Técnicas de Separação Cromatográficas Cromatografia de troca ou permuta iónica. Métodos Instrumentais de Análise:

Técnicas de Separação Cromatográficas

Cromatografia de troca ou permuta iónica

Sumário

• Princípios básicos

• Curva de titulação de uma proteína

• Matriz

• Condições experimentais

• Etapas da cromatografia de troca iónica

• Exemplos

 Força do permutador

 Capacidade do permutador

 Escolha do permutador

 Escolha do tampão eluente

 Preparação da amostra

Tipos de cromatografia : Troca ou permuta iónica

•

Cromatografia de adsorção

•

interacções electrostáticas: soluto ionizável versus fase estacionária

(grupos carregados ligados covalentemente a uma matriz insolúvel)

Negativa

Liga catiões

Permuta catiónica

Fase estacionária

Positiva

Liga aniões

Permuta aniónica

Curvas de titulação das proteínas

pI

pH

3.5 < pI < 8.0

• tipicamente, a carga das proteínas varia pouco porque há poucos resíduos de aminoácidos tituláveis nesta região de pH

Pontos isoeléctricos de algumas proteínas

Proteína acídica rica em

Glu & Asp

Citocrómo c

Proteína básica rica em His,

Arg & Lys

pH= 7

pH= 7

Vermelho – regiões carregadas negativamente

Princípios básicos

M

(

C

)

Permutador aniónico

+

P



_M

₍

_P

₎

₊

_C

M

₍

_C

₎

₊

_P



_M

₍

_P

₎

₊

_C

Permutador catiónico

Tipo de permutadores iónicos

Matriz

mecânica (velocidade de fluxo) e capacidade

compostos inorgânicos, resinas sintéticas, celulose tratatada, dextranos e

agarose

Grupos

carregados

Tipo de grupos  determina o tipo e a força do permutador Nº total e disponibilidade  determina a capacidade do

permutador V oe t, B ioche m is tr y, 3e

Fórmulas moleculares de permutadores iónicos baseados na celulose:

M a triz G rupos c a rr e ga do s Permutador aniónico Permutador catiónico

Tipos de

permutadores

iónicos

+ CH₂CH₃ ----CH₂-CH₂-N-H+ CH₂CH₃ CH₂CH₃ ----CH₂-CH₂-N-CH₂CH₃

Força do permutador

•

•

permutador permanecem ionizados

pK_a ~10  permanece ionizado para 2 < pH < 9

DEAE: Permutador (aniónico) fraco

CH₂CH₃

 está sempre ionizado

Capacidade do permutador

•

está relacionada com o nº total e disponibilidade (acessibilidade)

dos grupos carregados presentes no permutador

Capacidade

total

- quantidade de grupos carregados ligados por

unidade de peso seco ou hidratado de permutador - pode ser medido através de uma titulação com ácido

ou base forte

Capacidade

disponível

- está relacionada com a quantidade de proteína que um permutador pode ligar em dadas condições experimentais e depende das:

- propriedades da proteína (M_r e curva de titulação) - propriedades do permutador

- condições experimentais usadas (pH e I)

Capacidade

dinâmica

- quando a descrição das condiçoes experimentais usadas inclui o fluxo utilizado na eluição da coluna

lavagem da coluna eluição selectiva da proteína de interesse 2 aplicar a amostra

Cromatografia de permuta aniónica

1 equilibrar a coluna 3 pH e/ou I 2 _{3 4} 4

Princípio da

permuta

iónica

1º Adsorção

2º Desadsorção

Matriz com cargas + Proteína com carga - Ião salino competidor

Efeito do

aumento da

força iónica





i

i

i

I

c

z

2

2

1

Influência da força iónica nas interacções

electrostáticas





i

i

i

I

2

2

1

z

c

Escolha das condições experimentais a usar

Etapas de uma

cromatografia de

troca iónica

Montagem experimental

#1. Escolha do permutador

pH > pI

Permuta aniónica

pH < pI

Permuta catiónica

pI

#1. Escolha do permutador

• pH

Componentes da

amostra mais

estáveis a

pH < pI

Permutador

catiónico

_pH

= pI 1

pH > pI

Permutador

aniónico

• Força iónica, I

os géis podem compactar com a variação da força iónica da solução e, eventualmente, aprisionar proteínas nos seus poros

• Tamanho dos componentes da amostra

M_r < 10 000  pode-se usar matrizes com poros de tamanho reduzido 10 000 < M_r < 100 000  usar Sepharose

#2. Escolha do tampão inicial

Composição do tampão

iões do tampão 

devem ter carga igual à dos grupos imobilizados na matriz Tampões catiónicos com permutadores aniónicos DEAE:

Tris, imidazole, piridina Tampões aniónicos

com permutadores catiónicos

CM:

acetato, citrato, fosfato

pH as condições

iniciais devem ser o mais próximas possíveis das condições de eluição

Permutador aniónico

_pH

_{= pI + 1}

Permutador catiónico

_pH

_{= pI - 1}

Força iónica,

I

• o valor inicial deve ser o mais baixo possível: 0.05 – 0.1 M (desde que a amostra não seja instável)

• sais habitualmente usados: NaCl, KCl Pressuposto:

as substâncias de interesse devem ficar ligadas à coluna

#3. Preparação da amostra

• Concentração

depende da capacidade disponível da coluna:

é função, entre outras variáveis, do nº de grupos carregados disponíveis no permutador

• Composição

#4. Estratégias de eluição

Estratégias de eluição

Variação de pH Permutador aniónico  pH Permutador catiónico  pH Variação da força iónica, I Início:

Força iónica baixa

competição mínima para a ligação da(s) proteína(s) aos grupos

carregados do permutador Final:

Força iónica elevada

aumenta a competição, reduzindo-se progressivamente a interacção entre a(s) proteína(s) e o permutador

Adição de um ligando

carregado

Eluição selectiva da proteína da coluna

Carga da proteína +5 Carga da proteína + 5 Carga do ligando - 2 Carga global + 3

Etapas de uma cromatografia de troca iónica

1- Equilibrar a coluna 2- Aplicação da mostra 3- Lavagem da coluna

4- Eluição:

variação de pH e/ou força iónica 5- Regeneração da coluna

Permuta catiónica:

X++

X++ _{& Y}+

Eluição dos

contra-iões C+ Eluição de Y+ Eluição de X++

Aplicar soluto Soluto ligado Adicionar contra-ião Z+ Adicionar mais contra-ião Z+ C+ C+ C+ C+ C+ C+ C+ Y+ X++ Y+ X+ Y+ X++ Z+ X++ Z+ X++ X++ Z+ X++ Z+ Z+ Z+ Z+ Z+ Z+ Z+ C+ _C+ _C+ _C+ _C+ _Y+ _Y+ _Y+ _Y+ _Y+ _X++ _X++ _X++ _X++

Cromatografia de permuta catiónica

V o e t, B ioch e m istr y, 3 e

Modo de eluição I: uso de um gradiente

descontínuo de força iónica

Modo de eluição I: uso de um gradiente

descontínuo de força iónica

P ro te in P u ri fi ca ti o n Ha n d b o o k , A m e rsh a m P h a rm a ci a B io te ch Abs@280nm

P ro te in P u ri fi ca ti o n Han d b o o k , A m e rsh a m P h a rm a ci a B io te ch V o e t, B io ch e m istr y, 3 e

Modo de eluição II: uso de um gradiente

contínuo de força iónica

A resolução da separação é afectada pelo declive

do gradiente aplicado

Aplicação #1: Determinação da composição em resíduos

de aas do hexapéptido Ala-Gly-Asp-Phe-Arg-Gly

Amostra: hidrólise ácida do hexapéptido Ala-Gly-Asp-Phe-Arg-Gly (HCl 6 M, T = 110 ºC, 24 h) Coluna: Dowex-50 (resina de poliestireno sulfonado: permutador catiónico),

uso de um gradiente descontínuo de pH e força iónica

Derivatização após eluição do eluente da coluna com ninidrina a T = 110 ºC

Aplicação #1: Determinação da composição em resíduos

de aas do hexapéptido Ala-Gly-Asp-Phe-Arg-Gly

Fase estacionária: Dowex-50 - resina de poliestireno sulfonado: permutador catiónico

Mecanismo de separação dos aas

1. devido à carga negativa da fase estacionária

os aas negativos tendem a eluir primeiro e os aas básicos a serem retidos mais tempo

2. a natureza hidrófoba do próprio poliestireno tende a

reter preferencialmente os aas mais hidrófobos, tais como a leucina, Leu, e a fenilalanina, Phe

Cromatografia de troca iónica: balanço

Cromatografia de Troca ou Permuta Iónica

Vantagens

Desvantagens

é possível tratar grandes volumes de amostra

inicialmente, as proteínas têm de

estar na mesma solução tampão com que a coluna foi equilibrada

é possivel tratar amostras com

concentrações elevadas de proteína

pode ser necessário um passo de troca de tampão após a aplicação desta técnica

as condições de eluição são muito flexíveis, o que aumenta muito a versatilidade da técnica

• Ambas as técnicas (permuta aniónica e catiónica) podem ser usadas sequencialmente na purificação de proteínas

• Por vezes, pode ser vantajoso ligar à coluna os contaminantes em vez da proteína de interesse