Efeito dos microplásticos no coral Zoanthus sociatus: respostas fisiológicas e bioquímicas

Universidade de Aveiro 2019

Departamento de Biologia

LAÍS HENRIQUE

CICERO

Efeito dos microplásticos no coral Zoanthus sociatus: respostas fisiológicas e bioquímicas

Effect of microplastics on the coral Zoanthus sociatus: physiological and biochemical responses

iii DECLARAÇÃO

Declaro que este relatório é integralmente da minha autoria, estando devidamente referenciadas as fontes e obras consultadas, bem como identificadas de modo claro as citações dessas obras.

Não contém, por isso, qualquer tipo de plágio quer de textos publicados, qualquer que seja o meio dessa publicação, incluindo meios eletrónicos, quer de trabalhos académicos.

v Universidade de Aveiro 2019 Departamento de Biologia

LAÍS HENRIQUE

CICERO

Efeito dos microplásticos no coral Zoanthus sociatus: respostas fisiológicas e bioquímicas

Effect of microplastics on the coral Zoanthus sociatus: physiological and biochemical responses

Dissertação apresentada à Universidade de Aveiro para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Toxicologia e Ecotoxicologia, realizada sob a orientação científica da Doutora Ana Luísa Patrício Silva (Investigadora em Pós-Doutoramento do Departamento de Biologia e CESAM, Universidade de Aveiro) e do Doutor Rui Jorge Miranda Rocha (Investigador Auxiliar do Departamento de Biologia e CESAM, Universidade de Aveiro).

vii

ix

o júri

Presidente Doutora Patrícia Alexandra Oliveira Pereira Kowalski, Investigadora Auxiliar, CESAM – Departamento de Biologia da Universidade de Aveiro.

Arguente Doutor Carlos Alexandre Sarabando Gravato, Professor Auxiliar, Universidade de Lisboa.

Orientador Doutora Ana Luísa Patrício Silva, Investigadora de Pós- Doutoramento, CESAM- Departamento de Biologia da Universidade de Aveiro

xi agradecimentos Agradeço meus orientadores, Dra. Ana Luísa e Dr. Rui Rocha, por

terem aceite embarcar nessa pesquisa comigo. Obrigada do fundo do coração toda a ajuda, correções e conselhos tanto a nível profissional como pessoal. Obrigada por não desistirem de mim, e por me terem dado força para que eu finalizasse o trabalho.

Obrigada Andreia Rodrigues, Diana Campos, Carlos Silva, Jamen Mussa, Sílvia Peres, Davide Silva e Ana Costa por toda a ajuda durante o meu percurso.

Agradeço imensamente aos meus pais, Irene e Sérgio, e minha irmã Isa, por sempre estarem ao meu lado, me apoiando, incentivando e sendo minha base e suporte de vida. Sem o apoio de vocês eu não teria conseguido finalizar a dissertação.

Agradeço também ao meu namorado e sua família por todo apoio e paciência que tiveram comigo.

Grata por todas as pessoas que conheci em Aveiro e que fizeram parte da minha vida em Portugal.

xiii palavras-chave corais,stress oxidativo, fotobiologia, ecotoxicologia, polímeros

resumo Os recifes de coral apresentam um inestimável valor ambiental e socioeconómico, devido à sua elevada biodiversidade e serviços ecossistémicos. Contudo, estes ambientes estão a ser ameaçados pela elevada pressão antropogénica, a nível local (ex. poluição, pesca com métodos destrutivos) e global (ex. aquecimento global, acidificação dos oceanos). Recentemente, a poluição por microplásticos (MPs; < 5mm) nos recifes de coral despertou a atenção da comunidade científica, por estar relacionada com uma maior suscetibilidade dos corais a doenças. Os poucos estudos acerca dos potenciais efeitos dos microplásticos em corais têm-se focado em espécies endossimbióticas de corais duros (ordem Scleractinia, Anthozoa: Hexacorallia), descrevendo essencialmente alterações a nível do organismo (comportamento, desenvolvimento, reprodução, necrose e branqueamento). No entanto, o efeito dos microplásticos a outros níveis de organização biológica (p. ex. celular e bioquímico) ou em outros corais, permanece pouco estudado. Esta tese apresenta, assim, as primeiras evidências acerca dos efeitos despoletados pela presença de MPs (1 e 10 mg/L de polietileno de baixa densidade - LDPE MP, ou cloreto de polivinil - PVC MP) em Zoanthus sociatus (ordem Zoantharia. Anthozoa: Hexacorallia), a nível do organismo (sobrevivência, comportamento), dos endosimbiontes (eficiência fotossintética) e a nível celular (stress oxidativo, metabolismo). Numa exposição de curta duração (96h), esta espécie revelou-se mais sensível ao polímero de PVC, dada a ausência de efeitos observados nos tratamentos de LDPE MP. Os corais expostos a MPs de PVC apresentaram uma adesão dez vezes superior de partículas na sua epiderme comparativamente aos corais expostos a LDPE MP, devido provavelmente à elevada densidade desse polímero que tendia a sedimentar e estar mais disponível ao nível de coral do que o MPs de LDPE que apresentavam menor densidade e flutuabilidade positiva. Na concentração mais elevada de PVC MP (10 mg/L) observou-se um aumento significativo da eficiência fotossintética (Fv/Fm) dos corais, provavelmente devido ao efeito de sombreamento causado

pelo elevado número de partículas aderidas à epiderme dos pólipos. Neste tratamento foi ainda observado um aumento da peroxidação lipídica e defesas antioxidantes (via catalase) nos corais. Apesar dos efeitos a nível fisiológico e bioquímico não comprometer a sobrevivência do Z. sociatus a curto prazo, não afasta a hipótese de potenciais efeitos (cumulativos) a longo prazo que poderão colocar em perigo esta e outras espécies de corais, que são a base dos recifes de coral.

xv keywords Corals, oxidative stress, photobiology, ecotoxicology, polymers

abstract Coral reefs have an inestimable environmental and socio-economic value due to their high biodiversity and ecosystem services. However, both local (e.g., pollution, destructive fishing) and global (e.g., global warming, ocean acidification) anthropogenic stressors are threatening these environments. Recently, microplastic pollution (MPs; < 5mm) in coral reefs has been raising particular attention in the scientific community when associated with increased susceptibility to diseases on corals. The few studies on the effects of microplastics on corals is focused on endosymbiotic hard corals (order Scleractinia. Anthozoa: Hexacorallia), mostly describing changes at organismal level (behavior, development, reproduction, necrosis, and bleaching). Thus, the effect of microplastics at other biological levels (e.g., cellular and biochemical) or on other coral species remains poorly uncovered. This work provides the first evidence on the potential effects induced by the presence of MPs (1 and 10 mg L-1 _{low-density polyethylene, LDPE MP, or polyvinyl chloride, PVC MP) in}

Zoanthus sociatus (order Zoantharia. Anthozoa: Hexacorallia), at organism level

(survival, behavior), endosymbionts (photosynthetic efficiency) and at the cellular level (oxidative stress, energy consumed). In a short-term exposure (96h), this species revealed to be more sensitive to PVC MP, with no effects observed to LDPE MP treatments. MP. Coral exposed to PVC MP presented a ten-fold higher adhesion of particles to their epidermis than LDPE MP treatments, probably due to the high density and negative floatability of PVC polymer that made them more available at the coral level than its less dense and floating LDPE MP. The highest tested PVC MP concentration (10 mg L-1_{) increased photosynthetic efficiency} (Fv/Fm), probably due to the shading effect induced by the high number of PVC

particles adhered to polyps’ epidermis. At this PVC MP concentration, it was also observed an increased lipid peroxidation and antioxidant defenses (via catalase) in corals. Although the observed physiological and biochemical effects did not compromise Z. sociatus survival in the short term, it does not rule out potential long-term (cumulative) effects that could endanger this and other coral species that underlie coral reefs.

xvii Índice 1. INTRODUÇÃO ... 1 1.1. Objetivo geral ... 5 1.1.1. Objetivos específicos ... 5 1.1.2. Hipóteses de trabalho ... 6 2. MATERIAIS E MÉTODOS ... 6

2.1. Origem da colónia e condições de cultura ... 6

2.2. Fragmentação e cicatrização ... 7

2.3 Desenho experimental... 9

2.3.1 Polímeros e concentrações testadas ... 9

2.3.2 Sistema experimental ... 9

2.4 Parâmetros analisados ... 10

2.4.1 Qualidade da água ... 10

2.4.2 Concentração de MPs nos sistemas de teste ... 11

2.4.3 Sobrevivência e comportamento dos pólipos ... 11

2.4.4 Capacidade fotossintética (Fv/Fm) ... 12

2.4.5 Quantificação de MPs nas amostras biológicas ... 13

2.4.6 Biomarcadores de stress oxidativo ... 14

2.4.7 Energia consumida ... 15

2.5 Análise estatística ... 15

3. RESULTADOS ... 16

3.1 Monitorização da qualidade da água ... 16

3.2 Quantidade de MPs na água dos aquários ... 16

3.3 Eficiência fotossintética ( Fv/Fm) ... 17

3.4 Biomarcadores de stress oxidativo e consumo de energia ... 17

4. DISCUSSÃO ... 21

5. CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 24

xix Lista de Tabela e Figuras

Tabela 1: Número de microplásticos aderidos ou ingeridos por Zoanthus sociatus, após 96 horas

de exposição a 1 e 10 mg/L de polietileno de baixa densidade (LDPE MP) ou cloreto de polivinil (PVC MP). Os dados são apresentados como média ± erro padrão (N = 15). (*) apresentam significância entre os grupos (variável: concentração; teste t, p <0,05)………....………….20

Figura 1: Espécie utilizada no estudo, Zoanthus sociatus...5 Figura 2: Sistema de aclimatação da colónia mãe………..………..7

Figura 3: Processo de fragmentação dos pólipos de Zoanthus sociatus e adesão a um substrato

firme………...…….8

Figura 4: Aparência dos pólipos de Zoanthus sociatus aquando o processo de cicatrização e

aclimatação………...……….……..….8

Figura 5: Sistema experimental, em que cada aquário continha 38 L de água marinha sintética, uma

bomba de circulação de água e um termostato………..…10

Figura 6: Filtro relativo a uma amostra de água filtrada, retirada do aquário contendo 10 mg/L de

polietileno de baixa densidade (LDPE MP) corado com vermelho nilo (100 g mL-1 _{ETHO) sob luz}

azul (450 nm). Cada ponto vermelho constitui uma partícula de LDPE

MP……….11

Figura 7: Fragmentos de Zoanthus sociatus expostos a 10 mg/L de polietileno de baixa densidade

(LDPE MP) após 6 h de exposição. Os cinco fragmentos (constituídos por 3 pólipos cada) encontravam-se completamente abertos (relaxados)………...…12

Figura 8: Adesão dos MPs à epiderme dos pólipos de Zoanthus sociatus. A condição de exposição

foi a de 10 mg/ L polietileno de baixa densidade (LDPE MP) (A) e cloreto de polivinil (PVC MP) (B)……….…13

Figura 9: Digestão dos pólipos de Zoanthus sociatus com 10% KOH, após 4 horas à 50

C………...…14

Figura 10: Número de MPs em cada tanque de tratamento, ou seja, 1 e 10 mg/L, de polietileno de

baixa densidade (LDPE MP) ou de cloreto de polivinil (PVC MP), após 3, 48 e 96h de exposição . Os dados são apresentados como média ± erro padrão (N = 3, por tempo de amostragem). (*) denotam significância entre os grupos (Variável: concentração; ANOVA 1-via, teste de Dunnett, p <0,05)…...…17

xxi Figura 11: Efeito dos diferentes polímeros (LDPE e PVC) em diferentes concentrações (1 e 10 mg/L)

na eficiência fotossintética da clorofila (Fv/Fm). * representa diferença significativa em relação ao controle. (ANOVA 1-via, teste de Dunnett, p<0.05)………...………....…….…17

Figura 12: Efeito dos diferentes polímeros (LDPE e PVC) em diferentes concentrações (1 e 10

mg/L) no dano oxidativo (LPO - peroxidação lipídica), capacidades antioxidante e de desintoxicação (atividade da Catalase - CAT, glutationa S-transferase - GST) e consumo de energia (via sistema de transferência de eletrões - ETS). * representa diferença significativa em relação ao controle. (ANOVA 1-via, teste de Dunnett, p<0.05)………...………...19

1 1. INTRODUÇÃO

Em todos os mares e oceanos da Terra tem sido relatada a poluição plástica, e é reconhecida amplamente como uma ameaça global à economia das nações costeiras e à vida marinha (SILVA, 2018). Habitats bentônicos costeiros podem sofrer degradação através da sufocação devido a poluição por plástico, mesmo eles não sendo facilmente biodegradáveis, os plásticos de fragmentam em pedaços cada vez menores quando são expostos à luz ultravioleta e abrasão física (CRITCHELL & HOOGENBOOM, 2018; SILVA, 2018).

Atualmente, a preservação dos ambientes aquáticos, em especial nas regiões costeiras, é uma das principais preocupações mundiais. As zonas costeiras estão a ser afetadas por várias pressões antropogénicas (BEBIANNO et al., 2015), de entre as quais a poluição com plásticos, que é amplamente reconhecida como uma ameaça global à vida marinha (DERRAIK, 2002) e, consequentemente à economia das nações costeiras (SILVA, 2018). Este tipo de poluição tem sido bem documentado, com registos de acumulação e persistência em variados ambientes, desde as regiões costeiras ao oceano aberto, desde os trópicos até às regiões polares (DERRAIK, 2002, DOYLE et al., 2011, AVIO et al., 2016, DING et al., 2019).

Os plásticos são polímeros orgânicos de natureza sintética ou semissintética de origem essencialmente petroquímica, como por exemplo o polipropileno (PP), poliestireno (PS), polietileno (PE), cloreto de polivinil (PVC), poliamida (Nylon), polietileno tereftalato (PET) (ANDRADY et al., 2011; PLASTIC EUROPE, 2015; GESAMP, 2015; NOBRE, 2015). Devido à sua natureza duradoira, flexibilidade e baixo custo, a sua produção cresceu exponencialmente nas últimas 4 décadas, tendo ultrapassado as 400 milhões de toneladas anuais em 2017 (GEYER et al., 2017). Apesar de ter contribuído para a melhoria significativa da nossa qualidade de vida, o seu descarte indevido tem levado a uma acumulação significativa de lixo plástico nos mais diversos ambientes naturais (WANG et al. 2016, CHEANG et al. 2018, OKUBO et al., 2018, DING et al., 2019).

Cerca de 80% do lixo plástico marinho é proveniente de atividades terrestres, como a agricultura e o estilo de vida urbano. Os restantes 20% resultam de atividades de aquacultura e pesca, cujos materiais podem ser abandonados, perdidos acidentalmente ou descartados deliberadamente (UNEP, 2016, CESA,

2

2017; BARBOZA et al., 2019). Os materiais responsáveis pela poluição de práticas pesqueiras vão desde os equipamentos de pesca, como redes, linhas e cordas, quanto itens auxiliares, como tiras de amarração luvas e caixas (UNEP, 2016, GESAMP, 2016, CESA, 2017). Incluem também recipientes de comida, embalagens e outros tipos de lixo, em sua maioria todos feitos de plástico (GESAMP, 2016, CESA, 2017). Tal como a pesca, todos os equipamentos usados na aquacultura são feitos de plásticos (ANDRADY, 2011, SUNDT et al., 2014, UNEP, 2015, CESA, 2017), e muitos destes materiais usados também podem se perder, principalmente na maricultura, onde as linhas e as gaiolas usadas podem sofrer desgaste das cordas devido tempestades ou acidentes (GESAMP, 2016; UNESP, 2016; CESA, 2017).

Uma vez no meio ambiente, os plásticos ficam expostos aos raios ultravioleta, abrasão física e à ação dos organismos/microrganismos, sofrendo processos de fragmentação e dando origem a partículas com dimensão cada vez menor (CRITCHELL & HOOGENBOOM, 2018; SILVA, 2018). No entanto, este processo pode durar meses ou séculos, dependendo do meio onde foi descartado (THOMPON et al., 2005, CRITCHELL & HOOGENBOOM, 2018).

Quando o tamanho destas partículas de plástico é inferior a 5 mm (até 1 m) denominam-se de microplásticos (MPs) (FRIAS & NASH, 2019). A origem dos MPs pode ser primária ou secundária (THOMPON et al., 2005). Os MPs primários são libertados para o meio ambiente na sua reduzida dimensão, como os pellets plásticos e as microesferas introduzidas em produtos cosméticos e de limpeza abrasiva. Os MPs secundários são oriundos da fragmentação de macroplásticos (WRIGHT, THOMPON & GALLOWAY, 2013; SILVA, 2018). Deste modo, os MPs podem apresentar diferentes formas (ex. esférica, fibrosa, irregular), constituição polimérica e densidades, o que lhes confere uma dispersão heterogénea em ambientes aquáticos marinhos (i.e., pela superfície da água, coluna de água ou no sedimento) e que influenciam a sua disponibilidade a organismos de diferentes habitats (WRIGHT, THOMPON & GALLOWAY, 2013; SILVA, 2018). Por exemplo, os organismos pelágicos como o zooplâncton estão mais propensos a encontrar (e ingerir voluntaria- ou involuntariamente) MPs pouco densos que se distribuem preferencialmente na coluna de água ou à sua superfície (SÁ et al., 2018). Já os

3

organismos bentónicos como os corais têm maior probabilidade de encontrar (e ingerir voluntaria- ou involuntariamente) MPs mais densos. A ingestão de MPs encontra-se relatada em muitas espécies de fauna marinha pertencentes a diferentes níveis tróficos (MOORE et al., 2001; RICHARDSON et al., 2017; SILVA, 2018; SÁ et al. 2018), causando obstrução e dano no trato intestinal, alterações do comportamento alimentar e predatório, alterações no crescimento, neurotoxicidade, stress oxidativo e citotoxicidade (SÁ et al., 2018).

O reduzido tamanho dos MPs aumenta-lhes o rácio superfície: volume que, conjuntamente com a sua natureza essencialmente hidrofóbica, os torna propícios a adsorver contaminantes ambientais, incluindo metais e hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (RIOS et al., 2007; BETTS, 2008; ASHTON et al., 2010), ou organismos patogénicos (ZETTLER et al.; 2013ANBUMANI & KAKKAR, 2018). O fato dos MPs serem vetores de contaminantes e agentes patogénicos aumentam o risco de introdução destes compostos/organismos ao nível dos consumidores primários, como animais filtradores e zooplâncton, com efeitos ainda imprevisíveis para as cadeias alimentares marinhas (FRIAS, OTERO & SOBRAL, 2014, CRITCHELL & HOOGENBOOM, 2018; SILVA, 2018).

Os recifes de coral representam um ecossistema muito importante a nível mundial devido à sua enorme biodiversidade, que leva a uma comparação com as florestas tropicais (HETZEL E CASTRO, 1994). Os corais tropicais, que na sua maioria vivem em simbiose com organismos unicelulares fotossintéticos do género Symbiodinium, vulgarmente designados por zooxantelas, representam a base dos recifes de coral (BAIRD et al., 2009; LEAL et al., 2017; OKUBO et al., 2018). A presença e o efeito da poluição por MPs nestes organismos tem sido relatado nos últimos 5 anos. Estudos de campo referem que cerca de 11 bilhões de itens de plástico estão presos em recifes de coral na região do Indo-Pacífico e a probabilidade de ocorrência de doenças nos corais aumenta quando os estes estão envoltos em plástico e MPs (LAMB et al., 2018). Estudos em laboratório mostram que os corais levam MPs para a cavidade gástrica, onde ficam envoltos em filamentos mesentéricos (HALL et al., 2015; ALLEN et al., 2017). Sabe-se ainda que os MPs podem afetar o crescimento dos corais e a relação com os seus endossimbiontes (OKUBO et al., 2018). Contudo, estes estudos focam-se apenas

4

em espécies de corais duros (Anthozoa: Hexacorallia: Scleractinia), existindo assim uma lacuna no conhecimento relativa a espécies de corais que não apresentem exosqueleto calcário.

Os zoantídeos (Anthozoa: Hexacorallia: Zoantharia) são um grupo de cnidários bentónicos marinhos comumente conhecidos como "pólipos de botão" ou “tapete do mar”, e constituem a terceira maior ordem de Hexacorallia. À semelhança dos corais duros, os zoantídeos, principalmente os que possuem endossimbiontes fotossintéticos, ocorrem frequentemente nos recifes de coral onde contribuem para a estrutura e função dos recifes (RABELO et al., 2015; SANTOS et al., 2016).

De entre os zoantídeos, destaca-se a espécie Zoanthus sociatus (ELLIS & SOLANDER, 1786). Esta espécie é mixotrófica, ou seja, a sua nutrição baseia-se na ingestão de plâncton e matéria orgânica particulada, bem como na utilização de nutrientes provenientes da fotossíntese, realizada pelos seus endosimbiontes fotossintéticos. Apresenta uma distribuição cosmopolita, encontrando-se não só em zonas de recife, mas também em zonas intertidais de regiões tropicais e sub-tropicais as quais recebem elevadas quantidades de MPs provenientes de atividades terrestres (LEAL et al., 2017). Para além da sua ampla distribuição, esta espécie apresenta uma elevada plasticidade fenotípica, provavelmente resultante de uma adaptação evolutiva às condições adversas de algumas zonas que coloniza (p. ex. nas zonas de entre marés). Pelas razões anteriormente descritas, esta espécie apresenta potencial para utilização em ensaios laboratoriais para avaliação dos efeitos da poluição por MPs a nível fisiológico, fotobiológico e metabólico.

O Zoanthus sociatus desenvolve-se formando colónias com pólipos alongados, muitas vezes afilados no sentido da base, formando assim, colónias com centenas de indivíduos interligados. A sua boca fica situada em uma pequena elevação do disco oral, com linhas de inserção dos mesentérios aparentes (ROHLFS & BELÉM, 1994). A coloração dos pólipos é bastante variada, no entanto é geralmente cinza-azulada, sendo verde-azulada na região próxima aos tentáculos no disco oral, tem perístoma verde, os tentáculos são cinza-claro-esverdeados e boca verde-claro-amarelada (ROHLFS & BELÉM, 1994). Pertencendo à subclasse Hexacorallia, este zoantídeo possui tentáculos em múltiplos de 6 (48-54) com

5

epiderme colunar simples, sem subcutícula e cutícula, com espirocistos em grande concentração nas extremidades. O disco oral com a epiderme mais estreita que a epiderme dos tentáculos (ROHLFS & BELÉM, 1994) (Figura 1).

Figura 1: Epécie utilizada no estudo, Zoanthus sociatus.

Fonte: ttps://reefs.com/magazine/inverts-d45/

1.1. Objetivo geral

Este trabalho teve como principal objetivo avaliar o efeito de MPs com grande representatividade em ambientes marinhos costeiros, concretamente do polietileno de baixa densidade (sigla internacional LDPE) e do cloreto de polivinil (sigla internacional PVC), na sobrevivência, comportamento, fotobiologia e respostas bioquímicas do Zoanthus sociatus.

1.1.1. Objetivos específicos

1) Avaliar o efeito da presença dos MPs de LDPE e PVC na sobrevivência e comportamento (i.e., abertura/fecho, expansão/contração) dos pólipos ao longo do tempo de exposição;

2) Avaliar a potencial aderência dos MPs à superfície dos pólipos e/ou sua potencial ingestão;

6

- eficiência fotossintética (através da medição de Fv/Fm);

- consumo de energia (via cadeia transportadora de eletrões – ETS);

- respostas ao stress oxidativo (peroxidação lipídica - LPO, atividade da catalase - CAT, níveis de glutationa-s-transferase - GST)

1.1.2. Hipóteses de trabalho

H1: A presença e/ou ingestão dos MPs afeta o comportamento dos zoantídeos.

H2: A presença e/ou ingestão dos MPs alteram a sua fotobiologia. H3: A presença e/ou ingestão dos MPs induzem stress oxidativo.

H4: A presença e/ou ingestão dos MPs interferem com o metabolismo energético.

2. MATERIAIS E MÉTODOS

2.1. Origem da colónia e condições de cultura

A colónia de Zoanthus sociatus é proveniente de Batam, Indonésia, e foram selecionadas sob condições similares (luz e profundidade) e estocadas por 1 semana para aclimatação às condições laboratoriais (água e condições de teste de luz). Durante este período, os organismos foram cuidadosamente monitorados quanto a qualquer evidência de doença. O sistema modular de aclimatação consistia em um tanque de vidro (1,48 m x 32,5 m x 48,5 m; 235 L), conectado a um tanque de filtração com 54 L (30 cm x 37 cm x 49 cm) equipado com um escumador (Eheim, Skimmarine 800), um reator de hidróxido de cálcio (KM 500S Deltec), refrigerador (Hailea HC-500A), dois aquecedores com termostato (Eheim Jäger 150 W), um filtro UV (TMC-P1 55W 220-240V 50HZ ), um filtro biológico (5 L de biobolas), um filtro químico (1 L, carvão ativado), um osmoregulador (Deltec Aquastat 1001, para compensar automaticamente a perda de água por evaporação, adicionando água purificada por osmose inversa). Uma bomba de

7

água (EHEIM universal 1200) permitia que a água circulasse sequencialmente pelo refrigerador e pelo sistema UV. A circulação entre o tanque de filtração e o tanque de aclimatação era realizada através de uma bomba (EHEIM universal 3400), –com um caudal de aproximadamente 2500 L.h-1_{. O sistema funcionou com}

água salgada sintética, com salinidade 35 (mistura de Pro Reef - tropica marinha, Alemanha, com água de osmose reversa -purificada por um Sistema de Osmose Reversa V2 Pure 360), iluminada com uma lâmpada fluorescente de 40W t5 (REEF-SPEC™, Red Sea) com radiação fotossintética ativa (PAR) de 120 μmol quanta m−1, um período de 12:12 (claro:escuro, horas) (Figura 2).

Figura 2: Sistema de aclimatação da colónia mãe.

2.2. Fragmentação e cicatrização

A fragmentação do coral procedeu-se como o descrito em Rocha et al. (2013). Com o auxílio de um bisturi e pinça previamente esterilizado, três pólipos foram retirados cuidadosamente da colónia mãe e posteriormente colados com cola de n-butil-2-cianoacrilato em placas de mármore (Figura 3). Ao todo produziram-se

8

125 placas contendo 3 pólipos cada. Após a secagem da cola, os fragmentos foram colocados no mesmo tanque onde a colónia mãe esteve em aclimatação e manutenção, e onde permaneceram duas semanas para a sua completa cicatrização. Durante esse período, os pólipos foram observados diariamente para avaliar o seu comportamento e processo de cicatrização (Figura 4). Os pólipos que se revelavam contraídos continuamente, ou que apresentavam comportamento erróneo, caso os pólipos não abrissem após os dias de adaptação, ou algum tenha descolado, não foram utilizados para os testes.

Figura 3: Processo de fragmentação dos pólipos de Zoanthus sociatus e adesão a um substrato

firme.

9 2.3 Desenho experimental

2.3.1 Polímeros e concentrações testadas

Os polímeros polietileno de baixa densidade (LDPE) e o cloreto de polivinil (PVC) foram selecionados para os testes de ecotoxicidade, devido à sua representatividade em ambientes costeiros e ambientes de águas rasas onde estão localizados a maioria dos recifes de coral (CHEANG et al 2018). Estes polímeros foram obtidos comercialmente (LDPE: Sigma Aldrich, PVC: Goodfellow) e, após crivagem mecânica, apenas a fração de tamanhos de 63-125 m foi utilizada de forma a ser compatível com a abertura do aparelho bocal dos corais (~500 m). Foram testadas duas concentrações de cada polímero: 1 e 10 mg/L, correspondendo a ~ 0,5 x 105 _{- 4 x 10}5 _{ou ~ 0,7 x 10}5 _{- 1,5 x 10}5 _{partículas de LDPE}

e PVC, respetivamente), resultando num total de 5 tratamentos (2 polímeros x 2 concentrações + controlo, caracterizado pela ausência de MPs). Foram preparadas 3 réplicas de cada tratamento. Antes da sua utilização, os MPs de cada condição ficaram a equilibrar (envelhecer) num litro de água salina sintética em constante agitação (70 rpm) durante duas semanas.

2.3.2 Sistema experimental

Considerando um total de 5 tratamentos, com 3 réplicas cada, foram preparados 15 aquários de vidro (33,7cm x 22,5cm x 48,8cm). Cada aquário continha 37 litros de água marinha sintética com salinidade 35 preparada pela mistura sintética sal marinho (Pro Reef - tropica marinha, Alemanha) com água purificada por um sistema de osmose reversa (Aqua-win RO-6080, Kaohsiung, Tailândia). Continham, igualmente, 1 termostato de 100 Watt (Eheim, Thermocontrol, Alemanha) e 1 bomba de circulação de água (Tunze, Tuchelle, Nanostream 6055) (Figura 5).

Os aquários ficaram a estabilizar até todos apresentarem uma temperatura constante de 25 ± 1 ºC, luz de Radiação Fotossintética Ativa (PAR) entre 40-60 μmol quanta m−1 _{e um fluxo controlado de água. Após esse período, 5 colónias}

10

aquário (para receber a mesma intensidade de luz UV com fotoperíodo de 16h:8h). O teste durou 96 h a 25 ± 1 ºC, pH ~ 8, salinidade 35, sem fornecimento de alimento. A temperatura, salinidade e o pH foram monitorizados diariamente.

Figura 5: Sistema experimental, em que cada aquário continha 38 L de água marinha sintética,

uma bomba de circulação de água e um termostato.

2.4 Parâmetros analisados

2.4.1 Qualidade da água

Os parâmetros de qualidade da água como pH, salinidade, oxigénio (sonda multiparamétrica) foram monitorizados diariamente.

11 2.4.2 Concentração de MPs nos sistemas de teste

A concentração de MPs nos aquários foram monitorizados a cada dois dias. Para este efeito, foram retiradas, cuidadosamente, 50 mL de água da coluna de água de cada tratamento e guardadas a 4 ºC até à sua análise.

De cada amostra foram retiradas 3 subamostras de 4000L, às quais foram adicionados 5000L de água ultrapura e 1000 L de SDS. Seguidamente, todas as subamostras foram filtradas em sistema a vácuo utilizando filtros de policarbonato pretos (PCTE, 0.2 μm,  47cm, GE Healthcare Whatman, U.S.), coradas com vermelho nilo (100 g/ ml ETHO; tempo de atuação: 5 min), lavadas abundantemente com água ultra pura e armazenados em placa de petri de vidro. Os filtros secaram em temperatura ambiente no escuro. Para a contabilização dos MPs retidos nos filtros, os mesmos foram excitados com luz azul a 450 nm (SPEX Forensic, U.S.A) e fotografados (Panasonic Lumix FZ-150, lente LEICA DC Vario-Elmarit de 25-600mm f/2.8-5.2, foco automático). A contagem dos MPs foi efetuada com o programa Image J (SCHNEIDER et al,. 2012)(Figura 6).

Figura 6: Fotografia de um filtro relativo a uma amostra de água retirada do aquário contendo 10

mg/L de polietileno de baixa densidade (LDPE MP) corado com vermelho nilo (100 g mL-1 _ETHO)

sob luz azul (450 nm, SPEX Forensic, U.S.A). Cada ponto vermelho constitui uma partícula de LDPE MP.

2.4.3 Sobrevivência e comportamento dos pólipos

A sobrevivência e o comportamento (abertura/fecho) dos pólipos de cada fragmento foram monitorizados diariamente, durante as horas de luz do fotoperíodo (Figura 7).

12

Figura 7: Fragmentos de Zoanthus sociatus expostos a 10 mg/L de polietileno de baixa densidade

(LDPE MP) após 6 h de exposição. Os cinco fragmentos (constituídos por 3 pólipos cada) encontravam-se completamente abertos (relaxados).

2.4.4 Capacidade fotossintética (Fv/Fm)

A capacidade fotossintética foi avaliada in vivo, no início (t = 0) e no fim da exposição (t = 96h), por fluorometria de modulação por amplitude de pulso (PAM) que permite medir a fluorescência não-intrusiva da clorofila variável em vários pontos do pólipo (Schreiber, 2004). O fluorómetro PAM é composto por uma Unidade de Controle PAM (Walz) computorizada e um emissor-detetor de WATER-EDF-Universal (Gademann Instruments, GmbH, Würzburg, Alemanha) (Cruz e Serôdio, 2008).

Os feixes de luz de medição eram lançados por uma lâmpada LED azul (pico de 450 nm, largura de banda de 20 nm) sobre a amostra através de uma fibra ótica de 1,5 mm de diâmetro. A fibra ótica foi posicionada perpendicularmente à superfície do pólipo do coral. As medições foram realizadas antes dos corais serem colocados nos aquários com os respetivos tratamentos e no fim do teste (96h). Antes dessas medições os pólipos foram deixados por 15 minutos no escuro e a sala do teste permaneceu no escuro no decorrer dos pulsos de luzes. Para determinar a eficiência fotossintética (Fv/Fm) do fotossistema II foi utilizada a

13

seguinte equação: Fv/Fm = (Fm- Fo)/Fm., onde Fm = fluorescência máxima e Fo =

fluorescência mínima. Após a avaliação da capacidade fotossintética dos pólipos, um pólipo de cada fragmento foi separado para quantificação de MPs e os restantes dois foram separados para as análises bioquímicas. Todas as amostras foram manipuladas com a maior brevidade possível, colocadas em microtubos de 2 mL, congeladas em azoto líquido e armazenados a -80 ºC até posterior processamento.

2.4.5 Quantificação de MPs nas amostras biológicas

Quantidade de MPs na superfície dos pólipos

Os pólipos foram fotografados com o Microscópio U500X Digital, de ângulos diferentes para se fazer a contagem dos MPs (LDPE MP e PVC MP) que aderiram à sua epiderme (Figura 8). Seguidamente, os MPs foram retirados com auxílio de um pincel e água ultra pura, para posterior digestão com 10% KOH segundo Prata et al., 2019.

A B

Figura 8: Adesão dos MPs à epiderme dos pólipos de Zoanthus sociatus. A condição de exposição

foi a de 10 mg/ L polietileno de baixa densidade (LDPE MP) (A) e cloreto de polivinil (PVC MP) (B).

Quantificação dos MPs ingeridos pelos pólipos

Após a completa remoção dos MPs aderidos à sua epiderme, cada pólipo foi colocado num frasco de vidro com 2250 L de 10% KOH. Esses frascos foram seguidamente colocados na mufla a 50 ºC por 4h, seguidas de 44 horas à

14

temperatura ambiente (Figura 9). Após esse período, as amostras foram diluídas com água ultra pura (10x), filtradas a vácuo utilizando filtros pretos de policarbonato (PCTE, 0.2 μm,  47cm, GE Healthcare Whatman, U.S.). A quantificação seguiu o procedimento descrito na secção anterior. Porém, devido ao baixo número de partículas contabilizadas por esta metodologia, resolveu-se confirmar esta contagem sob um microscópio estereoscópico. Em caso de dúvidas acerca da sua natureza (resto de digestão - espícula, microplástico), foi realizado o teste da agulha segundo De Witte et al., 2014.

Figura 9: Digestão dos pólipos de Zoanthus sociatus com 10% KOH, após 4 horas à 50 C.

2.4.6 Biomarcadores de stress oxidativo

As amostras, ainda congeladas, foram maceradas com um bastão de vidro e seguidamente homogeneizadas, permanecendo em gelo, em 1000 l de água ultra pura.

Do homogeneizado, retirou-se uma alíquota de 300 μL para a análise do consumo de energia (secção 2.4.7) e uma alíquota de 200 μL para a determinação da peroxidação lipídica (LPO), e à qual foi adicionado 4 µL de BHT a 4% (2,6-di-terc-butil-4-metil fenol) em metanol. O restante homogeneizado foi diluído em 500 μL de tampão K-fosfato 0,2M, pH 7.4, centrifugado por 20 min a 9.000 g (4°C) e o sobrenadante pós-mitocondrial (SPM) foi usado para medir a atividade da catalase (CAT), atividade da glutationa S-transferase (GST) e níveis de proteína.

15

O dano oxidativo foi inferido pelos níveis de peroxidação lipídica (LPO), medindo-se substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) a 535 nm, usando 1,56 x 105 M-1._cm-1 _{como coeficiente de extinção molar, segundo Bird E Draper}

(1984). As capacidades antioxidantes e de desintoxicação foram inferidas pelas atividades de catalase (CAT) e glutationa S-transferase (GST) na fração pós-mitocondrial (SPM). A atividade de CAT foi determinada medindo a decomposição do substrato peróxido de hidrogénio (H2O2) a 240 nm usando 40 M-1 cm-1 como

coeficiente de extinção molar, de acordo com CLAIBORNE (1985). E a atividade de GST foi determinada avaliando a conjugação de GSH com 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno a 340 nm por 5 min usando 9,6 x 103 M-1 _cm-1 _{como coeficiente de}

extinção molar, de acordo com HABIG et al. (1974). Os níveis de proteína no homogeneizado e na SPM foram determinados de acordo com o método de Bradford (BRADFORD, 1976), numa placa de fundo plano de 96 poços, usando a γ-globulina bovina como padrão.

2.4.7 Energia consumida

A medição do consumo de energia (via atividade do ETS) seguiu o método de De Coen E Janssen (1997) com pequenas modificações na leitura das microplacas (RODRIGUES et al., 2015). Resumidamente, aos 300 l do homogeneizado foi adicionado 150 mL de tampão de homogeneização (0,3 M de base Tris; 0,45% (p / v) de polivinil pirrolidona; 459 mM de MgSO4; 0,6% (v / v) de Triton X-100 a um pH de 8,5). Seguidamente, centrifugou-se (1.000 g, 10 min, 4 ° C) e retirou-se 50 l de sobrenadante, ao qual foi adicionado 150 l de solução tampão (base Tris 0,13 M contendo 0,27% (v / v) de Triton X-100; NADH 1,7 mM; NADPH 274 mM) e 100 l de solução INT (p-iodonitrotetrazólio; 8 milímetros). A absorvância foi lida a 490 nm durante 3 min. A taxa de consumo de energia foi calculada usando a relação estequiométrica (2 mmol de INT-formazan formou 1 mmol de oxigénio consumido) e usando a fórmula de Lambert-Beer usando ε = 15.900 M-1 _cm-1 _{para INT-formzan.}

2.5 Análise estatística

Os resultados do Fv/Fm, dano oxidativo (LPO - peroxidação lipídica),

16

glutationa S-transferase - GST) e consumo de energia (via sistema de transferência de eletrões - ETS), foram verificadas por modelos de Análise de Variância (ANOVA) 1-via, que em caso de rejeitar a hipótese nula, foi seguida de um teste de Dunnett que compara as diferenças dos tratamentos em relação ao controlo. A quantidade de MPs na superfície dos pólipos de Zoanthus sociatus foi verificada por modelo de comparação de médias t- student. As análises foram realizadas no software GraphPad Prism 8.

3. RESULTADOS

3.1 Monitorização da qualidade da água

Os parâmetros de qualidade da água (pH, salinidade, oxigénio) permaneceram estáveis durante a exposição (tempo de amostragem: 3, 24, 48, 72, 96h; com pH: 8,2 ± 0,04; temperatura: 24,4 ± 1,05 ºC; salinidade: 34,94 ± 0,21; 4 ± 0,07, valores de saturação do oxigénio entre 70% e 90%). Todos os corais sobreviveram às condições experimentais.

3.2 Quantidade de MPs na água dos aquários

A variação da quantidade de MPs em cada tratamento, ao longo do tempo,

encontra-se representada na figura 10. Como se pode observar, a quantidade de MPs de LDPE na água dos aquários diminuiu ao longo do tempo, embora estatisticamente significativo apenas para a menor concentração testada (ANOVA 1-via, F (2, 15) = 5,072, p = 0,02). Nos aquários contendo PVC a quantidade de MPs permaneceu estável em ambas as concentrações (p> 0,05, em ambas as concentrações de PVC MP). No entanto, a razão entre as concentrações mais baixas e as mais altas testadas, particularmente nos tratamentos com LDPE MP, permaneceu semelhante em cada tratamento. Não foram observados MPs nos filtros que não as partículas de LDPE e ou PVC.

17 Figura 10: Número de MPs em cada tanque de tratamento, ou seja, 1 e 10 mg/L, de polietileno de

baixa densidade (LDPE MP; A) ou de cloreto de polivinil (PVC MP; B), após 3, 48 e 96h de exposição. Os dados são apresentados como média ± erro padrão (N = 3, por tempo de amostragem). (*) denotam significância entre os grupos (Variável: concentração; ANOVA 1-via, teste de Dunnett, p <0,05).

3.3 Eficiência fotossintética (Fv/Fm)

A eficiência fotossintética inicial e final encontra-se representada na figura 11. Foi observado um aumento significativo da capacidade fotossintética das clorofilas apenas na concentração de 10 mg /L de PVC (ANOVA de 1-via, p<0.05).

Figura 11: Efeito dos diferentes polímeros (LDPE e PVC) em diferentes concentrações (1 e 10 mg/L)

na eficiência fotossintética da clorofila (Fv/Fm) no tempo 0 (dois gráficos à esquerda) e após 96h (dois gráficos à direita). * representa diferença significativa em relação ao controlo. (ANOVA 1-via, teste de Dunnett, p<0.05).

3.4 Biomarcadores de stress oxidativo e consumo de energia

Os resultados relativos aos biomarcadores de stress oxidativo estudados encontram-se representados na figura 12. A presença do polímero de LDPE não induziu peroxidação lipídica (LPO) nem promoveu qualquer alteração significativa

0 50 100 0 2×105 4×105 6×105 horas A : # L D P E M P 1 mg/L 10 mg/L * 0 50 100 0 2×105 4×105 6×105 horas B : # P V C M P 0 1 10 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 LDPE (mg/L) Fv /Fm ( 0 h ) 0 1 10 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 PVC (mg/L) Fv /Fm ( 0 h ) 0 1 10 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 LDPE (mg/L) Fv /Fm ( 9 6 h ) 0 1 10 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 PVC (mg/L) Fv /Fm ( 9 6 h )

*

18

ao nível da capacidade antioxidante (CAT), capacidade de destoxificação (GST) e no metabolismo energético (ETS) nos corais (ANOVA 1-via, todos os valores de p>0.05). Contudo, a presença de 10 mg/L de PVC causou peroxidação lipídica (LPO) (ANOVA 1-via, F(2,42) = 6,645; p = 0,003) e um aumento significativo na enzima antioxidante (CAT) (ANOVA 1-via, F(2,42) = 3,700; p = 0,03), sem alterações ao nível da capacidade de destoxificação (GST) e no metabolismo energético (ETS).

19 Figura 12: Efeito dos diferentes polímeros (LDPE e PVC) em diferentes concentrações (1 e 10 mg/L)

no dano oxidativo (LPO - peroxidação lipídica), capacidades antioxidante e de desintoxicação (atividade da Catalase - CAT, níveis de glutationa S-transferase - GST) e consumo de energia (via sistema de transferência de eletrões - ETS). * representa diferença significativa em relação ao controlo. (ANOVA 1-via, teste de Dunnett, p<0.05).

0 1 10 0 2 4 6 LDPE (mg/L) L P O ( T B A R S n m o l/ m g p ro t) 0 1 10 0 2 4 6 PVC (mg/L) L P O ( T B A R S n m o l/ m g p ro t)

*

*

20

3.5 Quantidade de MPs na superfície dos pólipos e na cavidade gastrovascular

O número de MPs aderidos à epiderme e/ou no interior dos corais (cavidade gastrovascular) está representado na tabela 1. Como observado, esta adesão dependeu visivelmente tanto do tipo de polímero como da concentração testada. Os corais expostos à concentração de 10 mg/L apresentavam um número de partículas aderidas 14 a 20 vezes superior à concentração mais baixa (1 mg/L). Assim como o número de partículas de PVC aderidas aos corais foi 6 a 10 vezes mais elevada que o número de partículas de LDPE. Já o número de partículas no interior do coral foi semelhante entre tratamentos de MPs (teste t, p <0,05 em ambos os polímeros).

Tabela 1: Número de microplásticos aderidos ou ingeridos por Zoanthus sociatus, após 96 horas

de exposição a 1 e 10 mg/L de polietileno de baixa densidade (LDPE) ou cloreto de polivinil (PVC). Os dados são apresentados como média ± erro padrão (N = 15). (*) apresentam significância entre os grupos (variável: concentração; teste t, p <0,05).

Tratamento Aderido a epiderme Cavidade intestinal A: LDPE (1 mg/L) 1.2 ± 0.6 0.8 ± 0.4 B: LDPE (10 mg/L) 17.7 ± 5.7* 1.0 ± 0.8 C: PVC (1 mg/L) 7.0 ± 1.6 0.5 ± 0.4 D: PVC (10 mg/L) 167± 28.2* 0.3 ± 0.2

21 4. DISCUSSÃO

Este trabalho apresenta as primeiras evidências acerca dos efeitos da presença de MPs de LDPE e de PVC no coral zoantídeo Zoanthus sociatus, a nível do organismo (sobrevivência, comportamento), dos endosimbiontes (eficiência fotossintética) e a nível celular (stress oxidativo, metabolismo). De uma forma geral, e considerando um cenário de exposição curta (96 horas), esta espécie revelou-se mais sensível a MPs de PVC. Na presença deste polímero a uma concentração de 10 mg/L, observou-se uma adesão de MPs à epiderme dos corais 10 vezes superior ao polímero de menor densidade (LDPE). Este resultado deve-se essencialmente à diferença de densidade entre os polímeros. O polímero de LDPE possui baixa densidade (portanto, flutuabilidade neutra a positiva), o que faz com que suas partículas se distribuam na coluna de água e na sua superfície. Esta facto originou, inclusivamente, que algumas dessas partículas fossem coletadas e retidas pelos instrumentos plásticos existentes nos aquários (por exemplo, bombas de água, termostato). O polímero de PVC possuí alta densidade (portanto flutuabilidade negativa), o que faz com que a maioria das partículas se deposite no fundo do aquário e na superfície dos corais. Resultados semelhantes foram observados em corais duros (ordem Scleractinia) das famílias Acroporidae, Pocilloporidae e Merulinidae, com partículas de alta densidade cobrindo maior área superficial dos corais do que MPs de baixa densidade (REICHERT et al., 2018).

Pesquisas anteriores com os corais Acropora e Pocillopora relataram uma correlação positiva entre o número de MPs aderidos e os ingeridos (TANG et al., 2018; MARTIN et al., 2019; SYAKTI et al., 2019). No nosso estudo, esta correlação parece não existir. A ingestão de MPs (aparentemente baixa) não dependeu nem da concentração testada nem do polímero e sua adesão. A (baixa) ingestão observada de MPs de LDPE e PVC pode ser devida a uma potencial baixa necessidade de heterotrofia revelada por Z. sociatus, num cenário de exposição a curto prazo. Como zoantídeos zooxantelados, estes corais podem permanecer sem alimentação por longos períodos, particularmente durante episódios de stresse, obtendo sua fonte de energia e carbono da fotossíntese das zooxantelas (LEAL et al., 2015). Outras possíveis explicações incluem o movimento lento de tentáculo

22

dos pólipos, e a “prisão” dos MPs no muco dos corais. O muco de coral tem sido proposto como um “adesivo” para partículas nos ecossistemas de recifes (WILD et al., 2004), e pode ter o mesmo papel para os MPs. O incremento na produção de muco também foi reconhecido como um mecanismo de defesa e remoção de corais, desencadeado pela presença de partículas estranhas (MARTIN et al., 2019). Um exemplo, os corais de Acropora hemprichii apresentaram uma maior produção de muco na presença de MPs em comparação com Goniastrea retiformis e Phialophora verrucosa, que também revelaram uma maior capacidade de remoção dessas particulas (MARTIN et al., 2019). Neste estudo, a produção de muco foi semelhante em todos os tratamentos (incluindo grupos controlo), indicando níveis semelhantes de stresse. Uma exposição a longo prazo pode fornecer evidências acerca da importância dos movimentos ciliares das células epidérmicas ou muco na ingestão e / ou remoção de MPs por Z. sociatus. Considerando que as espécies de corais apresentam diferentes comportamentos e fisiologias, é expectável que a ingestão de MPs seja específica da espécie e potencialmente impulsionada pelas propriedades quimiorreceptoras do pólipo, o que foi sublinhado por investigações anteriores (ALLEN et al., 2017; REICHERT et al., 2018, REICHERT et al., 2019).

A elevada adesão do PVC nos corais no estudo poderá explicar em parte os resultados obtidos ao nível da fotobiologia. Especificando, poderá ter contribuído para um “sombreamento” da superfície do coral, bloqueando parcialmente a luz às zooxantelas, o que poderá explicar o consequente aumento da eficiência fotossintética (Fv/Fm) em corais expostos a estas mesmas condições. Resultados

semelhantes foram observados em estudos anteriores com corais duros (ordem Scleractinia) das famílias Acroporidae, Pocilloporidae e Merulinidae, cujos pólipos também revelaram uma relação positiva entre a área de superfície coberta por MPs e a eficiência fotossintética (TANG et al., 2018; MARTIN et al., 2019; SYAKTI et al., 2019). Nestes estudos, verificou-se que a eficiência fotossintética dos corais estava igualmente (e positivamente) correlacionada com a densidade do simbionte e do teor de clorofila (TANG et al., 2018). Embora não se tenham avaliado esses parâmetros em Z. sociatus, é hipotético que o aumento observado na eficiência fotossintética nessa exposição de curto prazo possa ter resultado em uma

23

reorganização das clorofilas no aparelho fotossintético, em vez de um aumento no número de zooxantelas.

A presença do polímero de LDPE (nas diferentes concentrações testadas) não afetou o consumo de energia nem induziu estresse ou dano oxidativo na espécie de estudo. No entanto, a presença de 10 mg/L de MPs de PVC induziu um dano lipídico significativo (ou seja, LPO) e a um aumento da atividade antioxidante da catalase (CAT), sem alteração no consumo de energia (ETS) e capacidade de desintoxicação (GST). O aumento do dano lipídico e da atividade da catalase em Z. sociatus exposto à maior concentração de MPS de PVC pode estar relacionado a um incremento nas espécies reativas de oxigénio (ERO), como por exemplo o radical hidroxila (•OH) e o peróxido de hidrogénio (H2O2). A produção de ERO pode

ser o resultado de efeitos diretos da ingestão de MPs de PVC, cujas propriedades físico-químicas podem ter induzido respostas inflamatórias pelas possíveis abrasões nos tecidos mesentéricos na cavidade intestinal do coral; ou efeitos indiretos, por potenciais plastificantes/aditivos de PVC (por exemplo, ftalatos, que normalmente estão ausentes em partículas pristinas de LDPE) que podem ter lixiviado durante a exposição e consequentemente alterados os processos de digestão / ingestão. Outra possível explicação pode estar relacionada com a alteração na capacidade fotossintética e das trocas gasosas do coral causada pelo elevado número de MPs aderidos à sua epiderme. Essa hipótese é parcialmente sustentada pelos resultados transcriptómicos de Pocillopora damicornis expostos a outro MP altamente denso (poliestireno), que mostrou um incremento na atividade da CAT, juntamente com 134 genes sobre-expressos, principalmente relacionados à resposta ao estresse oxidativo, grânulo de zimogénio e via de sinal do gene JNK (proteína que ajuda a regular o processo de auto-destruição celular), juntamente com 12 genes relacionados aos transportadores de solutos orgânicos (TANG et al., 2018). Também revelou uma diminuição nos níveis de GST, mas em uma concentração cinco vezes maior que a testada em nosso estudo (50 mg/L).

Juntamente com o stresse oxidativo, esperava-se um incremento no consumo de energia. Uma ingestão, interação e subsequente egestão de itens alimentares ou partículas em suspensão (como os MPs) envolve geralmente movimentos energeticamente dispendiosos dos tentáculos dos pólipos, juntamente

24

com a contração do tecido. Da mesma forma, quando enfrentam alta aderência de partículas à epiderme, os corais tendem a removê-las ativamente através da produção de muco ou pela ação ciliar ativa (ABDEL-SALAM et al., 1988). Esses processos podem, portanto, ser energeticamente dispendiosos e levariam a um aumento esperado no consumo de energia. No entanto, este não foi o caso de Z. sociatus nas condições testadas, mesmo na concentração mais elevada de PVC, onde foi observado um alto número de MPS aderidos, sugerindo respostas fisiológicas basais aos MPs. O consumo de energia pode, no entanto, ocorrer em uma exposição a longo prazo.

5. CONSIDERAÇÕES FINAIS

No geral, este estudo fornece as primeiras evidências acerca do efeito dos MPs numa espécie de coral que não duro. Os resultados obtidos revelam que uma curta exposição a concentrações de 10 mg/L de MPs de elevada densidade podem afetar a fotobiologia e os mecanismos de resposta ao stresse oxidativo de Z. sociatus (e talvez outros zoantídeos com ecofisiologia semelhante). Embora os efeitos observados tenham sido aparentemente em menor extensão, esses efeitos podem se acumular ao longo da vida de um coral. A ausência de efeitos por MPs de LDPE deve, no entanto, ser cuidadosamente extrapolada para ambientes naturais. Uma vez em ambientes aquáticos, partículas de baixa densidade como o polietileno podem passar por processos como agregação e interação com partículas e microorganismos em suspensão (por exemplo, microalgas, bactérias e fungos), levando a um aumento da densidade e subsequente sedimentação (LAGARDE et al., 2016; GALLOWAY et al., 2017), o que poderia resultar em efeitos mais elevados como os relatados neste estudo. As respostas obtidas pelo organismo aos MPs (particularmente de PVC) foram relatadas para concentrações mais elevadas às ambientalmente reportadas, embora menores do que as testadas em corais até ao momento. No entanto, a concentração de MPs no meio ambiente tendem a aumentar com o tempo, o que sublinha a relevância deste estudo num cenário futuro.

Nos sistemas naturais de recifes, a poluição por MPs pode interagir com stressores existentes e ampliar a suscetibilidade dos corais ao branqueamento e

25

doenças. Isso pode levar ainda mais os corais a um ponto crítico e promover mudanças na comunidade nas assembleias de recifes de coral. Portanto, acreditamos que estudos futuros devem considerar o efeito combinado de MPs com outros stressores (naturais ou antropogénicos), para uma avaliação de risco adequada. O contínuo declínio na cobertura de corais e mudanças na composição da comunidade em escala global acarretam graves consequências económicas, sociais e ecológicas, e são pouco documentadas.

26

6. BIBLIOGRAFIA

ABDEL-SALAM HA, PORTER JW (1988). Physiological effects of sediment rejection on photosynthesis and respiration in three Caribbean reef corals. p. 285-292. In Choat, JH, Barnes D, Borowitzka MA, Coll JC, Davies PJ, Flood P, Hatcher BG, Hopley D, Hutchings PA, Kinsey D, Orme GR, Pichon M, Sale PF, Sammarco P, Wallace CC, Wilkinson C, Wolanski E, and Bellwood O (eds.) Proceedings of the 6th International Coral Reef Symposium: Vol. 2: Contributed Papers. Townsville, Australia.

ALLEN AS, SEYMOUR AC, RITTSCHOF D (2017) Chemoreception drives plastic consumption in a hard coral. Marine Pollution Bulletin 124:198–205.

ANDRADY, AL( 2011). Microplastics in the marine environment. Marine pollution bulletin, 62(8), 1596-1605.

ASHTON, K, HOLMES, L, TURNER, A. (2010). Association of metals with plastic production pellets in the marine environment. Marine Pollution Bulletin. N.60,p. 2050–2055.

AVIO CG, GORBI S., REGOLI F. (2016) Plastics and microplastics in the oceans: from emerging pollutants to emerged threats. Marine Environmental Research: 1-30.

BAIRD, AH, GUEST, JR, WILLIS, BL, (2009). Systematic and biogeographical patterns in the reproductive biology of Scleractinian corals. Annu. Rev. Ecol. Evol. Syst. 40, 551–571.

BEBIANNO, MJ, PEREIRA, CG, REY, F., CRAVO, A., DUARTE, D., D’ERRICO, G., REGOLI, F. (2015). Integrated approach to assess ecosystem health in harbor areas. Science of The Total Environment, v. 514, p. 92-107.

BETTS, K (2008). Why small plastic particles may pose a big problem in the oceans. Environmental Sciense Technology, n.42, p.8995–8995.

27

BIRD, RP; DRAPER, H (1984) Comparative studies on different methods of malonaldehyde determination. Methods Enzymol 105:299–305.

BRADFORD, MM.; BRADFORD, MM (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72:248–254.

CESA, FS. (2017). Microplásticos texteis: emissão de fibras sintéticas na lavagem doméstica. Dissertação apresentada para grau de Mestre em Têxtil e Moda, Universidade de São Paulo (USP), 156 p.

CHEANG CC, MA Y, FOK L (2018) Occurrence and Composition of Microplastics in the Seabed Sediments of the Coral Communities in Proximity of a Metropolitan Area. Int J Environ Res Public Health 15:2270–12.

CLAIRBORNE A. (1985) Catalase activity. In: Greenwald, R.A.E. (Ed.), Handbook of Methods for Oxygen Radical Research. CRC Press, Boca Raton, pp. 283–284. CRITCHELL, K.; HOOGENBOOM, MO (2018). Effects of microplastic exposure on the body condition and behaviour of planktivorous reef fish (Acanthochromis polyacanthus). PLoS ONE, v. 13, n. 3, p. 1–19.

CRUZ, S., SERÔDIO, J.,(2008). Relationship of rapid light curves of variable fluorescence to photoacclimation and non-photochemical quenching in a benthic diatom. Aquatic Botany 88, 256-264.

DE COEN, WM.; JANSSEN, CR (1997) The use of biomarkers in Daphnia magna toxicity testing. IV. Cellular energy allocation: a new methodology to assess the energy budget of toxicant-stressed Daphnia populations. Journal of Aquatic Ecosystem Stress and Recovery 6:43–55

DERRAIK, JG( 2002). The pollution of the marine environment by plastic debris: a review. Marine Pollution Bulletin, 44(9), 842-852.

De WITTE B., DEVRIESE L., BEKAERT K., HOFFMAN S., VANDERMEERSCH G., COOREMAN K., ROBBENS J., (2014). Quality assessment of the blue mussel

28

(Mytilus edulis): comparison between commercial and wild types. Marine Pollution Bulletin 85, 146–155

DOYLE, MJ, WATSON, W., BOWLIN, NM, & SHEAVLY, SB (2011). Plastic particles in coastal pelagic ecosystems of the Northeast Pacific ocean. Marine Environmental Research, 71(1), 41-52.

DING, J. ;JIANG, F.; LI, J.; WANG, Z.; SUN, C.; WANG, Z.; FU, L.; DING, N. X.; HE, C. (2019). Microplastic in the coral reef system from Xisha Island of South China sea. Enviromental Science and Technology, n. 53,p. 8036−8046.

FRIAS JPGL & NASH R. (2019) Microplastics: finding a consensus on the definition. Marine Pollution Bulletin 138: 145-147.

FRIAS, JPGL; OTERO, V.; SOBRAL, P. (2017). Evidence of microplastics in samples of zooplankton from Portuguese coastal waters. Marine Environmental Research, v. 95, n. November, p. 89–95, 2014.

GESAMP. (2015). Sources, fate and effects of microplastics in the marine

environment: a global assessment. (Kershaw, P. J., ed.).

(IMO/FAO/UNESCOIOC/UNIDO/WMO/IAEA/UN/UNEP/UNDP Joint Group of Experts on the Scientific Aspects of Marine Environmental Protection). Rep. Stud. GESAMP No. 90, 96 p.

GESAMP (2016). Sources, fate and effects of microplastics in the marine

environment: a global assessment. (Kershaw, P. J., ed.).

(IMO/FAO/UNESCOIOC/UNIDO/WMO/IAEA/UN/UNEP/UNDP Joint Group of Experts on the Scientific Aspects of Marine Environmental Protection). Rep. Stud. GESAMP No.93, 220p.

Geyer R, Jambeck JR, Law KL (2017) Production, use, and fate of all plastics ever made. Science Advances Vol. 3, no. 7, e1700782

HALL NM, BERRY KLE, RINTOUL L, HOOGENBOOM MO (2015) Microplastic ingestion by scleractinian corals. Marine Biology 162:725–732.

29

HETZEL, B. & CASTRO, C. B. (1994). Corais do sul da Bahia. Editora nova fronteira: Rio de Janeiro. 189p.

LAMB JB, WENGER AS, DEVLIN MJ, et al (2016) Reserves as tools for alleviating impacts of marine disease. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences 371:20150210–11.

LAMB JB, WILLIS BL, FIORENZA EA, COUCH CS, HOWARD R, et al. (2018) Plastic waste associated with disease on coral reefs. Science 359:460–462

LEAL, CM, ROCHA, RJM, ANAYA-ROJAS, JM, CRUZ, ICS, FERRIER-PAGÈS, C. (2017). Trophic and stoichiometric consequences of nutrification for the interdidal tropical zoanthid Zoabthus sociatus. Marine Pollution Bulletin, n119,p. 169-175. LEVY O, ACHITUV Y, YACOBI YZ, et al (2006) The impact of spectral composition and light periodicity on the activity of two antioxidant enzymes (SOD and CAT) in the coral Favia favus. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology 328:35– 46.

MARTIN C, CORONA E, MAHADIK GA, DUARTE CM (2019) Adhesion to coral surface as a potential sink for marine microplastics. Environmental Pollution 255:113281.

MOORE, E; SANDER, F.(1976). Quantitative and qualitative aspects on the zooplankton at two Caribbean coral reef stations. Estuarine and Marine Coastal Science. V.4, p. 589-607.

NOBRE, CR , SANTANA, MFM. , MALUF, A. , CORTEZ, FS , CESAR, A. , PEREIRA, CDS , TURRA, A. (2015). Assessment of microplastic toxicity to embryonic development of the sea urchin Lytechinus variegatus (Echinodermata: Echinoidea). Marine Pollution Bulletin. V.92, P. 99-104.

OKUBO, N.; TAKAHASHI, S.; NAKANO, Y. (2018). Microplastics disturb the anthozoan-algae symbiotic relationship. Marine Pollution Bulletin, n. 135, p.83–89.

30

PLASTIC EUROPE (2015) APME: Analysis of European plastic production, demand and waste data, Brussels (BE): Association of plastic manufacturers. Disponível em: https://www.plasticseurope.org/application/files/3715/1689/8308/2015plastics_the_ facts_14122015.pdf

PRATA JC, REIS V, MATOS JTV, et al (2019) A new approach for routine quantification of microplastics using Nile Red and automated software (MP-VAT). Science of the Total Environment 690:1277–1283

RABELO EF, SOARES M de O, BEZERRA LEA, MATTHEWS-CASCON H (2015) Distribution pattern of zoanthids (Cnidaria: Zoantharia) on a tropical reef. Marine Biology Research 11:584–592

REICHERT, J. SCHELLENBERG, J., SCHUBERT, P., WILKE, T. (2018). Responses of reed building corals to microplastic exposure. Environmental Pollution, 237, p. 955-960.

REICHERT J, ARNOLD AL, HOOGENBOOM MO, et al (2019) Impacts of microplastics on growth and health of hermatypic corals are species-specific. Environmental Pollution 254:113074.

RIOS, LM, MOORE, C, JONES, PR. (2007). Persistent organic pollutants carried by synthetic polymers in the ocean environment. Marine Pollution Bulletin. N.54,p.1230–1237.

ROCHA, RJM., SERÔDIO, J., LEAL, MVC, CARTAXANA, P., CALADO, R., (2013c). Effect of light intensity on post-fragmentation photobiological performance of the soft coral Sinularia flexibilis. Aquaculture 388, 24–29.

ROHLFS, C.; BELÉM, MJC. (1994). O Gênero Zoanthus no Brasil. I. Caracterização e Revisão anatômuca de Zoanthus sociatus (Cnidaria, Zoanthinaria, Zoanthidae). IHERINGIA, Sér. Zool., Porto Alegre (77), p. 135-144.

SANTOS MEA, KITAHARA MV, LINDNER A, REIMER JD (2015) Overview of the order Zoantharia (Cnidaria: Anthozoa) in Brazilian Marine Biodiversity 46:547–559.

31

SCHREIBER, U., 2004. impulsos de modulação de amplitude (PAM) fluorometria e saturação método de pulso: uma vista geral, em: Papageorgiou, GC, Govindjee (Eds.), fluorescência da clorofila a: Uma assinatura de fotossíntese. Holanda, pp. 279-319.

SCHNEIDER, CA.; RASBAND, WS & ELICEIRI, KW (2012), "NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis", Nature methods 9(7): 671-675, PMID 22930834

SILVA, JLA (2018). Plâncton e microplásticos flutuantes dos recifes de Serrambi (Ipojuca, PE), durante um ciclo circadiano. Monografia (Licenciatura de Biologia), 36p.

SORIANO-SANTIAGO OS, LIÑÁN-CABELLO MA, DELGADILLO-NUÑO MA, et al (2013) Physiological responses to oxidative stress associated with pH variations in host tissue and zooxanthellae of hermatypic coral Pocillopora capitata. Marine and Freshwater Behaviour and Physiology 46:275–286.

SUNDT, P; SCHULZE, P; SYVERSEN, F. (2014). Sources of microplastic-pollution to the marine environment. Norwegian Environment Agency, p. 1-108.

SYAKTI AD, JAYA JV, RAHMAN A, et al (2019) Bleaching and necrosis of staghorn coral (Acropora formosa) in laboratory assays: Immediate impact of LDPE microplastics. Chemosphere228:528–535.

TANG J, NI X, ZHOU Z, et al (2018) Acute microplastic exposure raises stress response and suppresses detoxification and immune capacities in the scleractinian coral Pocillopora damicornis. Environmental Pollution 243:66–74.

THOMPON RC, et al., 2004. Lost at sea: where is all the plastic? Science 304 (5672), 838.

32

UNEP (2015). Biodegradable plastics and marine litter misconceptions, concerns and impacts on marine environments. United Nations Environment Programe (UNEP). Nairobi.

UNEP (2016). Marine plastic debris and microplastic: global lessons and research to inspire action and guide policy change. United Nations Environment Programe (UNEP). Nairobi.

WILD C, HUETTEL M, KLUETER A, et al (2004) Coral mucus functions as an energy carrier and particle trap in the reef ecosystem. Nature 428:66–70.

WRIGHT, SL; THOMPON, RC.; GALLOWAY, TS.(2013) The physical impacts of microplastics on marine organisms: A review. Environmental Pollution, v. 178, n. March, p. 483–492.

ZETTLER, ER, MINCER, TJ, AMARAL-ZETTLER, L.A., (2013). Life in the «Plastisphere»: microbial communities on plastic marine debris. Environmental Science & Technology.