ANDERSON DO ESPIRITO SANTO PEREIRA
“NANOPARTÍCULAS DE POLI-ÉPISLON CAPROLACTONA
CONTENDO O HERBICIDA ATRAZINA: DO PREPARO E
CA-RACTERIZAÇÃO A AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE HERBICIDA”
CAMPINAS 2013
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Agradecimentos
Começo agradecendo primeiramente a Deus, por ter uma presença tão for-te em minha vida, sendo sempre sinônimo de força, ao meu padroeiro São Miguel Arcanjo, a virgem mãe Maria Santíssima e meu anjo da guarda que sempre me guiam em luz.
Agradeço ao CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico), UNICAMP e a UNESP/Sorocaba pelo apoio, formação e estrutura que foram fundamentais no desenvolvimento do trabalho.
Uma grande gratidão ao Prof. Dr. Leonardo Fraceto, por ter me aceitado como seu aluno, pelos ensinamentos, puxões de orelha e por ser uma pessoa ín-tegra e digna, que será com toda certeza um exemplo profissional e como pessoa para minha vida
.
Aos meus companheiros e amigos de laboratório, Renato Grillo e Nathalie Melo, por dividirem seus conhecimentos, dedicarem de seu tempo para me ensi-nar o que sabem, muito aprendi com eles e muito do que apresento neste trabalho devo a eles.
Agradecer sempre aos meus pais, por me amarem muito, aos meus irmãos Marcio (Trambs), Alessandro (Lerdo) e Adriano (Drica) e que nunca esqueçamos o significado da palavra “irmão”, a minha cunhada Andréia e minhas sobrinhas lin-das Camilla e Sarah que mesmo longe, sei que torcem por mim.
A Nathy Zocal por sempre estar ao meu lado, me ouvir e me entender, mui-tas vezes mesmo sem saber o motivo! Ao Roger, simplesmente por que ele é o Roger “grande amigo”, a Lu Vieira e Renan Monteiro por fazerem parte da minha vida, minha família há tantos anos, ao Edinho Riberio, meu grande irmão de todas as horas, as minhas primas Sil e Carla pelo carinho, atenção, preocupação e ami-zade, ao Dennis Maletich pelo qual tenho grande estima.
Aos meus grandes amigos, amigas, irmãos e irmãs da vida, a vocês que tanto me ensinam e que também não há como explicar a importância de todos vocês em minha vida.
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A “Revolução Verde” ocorreu na década de 60 e previa o aumento da produção agrícola devido ao crescimento populacional, onde foi intensificado o estudo de novas tecnologias para o aumento da produção de alimentos e rentabilidade dos agricultores. Entre as várias tecnologias, destacou-se a utilização de defensivos agrícolas no controle, prevenção e na eliminação de doenças que interferem na produtividade agrícola. O uso de nanopartículas (NPs) para o carreamento de compostos bioativos para liberação sustentada aumenta o tempo de ação e esta-bilidade química do ativo no meio, bem como a disponiesta-bilidade para ação junto ao organismo alvo. Na agricultura, o uso de NPs visa reduzir a concentração efetiva do ativo a ser utilizado, reduzir de aplicações, reduzir a toxicidade, diminuir a peri-culosidade e os riscos de contaminação ambiental. O presente trabalho propôs o desenvolvimento de NPs poliméricas de poli-épsilon caprolactona (PCL) como sis-temas carreadores para o herbicida atrazina (ATZ) bem como a avaliação das ca-racterísticas físico-químicas destes sistemas, a atividade herbicida e a genotoxici-dade das formulações preparadas. As nanocápsulas (NCs/ATZ) e as nanoesferas (NEs/ATZ) contendo ATZ apresentaram diâmetro médio de 483,1 ± 10,4 nm e 408,5 ± 2,5 nm, respectivamente. A ATZ apresentou uma eficiência de encapsula-ção acima de 90% para as formulações de NE e NC e foram observadas altera-ções no perfil de liberação da ATZ em comparação com o herbicida ATZ. A estabi-lidade coloidal e físico-química das formulações foi mantida por um período de 90 dias. O uso de NPs aumentou a retenção da ATZ em ensaios com coluna de solo, sendo que a atividade herbicida se mostrou mais eficaz quando comparada ao ativo ATZ apenas e ao de uma formulação comercial (Gesaprin). A investigação da genotoxicidade das formulações, utilizando o ensaio de aberração cromossô-mica Allium cepa, mostrou que a encapsulação da ATZ reduziu os efeitos sobre o número de aberrações cromossômicas quando comparadas ao ativo ATZ e à for-mulação comercial. As formulações de NPs contendo ATZ preparadas neste tra-balho apresentam grande potencial para aplicação na agricultura, uma vez que estas podem ter ação herbicida utilizando menor concentração de ativo, reduzem a mobilidade da ATZ no solo e diminuem os efeitos genotóxicos, tornando-se mais seguras ao meio ambiente e reduzindo os riscos de contaminação.
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Abstract
The “Green Revolution” occurred during the decade of 60 and it aimed towards the rapid increase on agriculture production due to population growth, when was inten-sified the research and and development to increase agriculture production and profitability. Among several technologies, herbicides and pesticides have emerged to control, prevent and destroy diseases that interfere in the agricultural productivi-ty. The use of nanoparticles (NPs), as drug delivery system loads to modified drug release profile, increase time of action and increased chemical stability is wells is increase in bioavailability. In agriculture the use of NPs can reduces the amount of chemical used and the number of applications with decrease in toxicity, minimizing the risks of an environmental contamination. This study aims to develop NPs pre-pared with poly-épsilon-caprolactone (PCL) as a carrier system for the herbicide atrazine (ATZ). The formulations were characterized and the herbicide activity and genotoxicity were investigated. The nanocapsules (NCs/ATZ) and nanospheres (NE/ATZ) containing ATZ showed a size average diameter of 483.1±10.4 nm and 408.5±2.5 nm respectively. The ATZ presented encapsulation efficiency over 90% on formulations of NC and NE. The release profiles of the ATZ encapsulated in NPs were changed in relation to the ATZ herbicide only. The colloidal stability over 90 days showed that the formulations were stable. The use of NPs increased the retention of ATZ on soil column and showing that the herbicide was more active when compared to ATZ or a commercial formulation (Gesaprin). The genotoxicity evaluation showed that the encapsulation of ATZ reduced the toxic effects on the number of chromosomal aberration when compared to active ATZ and commercial formulation. NPs formulation containing ATZ prepared in this study presented a great potential for application in agriculture, since these formulations have the same herbicide activity (using lower concentration of active compound), reduce the ATZ soil mobility and also decrease the genotoxicity effects of ATZ, and in this way, reducing the risks of environmental contamination.
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Figura 1: A) Estrutura química geral dos herbicidas triazínicos: os herbicidas triazínicos se diferenciam pelos grupos radicais R1, R2 e R3; B) Fórmula estrutural dos herbicidas
S-triazínicos ATZ, ametrina e simazina, sendo as principais diferenças estruturais devidas as alterações nos grupamentos R1 e R2. ... 23
Figura 2: Representação do processo de captação de luz no fotossistema II. A energia luminosa é captada pelos pigmentos fotossintéticos e transferida para o centro de reação P680, fazendo com que ocorra a excitação de elétrons. Estes elétrons entram em uma
cadeia transportadora dentro do sistema fotossintético II e posteriormente são transferidos ao fotosistema I. ... 24 Figura 3: Representação do processo de inibição do processo fotossintético por Hb triazínicos. A partir da figura, é possível observar que os Hb triazínicos se ligam à proteína D1 e, consequentemente, interrompem o transporte dos elétrons do sistema Qb para a
plastoquinona, cessando o fluxo de elétrons do fotosistema II para o I. ... 25 Figura 4: Nanopartículas poliméricas. A) Nanocápsulas poliméricas, sendo demonstrado o ativo tanto na parede polimérica como no núcleo oleoso. B) Nanoesferas poliméricas, sendo demonstrado o ativo retido na matriz polimérica. ... 29 Figura 5: Método de preparo das NPs poliméricas de PCL contendo ATZ. Inicialmente, é formada uma fase orgânica contendo polímero e ATZ, seguida de formação de emulsão óleo/água pela adição desta fase sob fase aquosa contendo PVA e posterior sonicação. Após o preparo da emulsão, foi realizada a remoção do solvente e concentração da formulação até que a ATZ ficasse a 1 mg/mL. ... 35 Figura 6: Representação esquemática da coluna de solo preparada para os ensaios de interação com solo e avaliação da atividade Hb. A coluna de solo foi dividida em 4 anéis denominadas por A, B, C e D, sendo a superfície do anel A o local de aplicação do Hb. . 41 Figura 7: Representação esquemática de uma plântula de mostarda. Nesta figura podem-se obpodem-servar as diferentes regiões (raiz, altura e número de folhas) que foram analisadas após o cultivo da mostarda nos diferentes anéis das colunas de solo. ... 45 Figura 8: Representação esquemática das principais etapas para a confecção de lâminas do ensaio de genotoxicidade em Allium cepa. ... 47 Figura 9: Distribuição de diâmetro hidrodinâmico das NPs de PCL com ou sem ATZ em função do tempo (0, 7, 30, 45, 60, 75 e 90 dias). Os valores representam a média de três análises (n=3), sendo as amostras medidas à 25 °C. ... 55 Figura 10: PDI das NPs de PCL com ou ATZ em função do tempo (0, 7, 30, 45, 60, 75 e 90 dias). Os valores são referentes à média de três análises (n=3), sendo as amostras medidas à 25°C. ... 56
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Figura 11: Valores de pH medidos nas suspensões coloidais contendo NPs de PCL com ou sem ATZ em função do tempo (0, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 dias). Os valores são referentes à média de três análises (n=3), sendo as amostras medidas à 25°C. ... 57 Figura 12: Valores de EE para o ativo ATZ nas NPs de PCL em função do tempo (0, 7, 30, 45, 60, 75 e 90 dias). Os valores são referentes a média de três análises (n=3), sendo as amostras medidas à 25°C. ... 58 Figura 13: Análise por espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier para A) ATZ; B) polímero PCL; C) NCs; D) NEs; E) NCs/ATZ; F) NEs/ATZ. Para as Figuras E e F, os números em vermelho representam as bandas do polímero PCL e os números em preto, as bandas para a ATZ. Os espectros foram coletados de 4000 a 400 cm-1, e representam a média de 32 varreduras, cada com resolução espectral de 2 cm-1. ... 60 Figura 14: Ensaio de cinética de liberação do herbicida ATZ. As curvas mostram o perfil da cinética de liberação da ATZ, NCs/ATZ e NEs/ATZ. Os dados representam a média de três experimentos realizados à 25 oC. ... 63 Figura 15: Análise do modelo matemático de Korsmeyer-Peppas para as NCs/ATZ (Equação 1 item 3.2.3.7). ... 65 Figura 16: Análise do modelo matemático de Korsmeyer-Peppas para as NEs/ATZ (Equação 1 item 3.2.3.7). ... 66 Figura 17: Perfil da umidade do solo medido para as diferentes frações da coluna de solo (A: 0-4 cm; B: 4-8 cm; C: 8-12 cm; D: 12-16 cm) para os diferentes tratamentos: negativo (apenas água), Comercial (formulação comercial de ATZ), ATZ, NC/ATZ, NE/ATZ. Valores expressos como a média de quintuplicatas determinados à temperatura de 25 oC. ... 68 Figura 18: Avaliação da distribuição de ATZ (em %) ao longo do perfil das colunas de solo para as formulações de ATZ, comercial, NCs/ATZ e NEs/ATZ. Valores expressos como a média de cinco experimentos realizados à 25oC. ... 69 Figura 19: Plantas Brassica sp cultivadas nos anéis de solo após duas semanas do plantio. Na Figura, estão representados os diferentes anéis para cada um dos tratamentos a) Negativo; b) Formulação Comercial; c) ativo ATZ; d) NC/ATZ e e) NE/ATZ. As frações da coluna estão dispostas na figura da esquerda (topo da coluna) para direita (base da coluna), sendo as frações A (0 a 4 cm); B (4a 8 cm); C (8 a 12 cm) e D (12 a 16 cm). .... 71 Figura 20: Plantas retiradas das frações das colunas de solo (A-D) após o período de duas semanas de cultivo. Na Figura, são apresentados resultados dos seguintes tratamentos: a) Formulação comercial; b) NCs/ATZ e c) NEs/ATZ. ... 72 Figura 21: Índice de germinação das sementes de Brassica sp nas diferentes frações de solo proveniente de cada tratamento. Valores representam a média do índice de
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determinados à 25 C. ... 73 Figura 22: Resultados das análises do comprimento da raiz observados ao longo do perfil da coluna de solo após a aplicação das formulações e crescimento das plantas por um período de duas semanas. A fim de realização de comparação entre os diferentes grupos foi feita análise estatística do parâmetro comprimento da raiz sendo representados em: a) comparação das formulações com o controle; b) comparação da formulação comercial e de NPs/ATZ com o ativo ATZ; c) comparação da formulação comercial com as NPs/ATZ. Valores representam a média de cinco determinações; *** p < 0,001; ** p < 0,01 e *p < 0,05. ... 74 Figura 23: Resultado das análises da altura da parte aérea das plantas observados ao longo do perfil da coluna de solo após a aplicação das formulações e crescimento das plantas após um período de duas semanas. A fim de realizar comparação entre os diferentes grupos foi feita análise estatística do parâmetro altura da parte aérea sendo representados em: a) comparação das formulações com o controle; b) comparação da formulação comercial e de NPs/ATZ com o ativo ATZ; c) comparação da formulação comercial com as NPs/ ATZ. Valores representam a média de cinco determinações; *** p < 0,001; ** p < 0,01 e *p < 0,05. ... 76 Figura 24: Resultados obtidos para a matéria verde das plantas observado ao longo do perfil da coluna de solo após a aplicação das formulações e crescimento das plantas sobre este solo. A fim de comparação entre os diferentes grupos foi feita análise estatística do parâmetro matéria verde, sendo representados em: a) comparação das formulações com o controle; b) comparação da formulação comercial e de NPs/ATZ com ATZ; c) comparação da formulação comercial com as NPs/ATZ. Valores representam a média de cinco determinações; *** p < 0,001; ** p < 0,01 e *p < 0,05. ... 78 Figura 25: Resultados obtidos para a matéria seca das plantas observados ao longo do perfil da coluna de solo após a aplicação das formulações e crescimento das plantas sobre este solo. A fim de realização de comparação entre os diferentes grupos foi feita análise estatística do parâmetro massa de matéria seca, sendo representados em: a) comparação das formulações com o negativo; b) comparação da formulação comercial e de NPs/ ATZ com o ativo ATZ; c) comparação da formulação comercial as NPs/ ATZ. Valores representam a média de cinco determinações; *** p < 0,001; ** p < 0,01 e *p < 0,05. ... 80 Figura 26: Comparação entre os pontos A (0-4 cm) e B (4-8 cm) para os parâmetros analisados: A) altura; B) comprimento das raízes; C) matéria verde; D) matéria seca, observados ao longo do perfil da coluna de solo após a aplicação das formulações e crescimento das plantas sobre este solo. A fim de realização de comparação entre os efeitos do ativo ATZ no ponto A da coluna de solo em relação aos efeitos da ATZ e as NPs no ponto B. Estatística: *** p < 0,001; ** p < 0,01 e *p < 0,05. ... 82
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Figura 27: Resultados obtidos para os parâmetros analisados A) número de folhas; B) altura; C) comprimento das raízes; D) matéria verde; E) matéria seca, observados ao longo do perfil da coluna de solo após a aplicação das formulações e crescimento das plantas sobre este solo. A fim de realização de comparação entre os efeitos da formulação comercial no ponto A da coluna de solo em relação aos efeitos da formulação comercial e as NPs no ponto B. Estatística: *** p < 0,001; ** p < 0,01 e *p < 0,05. ... 83 Figura 28: Imagem das células de Allium cepa obtidas por análise de microscopia ótica. A figura apresenta as principais fases de divisão celular (indicadas por setas) como: prófase, metáfase, anáfase e telófase. Imagem obtida com aumento de 40 vezes. ... 86 Figura 29: Valores dos índices mitóticos relativos, calculados para os diferentes tratamentos (controle, NPs/ATZ, NPs, ATZ e formulação comercial), obtido a partir das análises das lâminas de Allium cepa. Os dados representam a média das análises de três lâminas por tratamento. * Os valores de concentração são um indicativo de que as NPs encontram-se na mesma diluição das NPs/ATZ e desta forma, não representam a concentração das NPs e do ativo ATZ , uma vez que estas encontram-se sem ativo. ... 88 Figura 30: Índice de aberrações cromossômicas obtidas a partir da análise das lâminas de
Allium cepa expostas aos diferentes tratamentos (controle, NPs/ATZ, NPs, ATZ e
formulação comercial). Foram realizadas análise de três lâminas por tratamento: a) comparação estatística do ativo ATZ, formulação comercial, NCs/ATZ e NEs/ATZ em relação ao controle; b) comparação estatística da formulação comercial, NCs/ATZ e NEs/ATZ em relação à ATZ; c) comparação estatística das NCs/ATZ e NEs/ATZ em relação à formulação comercial. *** p < 0,001; ** p < 0,01 e *p < 0,05. **** Os valores de concentração são um indicativo de que as NPs encontram-se na mesma diluição das NPs/ATZ e desta forma, não representam a concentração das NPs e do ativo ATZ, uma vez que estas encontram-se sem ativo. ... 91
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Tabela 1: Condições cromatográficas para análise da ATZ por CLAE. ... 34 Tabela 2: Resultados da caracterização físico-química das NPs de PCL, contendo ou não ATZ. Dados de diâmetro (nm), índice de polidispersão (PDI), potencial zeta (PZ em mV), pH e eficiência de encapsulação da ATZ (EE) em %. Os valores apresentados indicam a média de três determinações. ... 51 Tabela 3: Ligações e faixas de absorção dos compostos ATZ, PCL, NCs, NEs, NCs/ATZ, NEs/ATZ encontradas por espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier. Espectros coletados em uma faixa de 4000 a 400 cm1, foram coletadas 32 varreduras com resolução de 2 cm-1. ... 62 Tabela 4: Valores da constante cinética de liberação (k) do expoente de liberação (n) coeficiente de correlação linear (r) das lineares obidas. ... 66 Tabela 5: Resultados obtidos a partir da análise das lâminas de Allium cepa para os diferentes tratamentos (controle, NPs/ATZ, ATZ e formulação comercial) em função de diferentes concentrações de ATZ, sendo as NPs sem ATZ avaliadas nas mesmas concentrações. Na tabela TCI, IM e IMR representam o total de células em intérfase, índice mitótico e índice mitótico relativo, respectivamente. Os valores de IM e IMR representam a média da análise de três lâminas... 87 Tabela 6: Resultados obtidos a partir da análise das lâminas de Allium cepa para os diferentes tratamentos (controle, NPs/ATZ, ATZ e formulação comercial) em função de diferentes concentrações de ATZ sendo as NPs sem ATZ avaliadas nas mesmas concentrações. Na tabela TDC = total de divisão celular; TAC = total de aberração cromossômica; TCI = total de células em intérfase MT = mutações; IAC = Índice de aberrações cromossômicas. Os valores representam a média da análise de três lâminas. ... 90
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Lista de Abreviaturas:
ANVISA: Agência de vigilância sanitária ATZ: Atrazina
CLAE: Cromatografia líquida de alta eficiência
DA: Defensivos Agrícolas
EE: Eficiência de encapsulação
FTIR: Espectroscopia de infravermelho por tomada de Fourier Hb: Herbicidas
IAC: Índice de aberração cromossômica
MAPA: Ministério da agricultura e meio ambiente
MT: Mutações
NCs/ATZ: Nanocápsulas de PCL encapsuladas com ATZ
NCs: Nanocápsulas
NEs/ATZ: Nanoesferas de PCL encapsuladas com ATZ
NEs: Nanoesferdas
NPs/ATZ: NCs e NEs encapsuladas com ATZ
NPs: Nanopartículas
PCL: Poli–epsílon caprolactona PDI: Índice de polidispersão
TCI: Total de célula em intérfase
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1. Introdução ... 17
1.1 Aumento da produção e rentabilidade na Agricultura ... 17
1.2 Defensivos agrícolas: uso e impactos ... 18
1.3 Plantas daninhas e herbicidas ... 21
1.3.1 Herbicidas inibidores fotossintéticos: S-Triazínicos ... 23
1.3.2 Herbicida Atrazina ... 25
1.4 Nanotecnologia e aplicações na agricultura ... 27
1.4.1 Nanopartículas poliméricas e aplicação na agricultura ... 29
2.
Objetivos ... 31
2.1 Objetivos Gerais ... 31 2.2 Objetivos Específicos ... 313 Materiais e Métodos ... 33
3.1 Materiais ... 33 3.2 Métodos ... 343.2.1 Quantificação da ATZ por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência ... 34
3.2.2 Preparo de nanocápsulas e nanoesferas de PCL contendo ATZ ... 34
3.2.3.1 Medidas de polidispersão e de diâmetro hidrodinâmico ... 36
3.2.3.2 Determinação do potencial zeta das suspensões de NPs ... 36
3.2.3.3 Estabilidade físico-química do polímero ... 37
3.2.3.4 Medida de eficiência de encapsulação ... 37
3.2.3 Avaliação da estabilidade das NPs ... 38
3.2.3.5 Caracterização por espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) ... 38
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3.2.4 Ensaios de interação com solo e avaliação da atividade herbicida ... 41
3.2.4.1 Ensaios em coluna de solo ... 41
3.2.4.2 Umidade do Solo ... 43
3.2.4.3 Análise de concentração de ATZ ao longo do perfil do solo ... 43
3.2.4.4 Avaliação da atividade herbicida ao longo do perfil da coluna de solo ... 44
3.2.5 Ensaio de aberração cromossômica em Allium cepa ... 46
3.2.5.1 Análises das lâminas obtidas no ensaio Allium cepa ... 48
4. Resultado e Discussão ... 51
4.1 Caracterização das NPs de PCL ... 51
4.2 Medidas de estabilidade das formulações. ... 54
4.3 Estudo da interação entre ATZ e NPs de PCL por espectroscopia de infravermelho ... 59
4.4 Ensaio de cinética de liberação da ATZ. ... 63
4.5 Ensaios de interação com solo e avaliação da atividade herbicida da atrazina .. 68
4.5.1 Índice de germinação ... 72
4.5.2 Avaliação de parâmetros quantitativos do efeito dos herbicidas ao longo da coluna de solo ... 74
4.5.3 Efetividade das formulações de NPs ... 81
4.6 Ensaio de Allium Cepa ... 85
4.6.1 Análise do efeito das formulações sobre o índice mitótico ... 85
4.6.2 Análise do efeito das formulações sobre o índice de Aberração Cromossômica .. 89
5. Conclusões ... 95
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1. Introdução
1.1 Aumento da produção e rentabilidade na Agricultura
A “Revolução Verde” ocorrida na década de 1960, movida pelo aumento da necessidade da produtividade rural, modernizou o campo com a intensificação do uso de máquinas agrícolas, equipamentos modernos, fertilizantes, defensivos agrícolas, sementes e matrizes melhoradas. Essa revolução foi importante para a expansão do setor agrícola, sendo fundamental para os avanços na área de quí-mica, engenharia mecânica e genética (AGUIAR & MONTEIRO, 2005).
Os usos destas tecnologias contribuíram para o aumento da produção e es-tima-se que até 2030 o mundo deverá aumentar em 40% sua produção agrícola para suprir a demanda de alimentos em escala mundial. Estima-se ainda que em 2030 a oferta de recursos naturais como água potável, disponibilidade de solo agriculturável, energética entre outros serão limitados e comprometidos pelas ações indiscriminadas do uso das tecnologias atuais (BEDDINGTON, 2010).
Estas tecnologias são escolhidas pela eficiência e rentabilidade para os produtores rurais, porém algumas delas são impactantes ao meio ambiente, afe-tando recursos naturais, que indiretamente afetam a população. Este fato gera discussões e debates sobre as vantagens da rentabilidade econômica versus im-pacto ambiental, na qual muitas vezes as escolhas levam em conta apenas o au-mento da rentabilidade (RODRIGUES, 2005).
Atualmente, devido ao aumento da demanda na produção de alimentos, existe ainda a necessidade de desenvolvimento de novas tecnologias para aplica-ção em agricultura (ZEIGHER & MOHANTY, 2010). Os organismos geneticamente modificados são umas das tecnologias empregadas que trazem benefícios devido à redução dos custos e ao aumento da produtividade agrícola (SILVEIRA et al., 2005).
Objetivos
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1.2 Defensivos agrícolas: uso e impactos
Defensivos agrícolas (DA) são substâncias químicas ou a mistura de subs-tâncias utilizadas para o controle, prevenção e eliminação de vetores de doenças que interferem na produção, elaboração, armazenamento, transporte e comerciali-zação de alimentos, produtos agrícolas, madeiras entre outros (MAPA, 2012; ALONZO & CORREIA, 2003).
Os DA podem ainda ser divididos em diferentes classes, de acordo com o foco de aplicação, dentre os quais, destacam-se: inseticidas, larvicidas, formicidas, acaricidas, carrapaticidas, nematicidas, moluscicidas, rodenticidas, raticidas, avici-das, fungicidas e herbicidas. Outros produtos também entram nesta lista, dentre os quais, agentes desfolhantes, antibrotantes, dessecantes e os conservadores de madeira (ALMEIDA et al., 1985). Dentre os DA, praguicidas ou pesticidas são classificados em quatro classes de acordo com o potencial tóxico, sendo: Classe I extremamente tóxicos, Classe II altamente tóxicos, Classe III mediamente tóxicos e por último a Classe IV considerados pouco tóxicos (SIQUEIRA & KUSE, 2008).
Na década de 1970, o uso de DA foi estimulado por políticas de estado, vinculados com a imagem da redução de trabalho, controle a pragas e benefícios na produção. A partir deste momento, esses produtos passaram a ser utilizados rotineiramente por trabalhadores rurais (SOUZA et al., 2011).
Desde então, os DA tem se tornado necessário à maioria dos sistemas ru-rais, sendo uma prática aplicada na maioria das culturas agrícolas, possibilitando o aumento da produção, com a diminuição do manejo e uso de recursos mecânicos por área cultivada (VEIGA, 2007). A não aplicação das normas de segurança bá-sica, a falta de informação sobre os riscos do uso destes produtos são quadros que agravam a contaminação humana e ambiental no Brasil (PERES & MOREI-RA, 2002). Desta forma, o aumento do uso de DA no Brasil deve levar em
consi-19
deração não só a aplicação, mas também o impacto que estes causam sobre o meio ambiente e a saúde humana (PEDLOWSKI et al., 2012).
Como exemplo, os recursos hídricos que atuam como integradores em pro-cessos biogeoquímicos superficiais ou subterrâneos são um dos principais desti-nos dos DA (RIBEIRO & LOURENCETTI, 2007). A contaminação de recursos hí-dricos por DA tem sido alvo de estudo na literatura (MILHOME et al., 2009; BRIT-TO et al., 2012; COPATTI et al., 2009) e tem demonstrado que no Brasil a maioria dos DA utilizados são encontrados nos corpos hídricos em concentrações dentro dos limites estabelecidos pelos órgãos regulatórios brasileiros, mas muitas vezes ultrapassam os limites estabelecidos por agências reguladoras da Europa (BRIT-TO et al., 2012; COPATTI et al., 2009).
Além da preocupação com a contaminação dos recursos hídricos, a Agên-cia Nacional de VigilânAgên-cia Sanitária (ANVISA, 2006), tem discutido a questão dos resíduos de DA em alimentos, somente em anos mais recentes com os avanços tecnológicos, a quantificação dos resíduos de insumos utilizados na agricultura vem permitindo avaliar a qualidade dos alimentos que chegam ao consumidor.
No Brasil, o programa para análise de DA em alimentos (PARA) tem levan-tado dados que chamam a atenção em relação à utilização desses produtos de produtores e de autoridades. O monitoramento de resíduos de DA em alimentos no período de 2001 a 2010 revelou que 48,3% das amostras se encontravam con-taminadas com algum tipo de DA. Desses, 13,2% apresentavam irregularidades como o uso de compostos não autorizados pela legislação brasileira, e menos de 3% apresentavam concentração de resíduos acima do recomendado. Destes 3%, a maioria dos alimentos estavam contaminados com DA da classe dos ditiocarba-matos (41,6%) e dos organofosforados (30,8%) (JARDIM & CALDAS, 2012).
Atualmente o conhecimento sobre os efeitos dos DA tem demonstrado os riscos que estes trazem à saúde humana e ao ambiente (GUILETTE & IGUSHI, 2012). Devido a sua intensa utilização, os DA são alvo de diversos estudos por
Objetivos
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causa dos danos gerados a saúde humana, em especial dos trabalhadores rurais que são os que apresentam maiores riscos de contaminação por DA. Estes podem ser absorvidos principalmente pela via dérmica e respiratória, podendo assim cau-sar intoxicações agudas ou crônicas (SILVA et al., 2005).
A exposição dos agricultores aos DA muitas vezes deve-se ao fato destes não utilizarem equipamentos de proteção individual, a falta de informação e co-nhecimento sobre a toxicidade dos produtos aumentando desta forma, o risco da exposição ocupacional que pode gerar efeitos genotóxicos e por consequência o desenvolvimento de neoplasias (PEREIRA et al., 2010; PACHECO & HACKEL 2002; BREGA et al., 1998).
Estudos sobre o impacto dos DA na saúde humana têm sido realizados, po-rém, ainda não é possível correlacionar à intensidade dos danos gerados com a quantidade de DA a que um indivíduo foi exposto, de forma aguda ou até mesmo, pelo seu uso prolongado (FARIA et al., 2007). Os efeitos dos DA no organismo permanecem por longos períodos, mesmo após a interrupção da exposição. A manutenção destes compostos químicos no organismo deve-se ao tempo de meia-vida do ativo e de seus metabólitos e também a fatores como a lipossolubi-dade da molécula que facilita o seu armazenamento no tecido adiposo (SOUZA et al., 2011). A concentração elevada de DA no organismo podem causar anomalias congênitas, doenças mentais e problemas relacionados à reprodução humana (SIQUEIRA & KRUSE; 2008).
Estes efeitos tóxicos apontados na literatura mostra que se fazem necessá-rias alternativas que tornem mais seguro a aplicação destes produtos como tam-bém uma maior fiscalização da utilização destes produtos por agricultores (GAR-CIA et al.; 2005).
21
1.3 Plantas daninhas e herbicidas
Plantas que infestam áreas agrícolas as quais não são do interesse do cul-tivo, são definidas como “daninhas”. São plantas com características pioneiras, possuem grande capacidade de reprodução e adaptação em diversos ambientes (PITELLI, 1987). Plantas daninhas não são capazes de produzir alimentos e habi-tam espontaneamente culturas agrícolas causando competição por luz, água e nutrientes e desta forma, reduzem o desenvolvimento das culturas agrícolas, oca-sionando resultados indesejáveis como plantas menores, queda na produção agrí-cola por hectare, redução no tamanho dos frutos e grãos, bem como retardam a maturação desses no campo (HERNANDEZ et al., 2007). Para o controle de plan-tas daninhas se usam DA denominados de herbicidas (Hb). O Brasil é um dos paí-ses que mais comercializam pesticidas, dentre os quais aproximadamente 50% são Hb (PEIXOTO et al., 2012).
Para o controle de plantas daninhas existem diferentes metodologias, den-tre as quais se destacam o controle mecânico (capinar) e o controle químico com a utilização de Hb. O controle mecânico possui alguns inconvenientes como alta demanda de tempo e mão de obra, altera a estrutura física do solo e pode danifi-car plantas não alvo. Por outro lado, os Hb atingem locais inacessíveis na área de plantio, reduzem ou eliminam os riscos de danos às raízes ou plantas novas, não alteram a estrutura física do solo (evitando assim a erosão), reduzem a mão de obra humana, aumentam a rapidez e eficiência da operação de controle de ervas daninhas. No entanto, demandam equipamentos para aplicação nas culturas e podem causar efeitos tóxicos ao ambiente e aos seres humanos (GOMES & CHRISTOFFOLETI, 2008).
Os Hb possuem a capacidade de provocar alterações metabólicas nas plan-tas daninhas levando as mesmas à morte, enquanto as planplan-tas não alvo apresen-tam resistência a estes produtos, fazendo com que os mesmos tenham uma ação seletiva (CAMPBELL & FARREL et al., 2007).
Objetivos
22
Normalmente após a aplicação à ação dos Hb depende de sua absorção e translocação na planta daninha e do metabolismo e sensibilidade da planta ao Hb e/ou aos seus metabólitos. Muitos Hb são classificados dependendo da forma de absorção e translocação no interior da planta, fazendo com que atinja o alvo celu-lar específico (SILVA et al., 2007).
Os Hb atuam principalmente de duas maneiras: inibindo a atividade enzimá-tica, levando células vegetais à morte ou inibindo o crescimento celular. Cada Hb (ou classe) tem um mecanismo de ação específico, por exemplo, o Hb benzoato de sódio 2,6-bis ((4,6-dimetoxipirimidim-2-i) oxi) (nome comercial: byspibac de só-dio) inibe a enzima acetolactato sintase (ALS, EC 2.2.1.6), enzima responsável pela síntese de aminoácidos de cadeia ramificada, além de bloquear fases do ciclo celular (MACHADO et al., 2006). O Hb clomazone inibe a síntese de carotenoides e pode gerar espécies reativas de oxigênio, causando assim estresse oxidativo nas células das plantas daninhas. Neste caso, são formadas espécies reativas de oxigênio como oxigênio singleto (1O2), superóxido (O-2), radical hidroxila (OH*) e
peróxido de hidrogênio (H2O2) que são capazes de peroxidar as membranas
lipídi-cas, levando a reação em cadeia que leva as células à morte (MACHADO et al., 2006).
No caso do Hb anitrol, seu mecanismo de ação visa inibir a síntese de caro-tenóides e, além disso, a de clorofila, fazendo com que as plantas sofram perda de pigmentação e por consequência sejam levadas à morte. Outros Hb, como o diu-ron, atuam no fotossistema, inibindo a transferência de elétrons no fotossistema II, enquanto outros Hb, como o diquat e paraquat, atuam no fotossistema I, compe-tindo com os aceptores de elétrons (CAMPBELL & FARREL, 2007).
Os processos de metabolização de Hb nas plantas podem ser classificados em quatro fases. A primeira fase é a transformação, na qual o composto pode so-frer processos de oxidação, redução e hidrólise. Na segunda fase, ocorrem rea-ções de conjugação do Hb com açúcares, devido à formação de uma ligação
gli-23
cosídica pela ação de enzimas glicosiltransferases. Este metabólito pode sofrer ação da enzima glutationa-S-transferase, que resulta em produtos menos fitotóxi-cos e mais solúveis em água. Na terceira fase, ocorre a compartimentalização, em que há o transporte do Hb (metabólitos) para dentro do vacúolo ou à matriz extra-celular. Já na quarta fase, ocorre o processamento completo destes compostos (COLEN, 1994).
1.3.1 Herbicidas inibidores fotossintéticos: S-Triazínicos
Os Hb triazínicos (Figura 1) são usados na agricultura para o controle de plantas daninhas, possuindo como mecanismo de ação a inibição do processo fotossintético. Entre os Hb triazínicos, destacam-se a atrazina (ATZ), a ametrina, a simazina e a propazina. Os Hb triazínicos possuem amplo espectro de aplicação e desta forma, podem ser utilizados em diferentes tipos de culturas para o controle pré e pós-emergente de ervas daninhas (COUTINHO et al., 2005).
Figura 1: A) Estrutura química geral dos herbicidas triazínicos: os herbicidas
tria-zínicos se diferenciam pelos grupos radicais R1, R2 e R3; B) Fórmula estrutural dos
herbicidas S-triazínicos ATZ, ametrina e simazina, sendo as principais diferenças estruturais devidas as alterações nos grupamentos R1 e R2.
Objetivos
24
Na fotossíntese, a energia luminosa é capturada pelos pigmentos fotossin-téticos (clorofilas e carotenóides), transferida ao centro de reação P680 do
fotossis-tema II, que oxida uma molécula de H2O gerando um elétron (Figura 2). Este
elé-tron é transferido à plastoquinona Qa que transfere o elétron à plastoquinona Qb
que se move através da membrana para a plastoquinona que transporta o elétron do fotosistema II para o I. No fotossistema I, a absorção de luz pelo centro de rea-ção P780 leva às series de reações de transferência de elétrons que ativa a enzima
ferredoxina NADP+ redutase, gerando NADPH (CAMPBELL & FARREL, 2007). Os íons de hidrogênio e a coenzima NADPH formados, respectivamente, nos fotossis-temas II e I, reduzem o pH no espaço tilacóide ativando a ATP sintase que inicia a produção de ATP.
Figura 2: Representação do processo de captação de luz no fotossistema II. A
energia luminosa é captada pelos pigmentos fotossintéticos e transferida para o centro de reação P680, fazendo com que ocorra a excitação de elétrons. Estes
elé-trons entram em uma cadeia transportadora dentro do sistema fotossintético II e posteriormente são transferidos ao fotosistema I.
25
Os Hb s-triazínicos competem pelo sítio da proteína D1 impedindo a trans-ferência de elétrons do fotossistema II para o I (ACHIM, 2008), conforme mostra a Figura 3. Desta forma, inibem a cadeia de transporte de elétrons, impedindo a oxi-dação da água no PSII e a produção de NADPH no PSI.
Figura 3: Representação do processo de inibição do processo fotossintético por
Hb triazínicos. A partir da figura, é possível observar que os Hb triazínicos se li-gam à proteína D1 e, consequentemente, interrompem o transporte dos elétrons do
sistema Qb para a plastoquinona, cessando o fluxo de elétrons do fotosistema II
para o I.
1.3.2 Herbicida Atrazina
Entre os Hb triazínicos, a atrazina - ATZ (6-cloro-N2-etil-N4-isopropil-1, 3, 5-triazina-2, 4-diamina) (Figura 1B) possui caráter básico devido aos seus grupos amino e a baixa solubilidade em água (33 mg/L) (MARTINAZZO et al., 2011). A aplicação de ATZ pode ser pré e pós emergente nas culturas de abacaxi, cana de
Objetivos
26
açúcar, milho, pinos, seringueira, sisal e sorgo, e ainda apresenta cerca de 40 di-ferentes produtos formulados com registro no Brasil (MAPA, 2012). A ATZ atua no fotossistema II, inibindo indiretamente a oxidação da água no fotossistema II, con-sequentemente impede formação de íons de hidrogênio e oxigênio. O bloqueio na transferência de elétrons para o fotossistema I impede a formação da coenzima NADPH. O bloqueio na transferência de elétrons tem como consequência a não ativação da ATP sintase, que gera energia para a célula vegetal, levando esta à morte (CAMPBELL & FARRELL, 2007).
As características do solo determinam a retenção da ATZ e o tempo de permanência, sendo que fatores como alta temperatura e chuva ajudam na degra-dação desse composto por aumento de atividade microbiana (BRIGHENTI et al., 2002). O uso da ATZ pode afetar plantas não alvo, reduzindo o desenvolvimento e a produtividade, gerando bioacumulação, podendo assim causar danos aos seres humanos (Li et al., 2012).
Além disso, a composição do solo influencia no efeito da ATZ em plantas daninhas, como exemplo, solos ricos em matéria orgânica causam uma redução na atividade Hb devido ao aumento da sorção no solo e consequentemente dimi-nuindo a biodisponibilidade deste composto para sua ação (DE SIMONE et al., 1992).
A sua ampla aplicação e a alta persistência em solo são frequentemente ci-tadas na literatura como principais fontes de contaminação de recursos hídricos (BORTOLLUZI et al., 2006; GRAYMORE et al., 2001). A contaminação de corpos hídricos por ATZ tem afetado o desenvolvimento de espécies aquáticas, levando a uma diminuição das taxas de reprodução destes (HAYES et al., 2002). Neste sen-tido, o desenvolvimento de sistemas que minimizem a contaminação de recursos naturais por ATZ é importante para redução de custos com processos de remedia-ção de áreas contaminadas (CORREIA & LANGEMBACH, 2006). Para minimizar os impactos causados por estes Hb tem-se descrito na literatura a utilização de
27
sistemas carreadores baseados em micropartículas e NPs. Esses carreadores se apresentam como uma alternativa interessante, pois além de reduzir efeitos tóxi-cos, melhoram as propriedades físico-químicas destes compostos (CEA et al., 2010; GRILLO et al., 2012, SILVA et al., 2010).
1.4 Nanotecnologia e aplicações na agricultura
A nanotecnologia envolve várias áreas da ciência como a biologia, farmácia e física, tendo a química como base para o seu desenvolvimento, devido os co-nhecimentos relacionados à estrutura, composição e propriedades da matéria em nível atômico e molecular (REY, 2003). Essa tecnologia consiste no uso de mate-riais na escala nanométrica que possuem propriedades físico-químicas diferencia-das como aumento da área superficial, mudanças nas propriedades mecânicas, ópticas, magnéticas ou químicas quando comparadas com o mesmo material em escala macroscópica (QUINA, 2004).
Existe uma grande diversidade de nanomateriais na forma de nanopartícu-las (NPs) que podem ser cnanopartícu-lassificados de acordo com o material de origem, como por exemplo os com bases carbonáceas, os de óxidos metálicos, os de materiais semi-condutores e os de metais como prata, ouro e ferro. Destaca-se ainda o de-senvolvimento de novos materiais como as nanofibras, nanofolhas e nanofios (KLAINE et al., 2008).
O emprego da nanotecnologia tem crescido exponencialmente e hoje se podem encontrar produtos no mercado que utilizam materiais em escala nanomé-trica em sua composição, assim como informações sobre a caracterização destes materiais, modelagem e simulação de suas propriedades (GALEMBECK et al., 2007; MCNEIL, 2005).
O desenvolvimento de nanomateriais pela indústria visa aplicações em me-dicina, como exemplo seguem as NPs para diagnóstico de doenças, próteses
con-Objetivos
28
tendo materiais nanoestruturados que aumentam a resistência mecânica e a dura-bilidade do material, bem como os sistemas de liberação de fármacos. Destaca-se que a aplicação destes materiais na área farmacêutica/médica deve ocupar o ter-ceiro lugar do setor de nanotecnologia até 2015 (REDIGUIERI, 2009).
A mesma estratégia que está sendo utilizada para a área farmacêuti-ca/médica tem sido aplicada visando melhorar problemas da agricultura. A nano-tecnologia aplicada à agricultura é bastante recente e procura promover o desen-volvimento de produtos/processos/dispositivos que aumentem as vantagens em relação aos sistemas convencionais. As aplicações de nanotecnologia em agricul-tura vão desde a detecção de doenças através do uso de nanosensores, passan-do pela liberação/direcionamento de nutrientes às plantas, aumento passan-do tempo de armazenamento de alimentos, até a redução da quantidade de DA utilizados, cau-sando assim menor contaminação ambiental e à saúde humana (CHEN & YADA et al., 2011; GARCIA et al., 2010; NAIR et al., 2010; RAMOS et al., 2009).
Um exemplo do uso de nanomateriais em agricultura é o desenvolvimento de filmes comestíveis para revestimento de frutas e legumes que utilizam materi-ais nanoestruturados em sua composição, fazendo assim com que o tempo de armazenamento em prateleira seja aumentado devido a proteção desses alimen-tos da degradação por microrganismos (MEDEIROS et al., 2011).
29
1.4.1 Nanopartículas poliméricas e aplicação na agricultura
As NPs poliméricas podem ser encontradas na forma de nanoesferas (NEs) e nanocápsulas (NCs) devido às diferenças em seus aspectos estruturais. As NCs são constituídas por um invólucro polimérico, disposto ao redor de um núcleo ole-oso. A substância a ser encapsulada pode ser encontrada interagindo com a pa-rede polimérica ou distribuída no núcleo oleoso. Já as NEs diferem das NCs, pois em sua composição não há óleo, sendo a partícula formada apenas pela matriz polimérica. Nestas partículas a substância pode ser encapsulada na matriz polimé-rica ou adsorvida na superfície da partícula (Figura 4) (MÜLLER et al., 2002).
Figura 4: Nanopartículas poliméricas. A) Nanocápsulas poliméricas, sendo
de-monstrado o ativo tanto na parede polimérica como no núcleo oleoso. B) Nanoes-feras poliméricas, sendo demonstrado o ativo retido na matriz polimérica.
As NPs poliméricas podem ser utilizadas como sistemas carreadores de compostos bioativos, levando a uma liberação modificada, podendo prolongar o tempo de ação deste ativo, bem como, direcionar o ativo ao organismo alvo com maior eficiência.
Sistemas de carreamento baseados em NPs podem resultar em produtos com maiores benefícios para agricultura (WANYIKA et al., 2012), podendo aumen-tar a distribuição desses produtos na área foliar proporcionando uma maior
efici-Objetivos
30
ência (LIU et al., 2008). A utilização de NPs como sistemas carreadores de Hb pode trazer benefícios, dentre eles a diminuição de processos de lixiviação, mini-mizando assim possíveis contaminações de recursos hídricos subterrâneos (CEA et al., 2010).
Tradicionalmente, os DA são aplicados várias vezes ao longo do período de cultivo de uma cultura. Esta estratégia é realizada muitas vezes, pelo fato da con-centração do ativo que chega aos organismos alvos não atingir a quantidade mí-nima efetiva em uma primeira aplicação, fato este devido a fatores como: degra-dação do ativo, sorção em solo, processos de lixiviação entre outros (NAIR et al., 2010).
O uso de NPs para inseticidas além de se apresenta como uma alternativa mais eficiente e econômico para a proteção de lavouras (SARKAR et al., 2012; POPAT et al., 2012), reduzindo a concentração efetiva e prolongando o tempo de ação quando comparado com produtos não baseados em NPs, promovendo maior controle de insetos (LOHA et al., 2012) e também pode reduzir a intoxicação de organismos não alvo (LI et al., 2012).
Vários sistemas de NPs preparadas utilizando diferentes tipos de polímeros como poli-(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) (PHBV), poli(ε-caprolactona), alginato/quitosana possuem grande potencial para aplicação de DA na agricultura, uma vez que por serem biodegradáveis poderão melhorar o direcionamento des-tes compostos aos organismos alvos, causando assim menores impactos ao am-biente (CEA et al., 2010; GRILLO et al., 2012; LOBO et al., 2011; POPAT et al., 2012; SILVA et al., 2012; SARKAR et al.; 2012).
31
2.
Objetivos
2.1 Objetivos Gerais
O presente trabalho teve como objetivo preparar e caracterizar NCs e NEs poliméricas de poli-épsilon-caprolactona como sistema carreador para o Hb ATZ, visando futuras aplicações em agricultura de forma a gerar alternativas mais segu-ras para o uso desse Hb.
2.2 Objetivos Específicos
Preparo das NPs poliméricas (NCs e NEs) contendo o Hb ATZ pelo método de emulsificação seguida de evaporação do solvente;
Determinação da eficiência de encapsulação do Hb ATZ nas NPs poliméri-cas por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE);
Caracterização físico-química através da medida de distribuição de tama-nho e potencial zeta das NPs por espectroscopia de correlação de fótons, microeletroforese e espectroscopia de infravermelho por tomada de Fourier (FTIR);
Avaliação do perfil de liberação através dos ensaios de cinética de libera-ção da ATZ encapsulada ou não e avalialibera-ção do mecanismo de liberalibera-ção através da aplicação de modelo matemático de Korsmeyer-Peppas;
Avaliação da atividade Hb, através de ensaios em coluna de solo para ava-liar o comportamento da ATZ encapsulada nas NPs ou não em solo, segui-do da avaliação da atividade Hb ao longo segui-do perfil da coluna de solo;
Avaliação da genotoxicidade da ATZ encapsulada nas NPs ou não através do ensaio de aberração cromossômica em Allium cepa.
Materiais e Métodos
33
3 Materiais e Métodos
3.1 Materiais
ATZ (grau de pureza 95%)-Pestanal®
Poli(ε-caprolactona) PCL 65.000 Da Da-Sigma®
Triglicerídeos de ácidos cáprico e caprílico (Myritol® 318)- Cognis®
Diclorometano (grau espectroscópico analítico)- Cetus®
Acetona (grau espectroscópico analítico)- Merck®
Poli (vinil álcool), 87- hidrolisado 90%- (PVA)- Da Sigma
Agitador magnético- Tecnal®
Dispositivo de ultracentrifugação de celulose regenerada de 30 kDa-Millipore
Microcentrífuga-Ministar®
Evaporador Rotativo AL 390-American Lab®
Bomba à vácuo A12- Simbol®
pHmetro Tecnal®
Analisador de partículas Zetasizer modelo Nano ZS90- Malvern®
Sistema de cromatografia de alta eficiência- Varian® Pro star
Bomba PS 210 – Módulo de controle de solvente- Varian® Detector UV-Vis PS 210-Varian®
Coluna Cromatografica Varian® C18 fase reversa, 5µ 110A ,
Injetor Manual
Materiais e Métodos
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3.2 Métodos
3.2.1 Quantificação da ATZ por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
A metodologia analítica para a quantificação da ATZ foi previamente descri-ta por Grillo (2011), que permitiu obter um pico simétrico com boa resolução para quantificação deste ativo. As condições cromatográficas utilizadas neste estudo estão apresentadas na Tabela 1.
Tabela 1: Condições cromatográficas para análise da ATZ por CLAE.
Amostra ATZ
Fase Móvel Acetonitrila/água (50/50) v/v
Volume de injeção 100 µL
Fluxo 1 mL/minuto
Temperatura 25°C
Detector Ultravioleta (UV), ʎ=225 nm
Coluna cromatográ-fica
PHenomenex, Gemini 5 µm C18 110Angstron, 250x 4,60 mm
As condições cromatográficas descritas na Tabela 1 foram utilizadas para quantificação da ATZ a fim de determinar a eficiência de encapsulação, a avalia-ção do perfil de liberaavalia-ção, bem como da quantificaavalia-ção deste ativo nos ensaios com coluna de solo.
3.2.2 Preparo de nanocápsulas e nanoesferas de PCL contendo ATZ
O preparo das NPs (NEs e NCs) foi realizado pelo método descrito por Zhao e colaboradores (2011). Inicialmente, foi preparada uma fase orgânica
com-35
posta da mistura de duas soluções, uma com 400 mg de polímero (PCL) dissolvi-dos em 20 mL de diclorometano e outra com 10 mg de ATZ dissolvida em 10 mL de acetona. As duas soluções foram misturadas e sonicadas por 1 minuto (com 90% de potência) para melhor solubilização das fases orgânicas. Em seguida, foi adicionada a esta fase orgânica uma solução aquosa de PVA (3 mg/mL) sendo, em seguida, sonicada por 8 minutos na mesma condição de potência para obten-ção das NEs, formando assim uma emulsão óleo/água. Em seguida, esta emulsão foi colocada em rotaevaporador para remoção do solvente e redução do volume até 10 mL a fim de que a concentração final de ATZ fosse de 1 mg/mL. Após esta etapa as NPs foram armazenadas em frascos âmbar e a temperatura ambiente. Para o preparo das NCs foi realizado o mesmo procedimento, no entanto, adicio-nando 200 mg de Myritol na solução orgânica contendo o polímero (Figura 5).
Figura 5: Método de preparo das NPs poliméricas de PCL contendo ATZ.
Inicial-mente, é formada uma fase orgânica contendo polímero e ATZ, seguida de forma-ção de emulsão óleo/água pela adiforma-ção desta fase sob fase aquosa contendo PVA e posterior sonicação. Após o preparo da emulsão, foi realizada a remoção do sol-vente e concentração da formulação até que a ATZ ficasse a 1 mg/mL.
Materiais e Métodos
36
3.2.3.1 Medidas de polidispersão e de diâmetro hidrodinâmico
A partir da técnica de espalhamento de luz dinâmico ou espectroscopia de correlação de fótons foi possível determinar o diâmetro hidrodinâmico de NPs co-loidais, sendo o mesmo calculado pela equação de Stokes-Einstein (FORMARIZ et al., 2007). A aplicação desta técnica permite avaliar como é a distribuição de tamanho de uma suspensão coloidal, bem como, a avaliação do índice de polidis-persão das amostras a fim de verificar o quão homogêneo é o sistema. Esta técni-ca pode ser utilizada ainda para a avaliação da estabilidade coloidal em função do tempo, uma vez que pode se verificar a formação de possíveis agregados.
A espectroscopia de correlação de fótons foi aplicada para determinação do diametro hidrodinâmico das NPs de PCL contendo ou não ATZ. As suspensões coloidais foram diluídas em água deionizada (1:1000, v:v), seguida de análise no equipamento Zetasizer modelo Nano ZS 90 (Malvern), utilizando um ângulo fixo de 90° para detecção. As amostras foram analisadas a temperatura de 25°C sendo as medidas realizadas em triplicata e em função do tempo (0, 7, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 dias).
3.2.3.2 Determinação do potencial zeta das suspensões de NPs
O potencial zeta apresenta a carga superficial de uma partícula, esta carga pode ser influenciada pelas alterações na interface dependendo do meio disper-sante. Estas mudanças são geradas devido à dissociação de grupos funcionais na superfície da partícula ou à adsorção de espécies iônicas. Um alto valor de poten-cial zeta representa maior estabilidade físico-química da suspensão coloidal, uma vez que grandes forças repulsivas evitam agregações ocasionadas em função das colisões das NPs (SCHAFFAZICK et al., 2003).
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O potencial zeta das formulações foi determinado utilizando o equipamento Zetasizer Nano ZS 90 (Malvern), sendo as suspensões coloidais diluídas em água deionizada (1:1000, v:v). As análises foram realizadas em triplicata e em função do tempo (0, 7, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 dias).
3.2.3.3 Estabilidade físico-química do polímero
Alterações nos valores de pH de suspensões coloidais de NPs poliméricas pode ser um indicativo de degradação do polímero (SCHAFFAZICK et al., 2003). Afim de, avaliar a estabilidade química do polímero, foi realizada a medida de pH das suspensões de NPs e NPs/ATZ utilizando um potenciômetro (pHmetro Tec-nal®) acoplado a um eletrodo de pH previamente calibrado utilizando-se soluções tampão padrão em pH 4 e 7. As medidas foram realizadas em função do tempo (0, 7, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 dias).
3.2.3.4 Medida de eficiência de encapsulação
Para a determinação da eficiência de encapsulação (EE) da ATZ nas NPs de PCL, inicialmente, determinou-se o total de ATZ presente na formulação. Para isso, as suspensões de NPs foram dissolvidas em acetonitrila e, posteriormente, foram filtradas em membrana Millipore® de 0,22 µm. O filtrado foi, em seguida, analisado por CLAE de acordo com as condições cromatográficas descritas no item 3.2.1 para a quantificação dos 100% de ATZ presente nas NPs.
A medida da EE foi determinada de maneira indireta, uma vez que uma suspensão de NPs (1000 uL) foi submetida a centrifugação (6200 rpm) por 30 mi-nutos utilizando um sistema de ultrafiltração constituído de celulose regenerada
Materiais e Métodos
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com poro de exclusão molecular de 30 kDa (Microcon-Millipore®), sendo o filtrado (ATZ livre) quantificado por CLAE (item 3.2.1).
Desta forma, a partir do valor da quantidade de ATZ total e livre pode-se determi-nar a EE do ativo ATZ nas NPs, demonstrando que estas mantém o ativo encap-sulado em relação ao tempo. Esta metodologia tem sido utilizada na literatura para determinação da EE de compostos bioativos em NPs (GRILLO et al., 2011; MELO et al., 2010; SILVA et al., 2012). A EE foi medida em triplicata em função do tempo (0, 7, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 dias).
3.2.3 Avaliação da estabilidade das NPs
A avaliação da estabilidade das NPs de PCL contendo ou não ATZ foram realizadas a partir das medidas dos parâmetros de estabilidade coloidal como o tamanho (diâmetro hidrodinâmico), índice de polidispersão (PDI), potencial zeta e a estabilidade físico química das NPs através de medidas de pH das formulações em função do tempo (0, 7, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 dias).
3.2.3.5 Caracterização por espectroscopia de infravermelho com transforma-da de Fourier (FTIR)
As medidas de FTIR foram realizadas utilizando o equipamento Varian 660-R, sendo os espectros coletados em uma faixa de 4000 a 400 cm-1. Cada espectro foi obtido como uma média de 32 varreduras e com resolução de 2 cm-1. O prepa-ro das amostras de NPs para análises de FTIR foi realizado a partir de 2 mL de cada formulação (NCs, NEs, NCs/ATZ e NEs/ATZ) submetidas à centrifugação para formação de pellet que foi seco em estufa. Após essa etapa, as amostras foram submetidas à análise por FTIR com ATR (reflexão total atenuada). Devido
39
às características sólida e granular do polímero PCL, não foi possível realizar a mistura física com ATZ.
3.2.3.6 Ensaio de cinética de liberação
Para a avaliação do perfil de liberação da ATZ e NPs/ATZ foram realizados ensaios de cinética de liberação. Esse se baseia em um sistema com dois com-partimentos, um chamado de doador, onde foi inserida a formulação/solução con-tendo ATZ, separado do compartimento aceptor, por uma membrana de celulose (Spectrapore, com poro de exclusão molecular de 1200 Da).
O compartimento aceptor foi preparado em condição de diluição sink com água e mantido sob agitação leve durante todo o tempo do experimento (AUL-TON, 2002). As amostras foram coletadas em função do tempo, em intervalos de 15 minutos na primeira hora, de 30 minutos nas duas horas seguintes, e depois em intervalos de uma hora. As amostras coletadas foram analisadas por CLAE de acordo com as condições descritas no item 3.2.1. Os dados obtidos de concentra-ção foram convertidos em porcentagem de liberaconcentra-ção em funconcentra-ção do tempo. Os en-saios de liberação foram realizados em triplicata.
Materiais e Métodos
40
3.2.3.7 Modelagem matemática dos ensaios de liberação
O mecanismo de liberação da ATZ foi avaliado utilizando a equação semi-empírica proposta por Korsmeyer-Peppas de acordo com a Equação 1:
(Equação 1)
Onde Mt representa a quantidade total absoluta de ATZ liberada no tempo t
e M∞ corresponde a quantidade total de ATZ incorporado ao sistema polimérico no
tempo t = 0, k é a constante cinética de liberação e n o expoente de liberação. O expoente de liberação n se relaciona a forma geométrica do sistema de liberação e a partir do seu valor é possível determinar o tipo de mecanismo de liberação da ATZ das NPs. Valores de n iguais a 0,45 indicam que o ativo é liberado por um processo de difusão que segue a lei de Fick; valores de n acima de 0,89 indicam que a liberação do ativo se deve ao relaxamento da matriz polimérica e/ou libera-ção mediante a erosão da partícula; valores de n 0,45< n < 0,89 indicam que o ativo é liberado por transporte anômalo, ou seja, é a combinação dos processos de difusão e relaxamento das cadeias poliméricas/erosão da partícula (COSTA & LOBO, 2005; KORSMEYER & PEPAS; 1983).
41
3.2.4 Ensaios de interação com solo e avaliação da atividade herbicida
3.2.4.1 Ensaios em coluna de solo
Para avaliação da mobilidade e distribuição da ATZ em solo foi realizado o ensaio em coluna de solo. Para isso foram utilizados tubos de PVC com 3 centí-metros de diâmetro e 20 cm de comprimento, cortados em partes de 4 cm forman-do 5 anéis, uniforman-dos por fita adesiva para que não houvesse vazamento (Figura 6). A cada coluna foi adicionada a mesma quantidade de solo (162 mg) de forma a preencher 4 anéis (A a D), formando uma coluna de 16 cm de solo. Na extremida-de terminal da coluna, foi fixado papel extremida-de filtro para manter o solo na coluna.
Figura 6: Representação esquemática da coluna de solo preparada para os en-saios de interação com solo e avaliação da atividade Hb. A coluna de solo foi divi-dida em 4 anéis denominadas por A, B, C e D, sendo a superfície do anel A o local de aplicação do Hb.
Materiais e Métodos
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O solo utilizado para o preparo das colunas de solo é originário de uma re-manescente florestal, longe de área rural (coordenadas cartesianas: - 23,432628 (latitude), -47,369862 (longitude) e 601 metros de altitude). O solo foi previamente caracterizado pelo grupo de pesquisa do laboratório de química ambiental da UNESP/ Sorocaba sendo do tipo argissolo vermelho, constituído aproximadamen-te por 3,8 % de silaproximadamen-te, 11,29 % de argila e 84,8 % de areia, possuindo 3 % de maté-ria orgânica, com pH em torno de 5,4. O solo para preparo da coluna foi peneirado em malha de 2 mm e armazenado ao ar livre.
Após a construção das colunas, foi aplicada sobre a superfície do solo de cada coluna: formulação comercial de ATZ da marca GESAPRIM 500 CG (SYN-GENTA), ativo ATZ, NCs/ATZ, e NEs/ATZ na concentração recomendada por fa-bricantes de formulações comerciais de 2,5 kg/ha. Foram preparadas também co-lunas como controle, onde nestas foram aplicadas apenas água.
Após a aplicação da formulação no topo da coluna foram simuladas condi-ções de irrigação, adicionando água destilada, equivalente a 70 mm de irrigação (50 mL), dividida em duas partes de 25 mL, sendo os primeiros 25 mL aplicados com 24 horas e os outros 25 mL com 48 horas. A irrigação visou avaliar a distri-buição da ATZ (encapsulado ou não) através da coluna. Após a aplicação dos 50 mL de água e passado um período de 24 horas da última irrigação os quatro anéis da coluna de solo foram separadas para posterior quantificação da ATZ em cada fração e também para a avaliação da atividade Hb ao longo do perfil da coluna de solo. Estes ensaios foram realizados em quintuplicata.
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3.2.4.2 Umidade do Solo
Após o fracionamento da coluna de solo em partes de 4 cm (item 3.2.4.1), foram coletadas 2 gramas de solo de cada anel para análise da porcentagem de umidade do solo (h), conforme Equação 2.
(equação 2)
Onde P representa a massa do solo úmido, Ps a massa de solo seca em estufa após um período de 24h mantidas a 100 oC
3.2.4.3 Análise de concentração de ATZ ao longo do perfil do solo
Após a separação das colunas em partes de 4 cm (item 3.2.4.1), foram co-letadas 5 g de solo de cada anel. Neste solo foi realizada a extração da ATZ com metanol para quantificação do ativo nos diferentes anéis da coluna de solo. Para a extração da ATZ do solo foi utilizada uma adaptação do método descrito por Vas-concelos e colaboradores (2008). Nesse, 5 g de solo foram colocados em um er-lenmeyer de 25 mL, sendo adicionado a este 5 mL de metanol que foi mantido sob agitação orbital em incubadora por 20 minutos a 25 °C. Após o período de agita-ção, a suspensão foi mantida em repouso por 30 minutos, sendo o sobrenadante retirado. Este procedimento foi realizada por mais duas vezes, a fim de garantir que toda ATZ fosse removida do solo. Após esta etapa, as frações foram unidas e evaporadas até um volume final de 5 mL, sendo a quantidade de ATZ determinada por CLAE, conforme condições descritas no item 3.2.1.
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Para a avaliação dos resultados obtidos após a quantificação da ATZ em cada ponto da coluna de solo entre os diferentes tratamentos, foi utilizado a análi-se estatística por análianáli-se de variância (ANOVA) com teste posterior de Tukey-Kramer, com significância estatística de p<0,05, utilizando para isso o software Graph Pad InStat 3.
3.2.4.4 Avaliação da atividade herbicida ao longo do perfil da coluna de solo
A fim de avaliar o perfil de migração da ATZ ao longo da coluna de solo, foi realizado o cultivo da mostarda lisa da Flórida (Brassica sp) (planta alvo do Hb ATZ) em cada um dos anéis da coluna de solo, separados conforme descrito no item 3.2.4.1.
Para este estudo, em cada anel foram plantadas 10 sementes, sendo estas cultivadas por duas semanas em uma casa de vegetação. Após este período foi determinado o índice de germinação em porcentagem (IG) calculado conforme Equação 3.
(Equação 3)
Onde, SG o número total de sementes germinadas e TSS o número total de sementes semeadas inicialmente.
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Além do índice de germinação foram também avaliados outros parâmetros como: a média da altura das plântulas e o tamanho da raiz (Figura 5), bem como, a determinação da massa média de matéria seca e verde das plântulas.
Figura 7: Representação esquemática de uma plântula de mostarda. Nesta figura
podem-se observar as diferentes regiões (raiz, altura e número de folhas) que fo-ram analisadas após o cultivo da mostarda nos diferentes anéis das colunas de solo.
Para a avaliação dos resultados dos diferentes tratamentos sobre os parâ-metros descritos acima em cada anel da coluna de solo foi realizada análise de variância (ANOVA) com teste posterior de Tukey-Kramer, com significância esta-tística de p<0,05, utilizando para isso o software Graph Pad InStat 3.
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3.2.5 Ensaio de aberração cromossômica em Allium cepa
Para avaliar o possível efeito genotóxico das formulações produzidas utili-zamos o teste de Allium cepa que é validado pelo Programa Internacional de Se-gurança Química (IPCS, OMS), e pelo Programa Ambiental das Nações Unidas (UNEP), como um teste eficaz para a avaliação e monitoramento de substâncias químicas em sistemas ambientais (Rodrigues et al., 1999).
O objetivo desse experimento foi avaliar a genotoxicidade do ativo ATZ, da formulação comercial, das formulações de NPs/ATZ e NPs de PCL. Foram testa-das cinco diferentes concentrações (0,7, 2,1, 6,3, 18 e 54 µg/mL) sendo estas concentrações determinadas a partir do valor de LC50 do ativo ATZ (MAPA, 2012),
sendo diluída e concentrada duas vezes o valor da LC50, as mesmas
concentra-ções testadas foram usadas para a avaliação das NPs sem ATZ.
Neste ensaio, as raízes de Allium cepa cresceram em meio à exposição da substância teste em temperatura ambiente. Quando as raízes atingiram aproxima-damente 2 cm de comprimento, foram coletadas para os procedimentos de prepa-ro das lâminas. As raízes foram fixadas entre 12:00 e 14:00 horas e transferidas para frascos identificados (para cada concentração de amostra) com o fixador Carnoy I.
Para o preparo das lâminas, retirou-se uma quantidade de raízes dos fras-cos com o auxílio de uma pinça, sendo estas lavadas com água destilada por três vezes, com um período de 5 minutos entre cada lavagem. Após esta etapa, foi retirado o excesso de água das raízes e realizada a hidrólise das mesmas através da exposição das raízes em frascos contendo HCl 1 mol/L mantidos à 60 °C por nove minutos. Após a etapa de hidrólise, as raízes foram novamente submetidas a três lavagens com água destilada para remoção do excesso de ácido das raízes. As raízes foram então coradas com o reagente de Schiff e mantidas por duas ho-ras em local escuro.
