Atividade amebicida do óleo essencial de plantas do gênero Lippia (Verbenaceae) frente a trofozoítos de Acanthamoeba polyphaga

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(1)Universidade Federal de Sergipe – UFS Pró-reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária. Atividade amebicida do óleo essencial de plantas do gênero Lippia (VERBENACEAE) frente a trofozoítos de Acanthamoeba polyphaga. Israel Gomes de Amorim Santos. São Cristóvão/SE 2014.

(2) i. Israel Gomes de Amorim Santos. Atividade amebicida do óleo essencial de plantas do gênero Lippia (VERBENACEAE) frente a trofozoítos de Acanthamoeba polyphaga. Dissertação apresentada à Universidade Federal de Sergipe como requisito para a obtenção do título de Mestre em Biologia Parasitária pelo Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária – PROBP, da área de Ciências Biológicas, sob orientação do Prof. Dr. Silvio Santana Dolabella.. São Cristóvão/SE 2014.

(3) FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE. S237a. Santos, Israel Gomes de Amorim Atividade amebicida do óleo essencial de plantas do gênero Lippia (Verbenaceae) frente a trofozoítos de Acanthamoeba polyphaga / Israel Gomes de Amorim Santos ; orientador Silvio Santana Dolabella. – São Cristóvão, 2014. 42 f. : il.. Dissertação (mestrado em Biologia Parasitária)– Universidade Federal de Sergipe, 2014.. 1. Acanthamoeba. 2. Plantas medicinais. 3. Óleos essenciais. 4. Lippia. I. Dolabella, Silvio Santana, orient. II. Título. CDU 615.283.21.

(4) ii. Israel Gomes de Amorim Santos. Atividade amebicida do óleo essencial de plantas do gênero Lippia (VERBENACEAE) frente a trofozoítos de Acanthamoeba polyphaga. Dissertação apresentada à Universidade Federal de Sergipe como requisito para a obtenção do título de Mestre em Biologia Parasitária pelo Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária – PROBP, da área de Ciências Biológicas.. Aprovado em 09 de maio de 2014. ______________________________________________ Prof. Dr. Sílvio Santana Dolabella Orientador – Universidade Federal de Sergipe _______________________________________________ Prof. Dr. Ricardo Scher Universidade Federal de Sergipe _______________________________________________ Prof. Dr. Evander de Jesus Oliveira Batista Universidade Federal do Pará. São Cristóvão/SE 2014.

(5) iii. DEDICATÓRIA. Dedico esta dissertação primeiramente a Deus por ter me dado coragem e aptidão para os estudos.. Aos meus pais por terem me dado a oportunidade de freqüentar a escola e terem cuidado tão bem de mim.. A minha nova família que a cada dia que passa me impulsiona a prosseguir com a minha qualificação profissional.. A todos que direta ou indiretamente contribuíram para que eu chegasse a esse dia com êxito..

(6) iv. AGRADECIMENTOS Aos meus familiares, pai, mãe, irmãos pela força dada durante toda a minha vida, sobretudo durante os dois anos de mestrado.. A minha esposa Janadí da Conceição Silva Amorim por ter conseguido entender a minha ausência durante o período em que passei distante; e por ter conseguido cuidar tão bem do nosso pequeno Fernando Gabriel. A única frase de agradecimento que pode sair de minha boca neste momento é EU TE AMO!. Ao meu grande orientador Prof. Silvio por ter aceitado me orientar durante essa jornada e sem o qual eu jamais teria conseguido está nesse momento escrevendo estas palavras. Muito obrigado PROFESSOR, serei eternamente grato a você!. A todos os professores do PROBP que me oportunizaram conhecimentos novos e extremamente relevantes para os meus propósitos profissionais.. A minha colega de curso e de orientador Mariana pelos conselhos, ajuda e descontrações; tenha certeza que este mestrado não teria sido o mesmo sem você, muito obrigado por tudo!. A Ana Mércia pelas palavras amigas dadas no momento certo e na hora certa. Você pode contar sempre comigo.. A Alda, Tiago, Ana Nery, Katily, Alan, Aline e Mônica por todos os momentos agradáveis que passamos durante as aulas e os seus intervalos.. Ao pessoal da república onde morei por terem me acolhido na chegada à cidade.. Ao grupo do Cine Trash que me ensinaram uma forma diferente e divertida de se assistir filmes.. Aos amigos do LEPAT pela companhia e colaboração.. A todos que direta ou indiretamente contribuíram para a concretização deste sonho. OBRIGADO A TODOS!.

(7) v. LISTA DE FIGURAS. Figura 1. Microsccopia de luz e eletrônica de trofozoítos e cistos de Acanthamoeba. 3. Figura 2. Encefalite amebiana granulomatosa, apresentando necrose cortical e subcortical. 5. Figura 3. Ceratite amebiana ocasionada por Acanthamoeba sp.. 5. Figura 4. Aspecto botânico de Lippia gracilis: folhas e flores. 8. Figura 5. Aspecto botânico de Lippia Alba. 9. Figura 6. Aspecto botânico de Lippia sidoides: folhas e flores. 10. Figura 7. Aspecto botânico de L. pedunculosa: folhas e flores. 11.

(8) vi. SANTOS, I. G. A. Atividade amebicida de espécies de Lippia (Verbenaceae) frente a trofozoítos de Acanthamoeba polyphaga. (Dissertação de mestrado apresentado ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária), 2014.. RESUMO. A ceratite amebiana e a encefalite amebiana granulomatosa são doenças causadas por amebas de vida livre do gênero Acanthamoeba. No caso da ceratite, o grande problema é a recidiva da doença devido à resistência, especialmente da forma cística do organismo, aos medicamentos utilizados. Óleos essenciais de plantas têm sido utilizados como agentes potencialmente ativos contra este protista. Portanto, o objetivo deste estudo foi determinar a atividade amebicida de óleos essenciais de plantas do gênero Lippia frente à trofozoítos de Acanthamoeba polyphaga. Para isto 8 x 104 trofozoítos foram expostos durante 24 horas a concentrações crescentes dos óleos essenciais de Lippia sidoides, Lippia gracilis, Lippia alba e Lippia pedunculosa, bem como de seus compostos majoritários rotundifolona, carvona e carvacrol. Praticamente todas as concentrações dos óleos e compostos apresentaram atividade amebicida. Diante destes resultados, os óleos pesquisados neste estudo são candidatos em potencial para a terapêutica complementar na ceratite amebiana e encefalite amebiana granulomatosa.. Palavras-chave: Acanthamoeba polyphaga; rotundifolona; atividade amebicida.. Lippia. spp.;. carvacrol;. carvona;.

(9) vii. SANTOS, I. G. A.; DOLABELLA, S. S. Activity amoebicide species of Lippia (Verbenaceae) against trophozoites of Acanthamoeba polyphaga. (Dissertação de mestrado apresentado ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária), 2014.. ABSTRACT Amebic keratitis and granulomatous amebic encephalitis are diseases caused by free-living amoebas of the Acanthamoeba type. In the case of keratitis, the great problem is the relapse of this disease because of its resistance to medicines used for it, especially the cystic form of the organism. Plant essential oils have been used as potentially active agents against this protist. Therefore, the objective of this study was to determine the amebacide activity of plant essential oils of Lippia type against Acanthamoeba polyphaga trophozoites. To do this, 8 x 104 trophozoites were exposed to increased concentrations of essential oils of Lippia sidoides, Lippia gracilis, Lippia alba and Lippia pedunculosa during 24 hours, as well as of their majority compounds rotundifolona, carvone and carvacrol. Practically all the oil and compound concentrations presented amebacide activity. Based on these results, the researched oils in this study are potential candidates for a complementary healing for amebic keratitis and granulomatous amebic encephalitis.. Key-words: Acanthamoeba polyphaga; Lippia spp.; carvacrol; carvone; rotundifolona; amebacide activity..

(10) SUMÁRIO. FOLHA DE ROSTO. i. FOLHA DE APROVAÇÃO. ii. DEDICATÓRIA. iii. AGRADECIMENTOS. iv. LISTA DE FIGURAS. v. RESUMO. vi. ABSTRACT. vii. 1 INTRODUÇÃO. 1. 2 REVISÃO DE LITERATURA. 2. 2.1 Acanthamoeba. 2. 2.2 Patogenia e fatores de risco. 4. 2.3 Plantas medicinais com atividade antiparasitária. 6. 2.3.1 Plantas do gênero Lippia. 7. 2.3.1.1 Lippia gracilis Schauer. 7. 2.3.1.2 Lippia alba (Mill.) N.E.Brown. 8. 2.3.1.3 Lippia sidoides Cham.. 9. 2.3.1.4 Lippia pedunculosa. 10. 2.4 Óleos essenciais. 11. 3 JUSTIFICATIVA. 13. 4 OBJETIVOS. 15. 4.1 Geral. 15. 4.2 Específicos. 15. REFERÊNCIAS. 16. ARTIGO 1. 21. Atividade amebicida de óleos essenciais de Lippia spp. (Verbenaceae) frente a trofozoítos de Acanthamoeba polyphaga ANEXOS. 35. Anexo A – Normas para publicação na revista Experimental Parasitology.

(11) 1. 1 INTRODUÇÃO. Amebas de vida livre (AVL) são protistas de ampla dispersão ambiental que não necessitam de um hospedeiro em seu ciclo vital, sendo as infecções por elas causadas consideradas acidentais ou oportunistas. Amebas do gênero Acanthamoeba são causadoras da encefalite amebiana granulomatosa (EAG) - uma doença do sistema nervoso central de prognóstico quase sempre fatal, e também da ceratite amebiana, doença ocular que começou a ganhar importância epidemiológica com o aumento do número de usuários de lentes de contato e que, se não tratada, pode acarretar perda da visão. Outras patologias provocadas por este gênero de amebas são infecções de pele e pulmonar. A busca de novas substâncias que inibam a formação do cisto ou que sejam efetivas em eliminar os trofozoítos tem se mostrado necessária, especialmente nos casos de ceratite amebiana, onde pacientes sofrem recidivas devido a resistência às drogas utilizadas. O óleo essencial extraído de diversas partes de plantas é rico em compostos com atividades biológicas, tais como:. antiparasitária,. antiinflamatória,. antiespasmolítica,. vasorrelaxante,. antibacteriana, antifúngica, calmante e sedativo, entre outras. Muitos compostos de plantas são responsáveis por diversas atividades biológicas, alguns outros são produzidos sinteticamente para estas finalidades, dada a sua importância como agente terapêutico. Dentro deste contexto destacam-se os vegetais da família Verbenaceae, que estão distribuídas na América Central e do Sul e apresentam diversas propriedades biológicas comprovadas. No estado de Sergipe é comum o registro das espécies Lippia alba, Lippia gracilis, Lippia sidoides e Lippia pedunculosa. A ação destas plantas sobre AVL ainda não está estabelecida e pesquisas neste sentido são importantes dado o aumento dos casos de infecção ocular e mesmo de doenças amebianas intestinais e/ou cerebrais ocasionadas por amebas parasitas ou de vida livre, respectivamente..

(12) 2. 2 REVISÃO DE LITERATURA As amebas de vida livre (AVL) pertencem a um extenso grupo de protozoários ubiqüitários, sendo encontradas em diferentes tipos de solo e água, no ar, em ar-condicionado e esgotos (MARCIANO-CABRAL e CABRAL, 2003; SALAS et al., 2006; KHAN, 2006). Via. de. regra,. a. alimentação. destas. amebas. se. baseia. em. microorganismos como bactérias, outros protozoários, algas e leveduras (MARCIANO-CABRAL e CABRAL, 2003; KHAN, 2006), evidenciando um modo de vida que não traz perigo para a saúde humana e de outros seres vivos. Porém, em condições ainda não bem esclarecidas, algumas espécies de AVL dos gêneros Naegleria, Acanthamoeba, Balamuthia e Sappinia podem infectar seres humanos e outros animais e ocasionar sérias patogenias nestes hospedeiros (MARCIANO-CABRAL e CABRAL, 2003; SALAS et al., 2006;).. 2.1 Acanthamoeba. O gênero Acanthamoeba abriga espécies que podem causar a encefalite amebiana granulomatosa (EAG) e a ceratite amebiana. As espécies do gênero apresentam duas formas evolutivas em seu ciclo de vida, a saber: 1. o trofozoíto, forma móvel que se alimenta e se reproduz e 2. o cisto, forma de resistência encontrada no meio ambiente, em diversas variações de temperatura e pH (KHAN, 2008). Nos trofozoítos, forma ativa do parasita e que varia de 25 a 40µm, podem ser encontradas todas as organelas de um eucarionte superior: complexo de golgi, retículo endoplasmático, ribossomos livres, mitocôndrias, microtúbulos, vacúolos digestivos, além de vacúolos contráteis que atuam na osmorregulação (figura 1A). Esta forma evolutiva é composta por uma membrana. plasmática. trilaminar. que. circunda. todas. as. organelas. citoplasmáticas e estruturas em forma de espinho, que emergem da membrana, denominadas de acantopódios (figura 1B) (MARCIANO-CABRAL & CABRAL, 2003)..

(13) 3. Por sua vez, o cisto é composto por dupla membrana, uma externa de quitina e uma interna bilipídica (figuras 1C e 1D) que o diferencia em ectocisto e endocisto. Esta forma evolutiva de Acanthamoeba varia de 13 a 20µm e também de espécie a espécie. A formação do cisto ocorre devido a condições adversas do ambiente, como privação de nutrientes, dessecação e mudanças de temperatura e pH (MARCIANO-CABRAL & CABRAL, 2003).. Figura 1. Microscopia de luz (A e C) e eletrônica (B e D) de trofozoítos (A e B) e cistos (C e D) de Acanthamoeba. Em B (setas) podem ser observados os acantopódios e em D (setas) a dupla parede do cisto. Adaptado de Marciano-Cabral e Cabral (2003).. Castellani, em 1930, detectou amebas em cultura de células eucariontes e neste mesmo ano foi estabelecido o gênero Acanthamoeba (KHAN, 2006)..

(14) 4. Durante muito tempo discutiu-se a classificação das espécies do gênero e por cerca de três décadas desde a sua descoberta estas amebas foram ignoradas pela comunidade científica. Por volta de 1950, as Acanthamoebas foram redescobertas, desta vez como sendo contaminantes de culturas de tecidos. Culbertson et al. (1958) demonstraram, pela primeira vez, que estes organismos eram fatais por apresentarem efeito citopático em culturas de células de macacos e por matar animais de laboratório. Apenas em 1972 e 1974 é que se identificou o primeiro caso humano de EAG e de ceratite amebiana, respectivamente (KHAN, 2006). As Acanthamoebas foram largamente agrupadas em 17 espécies a partir de características como tamanho e morfologia do cisto. No entanto, atualmente, essas amebas estão agrupadas em 12 diferentes linhagens (T1T12) de espécie única ou complexo de espécies baseado no seqüenciamento do DNA ribossomal 18S. Dentro destas linhagens, as amebas da linhagem T4 são as que mais se encontram em isolados de casos de encefalite amebiana, entre. elas. a. Acanthamoeba. castellani. e. Acanthamoeba. polyphaga. (SCHUSTER & VISVESVARA, 2004; KHAN, 2006).. 2.2 Patogenia e fatores de risco. Na encefalite amebiana granulomatosa são observados edemas, necrose hemorrágica com irritações nas meninges e encefalite (Figura 2). Ao microscópio são visualizados cistos de amebas, principalmente no espaço perivascular do parênquima, indicando que os capilares cerebrais sejam a porta de entrada das amebas no sistema nervoso central (SALAS et al., 2006; KHAN e SIDDIQUI, 2009). A ceratite amebiana, por sua vez, é uma infecção da superfície ocular que pode resultar em dor intensa e ulceração da córnea (Figura 3). O uso de lentes de contato contaminadas por Acanthamoeba e trauma da córnea seguida pela colonização por estes protozoários constituem os principais fatores de risco para a aquisição da doença (CLARKE e NIEDERKORH, 2006). Da descoberta destas amebas como patógenos humanos em 1957 até o ano.

(15) 5. 2000 foram relatados cerca de 3000 casos mundiais de ceratite de etiologia amebiana (CASTRILLON e OROZCO, 2013).. Figura 2. Encefalite amebiana granulomatosa, apresentando necrose cortical e subcortical. Fonte: Marciano-Cabral e Cabral (2008).. Figura 3. Ceratite amebiana ocasionada por Acanthamoeba sp. Fonte: Khan (2006). Estudos. têm. demonstrado. que. trofozoítos. patogênicos. de. Acanthamoeba sp. expressam em sua membrana plasmática a proteína ligadora de manose (MBP), responsável por grande parte do potencial patogênico destas amebas. A MBP não é observada em cepas não patogênicas do parasito (GARATE, 2004)..

(16) 6. Em pacientes que apresentam ceratite amebiana, as espécies de amebas comumente encontradas são A. castellani e A. polyphaga. Em muitos destes pacientes, o grande problema é a recorrência da doença, a qual ocorre devido à formação da forma cística do protozoário em resposta aos fármacos utilizados na terapêutica (DART, SAW & KILVINGTON, 2009). No geral, o tratamento das infecções causadas por amebas do gênero Acanthamoeba é realizado com doses simples dos fármacos clorexidina, neosporina, pentamidina, propamidina, itraconazol, polihexametileno biguanida ou ainda a combinação de dois destes fármacos (GARATE, 2004). Sendo, em muitos casos de ceratite amebiana, usado a biguanida tópica como a única quimioterapia efetiva contra a forma cística do parasito (DART, SAW & KILVINGTON, 2009).. 2.3 Plantas medicinais com atividade antiparasitária. A população humana sempre teve estreita relação com os vegetais, seja para consumo alimentar ou como fonte de princípios ativos para muitas de suas enfermidades ou de seus animais (SILVA et al., 2013). Dentro desta perspectiva, o uso de plantas medicinais aliada ao tratamento. convencional. das. diversas. enfermidades. parasitárias. tem. aumentado significativamente nos últimos anos, sendo que os óleos essenciais extraídos de plantas e/ou os seus princípios ativos podem ser utilizados como forma alternativa de quimioterapia nestas morbidades (CHAGAS, 2004; FURTADO, 2006; GITHIORI, ATHANASIADOU & THAMSBORG, 2006; ATHANASIADOU, GUITHIORI & KYRIAZAKIS, 2007). O Brasil é o país com maior diversidade genética vegetal do mundo, contando com mais de 55.000 mil espécies catalogadas de um total estimado entre 350.000 e 550.000 (GUERRA & NODARI, 2007). Avalia-se que, no Brasil, 25% dos US$ 8 bilhões de faturamento da indústria farmacêutica nacional, em 1996, foram originados de medicamentos derivados de plantas (URIAS, 2006)..

(17) 7. 2.3.1 Plantas do gênero Lippia. Existem cerca de 200 espécies no gênero Lippia. Estas plantas são utilizadas na medicina popular principalmente para o tratamento de desordens respiratórias e gastrointestinais, sendo encontradas principalmente nas Américas Central e do Sul e África (ESCOBAR et al., 2010).. 2.3.1.1 Lippia gracilis Schauer. É um arbusto caducifólio, ramificado e de até dois metros de altura, pertencente a família Verbenaceae e comum no Nordeste brasileiro, onde é conhecida popularmente como “alecrim-da-chapada” (Figura 4). É utilizada na medicina popular para tratar problemas respiratórios como gripes, tosse, sinusite, bronquite, congestão nasal e também como tópico em casos de afecções cutâneas como feridas e sarnas (LORENZI & MATOS, 2008). Recentemente, as atividades antiinflamatória e antinociceptiva do óleo essencial de L. gracilis foram demonstradas em um modelo murino de edema de pata e peritonite (MENDES et al., 2010), além de ter sido comprovado, também, efeitos leishmanicida e fungicida dos óleos e compostos majoritários de alguns genótipos desta espécie (MELO et al., 2013)..

(18) 8. Figura 4. Aspecto botânico de Lippia gracilis: folhas e flores. FONTE: https://picasaweb.google.com/lh/photo/OVj3vUpscJ0rxsbUIolbHA. 2.3.1.2 Lippia alba (Mill.) N.E.Brown. É um subarbusto aromático que mede aproximadamente 1,70 metro de altura e apresenta folhas do tipo membranosas e flores de coloração rosa (Figura 5). É conhecida popularmente no Brasil como erva-cidreira e amplamente distribuída desde o Sul dos Estados Unidos até a América do Sul. A sua utilização na medicina popular se deve às propriedades calmante, sedativa, antiespamódica e expectorante, atribuídas a seus óleos essenciais (TAVARES, MOMENTE & NASCIMENTO, 2011). O óleo essencial desta apresenta apresentou atividade antiparasitária frente a epimastigotas de Trypanosoma cruzi e promastigotas de Leishmania chagasi (ESCOBAR et al., 2010). Atividade antiviral (OCAZIONEZ, 2010) e antimicrobiana (MESA-ARANGO et al., 2009) também já foram demonstradas para o óleo essencial de L. alba..

(19) 9. Figura 5. Aspecto botânico de Lippia Alba. FONTE: Tavares, Momenté e Nascimento, 2011.. 2.3.1.3 Lippia sidoides Cham.. É um arbusto caducifólio, com dois a três metros de altura, folhas com forte cheiro picante e flores pequenas e esbranquiçadas (Figura 6). Conhecida popularmente como alecrim-pimenta é uma planta muita utilizada na medicina alternativa para tratamento de infecções da pele e membranas mucosas e como antisséptico tópico (BOTELHO et al., 2007a; BOTELHO et al., 2007b). No Brasil, ela é comumente encontrada na região Nordeste (MATOS, 2002 apud GONÇALVES, 2012). Já foi demonstrado que o óleo essencial desta planta apresenta atividade leishmanicida (RONDON et al., 2012), tripanocida (BORGES et al., 2012), larvicida (LIMA et al., 2013) e antimicrobiana (BOTELHO et al., 2007a)..

(20) 10. Figura 6. Aspecto botânico de Lippia sidoides: folhas e flores. FONTE: http://www.geralforum.com/board/1955/502370/alecrim-pimenta.html. 2.3.1.4 Lippia pedunculosa. É um subarbusto ou arbusto medindo entre 0,7 - 1,5 metro, folhas decussadas, flores de cor lilás (Figura 7). No Brasil, esta espécie é encontrada apenas nas Regiões Nordeste e Sudeste, nos estados de Alagoas, Sergipe e São Paulo (SANTOS et al., 2009)..

(21) 11. Figura 7. Aspecto botânico de L. pedunculosa: folhas e flores. Fonte: Menezes, 2012.. 2.4 Óleos essenciais. Óleos essenciais são misturas complexas de substâncias voláteis, lipofílicas, puramente odoríferas e líquidas. Sua principal característica é a volatilidade. Seus constituintes variam desde hidrocarbonetos, alcoóis simples, terpinenos, aldeídos, cetonas, fenóis, ésteres, óxidos, peróxidos, furanos e ácidos orgânicos até compostos com enxofre. São utilizados para fins terapêuticos, perfumaria ou como material para síntese de outros compostos. Enquanto agentes terapêuticos, os óleos essenciais são administrados via inalação e oralmente, entre outras formas (EVANS, 2009). Os óleos essenciais são obtidos principalmente por meio de destilação por arraste a vapor. As folhas representam o principal órgão vegetal de onde se extraem os óleos, embora outras partes como flores, cascas, rizomas e frutos também possam ser utilizadas para este propósito (BIZZO, REZENDE & HOVELL, 2009)..

(22) 12. Alguns óleos essenciais já foram testados contra amebas e seu efeito demonstrado por alguns pesquisadores (Samie et al., 2009, Sauter et al., 2011; Vunda et al. 2012). Estes dados demonstram o potencial que alguns produtos naturais possuem como alternativa no tratamento de doenças provocadas por amebas sejam elas intestinais ou patógenas oportunistas..

(23) 13. 3 JUSTIFICATIVA. Acanthamoeba sp. é uma ameba de vida livre encontrada amplamente distribuída pela natureza. Muitas destas amebas já foram encontradas em botijões de água mineral, em estações de lavagem dos olhos, em lente de contato, no ambiente hospitalar, sobretudo em UTIs. Enquanto ameba de vida livre, não há problemas quanto a sua ampla dispersão. Contudo, algumas espécies são capazes de produzir em seres humanos a encefalite amebiana granulomatosa, de prognóstico quase sempre fatal, e a ceratite amebiana, que se não tratada pode resultar em perda da visão. Esta condição se tornou epidêmica a partir dos anos 70, quando o uso de lentes de contato passou a ser frequente. Até então, casos desta doença eram raros e, desde então, mais de 3000 casos de ceratite amebiana foram registrados, o que a torna um problema oftálmico importante e merecedor de investigações científicas quanto a drogas eficazes na eliminação do patógeno e cura do paciente (SCHUSTER e VISVESVARA, 2004). No caso da ceratite, o grande problema é a recorrência da doença, que ocorre devido ao encistamento do trofozoíto em resposta ao medicamento utilizado no tratamento. Portanto, a busca por novas drogas que possam evitar esse encistamento por meio de efeito amebicida ou amebistático é de grande necessidade e urgência. Com este propósito, a busca por produtos naturais que possam agir em tais funções se faz necessária, uma vez que diversas pesquisas tem demonstrado que o óleo essencial de muitas plantas possui atividade biológica frente a uma gama de patógenos e doenças não infecciosas humanas: Trypanosoma cruzi, Leishmania sp., amebas intestinais, células tumorais, dor e inflamação, entre outros. Dentre estas plantas destaca-se o gênero Lippia, amplamente distribuído no Nordeste e que apresentou, em trabalhos apresentados pela comunidade científica, grande atividade biológica contra alguns patógenos e doenças não.

(24) 14. infecciosas. Porém, seu potencial amebicida ainda permanece desconhecido, o que reforça a necessidade de estudos nesta linha de pesquisa..

(25) 15. 4 OBJETIVOS 4.1 Geral. Avaliar a atividade amebicida dos óleos essenciais de L. gracilis genótipo LG110, L. alba genótipo LA57, L. sidoides genótipo LS104, L. pedunculosa e seus componentes majoritários sobre trofozoítos de A. polyphaga.. 4.2 Específicos . Determinar a IC50 dos óleos essenciais e dos compostos majoritários de L. gracilis LG110, L. alba LA57, L. sidoides LS104 e L. pedunculosa sobre os trofozoítos de A. polyphaga.. . Verificar a citotoxicidade dos óleos essenciais de Lippia spp. em cultura de células de mamífero..

(26) 16. REFERÊNCIAS. ATHANASIADOU, S.; GUITHIORI, J.; KYRIAZAKIS, I. Medicinal plants for helminthes parasite control: facts and fiction. Animal, 1(9): 1392-1400, 2007. BIZZO, H.R.; REZENDE, C.M.; HOVELL, A.M.C. Óleos essenciais no Brasil: aspectos gerais, desenvolvimento e perspectivas. Quím. Nova, 32(3): 588-94, 2009. BOTELHO, M.A.; BEZERRA FILHO, J.G.; CORREA, L.L., FONSECA, S.G.; MONTENEGRO, D.; GAPSKI, R.; BRITO, G.A.; HEUKELBACH, J. Effect of a novel essential oil mouthrinse without alcohol on gingivitis: a double-blinded randomized controlled trial. J. Appl. Oral Sci., 15(3): 175-180, 2007a. BOTELHO, M.A.; NOGUEIRA, N.A.; BASTOS, G.M.; FONSECA, S.G.; LEMOS, T.L.; MATOS, F.J.; MONTENEGRO, D.; HEUKELBACH, J.; RAO, V.S.; BRITO, G.A. Antimicrobial activity of the essential oil from Lippia sidoides, carvacrol and thymol against oral pathogens. Braz. J. Med. Biol. Res., 40(3): 349-56, 2007b. CASTRILLÓN, J.C.; OROZCO, L.P.. Acanthamoeba spp. como parásitos. patógenos y oportunistas. Rev. Chil. Infectol., 30(2): 147-155, 2013. CHAGAS, A.C.S. Controle de parasitas utilizando extratos vegetais. Rev. Bras. Parasitol. Vet., 13(Supl. 1): 156-160, 2004. CLARKE, D.W.; NIEDERKORN, J.Y. The pathophysiology of Acanthamoeba keratitis. Trends Parasitol., 22(4): 175-80, 2006. CULBERTSON, C.G.; SMITH, J.W.; MINER, J.R. Acanthamoeba observation on animal pathogenicity. Science, 127: 1506, 1958. DART, J.K.G.; SAW, V.P.J.; KILVINGTON, S. Acanthamoeba keratitis: diagnosis e treatment update 2009. Am. J. Ophtalmol., 148(4): 487-99, 2009..

(27) 17. ESCOBAR, P.; LEA, S.M.; HERRERA, L.V.; MARTINEZ, J.R.; STASHENKO, E. Chemical composition and antiprotozoal activities of Colombian Lippia spp essential oils and their major components. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 105(2): 184-90, 2010. EVANS, W.C. Trease and Evans pharmacognosy. 16. ed. Toronto, Elsevier: 2009. FARIAS-JUNIOR, P.A.; RIOS, M.C.; MOURA, T.A.; ALMEIDA, R.P.; ALVES, P.B.; FLANK, A.F.; FERNANDES, R.P.M.; SCHER, R. Leishmanicidal activity of carvacrol-rich essential oil from Lippia sidoides Cham. Biol. Res., 45(4): 399402, 2012. FURTADO, S.K. Alternativas fitoterápicas para o controle da verminose ovina no Estado do Paraná: testes in vitro e in vivo. Tese (Doutorado em Ciências) – Curso de Pós-graduação em Agronomia, Universidade Federal do Paraná, 2006. GARATE, M.; CAO, Z.; BATEMAN, E.; PANJWANI, N. Cloning and characterization of a novel mannose-binding protein of Acanthamoeba. J. Biol. Chem., 279(28): 29849-56, 2004. GITHIORI, J.B.; ATHANASIADOU, S.; THAMSBORG, S.M. Use of plants in novel approaches for control of gastrointestinal helminths in livestock with emphasis on small ruminants. Vet. Parasitol., 139(4): 308-320, 2006. GONÇALVES, A.H. Atividade fungitóxica dos óleos essenciais de Lippia sidoides Cham. e de Cymbopogon citratus (D.C.) Staff no controle de fitopatógenos do feijoeiro comum. (Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Produção Vegetal da Universidade Federal do Tocantins), 2012. GUERRA,. M.P.;. NODARI,. R.O.. Biodiversidade:. aspectos. biológicos,. geográficos, legais e éticos. In: SIMÕES, C. M. O.; SCHENKEL, E. P.; GOSMANN, G.; MELLO, J. C. P.; MENTZ, L. A.; PETROVICK, P. R. (org.) Farmacognosia:. da. planta. ao. medicamento.. 3.. ed.. Porto.

(28) 18. Alegre/Florianópolis: Editora da UFRGS/ Editora da UFSC, Capítulo 1, p. 1326, 2007. KHAN, N.A. Acanthamoeba biology and increasing importance in human health. FEMS Microbiol. Rev., 30(4): 564-595, 2006. ______. Acanthamoeba and the blood-brain barrier: the breakthrough. J. Med. Microbiol., 57(9): 1051-1057, 2008. KHAN, N.A.; SIDDIQUI, R. Acanthamoeba affects the integrity of human brain microvascular endothelial cells and degrades the tight junction protein. Int. J. Parasitol., 39(14): 1611-1616, 2009. LIMA, G.P.G.; SOUZA, T.M.; FREIRE, G.P.; FARIAS, D.F.; CUNHA, A.P.; RICARDO, N.M.P.S.; MORAIS, S.M.; CARVALHO, A.F.U. Further insecticidal activities of essential oils from Lippia sidoides and Croton species against Aedes aegypti L. Parasitol. Res., 112(5): 1953-1958, 2013. LORENZI, H.; MATOS, F.J.A. Plantas medicinais no Brasil: Nativas e Exóticas. 2 ed. Instituto Plantarum, Nova Odessa, 2008. MARCIANO-CABRAL, F.; CABRAL. G. Acanthamoeba spp. as agents of disease in humans. Clin. Microbiol. Rev., 16(2): 273–307, 2003. MELO, J.O.; BITENCOURT, T.A.; FACHIN, A.L.; CRUZ, E.M.O.; JESUS, H.; ALVES, P.; ARRIGONI-BLANK, M.F.; FRANCA, S.C.; BELEBONI, R.O.; FERNANDES, R.P.M.; BLANK, A.F.; SCHER, R. Antidermatophytic and antileishmanial activities of essential oils from Lippia gracilis schauer genotypes. Acta Trop., 128(1): 110-115, 2013. MENDES, S.S.; BOMFIM, R.R.; JESUS, H.C.R.; ALVES, P.B.; BLANK, A.F.; ESTEVAM, C.S.; ANTONIOLLI, A.R.; THOMAZZI, S.M. Evaluation of the analgesic and anti-inflammatory effects of the essential oil of Lippia gracillis leaves. J. Ethnopharmacol., 129(3): 391-397, 2010. MESA-ARANGO, A.C.; MONTIEL-RAMOS, J.; ZAPATA, B.; DURAN, C. BETANCUR-GALVIS, L.; STASHENKO, E. Citral and carvone chemotytes from.

(29) 19. the essential oils of Colombian Lippia Alba (Mill.) N.E. Brown: composition, cytotoxicity and antifungal activity. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 104(6): 878-84, 2009. OCAZIONEZ, R.E.; MENESES, R.; TORRES, F.A.; STASHENKO, E. Virucidal activity of Colombian Lippia essential oils on dengue vírus replication in vitro. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 105(3): 304-309, 2010. RONDON, F.C.; BEVILAQUA, C.M.; ACCIOLY, M.P.; MORAIS, S.M.; ANDRADE-JUNIOR, H.F.; CARVALHO, C.A.; LIMA, J.C.; MAGALHAES, C.R. In vitro efficacy of Coriandrum sativum, Lippia sidoides and Copaifera reticulata against Leishmania chagasi. Rev. Bras. Parasitol. Vet., 21(3): 185-191, 2012. SAMIE, A.; HOUSEIN, A.; LALL, N.; MEYER, J.J. Crudes extracts of, and purified compounds from, Pterocarpus angolensis, and the essential oil of Lippia javanica: their in-vitro cytotoxicities and activities against selected bacteria and Entamoeba histolytica. Ann. Trop. Med. Parasitol., 103(5): 427439, 2009. SALAS, M.S.; LUNA, J.S.S.; TSUTSUMI, V. Amibas de vida libre. In: FLISSER, A.; TAMAYO, R. P.. Aprendizaje de la parasitologia basado em problemas. México, D.F.: ETM, p. 481-502, 2006. SANTOS, J.S.; MELO, J.I.M.; ABREU, M.C.; SALES, M.F. Verbenaceae Sensu Stricto na região de Xingó: Alagoas e Sergipe, Brasil. Rodriguésia, 60(4): 985998, 2009. SCHUSTER, F.L.; VISVESVARA, G.S. Amebae and ciliated protozoa as causal agents of waterborne zoonotic disease. Vet. Parasitol., 126(1-2), 91-120, 2004. SILVA, W. M. O.; SOUZA, G. F. X. T.; VIEIRA, P. B.; SANAVRIA, A. Uso popular. de. plantas. medicinais. na. promoção. da. saúde. animal. em. assentamentos rurais de Seropédica – RJ. R. bras. Ci. Vet., 20(1): 32-36, 2013..

(30) 20. URIAS, E.M.P. As mudanças recentes nas estratégias produtivas e tecnológicas dos laboratórios farmacêuticos instalados no Brasil: uma análise a partir dos impactos originados pela regulamentação dos medicamentos genéricos (Monografia – Universidade Estadual Júlio de Mesquita Filho), 2006. TAVARES, I.B.; MOMENTÉ, V.G.; NASCIMENTO, I.R. Lippia alba: estudos químicos, etnofarmacológicos e agronômicos. Pesq. Apl. Agrotecnol. , 4(1): 204-220,. 2011..

(31) 21. Artigo 1 Atividade amebicida de óleos essenciais de Lippia spp. (Verbenaceae) frente a trofozoítos de Acanthamoeba polyphaga. Artigo em preparação para a revista Experimental Parasitology..

(32) 22. Atividade amebicida de óleos essenciais de Lippia spp. (Verbenaceae) frente a trofozoítos de Acanthamoeba polyphaga Israel Gomes de Amorim Santosa, Leociley Rocha Menezesb, Marilise Brittes Rottc, Ricardo Scherd, Emanoel Vilaça Costab, Sócrates Cabral de Holanda Cavalcantie, Jaciana dos Santos Aguiarf, Teresinha Gonçalves da Silvaf, Silvio Santana Dolabellaa,* a. Departamento de Morfologia, Laboratório de Entomologia e Parasitologia Tropical, Universidade Federal de Sergipe, São Cristóvão, Sergipe, Brasil b Departamento de Química, Universidade Federal de Sergipe, São Cristóvão, Sergipe, Brasil c Instituto de Ciências Básicas da Saúde, Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brasil d Departamento de Morfologia, Laboratório de Biologia Molecular de Bioagentes Patogênicos, Universidade Federal de Sergipe, São Cristóvão, Sergipe, Brasil e Departamento de Farmácia, Laboratório de Química Farmacêutica, Universidade Federal de Sergipe, São Cristóvão, Sergipe, Brasil f Departamento de Antibióticos, Laboratório de Bioensaios para Pesquisa de Fármacos, Universidade Federal de Pernambuco, Recife, Brasil. * Endereço para correspondência: Departamento de Morfologia, Laboratório de Entomologia e Parasitologia Tropical, Universidade Federal de Sergipe, Av. Marechal Rondon, s/n, Roza Elze, CEP 49100-000, SE – Brasil. Telefone: +55 79 21056626. Endereço de email: dolabella@ufs.br (S. S. Dolabella). Resumo A ceratite amebiana e a encefalite amebiana granulomatosa são doenças causadas por amebas de vida livre do gênero Acanthamoeba. No caso da ceratite, o grande problema é a recidiva da doença devido à resistência, especialmente da forma cística do organismo, aos medicamentos utilizados. Óleos essenciais de plantas têm sido utilizados como agentes potencialmente ativos contra este protista. Portanto, o objetivo deste estudo foi determinar a atividade amebicida de óleos essenciais de plantas do gênero Lippia frente à trofozoítos de Acanthamoeba polyphaga. Para isto 8 x 104 trofozoítos foram expostos durante 24 horas a concentrações crescentes dos óleos essenciais de Lippia sidoides, Lippia gracilis, Lippia alba e Lippia pedunculosa, bem como de seus compostos majoritários rotundifolona, carvona e carvacrol. Praticamente todas as concentrações dos óleos e compostos apresentaram atividade amebicida. Diante destes resultados, os óleos pesquisados neste estudo são candidatos em potencial para a terapêutica complementar na ceratite amebiana e encefalite amebiana granulomatosa..

(33) 23. PALAVRAS-CHAVE: Acanthamoeba polyphaga; Lippia spp.; carvacrol; carvona; rotundifolona; atividade amebicida.. 1. Introdução Acanthamoeba é um gênero que inclui patógenos oportunistas distribuídos mundialmente. Tais patógenos são agentes etiológicos de duas enfermidades que acometem o ser humano: a encefalite amebiana granulomatosa, uma infecção geralmente fatal do sistema nervoso central (VISVESVARA, 2008; KHAN & SIDDIQUI, 2009), e a ceratite amebiana, uma doença da córnea que, quando não tratada, pode levar a perda da visão (CLARKE &NIEDERKORH, 2006; ROBSON et al., 2014). O tratamento da encefalite amebiana granulomatosa tem sido realizado com a combinação de diversos agentes farmacológicos, incluindo isotionato de pentamidina, sulfadiazina, flucitosina e fluconazol ou itraconazol. Contudo, a maioria dos casos tem tido mau prognóstico devido a diversos fatores, incluindo a ausência de sinais e sintomas patognomônicos para a doença. Na ceratite amebiana, as amebas apresentam resistência aos medicamentos atualmente utilizados, levando à recidiva da doença e à necessidade urgente de novas drogas que inibam este fenômeno (DART et al., 2009). Desta forma, a investigação de plantas utilizadas pela tradição popular é uma estratégia para encontrar alternativas ao tratamento convencional. Plantas do gênero Lippia são utilizadas na medicina alternativa para o tratamento de diversas enfermidades, tais como desordens respiratórias e gastrointestinais. Existem cerca de 200 espécies de plantas deste gênero, grande parte encontrada nas Américas Central e do Sul e África (ESCOBAR et al., 2010). Atividades. leishmanicida,. fungicida,. tripanocida,. antiviral,. larvicida. e. antimicrobiana já foram demonstradas para plantas do gênero Lippia (BOTELHO et al., 2007; ESCOBAR et al., 2010; OCAZIONEZ, 2010; FARIAS-JUNIOR et al., 2012; LIMA et al., 2013; MELO et al., 2013). Contudo, a atividade amebicida dos óleos essenciais destas espécies frente a amebas de vida livre ainda não foi relatada pela comunidade científica, o que torna de grande relevância trabalhos que visem elucidar essa lacuna no conhecimento científico sobre agentes terapêuticos e anti-amebianos frente a trofozoítos de Acanthamoeba spp..

(34) 24. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade amebicida e citotóxica do óleo essencial das plantas Lippia alba, L. sidoides, L. gracilis eL. pedunculosa frente a trofozoítos de Acanthamoeba polyphaga.. 2. Material e Métodos. 2.1. Amebas. Foram utilizados trofozoítos de Acanthamoeba polyphaga (ATCC 30872) obtidos da American Type Culture Collection e mantidos no Laboratório de Entomologia e Parasitologia Tropical (LEPaT), da Universidade Federal de Sergipe, em meio PYG (2% de proteose peptona, 0,2% de extrato de levedo e 1,8% de glicose) à temperatura ambiente.. 2.2. Plantas. Foram utilizadas neste estudo as espécies L. alba (LA57), L. sidoides (LS104), L. gracilis (LG110) e L. pedunculosa (LP). Estas plantas foram coletadas nos estados de Sergipe e Bahia (Brasil) e exsicatas depositadas no Herbário da Universidade Federal de Sergipe (Tabela 1). Tabela 1 – Procedência dos genótipos de Lippia utilizados neste estudo. Código. Nome científico. Local de origem. Dados geográficos. LG110 LS104 LA57 LP. Lippia gracilis Lippia sidoides Lippia alba Lippia pedunculosa. Tomar do Geru - SE Poço Redondo - SE Rio Real - BA Poço Redondo - SE. 11° 19' 21,1" S; 37° 55' 14,9" W 9° 58' 09,2'' S; 37° 51' 50,3'' W 11° 0' 52,9" S; 37° 12' 23,0" W 9° 40' 46,1'' S; 37° 39' 41,4'' W. No Exsicata Herbário UFS 14732 8226 13469 23159. FONTE: FARIAS-JUNIOR et al., 2012.. 2.3. Óleos essenciais e compostos majoritários. As folhas secas e pulverizadas (75 g) foram submetidas à hidrodestilação em um aparelho do tipo Clevenger durante 2 horas. Ao final de cada destilação os óleos foram coletados e mantidos a -18°C até sua avaliação. As composições do óleo essencial das.

(35) 25. espécies de Lippia avaliadas foram previamente relatadas na literatura (MAYNARD et al., 2011 ; FARIAS-JUNIOR et al., 2012; MELO et al., 2013). Os óleos foram solubilizados em dimetilsulfóxido (DMSO) à concentração de 100mg/mL e testados nas seguintes concentrações finais: L. alba: 10, 20, 30, 40, 50 e 100μg/mL; L. sidoides e L. gracilis: 5, 10, 20, 30, 40 e 50μg/mL e L. pedunculosa: 25, 50, 100, 200, 300 e 400μg/mL. Os compostos majoritários carvacrol (99.9%) e carvona (99%) foram obtidos da Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Rotundifulona foi obtida de acordo Santos et al. (2014). De modo similar, os compostos majoritários foram diluídos a partir da concentração estoque de 100mg/mL e avaliados nas seguintes concentrações: rotundifolona e carvona:10, 20, 30, 75 e 100μg/mL e carvacrol:10, 25, 50,75 e 100μg/mL.. 2.4. Determinação da atividade amebicida Para determinar o potencial amebicida, 8 x 104 trofozoítos de A. polyphaga em fase logarítmica de crescimento (48 a 72 horas de cultivo) foram distribuídos em placas de cultivo celular de 24 poços (TPP®) contendo 2 mL de meio de cultivo PYG por poço e expostos às diversas concentrações dos óleos utilizados neste estudo e de seus compostos majoritários. Cada concentração foi avaliada em triplicata e todos os experimentos foram realizados duas vezes. Após 24 horas de tratamento, as placas foram submetidas a banho de gelo por 20 minutos para que os trofozoítos se desprendessem de sua superfície e, após homogeneização, uma alíquota de 10μl foi analisada em câmara de Neubauer para a contagem das amebas. Para o cálculo da concentração do óleo essencial que resultou em inibição de 50% do crescimento das amebas (IC50), foi usado o programa Excel por meio de uma regressão não-linear, utilizando as porcentagens de viabilidade celular e inibição do crescimento calculadas a partir dos resultados da contagem em câmara de Neubauer. Foi realizada a análise de variância e comparação entre as médias pelo teste T, tendo os resultados significância estatística quando p < 0,05..

(36) 26. 2.5. Citotoxicidade dos óleos essenciais sobre cultura de células de mamífero. A atividade citotóxica dos óleos essenciais foi realizada por meio do ensaio de MTT (brometo de 3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio). Foi utilizada a linhagem NCI-H292 (carcinoma mucoepidermoide de pulmão humano) mantida em meio de cultura DMEM, suplementada com 10% de soro fetal bovino e 1% de antibióticos (penicilina e estreptomicina, GIBCO®). As células (1 x 105células totais) foram plaqueadas em placas de 96 poços e mantidas a 37oC em atmosfera de 5% de CO2. Depois de 24h, 10µL dos óleos essenciais foram adicionados a cada poço na concentração final de 50µg/mL. O fármaco doxorrubicina (5µg/mL) foi utilizado como controle positivo. Após 72 horas, 25µL da solução de MTT (5mg/mL) foi adicionado a cada poço e a mistura incubada por mais 3h. Ao fim deste tempo, o meio de cultura com excesso de MTT foi aspirado e 100µL de DMSO foram adicionados a cada poço para interromper a reação e solubilizar os cristais de formazan. A densidade ótica (DO) dos poços foi medida a 560nm.E como foi calculada a viabilidade?. 3. Resultados. 3.1. Atividade amebicida dos óleos essenciais e de seus compostos majoritários A inibição do crescimento dos trofozoítos de A. polyphagapelo tratamento com os óleos essenciais das quatro espécies avaliadas foi concentração dependente. Como pode ser observado na Figura 1, os óleos essenciais de L. gracilis e L. sidoides apresentaram melhores efeitos inibitórios, uma vez que na concentração de 40 μg/mL ambos os óleos eliminaram 100% dos trofozoítos. Por outro lado, efeito semelhante só foi observado nos tratamentos com as concentrações mais altas dos óleos essenciais de L. alba (100 μg/mL) e L. pedunculosa (400 μg/mL) (Figura 2). Este padrão reflete os valores das IC50 encontradas que foram 10,08 μg/mL e 18,19 μg/mL para L. gracilis e L. sidoides, respectivamente e 31,79 μg/mL para L. alba e 71,47μg/mL para L. pedunculosa..

(37) Viabilidade (%). 27. Concentrações (µg/mL) L. sidoides L. gracilis L. alba. Viabilidade (%). Figura 1. Viabilidade celular de trofozoítos de A. polyphaga após 24 horas de exposição a diversas concentrações do óleo essencial de L. gracilis, L. sidoides e L. alba.. 25. 50. Concentrações (µg/mL) 100 200 300. 400. Figura 2. Viabilidade celular de trofozoítos de A. polyphaga após 24 horas de exposição a diversas concentrações do óleo essencial de L. pedunculosa.. Estudos prévios de caracterização química dos óleos essenciais de L. sidoides e L. gracilis demonstraram que os mesmos apresentam como composto majoritário o carvacrol (43.69% e 48.92%, respectivamente), seguido por p-cimeno (17.8% e 12.87%) e γ-terpineno (16.6% e 11.81%) (FARIAS-JUNIOR et al., 2012; MELO et al., 2013). O óleo essencial de L. alba, por sua vez, apresenta em sua composição carvona (61.66%) e limoneno (29.28%) como principais compostos (FARIAS-JUNIOR et al., 2012), enquanto que o óleo essencial de L. pedunculosa é constituído principalmente por rotundifolona (52,94%) e limoneno (38,62%) (MENEZES et al., 2014)..

(38) 28. Deste modo, a atividade amebicida dos compostos majoritários do óleo essencial das quatro espécies de Lippia também foi avaliada (Figura 3). Assim como demonstrado para os óleos essenciais de L. gracilis e L. sidoides, seu componente majoritário carvacrol apresentou melhor efeito amebicida, sendo capaz de eliminar 100 % dos trofozoítos na concentração de 75 μg/mL, ao passo que este efeito só foi observado na concentração de 100 μg/mL de rotundifolona, componente majoritário do óleo essencial de L. pedunculosa. Por outro lado, mesmo na maior concentração testada, a carvona, principal composto do óleo essencial de L. alba, reduziu a viabilidade celular em cerca de 70%. Os valores de IC50 obtidos foram 24,74μg/mL para a rotundifulona,. Viabilidade (%). 18,98μg/mL para carvacrol e 43,62μg/mL para carvona.. Concentrações (µg/mL) Rotundifolona Carvona Carvacrol Figura 3. Viabilidade celular de trofozoítos de A. polyphaga após 24 horas de exposição a diversas concentrações dos monoterpenos rotundifolona, carvona e cravacrol.. 3.2. Ensaio de citotoxicidade dos óleos essenciais sobre células de mamíferos. Para a avaliação da atividade citotóxica dos óleos essenciais foi utilizada uma escala de intensidade proposta por Rodrigues et. al. (2014), pela qual o óleo é considerado sem atividade se seu potencial de inibição estiver entre 1 e 20%, com pouca atividade se estiver entre 20 e 50%, com atividade moderada se estiver entre 50 e 70% e com muita atividade se seu potencial de inibição for superior a 70%. Com base nestes parâmetros, pode-se observar que o óleo essencial de L. alba apresenta uma forte citotoxicidade frente à linhagem celular avaliada, sendo capaz de inibir em mais de 90%.

(39) 29. a viabilidade da mesma. Com relação aos óleos essenciais das demais espécies avaliadas, todos apresentaram pouca atividade sobre a linhagem NCI-H292.. Tabela 2– Porcentagem de inibição do crescimento em linhagem de células NCI-H292 exposta ao óleo essencial de L. alba, L. sidoides, L. gracilis e L. pedunculosa. % de inibição Produtos teste. NCI-H292. SEM. Lippia gracilis 110. 35.68. 2.22. Lippia pedunculosa. 45.14. 0.36. Lippia alba 57. 94.98. 3.73. Lippia sidoides 104. 47.22. 2.29. Doxorrubicina. 94.15. 1.99. SEM: Erro médio padrão. Os experimentos foram repetidos 2 vezes em triplicata.. 4. Discussão. Poucos são os trabalhos na literatura com o objetivo de encontrar produtos naturais com ação sobre amebas de vida livre. Uma subfração do extrato metanólico de Allium sativum foi identificada como amebicida para cistos e trofozoítos de Acanthamoeba castellanii em um mecanismo dose e tempo dependente, sendo a eficácia máxima encontrada na concentração de 3,9mg/mL (POLAT et al., 2008). O extrato metanólico de Origanum syriacum e Origanum laevigatum na concentração de 32mg/mL eliminou todos os trofozoítos de A.castellanii após um período de incubação de 3 horas, tendo estes extratos um efeito cisticida após 24 horas de exposição (DEGERLI et al., 2012). Especificamente contra A. polyphaga, o óleo essencial de Pterocaulon polystachyum apresentou efeito amebicida nas concentrações de 10 e 20mg/mL. Para Piper hispidinervum, Sauter et al.,(2012) determinaram em 500µg/mL a concentração de seu óleo essencial que eliminava 100% dos trofozoítos desta ameba. Por sua vez, Vunda et al., (2012) determinaram em 500µg/mL a concentração capaz de matar 87% dos trofozoítos deste protozoário quando exposto ao óleo essencial de Croton ericoides. Tais resultados demonstram que os óleos utilizados neste estudo foram mais efetivos.

(40) 30. que os usados por Sauter et al. e Vunda et al., uma vez que as concentrações efetivas encontradas foram menores, sendo que os óleos essenciais de L. gracilis e L. sidoides eliminaram 100% dos trofozoítos a uma concentração de 40µg/mL. Diferentemente dos óleos essenciais das plantas P. polystachyum e C. ericoides, que tem como compostos majoritários o acetato de E-sesquilavandulil e germacreno D, respectivamente, os óleos essenciais das plantas utilizadas neste trabalho são constituídas principalmente de carvacrol (L. sidoides e L. gracilis), carvona (L. alba) e rotundifolona (L. pedunculosa). A ação amebicida de alguns destes compostos também foi determinada. Novamente, praticamente todas as concentrações testadas foram significativamente inibitórias para o crescimento amebiano e a IC50 determinada como 18,98µg/mL, 43,62µg/mL, 24,74µg/mL para os compostos rotundifolona, carvona e carvacrol, respectivamente. As espécies de plantas e os compostos majoritários utilizados neste trabalho já foram alvos de investigação de sua atividade biológica contra alguns protozoários. L. sidoides já teve a sua atividade leishmanicida e tripanocida comprovada (ESCOBAR et al., 2010; MELO et al., 2013). A IC50 de 86,32µg/mL para a atividade leishmanicida encontrada por Melo et al. (2013) foi superior à encontrada neste trabalho para a atividade amebicida deste óleo, o que demonstra que possivelmente estas amebas sejam mais susceptíveis à atividade citotóxica dos óleos analisados aqui. O principal composto dos óleos essenciais de L. gracilis e L. sidoides, carvacrol, exibiu IC50 de 10,08 µg/mL. Desta forma, este composto é provavelmente o princípio ativo responsável pela ação amebicida apresentado por estes óleos essenciais. Independentemente do fato de p-cimeno e γ-terpineno serem encontrados no óleo essencial de L. sidoides em pequena quantidade (12,8% e 11,8%, respectivamente), sua atividade amebicida (dado não mostrado) sugere a existência de atividade sinérgica entre os compostos e tende a explicar os menores valores de IC50 apresentados por L. sidoides e L. gracilis. Este foi o primeiro relato de avaliação da atividade amebicida de espécies do gênero Lippia frente a amebas de vida livre. Apesar de todas as concentrações dos óleos testados terem apresentado boa atividade amebicida frente a trofozoitos de A. polyphaga, novos testes deverão ser realizados, a fim de viabilizar sua utilização na terapêutica clínica..

(41) 31. Agradecimentos. Os autores agradecem ao apoio da CAPES pelo auxílio financeiro para realização da pesquisa.. Referências. BOTELHO, M. A.; NOGUEIRA, N. A.; BASTOS, G. M.; FONSECA, S. G.; LEMOS, T. L.; MATOS, F. J.; MONTENEGRO, D.; HEUKELBACH, J.; RAO, V. S.; BRITO, G. A. Antimicrobial activity of the essential oil from Lippia sidoides, carvacrol and thymol against oral pathogens. Brazilian Journal Medical Biology Resource, p. 349356, 2007.. CLARKE, D. W.; NIEDERKORN, J. Y. The pathophysiology of Acanthamoeba keratitis. Trends in Parasitology, 2006.. DART, J. K. G.; SAW, V. P. J.; KILVINGTON, S. Acanthamoeba keratitis: diagnosis e treatment update 2009. American Journal of Ophtalmology, 2009.. DEGERLI, S.; TEPE, B.; CELIKSOZ, A.; BERK, S.; MALATYALI, E. In vitro amoebicidal activity or Origanum syriacum and Origanum laevigatum on Acanthamoeba castellani cysts and trophozoites. Experimental Parasitology, 2012).. ESCOBAR, P.; LEA, S. M.; HERRERA, L. V.; MARTINEZ, J. R.; STASHENKO, E. Chemical composition and antiprotozoal activities of Colombian Lippia spp essential oils and their major components. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 2010.. FARIAS JÚNIOR, P. A.; RIOS, M. C.; MOURA, T. A.; ALMEIDA, R. P.; ALVES, P. B.; BLANK, A. S.; FERNANDES, R. P. M.; SCHER, R. Leishmanicidal activity of carvacrol-rich essential oil from Lippia sidoides Cham. Biological Research, v. 45, p. 399-402, 2012..

(42) 32. KHAN, N. A.; SIDDIQUI, R. Acanthamoeba affects the integrity of human brain microvascular endothelial cells and degrades the tight junction protein. Internacional Journal of Parasitology, p.1611–1616, 2009.. LIMA, G. P. G.; SOUZA, T. M.; FREIRE, G. P.; FARIAS, D. F.; CUNHA, A. P.; RICARDO, N. M. P. S.; MORAIS, S. M.; CARVALHO, A. F.U. Further insecticidal activities of essential oils from Lippia sidoides and Croton species against Aedes aegypti L. Parasitology Research, 2013.. MELO, J. O.; BITENCOURT, T. A.; FACHIN, A. L.; CRUZ, E. M. O.; JESUS, H.; C.; R.; ALVES, P.; B.; ARRIGONI-BLANK, M. F.; FRANCA, S. C.; BELEBONI, R. O.; FERNANDES, R.; P.; M.; BLANK, A.; F.; SCHER, R. Antidermatophytic and antileishmanial activities of essential oils from Lippia gracilis schauer genotypes. Acta Tropica, 2013.. MAYNARD, L. G.; SANTOS, K. C.; CUNHA, P. S.; BARRETO, A. S.; PEIXOTO, M. G.; BLANK, A. F.; ARRIGONI-BLANK, F. A.; BONJARDIN, L. R.; SANTOS, M.R.V. Chemical composition and vasorelaxant effect induced by the essential oil of Lippia alba (Mill.) N.E. Brown. (Verbenaceae) in rat mesenteric artery. Indian Journal of Pharmacology, v. 43, p. 694-698, 2011.. MENEZES, L. R. A.; SANTOS, N. N.; MEIRA, C. S.; DOS SANTOS, J. A. F.; GUIMARAES, E. T.; SOARES, M. B. P.; NEPEL, A.; BARISON, A.; COSTA, E. V., A new source of (R)-limonene and rotundifolone from leaves of Lippia pedunculosa (Verbenaceae). and. their. trypanocidal. properties,. Natural. Product. Communications (2014), 9(6), 737-739.. OCAZIONEZ, R. E.; MENESES, R.; TORRES, F. A.; STASHENKO, E. Virucidal activity of Colombian Lippia essential oils on dengue vírus replication in vitro. Mem. Inst. Osw. Cruz, 2010..

(43) 33. POLAT, Z. A.; VURAL, A.; OZAN, F.; TEPE, B.; ÖZCELIK, S.; CETIN, A. In Vitro Evaluation of the Amoebicidal Activity of Garlic (Allium sativum) Extract on Acanthamoeba castellaniiand its Cytotoxic Potential on Corneal Cells.. ROBSON, J.; NOURSE, C.; GERARD, J. BYRNE, S. Free living amoebic infection causing CNS disease – diagnostic techniques. Pathology, 2014.. RODRIGUES, F. A. R.; BOMFIM IDA, S.; CAVALCANTE, B. C.; PESSOA, C.; GONÇALVES, R. S.; WARDELL, J. L.; WARDELL, S. M.; DE SOUZA, M. V. Meﬂoquine–Oxazolidine Derivatives: A New Class of Anticancer Agents. ChemBiol Drug Des, v. 83, p. 126–131, 2014.. SAUTER, I. P.; SANTOS, I. C.; APEL, M. A.; CIBULSKI, S. P.; ROEHE, P. M.; Von POSER, G. L.; ROTT, M. B. Amoebicidal activity and chemical composition of Pterocaulon polystachyum (Asteraceae) essential oil. Parasitology research, 2011.. SAUTER, I. P.; ROSSA, G. E.; LUCAS, A. M.; CIBULSKI, S. P.; ROEHE, P. M.; SILVA, L. A. A.; ROTT, M. B.; VARGAS, R. M. F.; CASSEL, E.; Von POSER, G. L.; Chemical composition and amoebicidal activity of Piper hispidinervum (Piperaceae) essential oil. Industrial Crops and Products, 2012.. SLAMENOVÁ, D.; HORVÁTHOVÁ, E.; SRAMKOVÁ, M.; MARSÁLKOVÁ, L. DNA-protective effects of two components of essential plant oils carvacrol and thymol on mammalian cells cultured in vitro. Neoplasma, 2007.. MOSMANN, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunological Methods, v. 65, n. 1-2, p. 55–63, 1983. VISVESVARA, G. S.; SCHUSTER, F. L. Opportunistic Free-living Amebae, Part I. Clinical Microbiology Newsletter, 2008..

(44) 34. VUNDA, S. L. L.; SAUTER, I. P.; CIBULSKI, S. P.; ROEHE, P. M.; BORDIGNON, S. A. L.; ROTT, M. B.; APEL, M. A.; Von POSER, G. L. chemical composition and amoebicidal activity of Croton pallidulus, Croton ericoides, and Croton isabelli (Euphorbiaceae). essential. oils.. Parasitology. research,. 2012..

(45) ANEXOS.

(46) EXPERIMENTAL PARASITOLOGY. AUTHOR INFORMATION PACK. TABLE OF CONTENTS. XXX. .. .. • • • • •. Description Audience Abstracting and Indexing Editorial Board Guide for Authors. ISSN: 0014-4894. p.1 p.1 p.1 p.2 p.3. DESCRIPTION .. Experimental Parasitology emphasizes modern approaches to parasitology, including molecular biology and immunology. The journal features original research papers on the physiological, metabolic, immunologic, biochemical, nutritional, and chemotherapeutic aspects of parasites and host-parasite relationships. Most downloaded papers Benefits to authors We also provide many author benefits, such as free PDFs, a liberal copyright policy, special discounts on Elsevier publications and much more. Please click here for more information on our author services . Please see our Guide for Authors for information on article submission. If you require any further information or help, please visit our support pages: http://support.elsevier.com. AUDIENCE .. Parasitologists, microbiologists, molecular biologists and biochemists working with parasites as a model. ABSTRACTING AND INDEXING .. Abstracts in Hygiene and Communicable Diseases BIOSIS Elsevier BIOBASE Chemical Abstracts Current Contents/Life Sciences MEDLINE® EMBASE Helminthological Abstracts Pascal et Francis (INST-CNRS) Protozoological Abstracts Reference Update Tropical Diseases Bulletin Scopus. AUTHOR INFORMATION PACK 23 Mar 2014. www.elsevier.com/locate/yexpr. 1.

(47) EDITORIAL BOARD .. Co Editors-in-Chief: Anton Aebischer, Berlin, Germany, Email: T_Aebischer@t-online.de Bernd Kalinna, Parkville, Victoria, Australia, Email: bernd.kalinna@unimelb.edu.au Editorial Board: J. Cable, Cardiff, UK P. Craig, Manchester, UK W. de Souza, Rio de Janeiro, Brazil R. Docampo, Athens, Georgia, USA M. Doenhoff, Nottingham, UK E. Dumonteil, Yucatán, Mexico H. Garcia, Urb. Ingeneria, S.M.P, Peru P. Geldhof, Merelbeke, Belgium G.N. Gobert, Brisbane, Queensland, Australia S.B. Gould, Düsseldorf, Germany E. Grisard, Florianópolis, Brazil M.-J. Gubbels, , A. Hemphill, Bern, Switzerland J. Horton, M. Hu, Wuhan, China A. Klion, Bethesda, Maryland, USA J. Kurtz, Münster, Germany M. Lalle, Roma, Italy K. Matuschewski, Berlin, Germany S. Moreno, Athens, Georgia, USA A.J. Nisbet, Edinburgh, Scotland, UK N.C. Peters, Bethesda, Maryland, USA M. Riscoe, Portland, Oregon, USA L. Robertson, Oslo, Norway M.H. Rodriguez López, Curernavaca, Mexico U. Ryan, Murdoch, Western Australia, Australia B. Sinden, London, UK F. Villalta, Nashville, Tennessee, USA J Walochnik, Vienna, Austria M. Wiese, Glasgow, Scotland, UK L. Xiao, Atlanta, Georgia, USA X.Q. Zhu, Lanzhou, Gansu, China. AUTHOR INFORMATION PACK 23 Mar 2014. www.elsevier.com/locate/yexpr. 2.

(48) GUIDE FOR AUTHORS .. Your Paper Your Way ypyw-gfa-banner.gifyour paper your way. INTRODUCTION Experimental Parasitology emphasizes modern approaches to parasitology, including molecular biology and immunology. The journal features original research papers on the physiological, metabolic, immunologic, biochemical, nutritional, and chemotherapeutic aspects of parasites and host-parasite relationships. Authors of studies on anti–microbial properties of natural substances are strongly encouraged to submit their work to other, more appropriate journals unless the studies have a strong focus on anti– parasitic activity and address the following points: the chemical characterization of the compounds likely implicated to a reasonable degree controls for the effects of vehicles and solvents if an animal model is not investigated or not available, in vitro activity studies that include at least comparative cytotoxicity data using host cells or tissues to show selective anti–parasitic activity at a level that could indicate a realistic prospect for translation. some investigation into the potential mode of action or effects on likely molecular targets in parasites. BEFORE YOU BEGIN Ethics in publishing For information on Ethics in publishing and Ethical guidelines for journal publication see http://www.elsevier.com/publishingethics and http://www.elsevier.com/journal-authors/ethics.. Conflict of interest All authors are requested to disclose any actual or potential conflict of interest including any financial, personal or other relationships with other people or organizations within three years of beginning the submitted work that could inappropriately influence, or be perceived to influence, their work. See also http://www.elsevier.com/conflictsofinterest. Further information and an example of a Conflict of Interest form can be found at: http://help.elsevier.com/app/answers/detail/a_id/286/p/7923.. Submission declaration Submission of an article implies that the work described has not been published previously (except in the form of an abstract or as part of a published lecture or academic thesis or as an electronic preprint, see http://www.elsevier.com/postingpolicy), that it is not under consideration for publication elsewhere, that its publication is approved by all authors and tacitly or explicitly by the responsible authorities where the work was carried out, and that, if accepted, it will not be published elsewhere including electronically in the same form, in English or in any other language, without the written consent of the copyright-holder.. Changes to authorship This policy concerns the addition, deletion, or rearrangement of author names in the authorship of accepted manuscripts: Before the accepted manuscript is published in an online issue: Requests to add or remove an author, or to rearrange the author names, must be sent to the Journal Manager from the corresponding author of the accepted manuscript and must include: (a) the reason the name should be added or removed, or the author names rearranged and (b) written confirmation (e-mail, fax, letter) from all authors that they agree with the addition, removal or rearrangement. In the case of addition or removal of authors, this includes confirmation from the author being added or removed. Requests that are not sent by the corresponding author will be forwarded by the Journal Manager to the corresponding author, who must follow the procedure as described above. Note that: (1) Journal Managers will inform the Journal Editors of any such requests and (2) publication of the accepted manuscript in an online issue is suspended until authorship has been agreed. After the accepted manuscript is published in an online issue: Any requests to add, delete, or rearrange author names in an article published in an online issue will follow the same policies as noted above and result in a corrigendum.. Copyright This journal offers authors a choice in publishing their research: Open Access and Subscription.. AUTHOR INFORMATION PACK 23 Mar 2014. www.elsevier.com/locate/yexpr. 3.

(49) For Subscription articles Upon acceptance of an article, authors will be asked to complete a 'Journal Publishing Agreement' (for more information on this and copyright, see http://www.elsevier.com/copyright). An e-mail will be sent to the corresponding author confirming receipt of the manuscript together with a 'Journal Publishing Agreement' form or a link to the online version of this agreement. Subscribers may reproduce tables of contents or prepare lists of articles including abstracts for internal circulation within their institutions. Permission of the Publisher is required for resale or distribution outside the institution and for all other derivative works, including compilations and translations (please consult http://www.elsevier.com/permissions). If excerpts from other copyrighted works are included, the author(s) must obtain written permission from the copyright owners and credit the source(s) in the article. Elsevier has preprinted forms for use by authors in these cases: please consult http://www.elsevier.com/permissions. For Open Access articles Upon acceptance of an article, authors will be asked to complete an 'Exclusive License Agreement' (for more information see http://www.elsevier.com/OAauthoragreement). Permitted reuse of open access articles is determined by the author's choice of user license (see http://www.elsevier.com/openaccesslicenses). Retained author rights As an author you (or your employer or institution) retain certain rights. For more information on author rights for: Subscription articles please see http://www.elsevier.com/journal-authors/author-rights-and-responsibilities. Open access articles please see http://www.elsevier.com/OAauthoragreement.. Role of the funding source You are requested to identify who provided financial support for the conduct of the research and/or preparation of the article and to briefly describe the role of the sponsor(s), if any, in study design; in the collection, analysis and interpretation of data; in the writing of the report; and in the decision to submit the article for publication. If the funding source(s) had no such involvement then this should be stated.. Funding body agreements and policies Elsevier has established agreements and developed policies to allow authors whose articles appear in journals published by Elsevier, to comply with potential manuscript archiving requirements as specified as conditions of their grant awards. To learn more about existing agreements and policies please visit http://www.elsevier.com/fundingbodies.. Open access This journal offers authors a choice in publishing their research: Open Access • Articles are freely available to both subscribers and the wider public with permitted reuse • An Open Access publication fee is payable by authors or their research funder Subscription • Articles are made available to subscribers as well as developing countries and patient groups through our access programs (http://www.elsevier.com/access) • No Open Access publication fee All articles published Open Access will be immediately and permanently free for everyone to read and download. Permitted reuse is defined by your choice of one of the following Creative Commons user licenses: Creative Commons Attribution (CC BY): lets others distribute and copy the article, to create extracts, abstracts, and other revised versions, adaptations or derivative works of or from an article (such as a translation), to include in a collective work (such as an anthology), to text or data mine the article, even for commercial purposes, as long as they credit the author(s), do not represent the author as endorsing their adaptation of the article, and do not modify the article in such a way as to damage the author's honor or reputation.. AUTHOR INFORMATION PACK 23 Mar 2014. www.elsevier.com/locate/yexpr. 4.