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ETANOL DE SEGUNDA GERAÇÃO

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Academic year: 2021

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GEORGE JACKSON DE MORAES ROCHA VIVIANE MARCOS NASCIMENTO CARLOS EDUARDO VAZ ROSSELL

PRODUÇÃO INDUSTRIAL

ETANOL DE

SEGUNDA GERAÇÃO

(2)

A

expansão do Ensino Técnico no Brasil, fator importante para melhoria de nossos recursos humanos, é um dos pilares do desenvolvimento do país. Esse objetivo, dos governos estaduais e federal, visa à melhoria da competitividade de nossos produtos e serviços, vis-à-vis com os dos países com os quais mantemos relações comerciais.

Em São Paulo, nos últimos anos, o governo estadual tem investido de forma contínua na ampliação e melhoria da sua rede de escolas técnicas - Etecs e Classes Descentralizadas (fruto de parcerias com a Secretaria Estadual de Educação e com Prefeituras). Esse esforço fez com que, de agosto de 2008 a 2011, as matrículas do Ensino Técnico (concomitante, subsequente e integrado, presencial e a distância) evoluíssem de 92.578 para 162.105.

A garantia da boa qualidade da educação profissional desses milhares de jovens e de trabalhadores requer investimentos em reformas, instalações/laboratórios, material didático e, principalmente, atualização técnica e pedagógica de professores e gestores escolares.

A parceria do Governo Federal com o Estado de São Paulo, firmada por intermédio do Programa Brasil Profissionalizado, é um apoio significativo para que a oferta pública de ensino técnico em São Paulo cresça com a qualidade atual e possa contribuir para o desenvolvimento econômico e social do estado e, consequentemente do país.

Almério Melquíades de Araújo Coordenador do Ensino Médio e Técnico

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Centro Estadual de Educação Tecnológica Paula Souza Diretora Superintendente Laura Laganá   Vice-Diretor Superintendente César Silva  

Chefe de Gabinete da Superintendência

Luiz Carlos Quadrelli  

Coordenador do Ensino Médio e Técnico

Almério Melquíades de Araújo

REALIZAÇÃO

Unidade de Ensino Médio e Técnico

Grupo de Capacitação Técnica, Pedagógica e de Gestão - Cetec Capacitações Responsável Cetec Capacitações

Lucília dos Anjos Felgueiras Guerra

Responsável Brasil Profissionalizado

Silvana Maria Brenha Ribeiro

Coordenadora de Projetos

Ana Maria Aoki Gonçalves

Revisão de Texto Yara Denadai Revisão de Conteúdo Luciano Tronchini Projeto Gráfico Diego Santos Fábio Gomes Priscila Freire

Projeto de formação continuada de professores da educação profissional do Programa Brasil Profissionalizado - Centro Paula Souza - Setec/MEC

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“Etanol de segunda geração”

Laboratório Nacional de Ciência e Tecnologia do Bioetanol - CTBE

Divisão de Processamento de Biomassa

Duração do curso: 16h teóricas e 8h de visitas técnicas em laboratório e planta piloto.

Responsáveis: George Jackson de Moraes Rocha Viviane Marcos Nascimento Carlos Eduardo Vaz Rossell

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Sumário

Materiais lignocelulósicos . . . 9

Principais componentes das biomassas vegetais . . . 11

2.1 Celulose . . . 11

2.2 Hemicelulose . . . .12

2.3 Lignina . . . .13

2.4 Extrativos . . . .14

2.5 Estrutura e ultraestrutura da parede celular vegetal . . . .14

2.6 Metodologia para determinação da composição do material lignocelulósico. . . .15

Biorefinaria. . . 17

4.1 Recalcitrância e pré-tratamento da biomassa lignocelulósica . .19

Pré-tratamento da biomassa vegetal . . . 19

4.1.1 Pré-tratamento com ácido diluído . . . .20

4.1.2 Pré-tratamento hidrotérmico . . . .21

4.1.3 Pré-tratamento por explosão a vapor . . . .22

4.1.4 Pré-tratamento organossolve . . . .23

4.1.5 Pré-tratamento alcalino . . . .24

5.1 Hidrólise química e hidrólise enzimática . . . .27

Hidrólise de materiais lignocelulósicos . . . 27

Fermentação alcoólica . . . 32

6.1 Formação dos produtos de degradação e ação inibitória no pro-cesso fermentativo . . . .32

6.2 Processo fermentativo . . . .33

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Apresentação

A busca por combustíveis e insumos químicos baseados no desenvolvimento sustentável é um campo emergente devido à necessidade de implementação de processos industriais ecologicamente corretos e de rotas alternativas para a substituição de derivados do petróleo.

O Brasil domina a tecnologia de produção de etanol a partir da extração do caldo da cana-de-açúcar desde a década de 1970, com a criação do Programa Nacional do Álcool (Próalcool), quando buscava uma solução à crise energética mundial e à diminuição da dependência brasileira em relação ao petróleo. Hoje o Brasil é o segundo maior produtor mundial de etanol, com uma frota de veículos com motores predominantemente flexfluel.

O domínio na produção de combustível renovável pode ser expandido pela possibilidade de obtenção de etanol por meio da fermentação dos carboidratos presentes no caldo da cana-de-açúcar, como também a partir dos polissacarídeos da parede celular vegetal, chamado etanol lignocelulósico ou de segunda geração.

Em 2010 o Laboratório Nacional de Ciência e Tecnologia do Bioetanol (CTBE) foi inaugurado para superar importantes gargalos tecnológicos do setor, dentre eles a necessidade de aprofundar o conhecimento científico e tecnológico em todo o ciclo cana/etanol.

O CTBE desenvolve pesquisa e inovação de nível internacional na área de biomassa voltada à produção de energia, em especial do etanol de cana-de-açúcar, além de possuir um ambiente singular para o escalonamento de tecnologias (Planta Piloto), visando à transferência de processos em escala piloto para o setor produtivo.

ANA MARIA AOKI GONÇALVES

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Introdução

O uso de combustíveis à base de petróleo para o transporte, como a gasolina e o diesel, tem impactado severamente o ambiente e as condições climáticas, com a estimativa que até 2040 14,7 toneladas de CO2 serão emitidas na atmosfera por pessoa (EIA, 2014). Além da questão ambiental, os aumentos previstos na demanda de energia de 1,6 % ao ano para o período de 2008-2030 têm gerado incertezas para os países com a economia predominante baseada em combustíveis fósseis (EIA, 2011).

Este cenário enfatiza a necessidade da inserção de fontes de energia renovável como uma parcela significativa da base energética mundial. O Brasil se encontra em uma posição privilegiada nesse contexto, pois tem boas possibilidades de se tornar líder na produção de etanol de biomassa devido, principalmente, ao pioneirismo na fabricação de etanol a partir do caldo de cana de açúcar.

Com uma produção, na safra de 2012/2013, de 659,85 milhões de toneladas de cana-de-açúcar, gerando cerca de 185 milhões de toneladas de subprodutos sólidos (bagaço e palha de cana-de-açúcar base seca) (Conab, 2013), o Brasil assume posição estratégica para a obtenção de energia, combustíveis e insumos químicos a partir de subprodutos e resíduos vegetais (CGEE, 2010).

Os principais constituintes das biomassas vegetais (celulose, hemicelulose e lignina) podem resultar, por meio de processos químicos e ou bioquímicos, insumos de alto valor agregado no mercado em um conceito análogo à refinaria de petróleo, denominado biorrefinaria.

Embora atraente do ponto de vista econômico, a disponibilização dos componentes da biomassa vegetal requer processos prévios de fracionamento e separação, a fim de tornar o processo eficiente, sendo este um dos principais desafios para a obtenção de bioprodutos a partir de materiais lignocelulósicos. Com base nesse preceito, o material apresentado a seguir pontua importantes características, vantagens e desvantagens das possibilidades de processos de disponibilização e transformação dos carboidratos presentes na parece celular vegetal em combustíveis.

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A Biomassa é definida como uma massa de material orgânico proveniente de qualquer composto biológico, como por exemplo, sementes, caule, lipídios, proteínas, fibras, amido etc (Smith et al., 1987).

O termo biomassa lignocelulósica é referido a plantas superiores, madeira mole e madeira dura, tendo como seus principais componentes a celulose, hemicelulose e a lignina.

A celulose, como principal componente da parede celular, é responsável por conferir força mecânica e estabilidade química às plantas. Já a hemicelulose, como um copolímero constituído por diferentes açúcares de cadeia de 5 e 6 carbonos, contribui para o intumescimento, mobilidade e flexibilidade das fibras. A lignina, como um polímero aromático, forma uma camada protetora das plantas. Além desses três componentes básicos, a lignocelulose também é constituída por água, proteínas, minerais, ceras, terpenos etc.

A composição da biomassa vegetal varia substancialmente de acordo com as espécies, condições ambientais durante o crescimento, método de colheita e armazenamento (Farinas, 2011).

Além das diferentes proporções de celulose, hemicelulose e lignina, as biomassas vegetais podem diferir entre si nos tipos de hemiceluloses e/ ou ligninas (Pauly e Keegstra, 2010). A Tabela 1 apresenta a composição química de diversas biomassas vegetais.

Capítulo 1

(9)

10 E ta n o l d e s eg un d a g er aç ão

Tabela 1 – Composição química de diferentes materiais lignocelulósicos (Fonte: Ramirez, 2010 e Zheng et al., 2009)

Biomassa Celulose (%) Hemicelulose (%) Lignina (%)

Palha de cevada 40-44 28-30 20-22 Bagaço de cana-de-açúcar 32-48 19-24 23-32 Forragem de milho 36 23 17 Palha de cana-de-açúcar 40- 44 30-32 22-25 Madeira dura 43-47 25-35 16-24 Madeira mole 40-44 25-29 25-31 Talo de milho 35 25 35 Espiga de milho 45 35 15 Algodão 95 2 0.3 Palha de trigo 30 50 15 Sisal 73,1 14,2 11 Fibra de coco 36-43 0,15- 0,25 41-45 Fibra de bananeira 60-65 6-8 5-10

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2.1 Celulose

Descoberta em 1838 pelo cientista francês Anselme Payen quando este percebeu a presença de resíduo sólido fibroso após tratar tecidos vegetais com ácido e amônia, (Hallac e Ragauskas, 2011) a celulose é a fonte mais abundante de carbono na biosfera, representando 40% de toda a reserva disponível. Ela está presente em todas as plantas, desde árvores altamente desenvolvidas até organismos mais primitivos, com seu conteúdo variando de 20 a 99% (Rabelo, 2007). Esse homopolímero linear de estrutura física e morfológica complexa e de alta massa molecular é formado por unidades de β-D glicopiranose unidas covalentemente através de ligações β 1,4 glicosídicas (O’sullivan, 1997).

O grau de polimerização da celulose é determinado de acordo com o número de monômeros que compõem a cadeia de celulose e varia de acordo com o tratamento e origem do material (Klemm et al., 2005). A polimerização da cadeia de celulose ocorre por meio da adição de novas unidades de glicose as extremidades não redutoras (Koyama et al., 1997), sendo que a celobiose é a estrutura repetitiva da cadeia de celulose, formada por dois resíduos de glicose ligados através de uma ligação β(1-4).

Apesar da aparente simplicidade química, a celulose é um polímero rígido e linear, insolúvel em água e que se apresenta em uma vasta gama de formas físicas (Fengel, Wegner, 1989). A estrutura da celulose pode ser definida em três níveis organizacionais (Atalla, 1993), com o primeiro correspondendo a sequência de ligações covalentes β-D(1,4) da anidroglicose; o segundo caracterizado pelas distâncias e ângulos das ligações de hidrogênio intramoleculares, que são responsáveis pela organização espacial dessas unidades repetitivas, e; o terceiro nível com a associação das moléculas que formam agregados com uma determinada estrutura cristalina (Gama, 1996) (Figura 1).

As moléculas de celulose tendem a formar ligações hidrogênio intramoleculares (entre unidades de glicose da mesma molécula) e intermoleculares (entre unidades de glicose de moléculas adjacentes). O primeiro tipo de interação é responsável por certa rigidez das cadeias unitárias e o segundo pela formação da fibra vegetal (Fengel e Wegener, 1989). Devido às suas fortes ligações de hidrogênio, a celulose é praticamente insolúvel em água e em solventes orgânicos comuns (Hon, 1996).

Capítulo 2

Principais componentes das

biomassas vegetais

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12 E ta n o l d e s eg un d a g er aç ão

Figura 1 - Estrutura da celulose com as ligações de hidrogênio inter e intramolecular.

Fonte: adaptado de Festucci-Buselli et al., 2007.

As microfibrilas de celulose são unidades estruturais que compõem a fase microfibrilar de cada camada da parede celular, formadas por cadeias de celulose alinhadas em paralelo em um arranjo cristalino específico. Essas microfibrilas são compostas por fibras elementares que posteriormente são associadas a polímeros não celulósicos, como a hemicelulose e a lignina.

Cada microfibrila tem aproximadamente 36 unidades de glicose e o número de unidades de glicose no polímero de celulose pode variar entre 15 a 15.000 unidades, com um valor médio da ordem de 3.000 unidades (Castro, 2009). 2.2 Hemicelulose

A hemicelulose é um heteropolímero ramificado representando em geral de 15- 35% da biomassa vegetal, no qual pode conter diferentes unidades de açúcares como glicose, manose, galactose (hexoses), xilose e arabinose (pentoses), além de quantidades variáveis de ácidos urônicos e desoxi-hexoses (Figura 2). Outros açúcares como ramanose e fucose podem estar presentes em pequenas quantidades e os grupos hidroxilas dos açúcares podem também estar parcialmente substituídos por grupos acetilas (Girio et al., 2010).

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13 E ta n o l d e s eg un d a g er aç ão

Figura 2 - Estrutura dos

monossacarídeos que formam as hemiceluloses Fonte: (Fengel e Wegener, 1989)

Na parede celular das plantas a hemicelulose interage com as microfibrilas de celulose e lignina formando um nano compósito natural (Fengel e Wegener, 1989, Scheller e Ulvskov, 2010). A origem e a localização citológica na planta são os fatores que mais influenciam na composição da hemicelulose e no seu teor relativo na parede celular vegetal (Sjostrom, 1993). As variações nas ligações e ramificações das hemiceluloses, devido à presença de diferentes açúcares monoméricos, contribuem para a formação da complexa estrutura e conformação da hemicelulose.

As hemiceluloses de angiospermas (monocotiledôneas como gramíneas e cereais e dicotiledônias como madeira dura) são formadas predominantemente por heteroxilanas altamente acetiladas e geralmente classificadas como 4-O-metil-glucuronoxilanas. Compostos de hexosanas também estão presentes, na forma de glucomananos, porém em menor quantidade.

Devido às suas características ácidas e propriedades químicas, as xilanas da madeira dura são relativamente instáveis à hidrólise ácida e sofrem auto-hidrólise em condições moderadas. Já as hemiceluloses de gimnospermas (como madeira mole) são constituídas por glucomananos e galactoglucomananos parcialmente acetilados, implicando em uma maior resistência à hidrólise do que as de madeira dura (Pereira Jr, 2010; Pereira Jr., 2008; Sjostrom, 1993; Eronen et al., 2011; Wyman, 2004).

A Figura 3 apresenta a estrutura da hemicelulose de angiosperma (A) e gimnosperma (B), no qual a cadeia principal linear é constituída por xilanas.

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14 E ta n o l d e s eg un d a g er aç ão

Figura 3 - Estrutura da hemicelulose de angiosperma (A) e gimnosperma (B). Ac: grupo acetil ; α-Araf: α-Arabinofuranose;

α-4-O-Me-GlcA: α-4-O- Acido metil glucurônico. Fonte: Sunna e Antranikian, 1997.

A Tabela 2 apresenta a composição de hemiceluloses provenientes de vários materiais lignocelulósicos.

Tabela 2 - Composição da Hemicelulose de vários materiais lignocelulósicos (Adaptado de Girio et al., 2010).

Material Xil Arab Man Galact Ra G.U. G. A.l Madeira Mole Douglas fir 6.0 3.0 -- 3.7 -- -- 1.2- 1.9 Pinheiro 5.3-10.6 2.0- 4.2 5.6- 13.3 1.9- 3.8 -- 2.5- 6.0 1.2- 2.4 Spruce 5.3-10.2 1.0- 1.2 9.4- 15.0 1.9- 4.3 0.3 1.8- 5.8 Madeira dura Aspen 18-27.3 0.7- 4.0 0.9-2.4 0.6- 1.5 0.5 4.8- 5.9 4.3 birch 18.5-24.9 0.3- 0.5 1.8- 3.2 0.7- 1.3 0.6 3.6- 6.3 3.7- 3.9 Eucalipto 14-19.1 0.6- 1.0 1- 2.0 1- 1.9 0.3- 1 2 3- 3.6 Mapple 18.1-19.4 0.8- 1.0 1.3-3.3 1.0 - 4.9 3.6- 3.9 Poplar 17.7-21.2 0.9- 1.4 3.3- 3.5 1.1 - 2.3- 3.7 0.5- 3.9 Resíduo/Subproduto agroindustrial Barley straw 15 4.0 - - - - -Fibra milho 21.6 11.4 - 4.4 - - -Palha de arroz 14.8-23 2.7- 4.5 1.8 0.4 - - -Bagaço de cana 20.5-25.6 2.3-6.3 0.5-0.6 1.6 - -

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-15 E ta n o l d e s eg un d a g er aç ão 2.3 Lignina

A lignina, depois da hemicelulose, é a macromolécula mais abundante, representando cerca de 20 a 30% do carbono da biomassa vegetal (Fengel & Wegener, 1989).

Essa substância de origem fenilpropanóica é incorporada durante o crescimento vegetal através do acoplamento via radicalar de três diferentes álcoois cinamílicos precursores: álcool p-cumarílico, álcool coniferílico e álcool sinapílico (Figura 4), que geram unidades p-hidroxibenzílicas, guaiacílicas e siringílicas, respectivamente. Na lignina, essas espécies monoméricas são unidas por ligações carbono-carbono (C-C) e ligações carbono oxigênio (C-O-C) (Gullichsen e Paulapuro, 2000).

Figura 4 - Precursores da biossíntese da lignina: (I) álcool p-cumarílico; (II) álcool coniferílico; (III) álcool sinapílico

Fonte: (Fengel e Wegener, 1989).

O acoplamento das unidades fenilpropano não ocorre de forma regular e repetitiva, o que é atribuído ao mecanismo da biossíntese da lignina, resultando em uma macromolécula tridimensional e amorfa. Estas substâncias químicas conferem rigidez à parede da célula e, nas partes da madeira, agem como um agente permanente de ligação, gerando uma estrutura resistente ao impacto, compressão e dobra.

A lignina é, essencialmente, a “cola” que proporciona rigidez à estrutura das plantas e árvores (Cherubini, 2010).

2.4 Extrativos

Os extrativos são componentes que não fazem parte da constituição química da parede celular e abrangem uma ampla classe de compostos químicos que podem ser removidos utilizando solventes orgânicos ou água (Fengel e Wegener, 1989; Yokoi et al., 2003; Sun e Tomkinson, 2003, Silverio et al., 2006). A composição dos extrativos pode variar, significativamente, entre diferentes espécies e mesmo dentro das diferentes partes da árvore.

Os extrativos contêm um grande número de compostos fenólicos, alguns deles resíduos ou subprodutos da biossíntese da lignina, conforme exemplificado na Figura 5.

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16 E ta n o l d e s eg un d a g er aç ão

Figura 5 - Estruturas de alguns compostos aromáticos. Fonte (Silvério, 2006)

As principais substâncias aromáticas presentes nos extrativos são os álcoois vanilícos e coniferilícos, os aldeídos vanilina e siringaldeído, a cetona acetovanilina e os ácidos vanílicos ou siríngicos, que ocorrem livres ou são produtos da degradação da lignina (Silvério, 2006).

Os materiais solúveis em água incluem sais, carboidratos simples como glicose, frutose e arabinose, polissacarídeos e monossacarídeos similares ou idênticos aos obtidos a partir da fração de hemiceluloses da madeira (Sjöströn e Alén, 1998, Freire et al., 2003).

Os extrativos são os responsáveis pela cor, odor e resistência ao apodrecimento e ao ataque de insetos. Além disto, influenciam nas propriedades da madeira como permeabilidade, densidade e dureza (Pettersen, 1984).

2.5 Estrutura e ultraestrutura da parede celular vegetal

As células vegetais são diferenciadas das animais, principalmente, pela presença de uma parede em torno da membrana celular (plasmadema). A parede celular vegetal é composta por uma mistura de polissacarídeos, proteínas, compostos fenólicos e sais minerais. Essa matriz é altamente ordenada e dinâmica, podendo se tornar mais rígida ou maleável conforme as necessidades da planta (Buckeridge et al., 2010).

A estrutura da parede celular vegetal é subdividida em parede primária (P), parede secundária (S1, S2 e S3) e parede terciária (T) (Figura 6). Essas camadas (P, S1, S2, S3 e T) são compostas predominantemente por celulose com espessura da ordem de 5 μm e as células encontram-se separadas pela lamela média (LM), que é uma camada fina (máximo 1 μm de espessura) composta por elevada concentração de lignina. A parede primária (P) é a camada mais fina da parede celular e a primeira a ser depositada nas células (menor do que 0,1 μm de espessura) (Fengel e Wegener, 1989; Rabelo 2007).

A distribuição da celulose, hemicelulose e lignina varia consideravelmente entre essas camadas (Fengel e Wegener, 1989).

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17 E ta n o l d e s eg un d a g er aç ão

Figura 6 – Esquema morfológico da célula e parede secundaria da célula vegetal.

Fonte: (Kirk e Cullen, 1998)

A celulose existe na forma de microfibrilas, e os microcapilares que circundam a armação da parede celular são preenchidos com hemicelulose e lignina (Fengel e Wegener, 1989). A hemicelulose se une às microfibrilas da celulose através de ligações de hidrogênio, dando forma a uma rede que fornece estrutura à parede celular da planta. Já a lignina aparece impregnando as paredes celulares de certos tecidos, como por exemplo, células do xilema e do esclerênquima, conferindo-lhes rigidez e resistência à compressão. Os compostos graxos, especialmente cutina, suberina e as ceras, são encontrados principalmente, nas paredes celulares dos tecidos de revestimento (epiderme e periderme) e têm a importante função de reduzir a perda de água das plantas. Dentre as substâncias inorgânicas da parede celular podem ser citados a sílica e o carbonato de cálcio (Perez e Mazeu, 2004).

2.6 Metodologia para determinação da composição do material lignocelulósico

A metodologia para a caracterização físico-química do bagaço de cana-de-açúcar permite a determinação da composição química detalhada do material lignocelulósico é de extrema importância para o acompanhamento de um processo de conversão através da determinação dos seus constituintes no início, meio e no final do processo.

A caracterização química torna viável o estudo comparativo de diferentes processos para a obtenção de biocombustíveis e blocos químicos a partir da biomassa, através de informações sobre o comportamento dos seus principais constituintes durante as diferentes etapas de um bioprocesso.

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O conceito de biorefinaria é definido pela agência internacional de energia (EIA,2011) como sendo o processamento sustentável da biomassa em uma gama de produtos de alto valor agregado (EIA,2011).

A biorrefinaria surge como uma plataforma industrial suportada por diferentes tecnologias. Seu objetivo é transformar a biomassa vegetal, através de diferentes rotas químicas e ou biológicas, em um vasto portfólio de insumos químicos concomitantemente com energia e combustíveis. Assim se desenha um processo similar ao das refinarias de petróleo hoje existentes, no qual múltiplos combustíveis, insumos químicos básicos, intermediários e sofisticados são produzidos a partir da fragmentação do petróleo (Cherubini, 2010; Morais e Bogel-Lukasik, 2013).

Para ser convertido em produtos da biorrefinaria, o material lignocelulósico requer uma etapa de fracionamento prévia, com o intuito de separar as frações celulose, hemicelulose e lignina.

A celulose, hemicelulose e lignina podem ser convertidas em inúmeros produtos via rotas químicas, biotecnológicas ou termoquímicas. As Figuras 7, 8 e 9 apresentam os produtos passíveis de serem obtidos a partir da celulose, da hemicelulose e da lignina, respectivamente (Pereira Jr, 2010).

Figura 7 - Biorrefinaria a partir de produtos advindos da celulose. Fonte: Pereira Jr. et al., 2010.

Figura 8 - Biorrefinaria a partir de produtos advindos da hemicelulose. Fonte: Pereira Jr. et al., 2010.

Figura 9 - Biorrefinaria a partir de produtos advindos da lignina. Fonte: Pereira Jr. et al., 2010.

Capítulo 3

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19 E ta n o l d e s eg un d a g er aç ão

Figura 8 - Biorrefinaria a partir de produtos advindos da hemicelulose. Fonte: Pereira Jr. et al., 2010.

Figura 9 - Biorrefinaria a partir de produtos advindos da lignina. Fonte: Pereira Jr. et al., 2010.

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20 E ta n o l d e s eg un d a g er aç ão

O etanol de segunda geração é um dos produtos passíveis de serem obtidos a partir da fração celulósica e hemicelulósica dos materiais lignocelulósicos, mas para que essa tecnologia possa ser implementada industrialmente os seguintes aspectos devem ser focalizados (Pereira Jr, 2010):

• Aperfeiçoamento do processo de pré-tratamento visando eficácia e diminuição da geração de substancias químicas que possam inibir a etapa de fermentação alcoólica;

• Conversão de ambas as frações celulósica (glicose) e hemicelulósica (principalmente xilose) a etanol, seja por meio da fermentação em conjunto do hidrolisado hemicelulósico e celulósico realizada por um organismo recombinante capaz de fermentar tanto pentoses quanto hexoses ou pela fermentação realizada separadamente;

• Realização de um estudo detalhado sobre o balanço de energia do processo; • Realização de estudos detalhados sobre a viabilidade econômica dos

processos de aproveitamento de resíduos agrícolas e agroindustriais, incluindo questões de logística.

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21 E ta n o l d e s eg un d a g er aç ão

4.1 Recalcitrância e pré-tratamento da biomassa lignocelulósica

A produção de álcool combustível por meio da utilização de biomassa vegetal como precursor envolve basicamente dois processos: hidrólise e fermentação. A hidrólise é responsável pela disponibilização dos polissacarídeos contidos nos materiais lignocelulósicos em açúcares fermentescíveis (sacarificação) e a fermentação pela posterior conversão destes em etanol ou outros insumos (Kim et al., 2011).

A estrutura complexa da biomassa lignocelulósica, resultante da organização e da interação entre os principais constituintes da parede celular (celulose, hemicelulose e lignina), representam uma barreira à ação enzimática. A menos que um excesso muito grande de enzimas seja usado, a digestibilidade enzimática da celulose na biomassa nativa é baixa, em torno de 20%. Por isso, a estrutura deve ser parcialmente desconstruída na etapa de pré-tratamento.

A interação das características estruturais, físicas e químicas da parede celular dos materiais lignocelulósicos é definida como recalcitrância da biomassa e se apresenta como um dos principais gargalos à viabilização econômica da biorrefinaria lignocelulósica.

O pré-tratamento é uma etapa imprescindível para remover as barreiras recalcitrantes e aumentar a digestibilidade da celulose, através da alteração de sua composição e estruturas físicas, graças: remoção da hemicelulose e da lignina, ampliação da área superficial interna das partículas, diminuição do grau de polimerização, aumento do volume dos portos e diminuição do tamanho de partículas, tornando-a suscetível à conversão em produtos como etanol e outras substâncias químicas (Zhu et al., 2008).

Esse processo, que visa fundamentalmente desorganizar o complexo lignocelulósico (Figura 10), pode ser realizado por meio de processos físicos, físico-químicos, químicos, ou biológicos, podendo se associar ou ser seguido por outros processos de hidrólise (Harmsen et al., 2010). A Figura 11 apresenta as diferentes frações que podem ser obtidas por meio de processos de fracionamento da biomassa vegetal.

Capítulo 4

Pré-tratamento

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22 E ta n o l d e s eg un d a g er aç ão

Figura 10 - Representativo esquemático da fragmentação/separação dos constituintes majoritários do material lignocelulósico.

Fonte: http://www.ceres.net/aboutus/AboutUs-Biofuels-Carbo.html

Figura 11 - Frações da biomassa vegetal a) bagaço de cana in natura, b) bagaço de cana-de-açúcar submetido ao pré-tratamento

por explosão a vapor, c) bagaço submetido ao pré-tratamento por explosão a vapor e deslignificação com NaOH, d) licor negro contendo lignina proveniente da etapa c; e) Lignina precipitada do

licor negro por meio da redução de pH com ácido sulfúrico. As biomassas lignocelulósicas se apresentam como um material extremamente heterogêneo, com diferentes composições conforme a respectiva procedência. Com base nesse preceito, eleger um único pré-tratamento como sendo o ideal é uma tarefa impossível, tornando a escolha dependente da natureza do material a ser utilizado, bem como a finalidade do uso do hidrolisado (Girio et al., 2010). Dentre as tecnologias que levam à solubilização da hemicelulose e da lignina se destaca o ácido diluído, hidrotérmico, organosolv, explosão a vapor e alcalino, que serão apresentados a seguir.

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23 E ta n o l d e s eg un d a g er aç ão

4.1.1 Pré-tratamento com ácido diluído

O pré-tratamento com ácido diluído se baseia na reação do material lignocelulósico com ácidos com concentrações de 0,2 a 2,5 % m/m, em temperaturas de 120 a 220°C e tempos de reação de segundos a horas (Tao et al., 2011, Menon et al., 2012).

O baixo consumo de ácido é uma das maiores vantagens em termos de custo e severidade do processo, além de liberar no meio nutrientes essenciais para o processo fermentativo, como o S e P decorrentes da utilização de ácido sulfúrico/ fosfórico (> 1% m/v) (Galbe e Zacchi, 2002; Zhang et al., 2012). Uma abrangente variedade de ácidos tem sido utilizada para a realização deste pré-tratamento, destacando–se o ácido sulfúrico e o ácido fosfórico como os mais usuais devido ao seu custo e eficiência (Sannigrahi, 2011, Bensah e Mensah, 2013).

A hemicelulose é preferencialmente hidrolisada nesse pré-tratamento, com a liberação de açúcares monoméricos e oligômeros solúveis da matriz lignocelulósica para o hidrolisado (Harmsen et al., 2010), remoção esta que ocasiona aumento da porosidade e digestibilidade enzimática da biomassa (Chen et al., 2007). O pré-tratamento ácido solubiliza a hemicelulose do material lignocelulósico com foco na xilana, visto que glucomananas são relativamente estáveis em meio ácido (Hendriks e Zeeman, 2009).

Esse tratamento se destaca pelo alto desempenho na recuperação da fração hemicelulósica. Por outro lado, apresenta como inconveniente a posterior degradação dos açúcares monoméricos em furfural, ácido fórmico, ácido acético e ácido urônico, os quais apresentam alto potencial inibitório do processo fermentativo.

A concentração do íon hidrogênio é diretamente correlacionada à constante da reação, sendo que quanto menor o Pka do ácido, mais efetiva é o processo de hidrólise (Bobleter, 1994).

O fator de severidade se apresenta como um fácil método comparativo para diferentes condições de pré-tratamentos, pois relaciona o efeito experimental da temperatura, tempo de residência e concentração de ácido (Chum et al., 1999).

Onde T é temperatura do pré-tratamento (°C), t é tempo do pré-tratamento (min) e T ref é 100°C.

A solubilização e a diminuição do grau de polimerização da celulose somente ocorre sob condições severas de pré-tratamento ácido. Em relação à lignina, esse pré-tratamento não ocasiona deslignificação do material lignocelulósico, resultando somente no aumento da concentração de lignina insolúvel (Klason) em relação ao material “in natura”, que pode ser atribuído à repolimerização de produtos de degradação de açúcares para a formação de “pseudo-lignina” (Li et al., 2007).

A Figura 12 apresenta reatores de escala laboratorial e piloto utilizados para a realização do pré-tratamento com ácido diluído. Já a Figura 13 apresenta o aspecto visual do bagaço de cana submetido ao pré-tratamento por ácido fosfórico e por ácido sulfúrico diluído.

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24 E ta n o l d e s eg un d a g er aç ão

Figura 12 – Reatores utilizados para pré-tratamento com ácido diluído a) Reator de 2L (Parr) de aço Hastelloy (CTBE); b) Reator de

350L de aço inox 316 (Departamento de Engenharia Química da Escola de Engenharia de Lorena – EEL/USP)

Figura 13 - Foto do bagaço de cana “in natura” (A), pré-tratado com H3PO4 1,5 % (m/v) (B) e pré-tratado com H2SO4 1,0 % (m/v) (C)

(Silva, 2009).

Nota-se que devido ao fato do pré-tratamento ácido solubilizar preferencialmente a hemicelulose não é possível obter modificações visuais significativas, salientando somente a redução do tamanho das partículas do material.

4.1.2 Pré-tratamento hidrotérmico

O pré-tratamento hidrotérmico utiliza um solvente ambientalmente favorável (água) em seu processo, a não necessita da atuação de catalisadores ou reatores especiais, tornando-se assim um processo reacional atrativo para uma variedade de aplicações (Van et al., 1996).

Ao decorrer do processo, cuja faixa de temperatura varia de 160 a 240°C (Alvira et al., 2010), a água atua como um ácido fraco, liberando no meio o íon hidroxônio. Os grupos acetais das hemiceluloses são os mais suscetíveis a este tipo de reação, levando à formação de oligossacarídeos e clivagem dos grupos acetila das frações hemicelulósicas das matérias-primas.

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25 E ta n o l d e s eg un d a g er aç ão

(DP 9-25) e as proporções variam significativamente conforme o aumento da severidade do processo, devido à degradação das cadeias de açúcares (Garrote et al., 2007). Entretanto, em etapas reacionais subsequentes, os íons hidroxônio gerados pela ionização do ácido acético também podem atuar como catalisadores na degradação de polissacarídeos. Isso resulta, dentre outros compostos, na formação de aldeídos (furfural), advindo da desidratação de pentoses e 5- hidroximetilfurfural (HMF) da desidratação de hexoses.

Furfural e HMF também são formados durante o processo de pré-tratamento hidrotérmico, porém em quantidades significativamente menores quando comparado ao pré-tratamento com ácido diluído (Du et al., 2010).

De fato, esse pré-tratamento apresenta simplicidade e baixo custo operacional atrelado à alta solubilização de hemicelulose, aumento da digestibilidade da celulose, mínima formação de produtos de degradação de açúcares (pH entre 4 e 7) e solubilização parcial da lignina (em torno de 180°C) (Mosier et al., 2005; Weil et al., 1998; Garrote et al., 2007).

A Figura 14 apresenta um reator piloto de 20L utilizado para a realização do pré-tratamento hidrotérmico.

Figura 14 – Reator rotatório de 20L utilizado para a realização de pré-tratamento hidrotérmico do bagaço de cana-de-açúcar (REGMED AU/E-20 - Departamento de Antibióticos da UFPE). 4.1.3 Pré-tratamento por explosão a vapor

A técnica de pré-tratamento por explosão a vapor se baseia na submissão do material lignocelulósico a altas pressões em um sistema saturado com vapor, seguido de uma descompressão explosiva.

É tipicamente conduzido entre 160-260°C (0,69 – 4,83 Mpa) por alguns segundos antes do material ser exposto à pressão atmosférica, o que ocasiona o enfraquecimento da estrutura lignocelulósica e a exposição das fibras celulósicas à conversão enzimática (Sun e Cheng, 2002; Rocha et al., 2012)

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26 E ta n o l d e s eg un d a g er aç ão

A adição de catalisadores como SO2 ou H2SO4 pode aumentar significativamente os rendimentos de extração da fração hemicelulósica (Wyman et al., 2005). Portanto, os rendimentos de extração de açúcares são dependentes das condições do processo.

Durante o pré-tratamento, o vapor penetra nas células da biomassa, resultando na hidrólise da hemicelulose e na modificação de alguns fragmentos de lignina de acordo com o aumento da temperatura. Ácido acético é liberado no meio reacional devido à quebra das ligações acetilas da hemicelulose, além do próprio pKa da água que é afetado pela temperatura de tal modo que o seu pH a 200°C fique próximo de 5,0 (Weil et al., 1998), o que catalisa a hidrólise da hemicelulose durante o processo. Em geral, a hemicelulose é extraída na forma oligomérica, que é parcialmente hidrolisada a monossacarídeos devido à liberação de ácidos no meio. À medida que as condições do pré-tratamento por explosão vão ficando mais severas, ocorrem reações de condensação e repolimerização entre os produtos de decomposição da hemicelulose, como furfural e lignina. Isso ocasiona a formação de “pseudo-ligninas” relacionado a um significativo aumento no teor de lignina insolúvel em ácido (Klason) (Li e Gallerstedt, 2008). A celulose, ao contrário da hemicelulose, é o ultimo componente a ser alterado durante o processo de explosão a vapor, e suas modificações abrangem alterações no grau de cristalinidade e polimerização, além da formação de HMF devido à hidrólise da glicose proveniente da celulose. Esse pré-tratamento ocasiona um aumento da porosidade e da área superficial do material atribuído à extração da hemicelulose e redistribuição da lignina (Wong et al., 1998).

Inúmeras similaridades são apontadas entre o pré-tratamento por explosão a vapor e o hidrotérmico; entretanto o por explosão pode ser realizado com alta concentração de sólidos, o que usualmente resulta em uma maior concentração de inibidores, produtos de degradação de açúcares, no licor, além de requer uma menor adição de agua no processo, o que o torna mais favorável à aplicação em escala comercial (Hu e Ragauskas, 2012).

A Figuras 15 e 16 apresentam exemplos de reatores de explosão a vapor e o aspecto visual da biomassa antes e após ser submetida a esse pré-tratamento.

Figura 15 – Reatores de pré-tratamento por explosão a vapor com capacidade de 3400 kg de bagaço por hora (a), e o bagaço de cana antes (b) e depois de ser submetido ao pré-tratamento por explosão

a vapor (c) Fonte: Rocha et al., 2014b.

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27 E ta n o l d e s eg un d a g er aç ão

Figura 16 – Reator contínuo de explosão a vapor com capacidade de 75 kg.h-1 (AdvanceBio LLC-USA).

4.1.4 Pré-tratamento organossolve

O pré-tratamento organossolve inclui a adição de solventes orgânicos e aquosos, incluindo metanol, etanol, acetona, etileno glicol, tetrahidrofurfuril álcool, etc., no meio reacional com e sem a adição de catalisador, como um ácido (HCl, H2SO4, etc.), uma base (e.g., NaOH), ou um sal (MgCl2, Fe2(SO4)3, etc.), sob temperaturas entre 180-195°C, com tempos de reação de 30 – 90 min e concentração de solvente entre 35- 70% (m/v) (Hallac et al., 2010; Park et al., 2010; Haverty et al., 2012; Mesa et al., 2011; Zhao e Liu, 2012)

Os álcoois de baixa massa molar, como etanol e metanol, são preferíveis como solventes nesse processo devido a seus baixos pontos de ebulição, (Xu et al., 2014) além do potencial de recuperação desses solventes o que reduziria os custos de operação (Koo et al., 2012)

Menores razões de etanol/água geralmente favorecem a hidrólise da hemicelulose e a degradabilidade enzimática da biomassa, tendo como base que o etanol é um inibidor da performance das enzimas hidrolíticas.

Três frações são geradas durante o pré-tratamento: uma lignina de alta pureza; um licor hemicelulósico contendo pentoses e hexoses e; uma celulose sólida relativamente pura, de acordo com o tipo de solvente, catalisador e condições de processo empregado.

A hemicelulose é hidrolisada em compostos solúveis como oligossacarídeos, monossacarídeos e ácido acético. Este por sua vez, pode atuar como catalisador na ruptura das ligações do complexo lignina-carboidrato, resultando em alta remoção de lignina, com valores maiores que 70% e mínima solubilização de celulose, em torno de 2%. (Papatheofanous et al., 1995). Tem-se ainda a formação de furfural, devido à desidratação das pentoses (Kumar et al., 2009).

A celulose é parcialmente hidrolisada em pequenos fragmentos que continuam insolúveis no meio (Xu et al., 2014) e a lignina é hidrolisada em pequenos fragmentos de baixa massa molar, devido à quebra das ligações of β-O-4 linkages, que as torna solúveis no meio etanol/água (Meshgini e Sarkanen, 1989) .

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28 E ta n o l d e s eg un d a g er aç ão

As reações envolvidas no processo organossolve com álcoois abrangem a hidrólise das ligações internas da lignina e das lignina-hemicelulose (éter e 4-O- ácido metilglucurônico – ligações éster com carbono α das unidades de lignina); hidrólise das ligações glicosídicas da hemicelulose e; diminuição do grau de polimerização da celulose de acordo com as condições do processo, degradação de monossacarídeos em furfural e HMF seguidos e condensação com fragmentos de lignina (Chum et al., 1985).

Em relação a outros tipos de pré-tratamentos de biomassa vegetal, o organossolve se apresenta promissor devido ao potencial obtenção de frações puras para a conversão de insumos químicos de alto valor agregado no contexto de biorrefinaria, à facilidade de recuperação dos solventes orgânicos utilizados no processo e à fácil recuperação da lignina e dos carboidratos presente na fração líquida. Esse processo se destaca como o mais promissor para a utilização na biorrefinaria lignocelulósica, uma vez considerada a utilização de todos os componentes da biomassa (Zhao et al., 2009).

Entretanto, existem alguns empecilhos como: a necessidade de uma lavagem prévia à lavagem com água do sólido, com solventes orgânicos que evitam a reprecipitação da lignina dissolvida no meio e; o alto custo dos solventes orgânicos, o que leva a necessidade da máxima recuperação e reutilização, resultando no aumento do consumo energético. Há ainda a necessidade de a reação ser desenvolvida em sistemas fechados e controlados, devido à volatilidade dos solventes, por conta do risco de ignição e explosões (Zhao et al., 2009).

4.1.5 Pré-tratamento alcalino

No pré-tratamento alcalino, o material lignocelulósico é misturado com bases como hidróxido de sódio, potássio, cálcio e amônia (Xu e Zhang, 2012; Menon 2012) em condições específicas de temperatura e pressão, com a finalidade de degradar as ligações éster e glicosídicas do material Isso resulta na fragmentação da estrutura da lignina, intumescimento/ inchamento e diminuição da cristalinidade da celulose (Conde-Meja el al., 2012; Zhao e Zhang 2010).

Dentre os agentes alcalinos, o hidróxido de cálcio tem se destacado devido ao seu baixo custo e fácil recuperação por meio de água carbonatada, ao contrário do hidróxido de sódio que, apesar da vasta utilização, apresenta alto custo, riscos operacionais e dificuldades de recuperação (Mosier 2005; Nagwani 1992). Esse pré-tratamento remove preferencialmente a lignina e uma fração da hemicelulose, gerando duas correntes no processo: uma sólida composta principalmente por celulose e uma líquida contendo hemicelulose dissolvida, lignina e alguns compostos inorgânicos que não reagem (Xu et al., 2014, Bensah e Mensah, 2013)

A figura 17 apresenta um exemplo de reator piloto utilizado para reação alcalina de bagaço de cana e a fração sólida obtida após a filtração e lavagem do material. Já a figura 18 mostra a corrente líquida do processo (licor negro), rica em lignina, após ser precipitada através da redução de pH e filtrada.

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29 E ta n o l d e s eg un d a g er aç ão

Figura 17 - Reator de 350L (Pope) utilizado para o pré-tratamento alcalino do bagaço de cana (a); filtro do tipo Nutshe utilizado para a separação sólido-líquido após o processo de pré-tratamento (b);

Bagaço de cana pré-tratado com hidróxido de sódio (c).

Figura 18 – Filtro do tipo prensa utilizado para a filtração do licor negro após a precipitação da lignina através da redução de pH (a);

Lignina sólida proveniente do licor negro (b) .

O tempo de reação e a quantidade de álcali adicionado influenciam diretamente nos rendimentos de solubilização dos componentes, apresentando-se menos severo quando conduzido em temperatura ambiente, mas com a desvantagem de requerer longos tempos de residência.

Em relação ao pré-tratamento com ácido diluído, tem-se algumas vantagens, incluindo as reações à baixa temperatura e pressão, a não necessidade da utilização de reatores especiais e a possibilidade de reciclo da solução alcalina (Rocha et al., 2014a).

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30 E ta n o l d e s eg un d a g er aç ão

sais e incorporado às fibras lignocelulósicas, tornando-se assim um ponto de desafio dessa tecnologia (Zheng e Zhang, 2009; Mosier 2005).

O mecanismo deste pré-tratamento envolve saponificação das ligações éster intermoleculares entre a hemicelulose e a lignina (Zheng e Zhang, 2009), ocasionando a exposição e a consequentemente disponibilização das microfibrilas da celulose à ação enzimática (Hu e Ragauskas, 2012) (Figura 19).

O agente alcalino também promove o inchaço das fibras de celulose e a diminuição do grau de polimerização durante o processo de pré-tratamento, resultando no aumento da área superficial interna que a torna mais acessível ao ataque enzimático.

Figura 19 - Saponificação da ligação éster entre a hemicelulose e a lignina durante processo alcalino

(Fonte: Hu e Ragauskas, 2012).

Após o processo ocorre a ruptura das ligações de hidrogênio da celulose, quebra parcial das ligações β- 1,4-glicosidicas entre as unidades de glicose da celulose [He et al., 2008) e a remoção de substituintes acetis e ácidos urônicos, promovendo aumento da área superficial, porosidade e consequentemente acessibilidade da hemicelulose e celulose às enzimas hidrolíticas (Wan et al., 2011; Keshwani e Cheng, 2010).

Em relação ao pré-tratamento com ácido diluído, tem-se algumas vantagens operacionais incluindo menores temperaturas, pressões operacionais e teor de furfural e HMF no licor (Taherzadeh, 2008).

Um obstáculo a esse processo é a conversão do álcali em sais irrecuperáveis e a incorporação destes nas fibras lignocelulósicas durante o processo reacional (Zheng e Zhang, 2009). Além disso, a precipitação de oxalato de cálcio no trocador de calor e nas linhas de alimentação/recirculação pode ser considerada uma das maiores causas de problemas operacionais em plantas industriais (Galbe e Zacchi, 2002).

Outro ponto a ser considerado nesse processo é a degradação/perda de celulose em reações realizadas sob condições mais severas, denominadas reações de peeling.

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Neste processo o agente alcalino promove a cisão da cadeia polimérica da celulose, com significativo decréscimo do comprimento da cadeia, as unidades de açúcar com extremidades redutoras são removidas e, além da perda de açúcares para o meio solúvel, os carboidratos são convertidos em diversos ácidos orgânicos hidroxilados, os quais resultam na concentração efetiva do alcalino na reação. Portanto, a reação de peeling provoca uma rápida perda de massa molar da celulose e também é responsável pela degradação da hemicelulose em meio alcalino. Existem dois tipos de reações de peeling: o primário que ocorre a temperaturas ao redor de 100°C e o secundário a temperaturas acima de 150°C (Fengel e Wegener, 1989). A Tabela 3 apresenta um comparativo entre diversos tipos de pré-tratamentos.

Tabela 3 – Comparação das vantagens e desvantagens de diferentes processo de pré-tratamento (Fonte: adaptado de Girio et al., 2010).

Características

desejáveis Ácido concentrado Ácido diluído Explosão a vapor Hidrotérmico Organossolv Alcalino

Alta solubilização de hemicelulose ++ ++ ++ ++ + + Alta obtenção de monossacarídeos de hemicelulose ++ ++ 0 - -/0 -/0 Alta obtenção de oligossacarídeos de hemicelulose + + 0 - -/0 -/0 Alta recuperação de celulose ++ ++ ++ ++ - + Aumento da digestibilidade da celulose ++ ++ + + - ++ Lignina de alta qualidade - - 0/+ + + -Reciclo de reagentes químicos - - 0 n.r - -/0/+ Baixa formação de inibidores - - 0 0 + + Baixos problemas de corrosão - - 0 0 - -Baixa demanda de reagentes químicos - - 0 ++ - -/0 Baixo custo de investimento + + - + 0 0/+ Baixo custo de operação - 0 ++ + - -/0 Baixo uso energético 0 - 0 0 0 +

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Capítulo 5

Hidrólise de

materiais lignocelulósicos

5.1 Hidrólise química e hidrólise enzimática

A Hemicelulose e a celulose podem ser hidrolisadas a açúcares fermentescíveis por meio de dois tipos de hidrólise, um que utiliza ácido como catalisador e o outro que utiliza enzima. A hidrólise catalisada por ácido engloba processos com ácido concentrado e diluído. No primeiro, a hemicelulose e a celulose presentes na biomassa são “quebradas” usando soluções aquosas de ácidos minerais fortes, tais como ácido sulfúrico, clorídrico ou fosfórico, em baixas temperaturas (<100°C). Devido as suas características estruturais, a hemicelulose é hidrolisada com maior velocidade que a celulose. Como os monossacarídeos liberados são expostos ao meio reacional por maior tempo, acabam sendo degradados (Szengyel, 2000). No processo com ácido diluído, parte da hemicelulose e da celulose é hidrolisada separadamente, com a possibilidade da remoção seletiva da hemicelulose em uma primeira etapa, porém as altas temperaturas empegadas nesse processo (em torno de 200 °C) resultam na formação de produtos de decomposição dos açúcares e fragmentos de lignina solúvel, componentes tóxicos para o processo de fermentação (Wyman, 2004, Rabelo 2007).

A Figura 20 apresenta o mecanismo para hidrolise ácida da β 1-4- glucana (Ogeda e Petri, 2010):

Figura 20 - Mecanismo de hidrólise catalisada por ácido da β 1-4- glucana

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33 E ta n o l d e s eg un d a g er aç ão

Apesar de fornecer conversões rápidas, a utilização de um ácido como catalisador apresenta desvantagens como a necessidade de um controle do processo a fim de se evitar reações laterais indesejadas e a necessidade de equipamentos resistentes à corrosão, o que acarreta no aumento do custo do processo (Taherzadeh e Karimi, 2008).

A hidrólise enzimática consiste na atuação de biocatalisadores (enzimas) para promover uma fragmentação de uma ligação especifica, por meio da interação entre enzima e substrato.

Uma ampla variedade de enzimas é necessária para efetivar a fragmentação de todos os componentes do material lignocelulósico. A tabela 4 apresenta um resumo dos tipos de enzimas necessárias.

Tabela 4- Algumas das principais enzimas requeridas para a fragmentação da lignocelulose em monômeros. Adaptado de Van Dyk,

2012 Substrato Enzimas

Lignina Lacase, manganês peroxidase, lignina peroxidase Pectina Pectina metil esterase, pectato liase, poligalacturanase,

ramanogalacturana liase

Hemicelulose Endo- xilanase, acetil xilana esterase, β-glucosidase, endo- manase, β- manosidase, a- L-arabinofuranosidase, a- glucorosidase, ácido ferrulico esterase, a- galactosidase, ácido p-cumarico esterase

Celulose Endoglucanase, celobiohidrolase e β- glucosidase

O complexo enzimático das celulases é composto por pelo menos três grandes grupos de celulases (endoglucanase, exoglucanase e β-glucosidases) que atuam sinergicamente, ou seja, uma ação em conjunto no qual os rendimentos da ação simultânea é melhor do que a soma dos rendimentos individuais (Lynd et al., 2002): As exoglucanase atacam as extremidades das cadeias de celulose, redutoras e não redutoras, enquanto as endo glucanase quebram as cadeias ao meio e reduzem o grau de polimerização (Teeri, 1997). A β-glucosidases quebram as cadeias de celobiose liberando unidades de glicose no meio (Figura 21).

A hemicelulose requer um maior número de enzimas para a sua efetiva hidrólise do que a celulose, por apresentar uma composição heterogênea. As hemicelulases podem ser divididas em dois grupos, um responsável pela quebra das extremidades da cadeia e outra pela remoção dos substituintes, os quais podem fornecem impedimento estérico à despolimerização (Van Dyk, 2012). A endoxilanase é a principal enzima do complexo, responsável pela quebra das extremidades da xilana em pequenos oligossacarídeos (Figura 21).

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34 E ta n o l d e s eg un d a g er aç ão

Figura 21 – Mecanismo proposto para ação das celulases sobre a celulose Fonte: (Arantes el al., 2010).

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35 E ta n o l d e s eg un d a g er aç ão

Figura 22 – Mecanismo proposto para ação das hemicelulases sobre a hemicelulose

Fonte: (Sunna e Antranikian, 1997)

A Tabela 5 apresenta um comparativo das vantagens e desvantagens dos processos de hidrólise dos açúcares da biomassa vegetal para posterior sacarificação. Já a Figura 23 mostra um exemplo de ensaio laboratorial de hidrólise enzimática.

Tabela 5 – Comparativo das vantagens e desvantagens dos processos de hidrólise ácida e enzimática da biomassa vegetal.

Método de

Hidrólise Vantagens Desvantagens

Ácido

concentrado Baixas temperaturas alto rendimento

Alto consumo de regentes Corrosão de equipamentos Alto consumo energético para recuperação do ácido Ácido diluído Baixo consumo de ácido

Baixo tempo de residência

Altas temperaturas

Baixa recuperação de açúcares Corrosão de equipamentos Formação de

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36 E ta n o l d e s eg un d a g er aç ão

Enzimas Alto rendimento Baixa formação de sub-produtos Condições brandas (pH 4,8 e temperatura entre 45° e 50°C) Possibilitar a fermentação simultânea à sacarificação Não produz inibidores

Longo tempo Alto custo das enzimas

Figura 23 - Hidrólise enzimática de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado por ácido diluído realizada em escala laboratorial, em

shaker rotativo.

Um dos fatores limitantes da viabilização da comercialização do etanol de segunda geração, utilizando-se enzimas no processo da quebra das cadeias de carboidratos, é seu alto custo, baixa especificidade e lentas taxas de hidrólise (Himmel, 2008; Bansal et al., 2012). As enzimas contribuem, excluindo-se o custo da matéria-prima (biomassa), com 25% do custo do processo de conversão da biomassa vegetal para obtenç sões enzimáticas (Himmel, 2008) e paralelamente aprimorar os processos de pré-tratamento para tornar o material lignocelulósico menos recalcitrante (Bansal et al., 2012).

A Tabela 6 apresenta alguns coquetéis enzimáticos comerciais e suas respectivas atividades enzimáticas.

Tabela 6- Alguns coquetéis enzimáticos disponíveis comercialmente e a faixa de atividade enzimática reportada na literatura. (Adaptado

de Van Dyk, 2012)

Mistura comercial Fornecedor Atividade enzimática reportada na literatura (U/ml) *

Celuclast 1.5L FG Novozyme 65 FPU, 12β-glucosidase, 660 bwx xylanase Novozyme 188 Novozyme

8.5 FPU, 665 β-glucosidase, 123 xylanase (osx), 29.3 α-arabinofuranosidase, 16.6 β-xylosidase, 116 α-galactosidase, 0.6 feruroyl esterase

Spezyme CP Genencor 58.2 FPU/ml, 128 β-glucosidase, 2622 xylanase(osx), 22.6 α-arabinofuranosidase, 7.3 β-xylosidase, 0.39 α-galactosidase Multifect(xylanase) Genencor

0.77 FPU, 35.9 β-glucosidase, 25,203 xylanase (osx), 9.44 α-arabinofuranosidase, 22.6 β-xylosidase, 2.39 α-galactosidase, 1.3 p-coumaroyl esterase Accelerase 1000 Genencor 93 FPU, 7.3 CMCase, 1632

β-glucosidase, 849-xylanase

* Ou alguma outra unidade especificada na tabela

O principal aperfeiçoamento necessário ao processo de hidrólise enzimática é identificar as principais causas das baixas taxas de conversões. fatores esses que

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37 E ta n o l d e s eg un d a g er aç ão

permanecem como desafios (Bansal et al., 2012).

Várias hipóteses tem sido propostas a esse cenário, como teor de lignina, atividade enzimática, temperatura, pH, fonte e concentração enzimática, ligação lignina-carboidrato, interação hidrofóbica lignina-enzima, inativação enzimática, acessibilidade e reatividade do substrato, cristalinidade da celulose, obstáculos superficiais, porosidade, adsorção inespecífica, entre outras (Caminal et al., 1985; Kumar and Wyman, 2009; Paul and Teli, 2011; Chen et al., 2007; Jalak and Väljamäe, 2010; Kurasin and Väljamäe, 2011; Van dyk et al., 2012).

A Tabela 7 apresenta alguns exemplos de conversões enzimáticas. (Adaptado de Rocha et al., 2014b)

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38 E ta n o l d e s eg un d a g er aç ão div ersas biomassas e c ondiç ões e xp erimen tais . Substr at o ligno celulósic o Tip o de hidr ólise e c ondiç ões Dosagem do c atalisador Con versão (%) Ref er ência Bagaç o de cana de açúcar H idr ólise enzimá tica substr at o: bagaç o de cana pr é-tr atado por

ácido seguido de NaOH 1%

25 FPU A cc eller ase 1500 e 50 UI de B eta-Gluc

osidase por g biomassa.

A c on versão de c elulose aumen tou de 22 % (ma ter ial não tr atado ) par a 72,4% Rez ende et al ., 2011 Caule de g irassol H idr ólise enzimá tica Substr at o: caule de g irassol pr é-tr atado por pr é-tr atamen to hidr ot ér mic o a 220°C 23–31 FPU c eluclast , 15 IU β-gluc

osidase por g de biomassa.

90% de c on versão de gluc ose depois de 72 h de c on versão enzimá tica Diaz et al ., 2011 Polpa de bagaç o H idr ólise enzimá tica Substr at o: polpa de bagaç o pr epar ada de pr é-tr atamen to com o xigênio e MgO - solido alcalino 15 IU/g of F usar ium o xy sporum ex tr at o enzimá tic o 82,38% r endimen to em açúcar Xiea et al ., 2013 M adeir a H idr ólise enzimá tica Substr at o: fibr a de c

elulose de polpa de madeir

a 25 FPU Celluclast e 123 CBU No vo zym 188 adicionado c on tinuamen te a cada 2 h. 1°: adição c on tinua do substr at o dur an te a hidr ólise --> aumen to de 50% na conc en tr ação dos pr odut os hidr olisados 2°: adição simultânea e c on tinua de enzima e substr at o r esultando em um hidr olisado muit o c onc en tr ado (170 g/l). Jac quet et al ., 2012

Palha de cana de açúcar

H idr ólise enzimá tica Substr at o: palha de cana pr é-tr atada por e xplosão a v

apor a 180, 190 e 200 °C por 15 min e

pr é-tr atado e deslig nificado c om NaOH. 15 FPU .mL C elluclast , 10 IU g No vo zym 188. Con versão enzimá tica de 58,8% par a o ma ter ial pr é-tr atado e 85,1% par a o ma ter ial pr é-tr atado e deslig nificado . Oliv eir a et al ., 2013

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39 E ta n o l d e s eg un d a g er aç ão

6.1 Formação dos produtos de degradação e ação inibitória no processo fermentativo

Os pré-tratamentos de biomassas lignocelulósicas podem gerar produtos de degradação de açúcares com um efeito altamente inibitório ao processo de fermentação, ocasionando a redução no rendimento e na produtividade do etanol (Harmsen et al., 2010). O nível de toxicidade varia entre microrganismo utilizado, concentração de oxigênio dissolvido e pH do meio. (Harmsen et al., 2010). Tendo que o efeito tóxico desses compostos é potencializado quando encontrados na mesma solução, devido ao efeito sinergético (Mussatto e Roberto, 2004). Além disso, o organismo fermentativo pode ser tolerante a alguns inibidores ou se tornar adaptado gradualmente à presença desses compostos no meio reacional. (Harmsen et al., 2010). Mas a melhor saída é prevenir a formação desses inibidores no pré-tratamento, o que faz dessa etapa um dos grandes gargalos para a industrialização do etanol celulósico. (Harmsen et al., 2010). A Figura 24 apresenta produtos provindos da degradação de açúcares durante o processo de pré-tratamento.

Figura 24 - Principais inibidores do processo fermentativo e suas respectivas estruturas químicas

(Fonte: adaptado de Mussatto e Roberto, 2004).

Capítulo 6

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40 E ta n o l d e s eg un d a g er aç ão

Os fragmentos fenólicos, advindos da lignina apresentam maior toxicidade em relação ao furfural e ao HMF, destacando-se os de baixa massa molar com ação mais potente. Estes podem causar ruptura e perda de integridade das membranas celulares e redução do crescimento celular e da capacidade de assimilar açúcar e outros nutrientes. Além disso, a formação desses compostos pode ser evitada por meio do emprego de processos de pré-tratamento abaixo de 180°C, temperatura no qual se inicia o processo de degradação da lignina (Harmsen et al., 2010).

O ácido acético, proveniente dos grupos acetilas da hemicelulose, não se apresenta dissociado em pH baixo (Pka 4.75). Este é lipossolúvel e transportado por difusão para o interior das células dos organismos fermentativos. Dentro desta (pH 7.4), ocorre a dissociação do ácido, resultando na redução do pH do meio e inibindo a atividade celular (Harmsen et al., 2010).

Como a formação do ácido acético não pode ser evitada, pois é inerente ao processo de hidrólise da hemicelulose, uma alternativa consiste em neutralizar o meio antes da fermentação ou desenvolver uma fermentação em pHs mais altos. A toxicidade desses compostos varia de acordo com as condições fermentativas (Harmsen et al., 2010).

A Tabela 7 apresenta alguns inibidores do processo fermentativo e a faixa de concentração favorável à fermentação. É importante salientar que, apesar dos dados apresentados, a toxicidade depende de vários fatores incluindo a concentração do açúcar, o tipo de microrganismo, o número de inibidores e as variáveis do processo fermentativo.

Tabela 7 - Faixas de concentração aceitáveis para os produtos de degradação dos açúcares no processo fermentativo a etanol

(Adaptado de Klinke et al., 2004).

Inibidor Concentração Máxima (g/L)

Ácido acético 3

Furfural <0,25

HMF 0,25

Fragmentos de lignina (acido vanilico, ácido palmítico, caprilico etc..)

< 0,1

6.2 Processo fermentativo

O licor rico em açúcares obtido no processo de hidrólise química ou enzimática da biomassa lignocelulósica é utilizado para subsequente fermentação a etanol. O hidrolisado lignocelulósico apresenta uma vasta variedade de açúcares como glicose, xilose, manose etc, com glicose e xilose representando 90 % desses açúcares (Hahn-Hägerdal et al., 2007).

Para a obtenção do etanol com rendimento e produtividade favorável a comercialização é necessário que se tenha a máxima conversão possível de açúcares em etanol. Portanto, a utilização de um microrganismo capaz de utilizar todos os tipos de açúcares gerados na hidrolise é essencial (Rocha et al., 2014b). A habilidade de converter pentoses em etanol não é uma característica presente

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41 E ta n o l d e s eg un d a g er aç ão

em todos os microrganismos. Exemplo disso é a levedura Saccharomyces cerevisiae que, amplamente utilizada na produção de etanol, é capaz de converter somente hexoses. Uma alternativa é a conversão de xilose em xilulose por meio da ação da enzima xilose isomerase e a fermentação desta em etanol por leveduras tradicionais. Entretanto, essa rota não é viável economicamente. A Tabela 8 apresenta o substrato e os produtos que podem ser obtidos na fermentação por várias espécies.

Tabela 8 – Espécies de leveduras e fungos nativos capazes de fermentar xylose a etanol (Fonte adaptado de Rocha et al., 2014b).

Microrganismo Rota de utilização do açúcar Referência

C. shehatae Produz xilitol Jeffries and Shin, 1999 C. boidinii Produz grandes quantidades de xilitol e oxide metanol Ko et al., 2008

P. stiptis

Fermenta todos os açúcares presente na madeira.

Algumas espécies fermentam xilana

Nigam, 2002

F. oxysporum

Utiliza 20 diferentes fontes de carbono incluindo xylitol, xilose, ácido acético e dióxido de carbono (não converte xilana ou celulose)

Suihko et al., 1983

Mucor species Fermenta pentoses Sharifia et al., 2008

P. tannophilus

Fermenta xylose, glicose e glicerol. Metaboliza xilose anaerobicamente e produz xilitol

Zhao et al., 2008

O etanol do licor lignocelulósico pode ser proveniente de três processos fermentativos: batelada, batelada alimentada e continuo. A escolha da melhor estratégia deve ser baseada na cinética do microrganismo utilizado, no tipo do hidrolisado e em fatores econômicos.

Tabela 9 - Comparativo das distintas tecnologias para fermen-tação de licor lignocelulósico para obtenção do bioetanol. (Rocha et al., 2014).

Tipo de

processo Descritivo Vantagens Desvantagens

SHF Hidrólise enzimática separada da fermentação - hidrólise e a fermentação acontecem em unidades de processo separadas Hidrólise e fermentação conduzidas nas suas condições ótimas

Inibição das enzimas do complexo enzimático pelos seus produtos finais Contaminação devido ao longo tempo de hidrolise

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42 E ta n o l d e s eg un d a g er aç ão SSF Hidrólise enzimática e fermentação simultânea - hidrólise enzimática e fermentação em um único evento. Glicose produzida pelas enzimas é imediatamente consumida pelos microrganismos fermentadores Minimização dos efeitos inibitórios Aumento da produtividade Processo conduzido fora das condições ótimas das enzimas Presença de etanol provoca um acentuado decréscimo na atividade enzimática SSCF Hidrólise enzimática e co-fermentação simultâneas - fermentação de ambos os açúcares (pentoses e hexoses), em uma mesma etapa. Melhores rendimentos de açúcares Necessidade de um único microrganismo com as características necessárias para fermentar ambos os açúcares BPC Bioprocesso consolidado - esta concepção de processo une em uma mesma etapa a produção de celulases, a hidrólise enzimática de celulose e a fermentação de pentoses e hexoses por um mesmo microrganismo.

Redução nos custos Estratégia convencional de produção de celulases em uma etapa, com o uso das enzimas resultantes para a hidrólise da celulose em uma segunda etapa.

Esse tipo de processo ainda não pode ser desenvolvido à nível industrial com os microrganismos disponíveis atualmente, necessidade de aperfeiçoamento da engenharia genética

A Tabela 10 sumariza alguns exemplos da produção de etanol a partir de diversos materiais lignocelulósicos (Fonte: Adaptado de Rocha et al., 2014b).

Tabela 10 - Exemplos da produção de etanol a partir de diversos materiais lignocelulósicos (Fonte: adaptado de Rocha et al., 2014b) NA: Não disponível

Material de

partida Tipo de pré-tratamento Configuração do processo Microrganismo

Etanol (g/l) ou rendimento etanol (g/g ou %) Referências Mistura de glicose e xilose NA Batelada alimentada Scheffersomyces (Pichia) stipitis 40,7 g/L Unrean e Nguyen, 2013 Pasta de cassava NA Continuo S. cerevisiae CHFY0321 86,1 g/L, 91% Moon et al., 2012

Palha de trigo Ácido diluído SHF

Linhagem de Escherichia coli FBR5 recombinante 41,1±1.1 g etanol/L Saha et al., 2011 Bagaço de cana Explosão a vapor com amônia (AFEX) SHF Linhagem de S. cerevisiae (424A LNH-ST) recombinante 34-36 g/L etanol 92% rendimento teórico Krishnan et al., 2010

(42)

43 E ta n o l d e s eg un d a g er aç ão Palha de

arroz Ácido diluído SHF Pichia stipitis 0,44 ± 0,02 g/L

Lin et al., 2012 Miscanthus

giganteus Hidrotérmico SSF S. cerevisiae 98,27%

Li et al., 2013 Palha de cana

de açúcar

Moagem

com bolas SHF S. cerevisiae 91,8%

Silva et al., 2010 Palha de milho AFEX Contínuo SSCF Linhagem de S. cerevisiae (424A LNH-ST) recombinante 80% conversão glicose-etanol 47% conversão xilose-etanol Jin et al., 2013

6.3 Etanol celulósico brasileiro

A produção de etanol lignocelulósico tem sido realizada em escala laboratorial e em testes pilotos por meio de diversas tecnologias.

Para a efetiva industrialização do etanol celulósico inúmeros fatores devem ser levados em consideração, como a utilização de processos integrados de hidrólise e fermentação e de etanol lignocelulósico com o processo de primeira geração e cogeração, promovendo assim a possibilidade de melhores rendimentos de produção de etanol e auto-suficiência energética (Albarelli, 2013).

A figura 25 apresenta um fluxograma esquemático da integração do processo de etanol de primeira e segunda geração.

Figura 25 - Fluxograma esquemático da integração do processo de etanol de primeira e segunda geração, com o objetivo de obtenção

(43)

44 E ta n o l d e s eg un d a g er aç ão

A produtividade média de cana-de-açúcar no Brasil é de 85 toneladas por hectare, sendo que para cada tonelada de cana processada são gerados cerca de 140 kg de palha e 140 kg de bagaço em base seca, ou seja, 12 toneladas de palha e 12 toneladas de bagaço (Chandel et al., 2014).

Considerando que toda glicose vai ser convertida em etanol, o aproveitamento integral da cana-de-açúcar (colmo, palha e bagaço) poderá aumentar significativamente a produção de etanol por hectare, passando dos atuais 7.000 L para aproximadamente 14.000 L, sem necessidade de expansão da área cultivada (Santos et al., 2012).

A figura 26 apresenta os rendimentos teóricos de etanol celulósico e hemicelulósico a partir do aproveitamento da palha e do bagaço de cana-de– açúcar, considerando-se 0,51 g etanol/g glicose (Santos, 2012), 0,46 g etanol/g xilose (Aquino, 2013), 26,6 % de xilose na hemicelulose da palha (Moutta, 2009), 20,4 % de xilose na hemicelulose do bagaço de cana (Nascimento, 2011) e a densidade do etanol como 0,79kg.L-1.

Figura 26 – Rendimento teórico da produção de etanol celulósico e hemicelulósico a partir da palha e do bagaço da cana de açúcar. Por meio desses valores se percebe que os rendimentos em etanol, mesmo que estimados pelas conversões teóricas, serão significativamente maiores com a introdução da palha da cana-de-açúcar.

Referências

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