UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA E MEDICINA LEGAL PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MICROBIOLOGIA MÉDICA
ISABEL PAIVA DIAS MENDES CARNEIRO
DIFERENÇAS NA EXPRESSÃO DO RECEPTOR PARA COMPLEMENTO TIPO 1 (CR1/CD35) EM HEMÁCIAS E LEUCÓCITOS DE PACIENTES COM
LEISHMANIOSE VISCERAL, ANTES E APÓS O TRATAMENTO.
FORTALEZA 2015
ISABEL PAIVA DIAS MENDES CARNEIRO
DIFERENÇAS NA EXPRESSÃO DO RECEPTOR PARA COMPLEMENTO TIPO 1 (CR1/CD35) EM HEMÁCIAS E LEUCÓCITOS DE PACIENTES COM
LEISHMANIOSE VISCERAL, ANTES E APÓS O TRATAMENTO.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia Médica da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Microbiologia Médica.
Área de concentração: Microbiologia Humana e Animal.
Orientador: Profª. Drª. Lília Maria Carneiro Câmara
FORTALEZA 2015
ISABEL PAIVA DIAS MENDES CARNEIRO
DIFERENÇAS NA EXPRESSÃO DO RECEPTOR PARA COMPLEMENTO TIPO 1 (CR1/CD35) EM HEMÁCIAS E LEUCÓCITOS DE PACIENTES COM
LEISHMANIOSE VISCERAL, ANTES E APÓS O TRATAMENTO.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia Médica da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Microbiologia Médica.
Área de concentração: Microbiologia Humana e Animal.
Aprovada em: 30/07/2015.
BANCA EXAMINADORA
_________________________________________ Prof. Dr.Anastácio de Queiróz Sousa
Universidade Federal do Ceará (UFC)
_________________________________________ Prof. Dr. Max Victor Carioca Freitas
Universidade Federal do Ceará (UFC)
_________________________________________ Prof. Drª. Maria Fátima da Silva Teixeira
À minha mãe, por todo amor e força que recebo todos os dias.
Acima de tudo a Deus, que me permitiu viver mais uma etapa do meu crescimento profissional e por ser estar comigo me fortalecendo, protegendo em todos os momentos e me conduzindo sempre a uma vida vitoriosa.
À minha mãe Fátima Paiva, meu pai Orley Carneiro, minhas irmãs Priscila e Catarina Paiva, meus sobrinhos José e Miguel, meu cunhado José Terceiro e meu namorado Wendel, por encherem meu coração de amor, incentivo e apoio, fazendo-me persistir e ter forças.
À minha orientadora Lília Câmara, que me abriu as portas no momento certo. Obrigada por todo o aprendizado, paciência, compreensão, generosidade, por só me dar exemplos de competência, dedicação e por me fazer superar meus limites.
A Fabíola Fernandes Herédia e Suellen Alves da Silva, por estarem ao meu lado desde a minha seleção até a conclusão do mestrado. Obrigada por terem sido vocês as presentes nesta etapa da minha vida e por contribuírem com tanta generosidade, amizade, paciência, acolhimento, aprendizado e companheirismo. Gratidão eterna!
A Eliane Nunes, Camila Fernandes e EdglesyAguiar, pela amizade e por estarem presentes me apoiando e ajudando sempre que necessário.
Ao Doutor Guilherme Henn, médico infectologista do Hospital São José de Doenças Infecciosas, por toda constante atenção e colaboração, essencial contribuição no projeto e auxílio de todas as horas na etapa de retorno dos pacientes participantes e na banca de qualificação.
Às professoras doutoras Maria Jânia Teixeira e Aparecida Tiemi Nagao-Dias por suas disponibilidades e presenças na banca de qualificação e suas valiosas contribuições dadas para a dissertação;
Aos profissionais do Hospital Universitário Walter Cantídio: dosetor de Coleta de Sangue, Francisca Mifran Lima e Janecélia; e do setor de Hematologia, Neide, Nilda, Vanda Cláudia, Glaírta, Conceição e Tereza, pelo apoio técnico necessário para os meus experimentos.
A todos os profissionais do Hospital São José de Doenças Infecciosas que, direta ou indiretamente, colaboraram de alguma forma na coleta de pacientes para o projeto. Minha sincera e especial gratidão aos técnicos Francisco Antônio Coelho Neto, Vera Lúcia Ferreira, Maria Djanira Soares, Érica Sousa, Arislene Costa e Erivane Martinspor todo apoio, colaboração, carinho, acolhimento e ajuda; aos farmacêuticos-bioquímicos Pedro, Márcia Oriá, Darcielle Bruna Dias Elias, e seus estagiários Edwin e Jamille; aos funcionários do SAME, responsáveis pelos prontuários; aos recepcionistas Naiara e José; aos demais funcionários do laboratório por todo acolhimento no dia a dia, Marise Lima Lopes, Ruth, Maria dos Anjos, Rafaela Fontenele, Alana, Ângela.
A todos os professores do programa de Pós-Graduação Sâmia Brilhante, Cibelle Barreto, André Jalles, Danielle Macêdo, Tereza Bandeira, Fernanda Edna por abrirem as janelas do conhecimento com suas aulas e por me mostrarem o quão longe eu sempre posso ir.
À secretária da pós-graduação Carolinda Vilma Soares de Oliveira, por toda atenção, cuidado, acolhimento e amizade desde muito antes de eu tentar a seleção, durante os momentos difíceis e até a conclusão do mestrado.
Aos meus colegas de mestrado que, com sua amizade, apoio e incentivo, deixavam meus dias sempre mais alegres e leves: Francisco Eliclécio, João Batista Andrade, Anderson Ramos, Daniel Domingues, Jamila Ricarte, Giovanna Riello, Cecília Leite e Crister Ocadaque.
Aos pacientes que aceitaram participar do projeto, que me permitiram, além da busca pelo conhecimento científico, estar ao lado deles oferencendo palavras de conforto, esperança e auxiliando-os durante e após o tratamento.
“O Senhor firmou os meus passos. Sobre uma rocha me fez subir, me deu força e coragem pra vencer.”
Salmo 40 RESUMO
A Leishmaniose Visceral ou Calazar é uma doença crônica sistêmica, endêmica na região nordeste do Brasil, causada pelo protozoário parasita Leishmania infantum chagasi e
transmitida pela picada do flebotomíneo Lutzomyia longipalpis.Ao quadro de pancitopenia associa-se a ativação policlonal de linfócitos B, com altos níveis de imunocomplexos circulantes (ICC). O receptor para complemento tipo 1 (CR1/CD35) nos eritrócitos (CR1/E) e nos neutrófilos (CR1/N) faz a retirada de ICC. A expressão do CR1 nas células é modulada durante as doenças e tende a se normalizar após um período de remissão. A redução do CR1/E foi observada em doenças autoimunes e em patologias infecciosas crônicas, sendo correlacionada com níveis aumentados de ICC e com a gravidade do quadro clínico. Também já foi observada a redução do CR1/N em doenças autoimunes. Este estudo teve como objetivo investigar em indivíduos com Calazar, antes e após o tratamento, a expressão do CR1 em eritrócitos e leucócitos, por citometria de fluxo e dosar a quantidade de ICC, por ensaio imunoenzimático. No momento do diagnóstico, os pacientes, quando comparados com o grupo controle saudável, apresentaram uma redução na expressão do CR1/E, assim como na frequência de eritrócitos CD35+. Também ocorreu redução na expressão do CR1/N, sem redução da frequência de neutrófilosCD35+, enquantonos linfócitos e monócitos ocorreu um aumento da expressão do CR1. Após o tempo médio de 24 dias de tratamento, as expressões do CR1/E e do CR1/N aumentaram significativamente, mostrando uma tendência à recuperação após o tratamento. A expressão do CR1 dos monócitos diminuiu e, a dos linfócitos mostrou uma tendência à normalização em relação aos controles. Antes do tratamento,em 66% dos pacientes, os níveis de ICC estavam aproximadamente nove vezes mais elevados e sem correlação com os valores de CR1/E. Após o tratamento, foi observada uma redução nos níveis de ICC nesses pacientes, contudo ainda mantendo-se acima do normal.Os resultados sugerem que as diferenças na expressão do número de CR1 nas populações celulares investigadas podem ser consideradas um fenômeno adquirido com a patologia, contudo sem correlação com os níveis de imunocomplexos circulantes.
Palavras-chave:Leishmaniose Visceral,eritrócitos, leucócitos, receptor para complemento tipo 1.
ABSTRACT
Visceral leishmaniasis or Kala-azar is a chronic systemic disease, endemic in northeastern Brazil, caused by the parasite Leishmania infantum chagasi and transmitted by the bite of the
sand fly Lutzomyia longipalpis. Laboratory findings of pancytopenia are associated with polyclonal activation of B cells, with high levels of circulating immune complexes (CIC). The receptors for complement type 1 (CR1/CD35) in erythrocytes (CR1/E) and in neutrophils (CR1/N) have the function of CIC clearance. The expression of CR1 is modulated during diseases and tends to normalize after a period of remission. Reducing the CR1/E was observed in autoimmune diseases and chronic infectious diseases, being correlated with increased levels of CIC and the severity of symptoms. It has also been observed a reduction in the CR1/N in autoimmune diseases. This study aimed to investigate in patients with Kala-azar, before and after treatment, the expression of CR1 on erythrocytes and leukocytes by flow cytometry and measuring circulating immune complexesby enzyme immunoassay. At the moment of diagnosis, patients compared with the healthy control group showed a reduction in the expression of CR1/E, as well as the frequency of erythrocytesCD35+. There was also a reduction in the expression of CR1/N without reducing the frequency of neutrophilsCD35+, while in lymphocytes and monocytes there was an increase in CR1 expression. After 24 days of treatment, the expression of CR1/E and CR1/N increased significantly, showing a tendency to recover after treatment. CR1expression in monocyte decreased and CR1expression in lymphocyte showed a tendency to normalization. Before treatment, 66% of patients, CIC levels were approximately nine times higher and no correlation with the expression of CR1/E. After treatment, a reduction in CICwas observedbut the levels yet still remaining above the normal. The results suggest that differences in expression of the CR1 in erythrocytes and leucocytesmay be considered a phenomenon acquired with pathology, but no correlation with the levels of circulating immune complexes.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 –Situação de endemicidade da Leishmaniose Visceral pelo mundo, 2012...22
Figura 2 –Número de casos de Leishmaniose Visceral no Brasil, em 2012 e de incidência no Ceará, em 2013...22
Figura3 –Flebotomíneo transmissor da Leishmaniose Visceral (Lutzomyia longipalpis)...24
Figura 4 –Formas amastigotas e promastigotas do parasita Leishmania infantum chagasi...25
Figura 5 –Ciclo de vida da Leishmania sp...26
Figura 6 –Modelo de infecção experimental pela Leishmania no sangue humano...29
Figura 7 –Regulação da infecção da Leishmania pelas células dendríticas e macrófagos ...31
Figura 8 –Esquema simplificado da ativação das três vias do Sistema Complemento...33
Figura 9 –Representação esquemática do CR1...36
Figura 10 –Esquema representativo das funções do receptor para complemento tipo 1 (CR1) ...39
Figura 11 –Citograma e histogramas representativos da expressão do CR1/CD35 noseritrócitos ...51
Figura 12 –Gráficos de pontos representativos da expressão do CR1/CD35 nos eritrócitos ...53
Figura 13 –Histogramas e gráficos de pontos representativos da expressão de CD59 nos eritrócitos ...61
Figura 14 –Citogramamostrando a distribuição das populações leucocitárias por tamanho e granulosidade (FSC x SSC) ...64
Figura 15 –Histogramas e gráficos de pontos representativos da expressão do CR1/CD35 nos linfócitos ...66
Figura 16 –Histogramas e gráficos de pontos representativos da expressão doCR1/CD35 nos monócitos ...70
Figura 17 –Histogramas e gráficos de pontos representativos da expressão do CR1/CD35 nos neutrófilos ...74
13
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1 –Distribuição das médias e desvios-padrões da mediana de intensidade de fluorescência (MIF) do CR1/CD35 nos eritrócitos dos pacientes, antes e depois do tratamento, e
do grupo de controle saudáveis
...52
Gráfico 2 –Distribuição das médias e desvios-padrões da frequência do CR1/CD35 nos eritrócitos dos pacientes, antes e depois do tratamento, e do grupo de controles saudáveis...54
Gráfico 3 –Distribuição das médias e desvios-padrões das dosagens séricas de imunocomplexos
circulantes nos pacientes antes e depois do tratamento
...56
Gráfico 4 –Correlações entre a concentração de imunocomplexos antes e depois do tratamento e a mediana de intensidade de fluorescência do CR1/CD35 nos eritrócitos ...57
Gráfico 5 –Correlações entre a concentração de imunocomplexos antes e depois do tratamento e a mediana de intensidade de fluorescência do CR1/CD35 nos neutrófilos ...58
Gráfico 6 –Distribuição das médias e desvios-padrões da mediana de intensidade de fluorescência do CD59 nos eritrócitos dos pacientes, antes e depois do tratamento, e do grupo de controle
saudáveis...62
Gráfico 7 –Distribuição das médias e desvios-padrões da frequência de eritrócitos positivos para o CD59 dos pacientes, antes e depois do tratamento, e do grupo de controles saudáveis...63
Gráfico 8 –Distribuição das médias e desvios-padrões da mediana de intensidade de fluorescência (MIF) do CR1/CD35 nos linfócitos de pacientes, antes e depois do tratamento, e
do grupo de controles saudáveis
...67
Gráfico 9 –Distribuição das médias e desvios-padrões da frequência do CR1/CD35 nos linfócitosdos pacientes, antes e depois do tratamento, e do grupo de controles
14
Gráfico 10 – Distribuição das médias e desvios-padrões da mediana de intensidade de fluorescência do CR1/CD35 nos monócitos de pacientes, antes e depois do tratamento, e do grupo de controles saudáveis ...71
Gráfico 11 –Distribuição das médias e desvios-padrões da frequência de monócitos positivos para o CR1/CD35 entre os pacientes antes e depois do tratamentoeo grupo decontroles saudáveis...72
Gráfico 12 –Distribuição das médias e desvios-padrões da mediana de intensidade de fluorescência do CR1/CD35 nos neutrófilos entre pacientes antes e depois do tratamento com o grupo decontroles saudáveis...75
Gráfico 13 –Distribuição das médias e desvios-padrões da frequência de neutrófilospositivos para o CR1/CD35 entre os pacientes antes e depois do tratamento e o grupo de controles saudáveis...76
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Receptores para proteínas do sistema complemento ... 34 Tabela 2 – Distribuição das frequências dos principais sinais e sintomas no momento
da admissão dos pacientes ... 49 Tabela 3 – Perfil hematológico dos pacientes antes e após o tratamento... 50 Tabela 4 – Distribuição das médias e desvios padrões dos pacientes quanto às dosagens
de imunocomplexos circulantes, à mediana de intensidade de fluorescência do CR1/E, à frequência do CR1/E e ao número de eritrócitos, antes e depois do tratamento ... 60
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS CR Receptor para Complemento
FITC Fluorescein Isothiocyanate (Isotiocianato de fluoresceína) FSC Foward scatter (dispersão frontal)
HIV Human Immunodeficiency Virus (Vírus da Imunodeficiência Adquirida) ICC Imunocomplexos circulantes
IFN- γ Interferon gama IL Interleucina
LHR Long Homologous Repeats
MIF Mediana de intensidade de fluorescência NK Natural Killer
OMS Organização Mundial de Saúde PE Phycoerythrin (Ficoeritrina) PMN Polimorfonucleares
SESA Secretaria de Saúde
SIDA Síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS) SSC Side scatter (dispersão lateral)
T reg Célula T regulatória
TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido Th T helper(auxiliar)
TNF Tumor Necrosis Factor (Fator de Necrose Tumoral)
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO...19
2 REVISÃO DE LITERATURA...20
2.1As Leishmanioses...20
2.1.1A Leishmaniose visceral ...20
2.1.2 Epidemiologia...21
2.1.3 Vetor e Agente Etiológico...24
2.1.4 Sintomas, Diagnóstico e Tratamento ...26
2.1.5 Resposta Imunológica na Leishmaniose Visceral ...27
3.1 Os receptores de membrana para o componente C3 do Sistema Complemento...33
4.1 O receptor para complemento tipo 1 (CR1)...35
4.1.1 Distribuição, Estrutura e Polimorfismo...35
4.1.2 Funções do receptor para complemento tipo 1...37
4.1.2.1 Regulação da cascata do Complemento ...37
4.1.2.2 Eliminação de Imunocomplexos ...37
4.1.2.3 Receptor para Fagocitose ...38
4.1.2.4 Regulação das respostas das células B e T ...38
4.1.3 O receptor para complemento tipo 1 em doenças humanas...39
5 HIPÓTESES...42 6 OBJETIVO GERAL...43 6.1 Objetivos Específicos...43 7 METODOLOGIA...44 7.1 Descrição do estudo...44 7.1.1 Tipo de estudo...44 7.1.2 População ...44 7.1.2.1 Grupo de estudo ...44
7.1.2.2 Grupo controle ...44
7.1.3 Critérios de Inclusão...44
7.1.4 Critérios de Exclusão...44
7.1.5 Aspectos Éticos...45
7.1.6 Material Clínico e coleta de dados...45
7.1.7 Coleta de amostras...45
7.2 Delineamento Experimental...46
7.2.1 Processamento das amostras...46
7.2.1.1 Processamento dos eritrócitos...46
7.2.1.2 Processamento dos leucócitos ...46
7.3 Quantificação do número de CR1 nas populações celulares por citometria de fluxo... ...47
7.3.1 Ensaio de citometria de fluxo ...47
7.4 Dosagens Plasmáticas...47
7.4.1 Dosagem de imunocomplexos circulantes por ensaio imunoenzimático...47
7.5 Análises Estatísticas ...48
8 RESULTADOS...49
8.1. Pacientes, Controles, Evolução Clínica ...49
8.2 Expressão e distribuição da frequência do CR1/CD35 na membrana dos eritrócitos...50
8.3 Dosagem de Imunocomplexos Circulantes...55
8.4Características clínicas dos pacientes pós-tratamento e análise da dosagem de imunocomplexos relacionada à expressão do CR1 dos eritrócitos e ao número de eritrócitos no sangue circulante...59
8.5Expressão e distribuição da frequência do CD59 na membrana dos eritrócitos...60
8.6Expressão e distribuição da frequência do CR1/CD35 na membrana dos leucócitos...64 8.6.1. Linfócitos ...65 8.6.2. Monócitos...69 8.6.3.Polimorfonucleares – Neutrófilos...73 9 DISCUSSÃO ...78 10 CONCLUSÃO ... 88 REFERÊNCIAS ...89
1 INTRODUÇÃO
A Leishmaniosevisceral (LV) ou Calazar é uma zoonose que pode acometer o homem quando ele entra no ciclo de transmissão do parasita causador, a Leishmaniainfantum chagasi. É uma doença tropical, negligenciada e que está amplamente distribuída pelo mundo. Apresenta alta incidência e pode ser fatal, principalmente em crianças desnutridas e em indivíduos não tratados. OCalazar apresenta uma expansão no seu comportamento epidemiológico, onde há uma tendência crescente por conta da urbanização e das condições higiênico- sanitárias- nutricionais inadequadas.
A Leishmania infantum chagasi é um parasita intracelular obrigatório que possui como alvo as células do sistema monocítico fagocitário, principalmente os macrófagos do baço, da medula óssea e do fígado. Após a picada do flebotomíneo infectado (Lutzomyia
longipalpis) ocorre a transmissão das promastigotas. Os neutrófilos recrutados são as
primeiras células a interagirem com as promastigotas e a se infectarem. Ocorre, então, a ligação de anticorpos anti-Leishmania IgM na superfície do parasita e a ativação da via clássica do complemento com deposição do componente protéico C3b. Esses eventos ativam o mecanismo de imuno-adesão entre as promastigotas opsonizadas e o receptor para complemento tipo 1 (CR1) presente na membrana dos eritrócitos. Os eritrócitos, por sua vez, irão transferir o parasita para granulócitos, monócitos e macrófagos.
O desenvolvimento da doença pode depender de diversos fatores, como as características genéticas do hospedeiro, a virulência da espécie infectante, o meio ambiente, os padrões imunológicos, nutricionais e clínicos dos pacientes. Pacientes com susceptibilidade à Leishmaniose visceral apresentam uma tendência à resposta imune celular do tipo Th2, com elevados níveis das citocinas IL-4 e IL-10, que levam à ativação policlonal das células B, à hipergamaglobulinemia e à formação de elevados títulos de imunocomplexos circulantes (ICC).
O CR1 medeia a adesão dos ICC associados ao complemento com os eritrócitos e os leucócitos.Diversas doenças infecciosas e autoimunes têm sido correlacionadas com a redução da expressão do CR1 nos eritrócitos, ao polimorfismo genético da molécula, ao aumento dos ICC e à gravidade da doença, mostrando ser uma perda adquirida por diversos mecanismos ainda não elucidados.Foi investigada a expressão dessa molécula nos eritrócitos e leucócitos de pacientes com Calazar, antes e após o tratamento, bem como correlacionamos os resultados com os níveis de imunocomplexos encontrados nesses dois momentos.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 AS LEISHMANIOSES
A leishmaniose é uma das doenças tropicais mais negligenciadas do mundo. Atinge, em sua maioria, a população mais pobre nos países em desenvolvimento (WHO, 2010). Segundo o Programa Regional dasLeishmanioses da Organização Panamericana da Saúde, daOrganização Mundial da Saúde (OPAS-OMS),mais de 12 milhões de pessoas estão infectadas com algum tipo de leishmaniose e 350 milhões estão em áreas de risco (WHO, 2014).
As leishmanioses apresentam-se como um espectro de quatro manifestações clínicas, de lesões cutâneas à leishmaniose visceral sistêmica, onde essa distinção estáassociada a diferentes graus de disseminaçãodo parasita: cutânea (LC), mucocutânea (LMC), visceral (LV)e leishmaniose cutânea pós- calazar (PKDL) (CHAPPUISet al, 2007; McCALLet al, 2013).
A respeito do papel da Leishmania na infecção e a diversidade das manifestações é conhecido que cada espécie possui seu próprio tropismo e formas clínicas específicas. Diversos estudos têm relacionado o polimorfismo genético da Leishmania ao tropismo observado no parasita ou à evasão ao sistema imune. Tais genes podem codificar proteínas envolvidas na interação patógeno-hospedeiro e na sobrevivência do patógeno nos macrófagos. Esses genes podem ser também bons candidatos para a análise funcional do seu papel no estabelecimento da infecção ou nas manifestações específicas da doença.A predisposição genética, os estados nutricionais e imunofisiológicos do hospedeiro também são fatores importantes para o desenvolvimento da doença e suas diversas manifestações clínicas. Como a Leishmania causa a doença e o porquê dessas manifestações não está totalmente claro ainda (BAÑUS et al, 2011).
2.1.1. A Leishmaniose visceral
Dependendo das características da transmissão,podem existirtrês formas de Leishmaniose visceral: a forma zoonótica, com os cães como reservatório principal; a forma antroponótica, com a transmissão homem-homem, através do inseto vetor, sem reservatório
animal; e a antropozoonótica, quando o homem entra no complexo ciclo de transmissão entre o vetor e o cão (VAN GRIENSVEN e DIRO, 2012).
O primeiro registro de Leishmaniose visceral no Brasil foi em 1913, quando Migone, no Paraguai, descreveu o caso de um paciente oriundo de Mato Grosso. Outros 41 casos positivos para Leishmania foram identificados no mesmo período a partir de lâminas de viscerotomias de pacientes falecidos em outras regiões do Brasil (BRASIL, 2014).
A doença era considerada predominantemente rural. No entanto, devido aos intensos processos de urbanização e desmatamento, atinge, hoje, os médios e grandes centros, tornando-se um grave problema de saúde pública, levando a uma considerável morbidade e mortalidade (CAVALCANTE, 2014). Percebe-se que as regiões mais pobres e com poucas condições higiênico-sanitárias são as mais propícias para a ocorrência da doença(BRASIL, 2014).
2.1.2 Epidemiologia
O Brasil é um dos seis países que concentram 90% dos casos encontrados de Leishmaniose visceral, onde fazem parte também países como a Etiópia, Índia, Bangladesh, Sudão do Sul e Sudão (Figura 1). Anualmente, são diagnosticados em média 4 mil casos, com índice de mortalidade de 7% (WHO, 2014).Segundo a Organização Mundial de Saúde, 310 milhões de pessoas no mundo estão em risco de infecção pela doença, com uma estimativa de 200 a 400 mil novos casos por ano (WHO, 2015).
No Brasil, em 2013, foram registrados casos autóctones em 21 estados, sendo que há uma maior prevalência de casos na região nordeste e um menor número de casos na região sul. Nesse ano, a taxa de letalidade foi de 7,1%. No Ceará, os primeiros casos datam da década de 30 e, após a década de 1980, houve uma continuidade dos casos relatados. Em 2014, foram registrados 204 casos confirmados de Calazar, em 62 munícipios, com 13 óbitos (Figura 2). Os municípios que registraram o maior número de casos foram Fortaleza, Sobral, Caucaia, Maracanaú, Uruoca, Maranguape e Eusébio (SESA-CE, 2014).
Figura 1 - Situação de endemicidade da Leishmaniose Visceral pelo mundo, 2012.
Fonte:http://gamapserver.who.int/mapLibrary/Files/Maps/Leishmaniasis_VL_2013.png?ua=1
Figura 2–Número de casos de Leishmaniose Visceral no Brasil, em 2012e de incidência no Ceará, em 2013.
Fonte: SESA. Atualizado em 31/07/2014
A doença é mais frequente em crianças, fato relacionado ao estado nutricional, que, se insuficiente, pode prejudicar a imunidade inata e as funções das células T (HUGHES e KELLY, 2006);em adultos jovens do sexo masculino, uma vez que mudanças hormonais após a puberdade predispõe a uma susceptibilidade maior à Leishmaniose visceral (NYLÉN e SACKS, 2007);em idosos e em pacientes com coinfecções, como o HIV (WHO, 2015; BRASIL, 2014).
Esforços têm sido feitos com o objetivo de controlar os casos de leishmaniose pelo mundo. As medidas ainda se limitam à identificação e eliminação dos reservatórios infectados, principalmente o cão; a aplicação de inseticidas para o inseto vetor; o diagnóstico e o tratamento dos pacientes. Essas são estratégias ainda pouco eficientes e novos caminhos devem ser tomados a fim de diminuir as mortes e os casos pelo mundo.
Uma compreensão dos fatores que desencadeiam a Leishmaniose visceralpoderá ajudar a identificar os melhores alvos para novos medicamentos, imunomoduladores, marcadores epidemiológicos para virulência e potenciais vacinas. Essas estratégias juntas ajudarão a eliminar a doença e isso terá um impacto significante nas regiões mais pobres dos países endêmicos (McCALL,2013).
2.1.3 Vetor e Agente Etiológico
O vetor primário da Leishmaniose visceral é a fêmea do flebotomíneo Lutzomyia
longipalpis(Figura 3),que transmite o agente etiológico, a Leishmania infantum chagasi, ao
fazer o repasto sanguíneo. O flebotomíneo adulto, que mede de 2 a 4 mm, possui hábitos noturnos e o corpo revestido por pelos claros. Há indícios de que ocorre uma maior transmissão da doença após um período de chuvas, devido ao aumento populacional de flebotomíneos (BRASIL, 2014).Cães domésticos, gambás, preguiças e raposas estão na lista dos demais reservatórios mamíferos (PIGOTT et al, 2014). Transmissões raras já foram relatadas, como uso de drogas intravenosas, transfusão sanguínea, transplante de órgãos e acidentes laboratoriais (revisto em GRIENSVEN, 2012). A possibilidade de transmissão transplacentária ainda é um pouco controversa (BRASIL, 2009).
O flebotomíneo lacera os vasos sanguíneos durante a sua alimentação, introduzindo os parasitas intradermicamente (BATES, 2007).A salivado vetor também tem um importante papel na transmissão daLeishmania, uma vez que ela é ricaem componentes vasodilatadores, que aumentam o fluxo sanguíneo no local da picada e imunossupressores, que de alguma forma, modulam o desenvolvimento da doença (WARBURG et al, 1994).
Figura 3 – Flebotomíneo transmissor da Leishmaniose visceral (Lutzomyia longipalpis).
Fonte: http://en.wikipedia.org/wiki/Lutzomyia
A Leishmania possui um ciclo de vida dimórfico, ou seja, são possíveis duas morfologias diferentes de acordo com o hospedeiro: a forma infectante promastigota (forma alongada, delgada, com um flagelo livre), encontrada no vetor; e a forma amastigota (forma
oval, sem flagelos externos), que se desenvolve no hospedeiro mamífero(Figura 4) (MURRAY, 2005).
Figura 4 - Formas amastigotas e promastigotas do parasita Leishmania infantum chagasi.
A) B)
Fonte: Universidade Federal de Minas Gerais
Na figura A: esfregaço de medula óssea corado por Giemsa evidenciando macrófagos parasitados por formas amastigotas de Leishmania (setas vermelhas). Em B, cultura de medula óssea com promastigotas livres (seta vermelha).
A infecção do vetor ocorre quando as fêmeas se alimentam de sangue de mamíferos infectados. As formas amastigotas encontram-se dentro dos macrófagos e, no trato digestivo anterior do inseto, são liberadas após o rompimento dessas células. As amastigotas reproduzem-se por divisão binária, transformando-se em promastigotas. Estas formas permanecem na faringe do vetor, onde se diferenciam em promastigotas metacíclicas, as formas infectantes.
A infecção no homem inicia-se quando ocorre a inoculação das promastigotas através da picada do flebotomíneo ao fazer um novo repasto sanguíneo, juntamente com a saliva do inseto. As promastigotas são fagocitadas pelos macrófagos, onde se diferenciam em amastigotas e se multiplicam dentro do fagolisossomo. Amudança de promastigota para amastigota é uma estratégia de evasão à ação do sistema imune do hospedeiro.No interior do vacúolo parasitóforo, as formas amastigotas multiplicam-se intensamente até o rompimento dos macrófagos, ocorrendo, então a disseminação hematogênica e a infecção de outras células
fagocitárias em outros tecidos, como o fígado, o baço, os linfonodos e a medula óssea(MURRAY, 2010; VAN GRIESVEN 2012; BRASIL, 2014) (Figura 5).
Figura 5 - Ciclo de vida da Leishmania sp.
Fonte: Adaptado de Kaye (2007).
2.1.4. Sintomas, Diagnóstico e Tratamento
O período de incubação da Leishmaniose visceral pode variar de 2 a 6 meses. Durante esta fase, a doença pode tornar-se assintomática, com possível cura espontânea, ou apresentar uma sintomatologia discreta que aos poucos pode evoluir quanto à intensidade e à gravidade.
A evolução da doença está relacionadaao tempo de busca por tratamento, ocasionando o aparecimento de sinais e sintomas como a febre intermitente e/ou irregular, perdas de peso e
de apetite, anemia, adinamia, hipergamaglobulinemia, pancitopenia, palidez cutâneo – mucosa, hepatoesplenomegalia com distensão abdominal, alterações ou não nas enzimas hepáticas, diarreia devido à parasitização e ulceração dos intestinos, tosse não produtiva, hemorragias relacionadas à trombocitopenia (epistaxe, petéquias, gengivorragia), edema de membros inferiores, infecções bacterianas, complicações renais, sepse e morte (BRASIL, 2014; KUMAR et al, 2012).
O método padrão-ouro para o diagnóstico da Leishmaniose visceral é a demonstração do parasita (forma amastigota) em aspirado de medula ou do baço através de exames parasitológicos direto (esfregaços) ou indireto (cultura). O diagnóstico pode ser também imunológico através da imunofluorescência indireta (RIFI), do ensaio imunoenzimático (ELISA), do imunoblotting; e do molecular, como a reação em cadeia de polimerase. Nos últimos anos, tornou-se popular o teste imunocromatográfico com o antígeno recombinante K39 (rK39) para a detecção de anticorpos IgG anti-K39. É um teste mais barato, mais rápido, e de fácil execução e disponibilidade (SRIVASTANA et al, 2011; KAYE et al, 2011; GRIENSVEN et al, 2012; BRASIL, 2014). Independente do método utilizado, sempre se faz necessário avaliar as questões epidemiológicas e clínicas do paciente para que o correto diagnóstico seja realizado.
A maioria dos casos de Calazar são tratáveis. No tratamento devem ser administrados drogas leishmanicidas, além deutilizar estratégias para combater qualquer infecção bacteriana, a anemia, a hipovolemia e a desnutrição.As drogas mais utilizadas são os antimoniais pentavalentes, sendo as disponíveis no Brasil o Glucantime®, a Anfotericina B desoxicolato e a Anfotericina B lipossomal, sendo esta última considerada a droga mais potente e com menor toxicidade (CHAPPUIS et al, 2007; BRASIL, 2014). A escolha de qual droga será administrada em um paciente está relacionada com a gravidade da doença, a idade, a presença de gravidez, de comorbidadese o perfil de toxicidade da droga (BRASIL, 2011).
2.1.5 Resposta Imunológica na Leishmaniose visceral
A maioria das pessoas que são infectadas pela Leishmania não desenvolve a doença e as razões que influenciam a susceptibilidade giram em torno de fatores genéticos, tanto do hospedeiro quanto do parasita, e ambientais. Muitos modelos experimentais que já foram utilizados para avaliar a resposta imune na Leishmaniose visceralmostram que há uma elevação dos níveis de citocinas dosadas (ANSARI et al, 2006; NYLÉN et al, 2007), o que
indica que o sistema imune responde efetivamente à infecção. A resposta imunológica do hospedeiro para combater a infecção pela Leishmania se mostra bastante complexa, com o envolvimento de diversas células e produção de citocinas que direcionam à resistência ou à susceptibilidade ao parasita.
Para compreender o processo de infecção da Leishmania, é necessário caracterizar os eventos pós inoculação até a entrada final nos macrófagos. Essas etapas foram caracterizadas em diversos estudos ex vivo, com sangue humano, e in vivo, através de modelos animais.
A membrana da forma metacíclica da promastigota é constituída de um glicocálix importante para a sua sobrevivência e para a patogenia, incluindo o lipofosfoglicano, a metaloproteinase gp63, o proteofosfoglicano e lipídios glicofosfatidilinositol que agem como proteases no hospedeiro (FRANCO, 2012).
O mecanismo pelo qual as promastigotas são opsonizadas ainda é um pouco controverso, pois alguns dados indicam que a ativação do sistema complemento se dá pela Via Clássica, mas outros ensaios indicam que seja anticorpo-independente (DOMÍNGUEZ, 2002). A ativação do complemento seria mediada por proteases das promastigotas, LPG e gp63, que levarim à geração das opsoninas C3b, convertidas em seguida em iC3b, e que se depositariam na superfície do parasita. Posteriormente, a C5 convertase seria gerada, para dar início à formação do complexo de ataque à membrana do parasita (revisto em DOMÍNGUEZ
et al, 1999; FRANCO, 2012). A presença dos componentes quimiotáticos C3a e C5a
promoveria uma inflamação, atraindo neutrófilos e monócitos/macrófagos para o local da infecção (GONÇALVES et al, 2011).
Segundo Moreno, anticorpos IgM anti-Leishmaniaopsonizam a promastigota imediatamente após a interação com o sangue do hospedeiro, ativando a via clássica (MORENO et al, 2010).Quando o complemento é ativado, a destruição massiva dos parasitas extracelulares aparentemente ocorre nos primeiros estágios da infecção. Entretanto, esses mesmos componentes atuam na opsonização do parasita e na sua interaçãocom os macrófagos,contribuindo fortemente para a evasão e a progressão do processo infeccioso (GOTO et al, 2013).
O mecanismo de infecção desse parasita foi determinado através de análises de um modelo de infecção ex vivo pela Leishmania em sangue humano, antes da fagocitose propriamente dita pelos macrófagos. As promastigotas opsonizadas pelo C3bligam-se ao receptor para complemento tipo 1 (CR1) dos eritrócitos por um mecanismo denominado imuno-adesão(DOMÍNGUEZ et al, 1999).
Para a Leishmania, sua ligação à IgM é um pré-requisito para a opsonização. A promastigota ligada ao C3b é o complexo-ligante envolvido na adesãoaos eritrócitos que, consequentemente,facilita a transferência do parasita para granulócitos, monócitos e linfócitos B, causando a infecção primária dessas células.Além das promastigotas, as formas amastigotas de Leishmania opsonizadas também se ligam aos eritrócitos, sugerindo que a imuno-adesão facilita a disseminação do parasita no hospedeiro. A infecção pode ser também disseminada quando granulócitos parasitados tornam-se apoptóticos, liberando as promastigotas que serão fagocitadas por outros macrófagos recrutados (DOMÍNGUEZ et al, 1999; MORENO et al, 2010).
Segundo esse modeloexperimental de infecção, o CR1 é considerado um fator primordial na invasão do parasita, bem como ficou provado que, sob condições fisiológicas, na infecção pela Leishmania, as promastigotas ativam o sistema complemento apenas através da via Clássica(FIGURA 6).
Figura 6 – Modelo de infecção experimental pela Leishmania no sangue humano.
A ligação das promastigotas opsonizadas permite que as células B apresentem os antígenos para monócitos e macrófagos via receptor para complemento tipo 2 (CR2) (LINDORFERet al, 2003). As promastigotas são rapidamente fagocitadas pelos macrófagos e os neutrófilos. Uma vez que os neutrófilos têm um ciclo de vida curto, os macrófagos recrutados fagocitam os parasitas livres e neutrófilos infetados/apoptóticos.
Os macrófagos tornam-se as células definitivas para a replicação do parasita, bem como as células responsáveis pela sua destruição. A promastigota necessita do receptor para complemento tipo 1(CR1)para mediar a sua ligação aos macrófagos (DA SILVA et al, 1989) e, também, do receptor tipo 3 (CR3),para a fagocitose (KANE et al, 2001), além de contarem com a colaboraçãodos lipofofoglicanos da sua superfície e a gp63 (YAO et al, 2003).
A destruição dos parasitas fagocitados pelos macrófagos depende de dois mecanismos de ativação dessas células: as ativações clássica e alternativa. A primeira é mediada pelos produtos das células Th1 e natural killer (NK), como o interferon-gama (IFN-γ). O IFN-γ estimula os macrófagos a produzirem iNOS, uma enzima que catalisa a L-arginina para gerar óxido nítrico (NO), tóxico para a Leishmania (LIEW et al, 1990).
A segunda via é induzida pelos produtos das células Th2, a IL-4 e a IL-13. A IL-4 induz a biossíntese de poliamina, que favorece a sobrevivência do parasita nos macrófagos (GORDON, 2003; KROPF et al, 2005). Dessa forma, como resultado, as defesas dos macrófagos, como o dano oxidativo, a apresentação de antígenos, a ativação imune e a apoptose são comprometidas(PODINOVSKAIAet al, 2015). Células T regulatórias (Treg) e macrófagos infectados também produzem citocinas regulatórias, como a IL-10 e o TGF-β, que desativam os macrófagos, levando à sobrevivência do parasita (revisto por LIUet al, 2012) (Figura 7).
Figura 7 – Regulação da infecção da Leishmania pelas células dendríticas e macrófagos.
Fonte: Liu (2012- adaptada).
No complexo mecanismo de defesa contra a Leishmania está bem definido que os macrófagos e as células dendríticas desempenham o papel de iniciação, desenvolvimento e manutenção da imunidade protetora. A produção de IL-12 pelas células dendríticas inicia a polarização das células Th0 no subtipo Th1e consequente produção de IL-12. Essa citocina gera uma resposta protetora pela indução das atividades das células NK, células que conectam as respostas imunes inata e adaptativa através da produção de IFN-γ e TNF-α (LIESEet al, 2007; VON STEBULT et al, 1998).
Macrófagos ativados na presença de imunocomplexos e/ou infectados por Leishmania regulam positivamente a secreção de IL-10 (SUTTERWALA, 1998), não secretam IL-12 (SUTTERWALA, 1997), e, consequentemente, tornam-se incapazes de estimular a resposta
antígeno-específica para as células CD4+ Th1 (KIMAet al, 1996). O mecanismo exato que direcionaria a diferenciação de células T CD4+virgemem Th1 (resistência) ou Th2 (susceptibilidade) não está bastante claro, mas pode estar direcionada às citocinas transcritas nas primeiras horas após a infecção (SOKOL et al, 2008). Os resultados clínicos desfavoráveis em um paciente não estão relacionados a uma resposta Th2 dominante ou a um defeito na resposta Th1, mas que algum mecanismo imunossupressor ou estratégias de evasão do sistema imune utilizadas pelo parasita contribuem para a patogênese (NYLÉN et al, 2007).
Pacientes com Leishmaniose visceral ativa possuem elevados níveis de IL-10 no soro, bem como uma aprimorada expressão de mRNA para essa citocina. A IL-10 pode ser secretada por diferentes células durante a infecção pela Leishmania, como as células Treg, células B, células Th1, células T CD8+, NK, macrófagos e neutrófilos. Os altos níveis de IL-10 podem diminuir os danos tissulares, ao mesmo tempoque promovem a replicação, a disseminação do parasita e a progressão da doença (ANDREANI et al, 2015).
As principais atividades da IL-10 que justificam seu papel de promover a doença são sua capacidade de afetar a ativação da via clássica dos macrófagos, por torná-los insensíveis aos sinais do IFN-γ, inibiçãoda explosão respiratória e a regulação negativa de citocinas inflamatórias, como o TNF-α e o NO, essenciais para a morte do parasita (revisto em NYLÉN
et al, 2007).
A IL-10 também pode suprimir a apresentação de antígenos das células dendríticas e dos macrófagos, diminuir a expressão de moléculas MHC II e co-estimulatórias e, principalmente, inibir a produção de IL-12, que inibirá a geração e/ou a manutenção das células Th1 antígeno-específicas.
Ativação policlonal das células B, com consequente hipergamaglobulinemia de IgM e IgG, e altos níveis de imunocomplexos circulantes (ICC) que contêm antígenos de
Leishmania ligados a auto-anticorpossão características marcantes da Leishmaniose visceral e
podem causar dano tecidual (revisto em SINGH et al, 2014; FALEIRO et al, 2014). Esses ICC podem estimular os macrófagos e monócitos a produzirem mais IL-10 e TNF-α, uma regulação que gerará mais imunocomplexos e mais IL-10 (ELSHAFIEet al, 2007; NYLÉN et
3.1 Os receptores de membrana para o componente C3 do Sistema Complemento
O Sistema Complemento representa um grupo de mais de 30 proteínas plasmáticas e de receptores de membrana que atuam, primordialmente, na resposta imune inespecífica (revisto por DUNKELBERGER, 2010). Essas proteínas são organizadas em cascatas proteolíticas e ativadas com o reconhecimento de algum patógeno. A partir deste evento, surgem as funções inatas desse sistema, que são a geração de componentes inflamatórios (anafilatoxinas), a inflamação, a opsonização, a formação do complexo de ataque à membrana (MAC) para a destruição do patógeno e o desenvolvimento da imunidade adaptativa (revisto por DUNKELBERGER et al, 2010; CARROL, 2008).
O C3b é a molécula mais importante do Sistema Complemento, uma vez que interliga as três vias de ativação desse sistema: Clássica, Alternativa e das Lectinas. Essas 3 vias formam a sua respectiva C3 convertase, que quebra o C3 em C3a (fator quimiotático) e C3b (opsonina), e é o momento em que todas as vias de ativação do complemento convergem (revisto em GOTO et al, 2013). Quando o C3 é clivado em C3b, a ligação interna tioéster fica exposta, permitindo a ligação covalente estável do C3b ao grupo hidroxil de carboidratos e proteínas próximos. Essa atividade está na base de todo o Sistema Complemento e que gera os eventos subsequentes necessários para a destruição do patógeno e ou a ativação da imunidade adaptativa (VOLANAKIS et al, 1998) (Figura 8).
Fonte: Abbas,et al, 2008.
O complemento é considerado o fator chave responsável pela coordenação dos eventos durante a resposta imune, facilitando a identificação e a localização do antígeno. Através das interaçõesdos produtos ativados pelos componentes do complemento e seus respectivos receptores, ocorre o direcionamento dos leucócitos para o local da inflamação pela liberação de quimiocinas; promoção da fagocitose; eliminação de imunocomplexos da circulação;a indução da resposta primária e ativação das células B aos antígenos; proliferação; apoptose e memória imunológica, sendo, então uma ponte entre a imunidade inata e adaptativa (COLE et
al, 2003).
O grupo de receptores do Sistema Complemento pode ser dividido em três categorias: os reconhecedores das anafilatoxinas (C3a e C5a); os que se ligam ao fragmento C3 ativado (C3b) e seus produtos de degradação (iC3b, C3dg) e os receptores para o componente C1q (revisto por LESLIE, 2001). Quatro receptores para complemento já foram descritos (Tabela 1).
Tabela 1 – Receptores para proteínas do sistema complemento.
RECEPTOR LIGANTE DISTRIBUIÇÃO FUNÇÕES
CR1 C3b, C4b, iC3b Eritrócitos, células fagocíticas, células B,alguns linfócitos T
Promoção da fagocitose, eliminaçãode ICC, co-fator para o Fator I, regulação da ativação do SC.
CR2 C3d, iC3b,C3dg Linfócitos B maduros, células dendríticas foliculares
Co-receptor de ativação das células B, regulação da ativação do SC.
CR3/CR4 iC3b Células fagocíticas profissionais Mediar a fagocitose, promover a ativação de células T e aumentar a apresentação de antígenos.
Fonte: revisto por Liu et al, (2009);Leslie (2009).
A cascata do complemento é regulada por proteínas plasmáticas e por receptores de membrana a fim de evitar o ataque autólogo e possíveis danos ao organismo. Essas funções são desempenhadas a nível da ativação das convertases, tanto na montagem e na atividade dessas enzimas quanto na montagem do complexo de ataque à membrana (CAM) (LISZEWSKI et al, 1996). Esses fatores incluem a proteína cofatora de membrana (membrane cofactor protein = MCP ou CD46), o fator acelerador de decaimento (decay
accelerating factor = DAF ou CD55), inibidor da formação do CAM(CD59), fator H e o
receptor para complemento tipo 1 (CR1)(revisto por STOUTE, 2011). CD55, CD59 e o CR1 são encontrados na membrana dos eritrócitos e são responsáveis pelas propriedades reguladoras dessas células (revisto por STOUTE, 2005).
4.1 O receptor para complemento tipo 1 (CR1)
O receptor para complemento tipo 1, também chamado de CD35, é uma glicoproteína de membranamultifuncional,que pertence à família das proteínas reguladoras da atividade do sistema complemento (revisto em LIU et al, 2009). A primeira descrição do CR1 aconteceu em 1973, quando Fearon identificou e caracterizou o primeiro receptor para complemento após dar continuidade aos estudos de 1953, realizados por Nelson, de imuno-adesão, fenômeno que envolvia os eritrócitos e microrganismos (revisto em LINDORFER et al, 2001).
4.1.1 Distribuição, Estrutura e Polimorfismo
O CR1 está expresso na membrana plasmática de uma grande variedade de células, como os eritrócitos, neutrófilos, monócitos, macrófagos, eosinófilos, linfócitos B, algumas subpopulações de linfócitos T, células de Langerhans da pele, podócitos glomerulares e células dendríticas (revisto por KHERA, 2009).
A molécula do CR1 é uma ampla glicoproteína de membrana de 200 kDa, com cadeia simples, uma pequena cauda citoplasmática e codificada na banda q32 do cromossomo 1. A porção extramembranar é composta de 30 short consensun repeats (CCPs), com aproximadamente 60 aminoácidos cada. As primeiras 28 são organizadas baseadas no grau de homologia em quatro repetições homólogas longas (LHRs), LHR-A a LHR-D. Os domínios funcionais do CR1 são distribuídos entre os diferentes LHRs. LHR-A liga-se principalmente ao C4b. LHR-B e LHR-C ligam-se ao C3b/C4b; LHR-D liga-se a lectinas (revisto por BIRMINGHANet al, 2003; KHERA, 2009; LIU, 2009) (Figura 9).
Figura 9– Representação esquemática do CR1.
Fonte: Liu, et al, 2009.
A variante de tamanho mais comum do receptor para complemento tipo 1. Cada caixa representa um curto domínio regulador do complemento (SCR). Caixas de cores iguais representam identidades semelhantes de SCR - 3, 10 e 17 com diferenças de 1 a 3 aminoácidos.
O polimorfismo presente no CR1 tem sido alvo de estudos devido ao fato de alterar a densidade da molécula na membrana dos eritrócitos. O níveis de expressão constitutivas do CR1 nos eritrócitos (CR1/E) variam em cerca de 10 vezes entre indivíduos normais saudáveis devido à sua composição genotípica específica, diferentemente dos leucócitos que não apresentam essa variabilidade (revisto por KHERA et al, 2009).
O número de CR1 nos eritrócitos é determinado por um sistema bialélico autossômico co-dominante,correlacionado com o polimorfismo de restrição Hind III RFLP, que corresponde a um único polimorfismo no íntron 27 do gene do CR1. O fragmento genômico de 7,4 kb está associadoà alta expressão do alelo H (high); e o fragmento de 6,9 kb à baixa expressão do alelo L (low).
O fenótipo homozigoto de alta expressão (HH) expressa aproximadamente 1000 moléculas de CR1 por célula; já o fenótipo homozigoto de baixa expressão com uma média de 100 moléculas por célula; e fenótipo heterozigoto (HL) em torno de 500 moléculas por eritrócito (XIANGet al, 1999).
4.1.2 Funções do receptor para complemento tipo 1
O CR1 possui múltiplas funções que o definem como uma molécula de grande interesse para a pesquisa. Suas funções biológicas variam de acordo com a população celular em que é expresso (FURTADOet al, 2008).
4.1.2.1 Regulação da Cascata do Complemento
Como já dito, o CR1 é uma proteína reguladora do complemento, pois modula a ativação da cascata desse sistema pela ligação reversível ao C3b/C4b e inativação da C3 e C5 convertases das vias Clássica e Alternativa, levando ao decaimento desses componentes.
O CR1 dos leucócitos, ao interagir com microrganismos opsonizados com C3b e C4b, leva à quebra proteolítica dessas opsoninas pelo Fator I em iC3b e iC4b e, em seguida, em C3d e C4d, ligantes para os demais receptores (CR2, CR3 e CR4). Dessa forma, o CR1 age como co-fator para a quebra do Fator I, regulando mais uma vez a via Alternativa (revisto por LIU et al, 2009; KHERA et al, 2009). O resultado global dessas duas atividades do CR1 leva à regulação negativa das três vias de ativação do complemento e a um direcionamento da resposta imune contra o antígeno para as células apropriadas e aos seus respectivos receptores (FURTADOet al, 2008).
O CR1 dos eritrócitos é o principal local de ligação para imunocomplexos circulantes (ICC) opsonizados com C3b/C4b. Imunocomplexos são formados quando os anticorpos encontram os antígenos alvos na circulação, que podem ser auto-antígenos ou derivados de algum agente infeccioso. Esses ICC, presos ao CR1, são transportados para os macrófagos do fígado e do baçopara posterior processamento (CRAIG et al, 2002). A adesão aos ICC é diretamente proporcional ao número de CR1/E e requer uma interação multivalente entre o C3b e o receptor. O número de CR1 e seus alelos podem ambos, portanto, determinar a eficiência da imuno-adesão (MADI et al, 2008). Essa ligação é multivalente, então, para que ela aconteça eficientemente, o CR1 deve estar agrupado na membrana e deve haver uma fixação ótima de C3b no imunocomplexo (revisto em MADIet al, 2008).
Considerando que há um número maior de eritrócitos no sangue do que de leucócitos, é notável que a ligação aos ICC ocorra predominantemente via CR1 dos eritrócitos, entretanto, um número menor de ICC e partículas opsonizadas podem ser reconhecidos pelas moléculas de CR1 presentes nos neutrófilos e monócitos, mesmo essas células possuindo um número muito maior de moléculas de CR1. Acredita-se que a menor quantidade de ligações dos ICC aos PMN em relação aos eritrócitos seja por conta do estado não agrupado do CR1 naquelas células (PACCAUD et al¸1990).
4.1.2.3 Receptor para fagocitose
Monócitos e neutrófilos expressam uma média de 5000 moléculas de CR1 por célula, a maioria intracelularmente, dentro de vesículas secretórias. Após um estímulo para a ativação dessas células com agentes quimiotáticos (como o C5a), essas vesículas se translocam para a membrana plasmática, aumentando de 5 a 10 vezes a expressão de CR1 (SENGELOV et al, 1994; ROTHER et al, 1997). Dessa forma, o CR1 em monócitos, macrófagos e neutrófilos reconhecem ICC e partículas opsonizadas por imunoglobulinas/C3b, mediando a fagocitose através do sinergismo entre a molécula e os receptores Fcγ. As partículas são internalizadas e, em seguida, destruídas nos lisossomos (revisto por KHERA et al, 2009).
4.1.2.4 Regulação das respostas das células B e T
A formação de imunocomplexos é um processo fisiológico e que faz parte dos mecanismos de defesa do sistema imune. Esses ICC são rapidamente removidos da circulação
e, através da interação dos receptores Fcγ dos anticorpos com os receptores para complemento, ocorre o envio de sinais para uma grande variedade de células. É necessário que haja um equilíbrio entre a ativação das células B através do seu receptor (BCR), os receptores Fcγ e os receptores para complemento ligados aos ICC (revisto por ERDEI et al, 2009).
Muito pouco é conhecido sobre o papel exato do CR1 nos linfócitos B, mas alguns estudos apontam que essa molécula possui uma função de controlar a proliferação dessas células, mediando sinais inibitórios (JOZSI et al, 2002). O significado fisiológico dessa função seria a inibição da ativação das células B por estímulos antigênicos fracos evocados por auto-antígenos (revisto por ERDEI et al, 2009).
Apesar de já ter sido comprovada a presença do CR1 nos linfócitos T, sua função ainda não foi estabelecida. No entanto, acredita-se que o CR1 também transmita sinais inibitórios para a proliferação das células T (WAGNERet al, 2005) (Figura 10).
Fonte: KHERA (2009 - adaptado).
(A) Regulação da cascata do complemento e retirada de imunocomplexos pelo CR1 dos eritrócitos; (B) fagocitose envolvendo o CR1 dos monócitos e PMN; (C) regulação das células B envolvendo o CR1 das células B.
4.1.3 O receptor para complemento tipo 1 em doenças humanas
A expressão do CR1 nos eritrócitos e nos leucócitos pode ser influenciada por diversos fatores. Nos eritrócitos, como dito anteriormente, a habilidade do polimorfismo em alterar a densidade do CR1 na membrana pode gerar diferenças entre os fenótipos exibidos por indivíduos saudáveis. No entanto, a expressão do CR1 pode sofrer efeitos do envelhecimento dos eritrócitos (RIPOCHE et al, 1986) e as condições clínicas do indivíduo (revisto em ODERA et al, 2011).
Os níveis de CR1 são modulados nas infecções e sua expressão é dependente de fatores genéticos e adquiridos. Diversos estudos já relatarama redução do número de CR1 nos eritrócitos em doenças infecciosas e autoimunes, como o lúpus eritematoso sistêmico (BIRMINGHAMet al, 2006); tuberculose (SENBAGAVALLIet al, 2008); hanseníase (TAUSKet al, 1986); paracoccidioidomicose (TEIXEIRA et al, 2001) e SIDA (KAZATCHKINE et al, 1987). Essa variabilidade na expressão do CR1 nos eritrócitos sugere que haja consequências em doenças mediadas pelo aumento de ICC, uma vez que pode comprometer a sua remoçãoda circulação, promovendo o depósito deles nos tecidos e gerando uma resposta inflamatória (revisto por ODERA et al, 2011).
No lúpus, a redução do CR1/E está associada a fatores adquiridos relacionados à atividade da doença e não pela sua gravidade (DE CARVALHO-LINSet al, 2004). Em pacientes com tuberculose, os resultados mostraram que os níveis de CR1/E reduzidos estariam relacionados à maior carga bacilar associada àgravidade da doença, demonstrando que se trata de um fenômeno adquirido e relacionado com a doença e não herdado(SENBAGAVALLIet al, 2008).
Partindo do princípio de que os mecanismos de expressão e modulação do CR1 sejam diferentes em células nucleadas do que aqueles nos eritrócitos, a expressão do CR1 nos leucócitos está relacionada com o padrão de citocinas transcritas e seus efeitos durante as doenças. Tais efeitos são variáveis de acordo com o tipo de célula (LIMB et al, 1991). Dessa
forma, condições inflamatórias locais ou sistêmicas podem regular positiva ou negativamente a expressão do CR1nos leucócitos (ISAAK et al, 2008).
Pacientes infectados com Leishmania possuem elevados níveis de ICC, com antígenos de Leishmaniae auto-antígenos(TUNCANN et al, 2012). A redução do número de CR1/E poderia ser considerada a justificativa do aumento dos níveis de ICC.Estes ICC podem afetar a progressão e o desenvolvimento da doença através da indução de citocinas pró ou anti-inflamatórias, que, consequentemente modulariam a resposta imune (revisto por ELSHAFIE
et al, 2007).
Em estudos anteriores avaliando pacientes com o Calazar foi evidenciada uma redução significativa de 50% no número de moléculas de CR1 em eritrócitos de pacientes com Leishmaniose Visceral sem tratamento, em relação ao grupo controle. Nos indivíduos dos quais foram obtidas amostras pós-tratamento, foi observado que houve a recuperação dos níveis de CR1/E, contudo não pode ser realizada inferência estatística pela reduzida casuística estudada (CÂMARA et al, 1997).
Dessa forma, considerando que há uma relação próxima entre a fisiopatologia, a gravidade de diversas doenças e a recuperação dessa expressão após o tratamento, os objetivos do nosso estudo foram quantificar a expressão do CR1nos eritrócitos e leucócitos (linfócitos, monócitos e neutrófilos), do CD59 nos eritrócitos e os níveis de imunocomplexos circulantesantes e após o tratamento de pacientes com Leishmaniose Visceral.
5 HIPÓTESES
Na Leishmaniose Visceral ocorre a redução da expressão do receptor para complemento tipo 1 da membrana dos eritrócitos (CR1/E) no paciente não tratado, em relação ao grupo de controles saudáveis, e reverte com o tratamento;
Na Leishmaniose Visceral a expressão do CR1 nos linfócitos, monócitos e neutrófilos pode ser alterada tanto para mais como para menos;
Durante a doença pode ocorrer ou não variação na expressão de outras moléculas reguladoras do complemento, como a molécula CD59;
Os níveis de imunocomplexos circulantes aumentam nos pacientes antes do tratamento, reverte com o tratamento e estão relacionados com a alteração da expressão de CR1 em eritrócitos e neutrófilos.
6OBJETIVO GERAL
Analisara dinâmica do receptor para complemento tipo 1(CR1) presente nos eritrócitos e leucócitos dos pacientes com Leishmaniose Visceral (Calazar)e determinar sua relaçãocom os níveis de imunocomplexos circulantes antes e após o tratamento.
6.1 Objetivos Específicos
1. Quantificar o CR1 nos eritrócitos, linfócitos, monócitos e neutrófilosde pacientes com Leishmaniose Visceral,antes e depois do tratamento, e dos controles saudáveis;
2. Quantificar a expressão do CD59 na membrana de eritrócitos dos pacientes antes e depois do tratamento e dos controles saudáveis;
3. Analisar a existência da associação entre o número de CR1 por eritrócito e por neutrófilo nos pacientes com os níveis plasmáticos de imunocomplexos circulantes.
7 METODOLOGIA
7.1 Descrição do estudo
7.1.1 Tipo de estudo
Estudo experimental, prospectivo, realizado de abril de 2014 a julho de 2015.
7.1.2 População
7.1.2.1 Grupo de estudo
Trinta pacientesatendidos no Hospital São José de Doenças Infecciosas (HSJ), referência no tratamento de Calazar no Ceará,com diagnóstico confirmado através de dados clínico-epidemiológicos epelo teste imunocromatográficoK39.
7.1.2.2 Grupo controle
Trinta indivíduos saudáveis, composto por doadores de sangue, atendidos no Centro de Hematologia e Hemoterapia do Ceará (HEMOCE), e indivíduos oriundos do quadro de pós-graduandos da instituição onde os ensaios foram realizados.
7.1.3 Critérios de Inclusão
Pacientes acima de 2 anos de idade, de ambos os sexos, com diagnóstico confirmado para Leishmaniose Visceral que não tenham iniciado o tratamento.
7.1.4 Critérios de Exclusão
Pacientes:
com 2ª infecção de Leishmaniose Visceral recente; comsorologia positiva para HIV;
com Calazar associado a outra doença infecto-parasitária, salvo as infecções bacterianas como intercorrência clínica ao quadro;
7.1.5 Aspectos Éticos
Este estudo recebeu parecer favorável do Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Ceará (PROPESQ) em 31 de março de 2014 (CAAE 20297113.5.0000.5054- Anexo A); e do Comitê de Ética em Pesquisa, do Hospital São José de Doenças Infecciosas, em 25 de abril de 2014 (CAAE: 20297113.5.3001.5044 - Anexo B).
7.1.6 Material Clínico e coleta de dados
As coletas de dados e do material clínico foram realizadas através debusca ativa pelos pacientes nos setores de emergência, laboratório de coleta de sangue e enfermarias do HSJ.
A ficha epidemiológica (Apêndice A) foi preenchida pelo pesquisadorao entrevistar o paciente. Antes da coleta do material clínico o paciente(e/ou seu responsável) e o indivíduo participante do grupo controle foram esclarecidos a respeito do estudo, procedimentos, riscos e finalidades através do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE), autorizando a continuidade do processo ao assiná-lo(ApêndiceB).
Os demais dados relevantes para a pesquisa comoresultados dos exames realizados e tratamento instituído foram obtidos da folha de atendimento ou do prontuário do paciente, nos casos de internamento. As informações obtidas eram arquivadas em planilhas do Excel (versão 2013), formando um banco de dados (Apêndice C).
As coletas de dados clínicos e das amostras foram realizadas em dois momentos: no momento do diagnóstico, pré-tratamento, e, para a segunda amostra, na primeira consulta ambulatorial após o término do tratamento.
7.1.7 Coleta de amostras
A coleta de material clínico foi realizada por profissionais capacitados do laboratório do HSJ e transportada sob refrigeração para o processamento no Laboratório de Imunologia Médica, da Universidade Federal do Ceará.
De cada paciente foram coletados 10 mL de sangue venoso periférico, sendo 5 mL em tubo Vacutainer® com EDTA, para o ensaio com os eritrócitos e leucócitos; e 5 mL em tuboVacutainer® com gel separador, para a obtenção do soro, antes e após o tratamento. As amostras de soro foram armazenadas a -80°C para posterior dosagem de imunocomplexos.
7.2 Delineamento Experimental
7.2.1 Processamento das amostras 7.2.1.1 Processamento dos eritrócitos
Um mililitro de sangue total foi centrifugado a 460 g, por 5 minutos, em 3 mL de tampão fosfato salino (PBS) com azida sódica, por três vezes, para a remoção das camadas de leucócitos e de plasma a cada lavagem. Cem microlitros do precipitado de eritrócitos foram ressuspendidos em 900 L de PBS-azida, de onde foi feita a contagem de hemácias utilizando o hemocitômetro. Uma ressuspensão dos eritrócitos foi preparada ajustando a solução em 1 x 108 células/mL.
Uma alíquota de 10L da suspensão de 1 x 108 células de eritrócitos foi incubada a 4°C, por 45 minutos, no escuro, com oanticorpo monoclonal de camundongo anti-CR1 humano marcado com fluoresceína tiocianato (FITC) (anti-anti-CR1-FITC, clone E11, BD Pharmigen®)ou com seu controle isotipo IgG1, κ de camundongo (FITC) (BD Pharmigen®).
Para marcar a molécula CD59 presente na membrana dos eritrócitos foi utilizadauma solução do anticorpo anti-CD59 marcado com ficoeritrina (PE) (clone p282 H19, Biolegend®)e seu isotipo IgG2a, κ de camundongo marcado com PE (clone MOPC- 173, Biolegend®), diluídos a 1:20.Além dos tubos marcados com anticorpos, um tubo com células não marcadas foi utilizado. Em seguida, as células foram lavadas duas vezes com 2 mL de tampão de lavagem (PBS, soro fetal bovino 2%) e ressuspendidas em 500 Lde PBS-azida para serem analisadas no citômetro de fluxo (FACSCalibur- Becton Dickinson®).
7.2.1.2 Processamento dos leucócitos
Quinhentos microlitros de sangue total foram incubados por 15 minutos, à temperatura ambiente, com uma solução de tampão de lise (BD). Após a incubação, a amostra foi centrifugada por 5 minutos, 460 g e lavada duas vezes com solução de PBS e soro fetal bovino a 2% (Cultilab®).A camada de creme leucocitário obtida foi incubada com anti-CR1-FITC ou seu isotipo, a 4°C, por 45 minutos, no escuro. Em seguida, as células foram centrifugadas a 460 g, por 5 minutos, em temperatura ambiente, por duas vezes com tampão de lavagem (2 mL de PBS, soro fetal bovino 2%).
