (2000), demonstra que em alguns casos o desenvolvimento do modelo PLS2 na tentativa de estimar dois ou mais fármacos pode ser falha, sendo preferível suas estimativas de maneira individual pelo método do PLS1. Outro passo importante no desenvolvimento de um modelo de calibração multivariada é a escolha do número de variáveis latentes (VL). Essas VLs explicam uma porção dos dados utilizados, chamado de variabilidade. A variabilidade é aumentada com o aumento das VL e isso pode ser prejudicial devido a incluir no modelo a interpretação dos ruídos presentes nos espectros (PASQUINI, 2003). Assim, é importante que a escolha do número de VLs do modelo sejam feitas pelo software utilizado, mas, principalmente seja definida pela avaliação final do analista, pois a utilização de um número de VLs pequena pode fornecer resultados insatisfatórios uma vez que informações importantes foram desconsideradas (underfitted – subajustado) e um número grande de VLs pode demonstrar a introdução de informações em excesso, o overfitting (superajuste) (MORGANO et al., 2005; CONZEN, 2006; ARAUJO, 2007; FERREIRA, 2015)..

(37) 36. Uma forma de se determinar o número de VLs é através do método de validação cruzada (leave-one-out), no qual uma amostra é retirada do modelo e o modelo é construído, posteriormente essa amostra retirada é prevista, então calculada a soma dos erros quadráticos da validação cruzada (RMSECV) (PASQUINI, 2003, CONZEN, 2006; ARAÚJO, 2007, FERREIRA, 2015). Ao se encontrar o menor valor de RMSECV podese concluir como o melhor número de VLs do modelo desenvolvido (FERREIRA et al., 1999). A presença de amostras anômalas ou outliers é tão importante quanto a determinação das VLs, visto que esses outliers são elementos muito distintos do conjunto de dados analisados ou por apresentarem erros grosseiros quando comparados a maioria dos dados, e que na maioria das vezes torna o modelo não representativo, ou seja, levam a resultados que indicam incapacidade de previsão das amostras (QUEJI, 2008; COZEN, 2006). Este tipo de análise é feito avaliando o gráfico de resíduos de Student versus leverage. Os dados de resíduos de Student são correspondentes aos desvios entre os dados de referência e os estimados pelo modelo, já os dados do leverage são as medidas de influência de uma amostra no modelo de regressão (FERREIRA et al., 1999; COZEN, 2006; ARAUJO, 2007, ASTM, 2012). Ao se avaliar os dados de leverage e resíduos de Student é necessário verificar a real necessidade de eliminação da amostra do modelo quando ultrapassados os limites individuais, porém, quando os dados são ultrapassados simultaneamente é imprescindível a retirada da amostra do modelo, pois aí se caracteriza como uma amostra anômala por completo (FERREIRA et al., 1999; PASQUINI, 2003).. 2.1.1.11.. VALIDAÇÃO ANALÍTICA. Segundo as BPF, a validação de novos métodos analíticos precisa demonstrar que os resultados obtidos são confiáveis e adequados à finalidade pretendida (BRASIL, 2010). Assim, a validação irá demonstrar através de estudos estatísticos a garantia do desempenho do método desenvolvido (BRASIL, 2003). Quando se fala em dados univariados há uma harmonização pelos órgãos reguladores nacionais e internacionais. Porém, o mesmo não ocorre quando se trata de dados multivariados nos quais poucos são os documentos que auxiliam na validação (BRITO et al., 2003)..

(38) 37. Os parâmetros que devem ser determinados pela validação de um processo analítico por calibração multivariada são chamados de figuras de mérito, tendo que atender a determinadas especificações impostas por órgãos reguladores ou pelas indústrias de medicamentos (VALDERRAMA, BRAGA, POPPI, 2009). Algumas das figuras de mérito multivariadas podem ser estimadas de maneira similar aos métodos de calibração univariada: precisão e exatidão (VALDERRAMA, BRAGA, POPPI, 2009). A precisão avalia a proximidade dos resultados obtidos em uma série de medidas de uma amostragem múltipla. É expressa em desvio padrão relativo (DPR), que consiste na razão do desvio padrão (DP) pela concentração média determinada (CMD) expressa em porcentagem. O nível repetibilidade é a concordância dos resultados obtidos pelo mesmo analista em um mesmo instrumento analisando concentrações baixas, médias e altas em triplicata (BRASIL, 2003). A exatidão é a proximidade dos resultados em comparação com um valor verdadeiro, sendo avaliada pelo erro percentual em relação ao valor nominal, e é satisfatória quando o erro percentual chega até ±2% do valor nominal (BRASIL, 2003). Já a linearidade, por ser a capacidade de demonstrar que o método analítico apresenta resultados diretamente proporcionais a concentração do analito, não tem como ser calculada desta forma no método multivariado, sendo, portanto avaliada geralmente com base no resultado previsto em relação ao resultado obtido pelo método de referência (VALDERRAMA, BRAGA, POPPI, 2009).. 3. OBJETIVOS 3.1.1.1. GERAL Desenvolver e validar um modelo de calibração multivariada para determinação simultânea de rifampicina, isoniazida, pirazinamida e cloridrato de etambutol em comprimido DFC empregando a técnica de Espectroscopia no Infravermelho (NIR). 3.1.1.2. ESPECÍFICOS.

(39) 38. ✓ Desenvolver modelos de calibração multivariada empregando a Espectroscopia no Infravermelho (NIR) para quantificação simultânea de rifampicina, isoniazida, pirazinamida e cloridrato de etambutol em comprimido DFC; ✓ Aplicar as técnicas de referência para análise dos quatro insumos farmacêuticos ativos: rifampicina, isoniazida, pirazinamida e cloridrato de etambutol associados em uma única forma farmacêutica; ✓ Utilizar a quimiometria para o tratamento dos espectros obtidos, fazendo uso dos métodos PCA (análise de componentes principais) para a análise exploratória não supervisionada e o PLS (quadrados mínimos parciais) para a construção dos modelos de calibração multivariada; ✓ Validar o modelo multivariado de melhor desempenho na quantificação dos IFA e comparar os resultados com a técnica de referência (CLAE); ✓ Aplicar o modelo multivariado (NIR e MID) desenvolvido em amostras DFC distribuídas pelo SUS, para o tratamento da tuberculose, e comparar os resultados obtidos com metodologia de referência.. 4. METODOLOGIA EXPERIMENTAL 4.1.1.1. MATERIAIS: AMOSTRA, PADRÕES, REAGENTES, SOLVENTES UTILIZADOS, EQUIPAMENTOS E SOFTWARES Os comprimidos dose fixa combinada para o tratamento da tuberculose são compostos por rifampicina (150mg), isoniazida (75mg), pirazinamida (400mg) e etambutol (275mg). Os lotes utilizados durante essa pesquisa foram doados pela Secretaria Municipal de Saúde (Fortaleza - Ce), a data de fabricação e data de validade destes comprimidos estão apresentadas na tabela 1, vale salientar que todos são de um mesmo fabricante. Tabela 1 – Informações adicionais dos comprimidos DFC. Lote 2589 2651 2688. Data de fabricação 12/2014 02/2015 03/2015. FONTE: Kelly Sivocy, 2017. Data de validade 11/2017 01/2018 02/2018.

(40) 39. Como não é declarado na bula do medicamento e nem há informações do fabricante em relação a composição dos comprimidos foi necessário a realização de deformulação, a engenharia reversa do comprimido para se definir o perfil quali/ quantitativo dos excipientes presente no medicamento. Para que isso fosse possível, alguns excipientes foram escolhidos de acordo com um levantamento farmacotécnico, segundo as funções necessárias para a composição do comprimido: alginato de sódio (Ativos Magistrais), amido de milho (Corn Product), celulose microcristalina 101 (Mingtal Chemical), dióxido de silício coloidal (Ativos Magistrais), lactote (Henrifarma), estearato de magnésio (ACM do Brasil Ltda), gelatina em pó (Synth), lauril sulfato de sódio (Primacom), methocel A15 (Colorcon), polivinilpirrolidona K30 (Viafarma), polivinilpirrolidona K90 (Viafarma), macrogol 6000 (Vetec), talco (Magnesita), dióxido de titânio (dinâmica), hipromelose (Colorcon), óxido de ferro (dinâmica), ácido ascórbico (Viafarma), amido glicolato de sódio e croscarmelose (Blanver Farmoquímica Ltda). Os IFA utilizados foram a rifampicina – 99,30% (Sanofi-aventis), etambutol – 99,80% (Lupin Limited), isoniazida – 99,67% (Amsal Chem Private Limited), pirazinamida – 99,36% (Calyx Chemicals & Pharmaceuticals Limited). Após definição da formulação, misturas foram preparadas para compor o conjunto de calibração (nomeadas de 1 a 31) e conjunto de validação (nomeadas de 32 a 49) de acordo com o planejamento experimental. As substâncias químicas de referência utilizadas foram rifampicina e etambutol da United States Pharmacopeia (USP) e a isoniazida e pirazinamida da farmacopeia brasileira (SQRFB). Estes padrões foram utilizados para as análises em cromatografia liquida de alta eficiência (CLAE). Para as análises do método padrão de doseamento dos 4 ativos foi necessário a utilização dos seguintes reagentes e solventes: acetato de amônio (Dinâmica), acetato de cobre II (Dinâmica), ácido acético glacial P.A. (Vetec), metanol grau CLAE (J.T. Baker), água ultrapura Milli-Q (Millipore, Milford, EUA), fosfato monopotássico (Nuclear), hidróxido de sódio (Dinâmica). Nas pesagens foi utilizada balança analítica (Sartorius – Ba-06). E as soluções tampões foram preparadas e o pH ajustado em um medidor de pH com eletrodo de vidro (Gehaka – PG2000). As análises envolvendo cromatografia líquida de alta eficiência foram realizadas em um cromatógrafo (Hitachi – Elite Ultra), equipado com coluna C18 (15 cm x 4,6 mm.