Analise do padrão de expressão dos genes da familia MADS-box durante o desenvolvimento do fruto de Citrus sinensis

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

PEDRO ARAÚJO

ANÁLISE DO PADRÃO DE EXPRESSÃO DOS

GENES DA FAMÍLIA MADS-box DURANTE O

DESENVOLVIMENTO DO FRUTO DE

Citrus sinensis

Tese apresentada ao Instituto de Biologia para a obtenção do Título de Mestre em Biologia Vegetal.

Orientador: Prof. Dr. Marcelo Carnier Dornelas

2010

AGRADECIMENTOS

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) e a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo apoio financeiro.

Ao Profo. Dr. Marcelo Carnier Dornelas pela orientação e conselhos durante esses dois anos.

À Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), especialmente ao Programa de Pós Graduação em Biologia Vegetal.

Aos colegas, funcionários e professores do Laboratório de Fisiologia Vegetal. Ao Profo. Dr. Elliot Watanabe Kitajima do NAP/MEPA pela utilização do Microscópio Eletrônico de Varredura e à Profa _{Drª. Siu Mui Tsai do CENA/USP pelo}

sequenciamento dos clones.

À banca examinadora, Profa Sandra Maria Carmello-Guerreiro e Profa Adriana Pinheiro Martinelli por aceitarem o convite e por terem contribuído com o trabalho.

Aos colegas do laboratório, principalmente em nossos almoços e cafés, pela amizade e risadas. Agradecimento em especial a Lilian que me ajudou muito durante todo esse tempo.

Aos meus queridos pais Paulo e Adélia, pelo incentivo e dedicação a mim. Ao meu irmão André, pelos momentos de descontração em suas breves visitas aos finais de semana.

A minha noiva Kaliandra, por aguentar meu mau humor e pela paciência durante todo o trabalho.

ÍNDICE

RESUMO ... vi

SUMMARY ... vii

I INTRODUÇÃO ... 1

1.1 Desenvolvimento do fruto de Citrus... 1

1.2 Bases moleculares do desenvolvimento dos frutos... 2

1.3 Homólogos dos genes FUL e SHP em diferentes espécies... 6

II OBJETIVOS... 7

III MATERIAL E MÉTODOS ... 8

3.1 Material ... 8

3.2 Métodos... 9

3.2.1 Caracterização do crescimento dos frutos em Citrus... 9

3.2.2 Análise do desenvolvimento dos frutos por microscopia de luz e varredura... 9

3.2.3 Identificação de homólogos de MADS-box em Citrus... 10

3.2.4 RT-PCR... 11

3.2.5 Síntese das sondas para hibridizações in situ... 12

3.2.6 Hibridizações in situ... 13

IV RESULTADOS ... 15

4.1 Caracterização do crescimento dos frutos em Citrus... 15

4.2 Desenvolvimento dos frutos em Citrus... 16

4.3 Análise de sequências homólogas aos genes MADS-box em Citrus... 23

4.4 Análise da expressão dos genes FUL e SHP por RT-PCR ... 24

4.5 Expressão dos genes FUL e SHP por hibridização in situ... 29

V DISCUSSÃO... 33

VI CONCLUSÕES ... 39

VII LITERATURA CITADA ... 41

VIII APÊNDICE ... 48

RESUMO

Na planta modelo Arabidopsis thaliana o desenvolvimento do fruto foi amplamente estudado e uma série de genes foram relacionados com a ontogênese e o amadurecimento. A identidade dos tecidos dos frutos secos de Arabidopsis é determinada principalmente pelos genes FRUITIFULL (FUL) e SHATTERPROOF (SHP), pertencentes à família multigênica MADS-box. Homólogos a estes genes foram encontrados em frutos carnosos, no entanto a expressão destes homólogos e o papel biológico dos mesmos durante o desenvolvimento dos frutos carnosos são desconhecidos. No banco de dados de genes expressos em Citrus (CitEST), sequências homólogas a FUL e SHP foram encontradas. Uma vez que os frutos de

Citrus são carnosos e não apresentam as mesmas estruturas dos frutos de Arabidopsis, decidiu-se caracterizar detalhadamente o desenvolvimento dos frutos

em Citrus sinensis e Citrus reticulata e estudar as possíveis funções dos homólogos de FUL e SHP durante o desenvolvimento dos frutos em C. sinensis. Técnicas de microscopia óptica e eletrônica de varredura foram utilizadas para caracterização do desenvolvimento dos frutos. Resultados de RT-PCR mostraram a expressão diferencial dos homólogos de Citrus de FUL e SHP em frutos maduros. Os resultados de hibridização in situ mostraram que o homólogo de FUL expressou-se diferencialmente durante o desenvolvimento do fruto, principalmente nas células secretoras das cavidades oleíferas e das vesículas de suco, nos tecidos do epicarpo, mesocarpo e endocarpo. O homólogo de SHP também se expressou no epicarpo, mesocarpo, endocarpo e nas vesículas de suco. Os resultados obtidos poderão auxiliar num melhor entendimento do desenvolvimento do fruto em Citrus.

vii SUMMARY

Fruit development is extensively studied in the model plant Arabidopsis

thaliana and a number of genes is being related to the control of fruit ontogenesis

and ripening. The FRUITFULL (FUL) and SHATTERPROOF (SHP) genes, which belong to the MADS-box multigenic family are, in large part, responsible for determining the identity of the Arabidopsis dry fruit tissues. Homologs to these genes have been described for species harbouring fleshy fruits, but the expression patterns and biological functions for these genes during fruit development are unknown. Sequences showing similarity to FUL and SHP were found at the database of the CitEST Project (expressed sequence tags in Citrus). Since Citrus fruits are fleshy and do not have the same structures of the Arabidopsis fruits, we decided to characterize in detail the development of fruits in Citrus sinensis and Citrus reticulata and to study the possible functions of FUL and SHP homologues during the development of C. sinensis fruits. These sequences were characterized by bioinformatic's tools and phylogenetic analysis. The use of light and scanning electron microscopy (SEM) techniques allowed the morpho-anatomical characterization of Citrus fruit development. The RT-PCR results showed a preferential expression of FUL and SHP in developing fruits. The in situ hybridization results showed that the C. sinensis homolog of the FUL gene is differentially expressed in the secretory cells of the oil cavity as well as in the juice vesicles, epicarp, mesocarp and endocarp tissues. The homolog of the SHP gene also expressed in epicarp, mesocarp, endocarp and juice vesicles. All the results taken together might contribute to a better understanding of the processes involved in Citrus fruit development.

I INTRODUÇÃO

1.1 Desenvolvimento do fruto de Citrus

O fruto das plantas do gênero Citrus é uma baga do tipo hesperídio composto por mesocarpo septado e endocarpo com “pêlos glandulares” cheio de sucos. O pericarpo é subdividido em regiões: epicarpo, mesocarpo e endocarpo. O flavedo formado pelo epicarpo mais parte do mesocarpo, onde se localizam as cavidades oleíferas, é a região mais externa do pericarpo formando a “casca”, de cor verde quando o fruto está imaturo e de coloração laranja ou amarela quando o fruto amadurece. O albedo é a região situada logo abaixo do flavedo e é composto pelo mesocarpo que forma um tecido branco e esponjoso. O endocarpo, que delimita a região dos lóculos, é a região mais interna do pericarpo formado, principalmente por vesículas repletas de suco e radialmente por algumas membranas delgadas denominadas septos (Agustí et al., 1995).

Segundo Bain (1958) a dinâmica do desenvolvimento do fruto em Citrus segue a tradicional curva sigmóide, desde a polinização da flor, até a maturação, caracterizada por três períodos bem diferenciados. A fase I corresponde ao período de crescimento exponencial, iniciado na antese, sendo caracterizada por um rápido crescimento do fruto. O aumento do tamanho do fruto é dado principalmente por divisões e alongamento celulares que ocorrem no mesocarpo.

Na fase II, que corresponde ao crescimento linear, se estende por vários meses, até o início de sua mudança de cor há um intenso alongamento celular e aumento dos espaços intercelulares na região mais interna do mesocarpo esponjoso. O aumento em tamanho nesta fase se deve principalmente ao desenvolvimento das vesículas de suco que alcançam seu tamanho máximo e o

conteúdo de suco em suas células se eleva. A fase III, ou período de maturação, é caracterizada por uma reduzida taxa de crescimento e pelas mudanças que ocorrem no fruto devido a sua maturação como a conversão de cloroplastos em cromoplastos, acúmulo de carotenóides e mudança na coloração do fruto (Huff, 1984; revisão de Iglesias et al., 2007).

1.2 Bases moleculares do desenvolvimento dos frutos

O fruto seco da planta-modelo Arabidopsis thaliana, denominado síliqua, é a base para os estudos relacionados ao desenvolvimento molecular dos frutos. O primeiro gene a ter sua função relacionada à formação das estruturas do fruto foi o gene

AGAMOUS (AG; Bowman et al., 1989). O gene AG codifica um fator de transcrição

da família MADS-box e exerce a função “C” do Modelo ABC proposto por Coen & Meyerowitz (1991) para explicar a determinação das estruturas florais. Segundo os criadores do Modelo ABC, a função “C” especifica a identidade do quarto verticilo e influencia a diferenciação dos carpelos. Todos os genes do modelo ABC (menos o gene APETALA2) pertencem à família MADS-box. Os genes desta família multigênica são conservados evolutivamente em eucariotos (Purugganan et al., 1995). A subfamília MIKC constitui uma classe de proteínas caracterizadas de acordo com domínios estruturais presentes: MADS (M), “intervening” (I), “keratin-like” (K) e C-terminal (C) (Theiβen et al., 1996). As proteínas codificadas pelos genes da subfamília MIKC, com domínios específicos, garantem as especificidades de interações entre as proteínas MADS para a formação de homo- e heterodímeros e, portanto, a especificidade das interações destes elementos de transcrição com determinadas sequências de DNA da região regulatória de vários genes envolvidos

com o desenvolvimento (veja a revisão de Kaufmann et al., 2005), tem sido amplamente estudados em plantas (Parenicova et al., 2003)

Apesar de não possuírem carpelos, gimnospermas pertencentes à Pinaceae (Tandre et al., 1995), Gnetales (Becker et al., 2000), Ginkgoales (Jager et al., 2003), e Cycadales (Zhang et al., 2004) apresentam ortólogos de genes da função “C”. Nestas plantas, o padrão de expressão de genes da função “C” também foi relacionado ao desenvolvimento das estruturas reprodutivas femininas, como os estróbilos femininos e as brácteas ovulíferas (Tandre et al., 1998; Winter et al., 2002; Zhang et al., 2004). Esta observação indica uma clara conservação evolutiva dos mecanismos moleculares responsáveis pela formação das estruturas reprodutivas e o recrutamento de genes conservados para a formação de “novidades evolutivas” como os carpelos (Becker & Theiβen, 2003; Kramer et al., 2004; Seymour et al., 2008).

A família MADS-box é, portanto, extremamente diversificada em termos de função, apesar de seus membros estarem, geralmente, envolvidos com o controle do desenvolvimento. Aparentemente, a taxa de divergência dos genes do domínio MADS em plantas é superior à observada para homólogos da mesma família em outros organismos (Theiβen & Saedler, 1996; Becker & Theiβen, 2003). Há evidências de que alguns dos membros da família MADS-box são oriundos de extensivos processos de duplicação gênica seguidos de neo- ou subfuncionalização (Kramer et al., 2004). A priori, os genes recém-duplicados tendem a ter funções redundantes, mas, posteriormente, com o acúmulo de mutações nas regiões regulatórias (promovendo a modificação dos padrões de expressão) ou codificadoras (causando mudanças na capacidade de dimerização ou na especificidade de interações com o DNA), há especialização em novas funções

(Theiβen & Saedler, 1996; Becker & Theiβen, 2003). As duplicações e neofuncionalizações, dentro do clado que inclui o gene AG, causaram a separação das linhagens AG e PLENA (Kramer et al., 2004). O mesmo foi observado no clado

AP1/SQUA com manutenção ou não de domínios conservados, neo- e

subfuncionalização, e “splicing” alternativo (Shan et al., 2007). Desta forma, estes processos de duplicação e divergência funcional provavelmente estão na origem dos genes SHATTERPROOF (SHP) e FRUITFULL (FUL). Estes genes pertencem aos clados em que se encontram os homólgos das classes “A” e “C” da subfamília MIKC em Arabidopsis, mas os mesmos não possuem um papel crucial no desenvolvimento floral. No entanto, papéis fundamentais foram atribuídos aos mesmos no que diz respeito ao controle do desenvolvimento dos frutos.

O gene FRUITFULL é descrito na literatura como responsável pelo controle de divisões celulares e da expansão celular no desenvolvimento do carpelo, além de controlar uma rede de genes que caracterizam os tipos celulares da região da valva e replum durante o desenvolvimento do fruto de Arabidopsis (Mandel & Yanofsky, 1995; Gu et al., 1998 e Ferrándiz et al., 1999). Mutantes ful apresentam frutos menores, onde a síliqua comprime as sementes causando o rompimento das valvas e deiscência das sementes precocemente (Gu et al., 1998; Ferrándiz et al., 1999; Dinneny & Yanofsky, 2004).

O trabalho de Mandel & Yanofsky (1995) demonstrou a presença de transcritos do gene FUL no caule, folhas e flores, mas não em raiz. Posteriormente Gu et al. (1998) por meio de ensaios com GUS demonstrou expressão nas inflorescências e nas valvas (nos carpelos em Arabidopsis) e também nos tecidos vasculares do caule e folhas. Novamente não foi detectada a expressão nas raízes. Nos carpelos o gene FUL é expresso preferencialmente na parte basal das valvas,

mas não no replum. Um modelo de como os genes interagem no desenvolvimento do fruto foi proposto por Dinneny & Yanofsky (2004). O gene FUL inibe a expressão dos genes SHATTERPROOF 1 e 2, (SHP1 e SHP2), INDEHISCENT (IND) e ALCATRAZ (ALC) que delimitam a zona de lignificação e separação entre a valva e o replum (Dinneny & Yanofsky, 2004; Ferrándiz et al., 2000b).

Em Arabidopsis, os genes SHP são amplamente expressos em todos os tecidos da região mediana do gineceu incluindo replum, margens das valvas, septo e óvulos. Posteriormente a expressão de SHP1 e 2 é excluída do replum no gineceu maduro. Os genes SHP são necessários para a determinação dos carpelos e óvulos, para a expansão do carpelo e para a deiscência do fruto maduro (Lijegren et

al., 2000; Dinneny & Yanofsky, 2004).

Os genes SHP1 e SHP2 regulam diretamente IND e ALC, sendo responsáveis pela lignificação e zona de separação na síliqua em Arabidopsis (Lijegren et al., 2004). Mutantes triplos shp1/shp2/ful apresentam frutos pequenos (Robles & Pelaz, 2005).

Mutações em somente um dos genes SHPs não resultam em um fenótipo mutante característico. Contudo, o duplo mutante shp1shp2 produz frutos indeiscentes, pois a separação e lignificação das margens não ocorrem e a diferenciação celular das margens das valvas fica comprometida. As valvas de frutos que superexpressam SHP apresentam falhas na região epidérmica, promovendo a abertura dos frutos antes da maturação (Liljegran et al., 2000; Robles & Pelaz, 2005).

Recentemente outros genes que controlam positivamente a expressão de

FUL e do grupo formado por SHP1, SHP2, IND e ALC foram descritos. Dinneny et al. (2005) propôs a regulação desses genes por FILAMENTOUS FLOWER (FIL),

YABBY3 (YAB3) e JAGGED (JAG) compondo uma rede hierarquizada de

regulação.

1.3 Homólogos dos genes FUL e SHP em diferentes espécies

Com o avanço do sequenciamento em diversas espécies de plantas, tanto de interesse comercial como acadêmico, diversos homólogos dos genes FUL e SHP foram identificados tanto em espécies que produzem frutos secos como em espécies de frutos carnosos.

Em pêssego (Prunus persica) foram identificados genes homólogos a FUL e

SHP (respectivamente PPERFUL e PPERSHP) em duas variedades, sendo uma

delas propensa (e a outra não) à formação de uma zona de separação entre a polpa do fruto e o caroço, denominada de “split-pit” provocada, principalmente, pela lignificação diferenciada dos tecidos do mesocarpo em Prunus. Os autores sugerem que modificações no padrão de expressão de PPERFUL e PPERSHP seriam responsáveis por essas características tornando uma variedade suscetível a retirada do caroço facilmente (Tani et al., 2007). Em tomate, Solanum lycopersicon, os genes TAG1 e TDR4 são homólogos aos genes AG/SHP e FUL respectivamente. TDR4 apresenta pouca expressão no inicio do desenvolvimento e uma maior expressão nos estágios tardios de maturação do fruto (Seymour et al., 2002). Mutantes tag1 tem o terceiro verticilo convertido em estruturas petalóides e sua expressão é necessária para maturação do fruto (Pnueli et al., 1994).

Seymour et al. (2008) propõem que genes homólogos a FUL e SHP encontrados tanto em frutos secos quanto em frutos carnosos representam um sistema de controle genético da determinação dos tecidos, conservado durante a evolução das plantas.

II OBJETIVOS

Caracterizar o desenvolvimento dos frutos de Citrus sinensis (variedade Valência) e Citrus reticulata (variedade Ponkan), bem como o papel de homólogos aos genes FRUITFULL e SHATTERPROOF, pertencentes à família MADS-box, durante o desenvolvimento dos frutos. Para tal, as seguintes metodologias foram adotadas:

- Estudo morfo-anatômico do desenvolvimento dos frutos em Citrus sinensis e em Citrus reticulata utilizando técnicas de microscopia óptica e eletrônica de varredura.

- Determinação do padrão de expressão gênica dos homólogos de

FRUITFULL e SHATTERPROOF durante o desenvolvimento dos frutos em Citrus sinensis por RT-PCR e hibridização in situ.

III MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Material

Tecidos de raízes, folhas e caule de Citrus sinensis (variedade Valência – Laranja doce) foram coletados de plântulas germinadas em vermiculita e posteriormente transferidas para cultivo hidropônico. Estes tecidos foram imediatamente mergulhados em nitrogênio líquido e armazenados a -80oC para posterior extração de RNA total. Flores (em antese) e frutos de C. sinensis e C.

reticulata (variedade Ponkan) em diversos estágios de desenvolvimento foram

coletados no campo experimental do Centro de Citricultura Sylvio Moreira (IAC), em Cordeirópolis, SP. Este material foi utilizado para as análises morfo-anatômicas, para o preparo de lâminas para hibridização in situ e para extração de RNA total para os experimentos de RT-PCR. As amostras destinadas à extração de RNA foram imediatamente mergulhadas em nitrogênio líquido e armazenadas a -80oC até o uso. Para o estabelecimento de fases precisas do desenvolvimento dos frutos, flores na antese foram marcadas com fitas indicando a data da antese até sua coleta para análise. Amostras dos frutos foram coletadas para Citrus sinensis 0, 7, 14, 21, 42, 56, 71, 87, 122, 157, 185, 239 e 272 dias após a antese e para Citrus

reticulata 0, 7, 14, 35, 49, 64, 80, 115, 150, 178, 232 e 265 dias após a antese,

sendo o dia 0 (zero) correspondente à flor em antese (aberta).

Como fonte para as buscas de homólogos dos genes MADS-box em Citrus, utilizou-se o banco de dados de sequências de ESTs do Projeto CitEST (Targon et

al., 2007). Clones bacterianos contendo plasmídeos com as sequências

selecionadas (veja abaixo) foram solicitados ao Banco de Clones do Projeto CitEST.

Os plasmídeos correspondentes foram utilizados para a síntese de sondas para as hibridizações in situ.

3.2 Métodos

3.2.1 Caracterização do crescimento dos frutos em Citrus

As coletas no Centro de Citricultura Sylvio Moreira (IAC) em Cordeirópolis, para acompanhamento do desenvolvimento do fruto, foram iniciadas em Setembro de 2008 na época do florescimento. Uma planta de Citrus sinensis teve suas flores marcadas com fitas vermelhas, todas no mesmo estágio – abertura completa das flores– e, após períodos que variaram de uma semana ou mais tiveram as medidas de diâmetro e circunferência ovário/fruto tomadas para acompanhar o crescimento e desenvolvimento. O mesmo procedimento foi utilizado para Citrus reticulata. Neste caso três plantas foram utilizadas no estudo, devido à não sincronia do florescimento nesta espécie. Foram utilizados 5 frutos como replicatas, coletados em diferentes posições da planta.

3.2.2 Análise do desenvolvimento dos frutos por microscopia de luz e varredura

As amostras coletadas para as observações em microscopia foram fixadas a vácuo, em paraformaldeído 4% (p/v) por 24 horas a 4°C. O material fixado para microtomia foi desidratado em série etílica e emblocado em resina plástica (Historesin, Leica) seguindo-se as instruções do fabricante do kit. Secções de 3-5µm foram obtidas com o uso de micrótomo rotativo e montadas em lâminas de microscopia. Após coloração com azul de toluidina a 0,3% (p/v) em tampão fosfato. As lâminas foram observadas em microscópio Zeiss Axioscop e fotografadas.

O material submetido à microscopia eletrônica de varredura (MEV) foi desidratado em série etílica, seco ao ponto crítico e metalizado com ouro coloidal (camada de 40nm). As observações foram feitas no microscópio de varredura LEO 435 VP do NAP /MEPA- ESALQ/USP. As imagens digitalizadas das observações obtidas foram capturadas utilizando-se o programa LEOUIF.

3.2.3 Identificação de homólogos de MADS-box em Citrus

Foram obtidos 182 reads no banco de dados do CitEST que apresentaram similaridades com membros da família MADS-box. Todos os reads foram alinhados e comparados com o banco de dados do NCBI utilizando a ferramenta BLASTx (Altschul et al., 1997). Utilizando o programa BioEDIT (Hall, 1999) e a ferramenta CAP – “contig assembly program” (Huang, 1991), foram obidos 8 clusters de sequências. As sequências consenso destes clusters foram novamente comparadas com bancos de dados públicos, via BLAST, para a identificação de similaridades. Um interesse especial foi dedicado aos clusters cuja sequencia-consenso apresentou similaridade significativa com os genes FUL e SHP. Clones representativos de cada um dos reads compondo os clusters identificados como possíveis homólogos de SHP ou FUL foram solicitados ao Banco de Clones do Projeto CitEST. Todos os clones foram ressequenciados. Para tal, os clones bacterianos foram cultivados em meio LB (Luria-Bertani), a 37oC por 12 horas e os plasmídeos isolados com kit PureLink™ Quick Plasmid Miniprep (Invitrogen). Os plasmídeos precipitados foram enviados para sequenciamento no Laboratório de Genômica do CENA/USP (Piracicaba, SP, sob coordenação da Profa. Siu Mui Tsai). Nos casos em que as sequências dos consensos não permitiam a identificação da totalidade da região codificadora, um novo sequenciamento foi realizado, mediante

a retirada de 250 à 350 bases da região 5´ do fragmento de cDNA inicialmente clonado, através de digestão com as enzimas EcoR1, Sac I, Nsi I, Nco I e Bgl II. As digestões foram realizadas num volume final de 100μL de reação contendo 85μL de DNA (plasmídeo), 10μL de solução tampão e 5μL de enzima de restrição. Os produtos das digestões foram purificados com o kit PureLink™ Quick Gel Extraction (Invitrogen), posteriormente utilizando Klenow fragment (Fermentas) para inserir nucleotídeos nos sítios de restrição (segundo protocolo do fabricante). As construções reduzidas foram religadas utilizando 5μL de solução tampão (pGEM-T), 1μL de T4 Ligase e 4μL de DNA extraído do gel de agarose durante 12 horas a 40C.

Com o objetivo de realizar uma análise comparativa, sequências de aminoácidos de membros da subfamília MIKC de Arabidopsis e dos homólogos putativos dos MADS-box em Citrus foram submetidas a um alinhamento. Para tal, o domínio MADS e algumas partes dos domínios I e K-Box foram mantidos. O alinhamento foi realizado pelo programa CLUSTAL W (Higgins et al., 1994). As matrizes de distâncias foram utilizadas pelo programa MEGA 4 (Tamura et al., 2007) e o método “maximum parsimony”, com teste de filogenia por “bootstrap” com 1000 replicações (Tamura et al., 2007) foi utilizado para a construção de um dendrograma. Para verificação de conservação de domínios característicos de homólogos de FUL e SHP foi utilizado o programa TCOFFEE::REGULAR (Notredame et al., 2000) e seus dados exportados para BOXSHADE 3.21 e comparados com os domínios descritos na literatura.

3.2.4 RT-PCR

A extração de RNA total foi realizada com TRIZOL (Invitrogen), segundo protocolo do fabricante. Após a extração, foi realizado um tratamento com DNAse

(Ambion) e a síntese da primeira fita de cDNA com iniciador poli-T (SuperScript II, Invitrogen). Os cDNAs foram armazenados a -20oC até utilização nos experimentos de RT-PCR.

Os primers gene-específicos (TABELA 1) foram desenhados no programa Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) seguindo as orientações de Rozen & Skaletky (2000). Os primers foram analisados posteriormente no programa Gene Runner 3.05 para verificar se formavam dímeros, hairpin loops ou internal loops que comprometam a reação de PCR posteriormente. As sequências dos primers do gene controle (de expressão constitutiva em todos os tecidos analisados) foram obtidos de Endo et al. (2006).

TABELA 1: Sequências dos primers sintetizados para os genes FRUITFULL, SHATTERPROOF e EF1- α para a reação de PCR.

Gene Primer Forward Primer Reverse

FRUITFULL 5’ CTTCAAAGTGTAGAGCAGCAGA 3’ 5’ AAGGTGACGAAGCATCCAAG 3’ SHATTERPROOF 5’ TGTGCCGATTCTTCTAACCC 3’ 5’ GCTTTCTGATTGCCGTTCTT 3’

EF1-α (controle) 5’ AAGGCTGAGCGTGAACGTGG 3’ 5’ ACGGCAATGTGGGAGGTGTG 3’

Os parâmetros utilizados para a PCR foram: 3 minutos a 940_{C; 40 ciclos}

(para saturação da reação) e 30 ciclos (análise semi-quantitativa) de: 940C por 1 minuto, 570C por 1 minuto e 720C por 1 minuto. Após os ciclos foi realizada uma extensão final de 5 minutos a 720C. Para a visualização dos resultados, amostras de 20μL da reação de PCR foram migradas por eletroforese em gel de agarose a 1%, a 75V, observadas em luz ultravioleta e documentadas com foto documentador utilizando o Quantity One® (BioRad).

3.2.5 Síntese das sondas para hibridizações in situ

Clones de cDNA oriundos do banco de clones do CitEST foram utilizados como molde para a síntese das sondas. Estes clones foram escolhidos por não

conterem a região conservada do domínio MADS-box, visando minimizar hibridizações cruzadas e ruído de fundo. Desta forma, foram utilizados os clones: CS00-C3-705-020-D07-CT.F como sonda para FRUITFULL e CS00-C3-703-067-E03-CT.F como sonda para SHATTERPROOF. Os plasmídeos contendo os clones em questão foram linearizados com a enzima PstI (a 37oC por 1h). As sondas foram obtidas por transcrição in vitro dos plasmídeos linearizados, com emprego da transcritase SP6, em reação contendo uracila marcada com digoxigenina (DIG-UTP), segundo as instruções do fabricante do kit de marcação (Roche). Para o controle negativo, sondas senso foram sintetizadas como descrito acima, no entanto com o emprego da enzima T7 polimerase.

3.2.6 Hibridizações in situ

As amostras coletadas para as hibridizações in situ foram fixadas a vácuo, em paraformaldeído a 4% (p/v) por 12 horas a 4°C. O material fixado foi desidratado em série etílica até álcool absoluto (100%). Posteriormente as amostras foram transferidas para soluções contendo álcool absoluto e xilol nas proporções 3:1, 1:1 e 1:3 e, por fim, em xilol 100%. Flocos de parafina foram adicionados às amostras, sendo as mesmas mantidas em estufa a 600C. Trocas de parafina foram realizadas diariamente durante 4 dias. Finalmente, os materiais embebidos em parafina foram colocados em formas de papel e deixados na bancada até solidificação completa da parafina.

O material emblocado foi seccionado com 10μm de espessura e fixado em laminas tratadas com uma solução de 3-aminopropyltriethoxysilane (Pierce) a 2% em acetona.

A parafina foi removida dos cortes mediante enxágues com misturas de xilol:álcool (3:1, 1:1, 1:3, álcool absoluto). Posteriormente, os cortes foram submetidos ao tratamento de pré-hibridização com proteinase-K (1μg/ml em 0,05M Tris HCl pH:7,5). A hibridização foi realizada no tampão de hibridização (3 ml de formamida deionizada, 132μL de Tris HCL 1M pH: 7,5 – 8; 720μL de NaCl 5 M; 120μL de EDTA; 144μL de denharts; 1,44 ml de dextran sulfato - solução estoque a 50%) contendo 300-600ng de sonda, a 42oC por 16 horas. Após a hibridização, o excesso de sonda não hibridizada foi removido por 2 lavagens de 20min a 42oC em 4X SSC seguidas de 2 lavagens de 20min a 42oC em 2X SSC (solução estoque 20X - 175,3g.L-1 NaCl, 88,2g.L-1 Citrato de Sódio, pH= 7). A visualização do sinal de hibridização foi obtida através de reação colorimétrica, utilizando-se anticorpos anti-DIG conjugados à fosfatase alcalina (1:1000) em 300μL de tampão DB1 (100 mM Tris pH 7,5; NaCl 150 mM) contendo 1% de agente de bloqueio (Roche). A visualização do sinal foi obtida com uma solução comercial de NBT (Nitro-Blue Tetrazolium Chloride)/BCIP(5-Bromo-4-Chloro-3'-Indolyphosphate p-Toluidine) mais supressor (Levamissole 1mM) como substrato (Pierce). O material hibridizado foi observado em microscópio ZEISS, modelo AXIOSKOPE, para documentação e posterior análise.

IV RESULTADOS

4.1 Caracterização do crescimento dos frutos em Citrus

Os resultados da análise do crescimento dos frutos das espécies estudadas estão resumidos na TABELA 2 e na FIGURA 1. O processo de crescimento pôde ser dividido em três fases: Uma fase inicial de crescimento lento, que durou 21 dias para C. sinensis e 35 dias para C. reticulata (estágio 1). Uma segunda fase de crescimento acelerado que durou cerca de 120 dias para as duas espécies (estágio 2) e, em seguida, uma fase de desaceleração de crescimento (ao redor de 160 dias após a antese) que culminou com o processo de maturação, evidenciado com a modificação da coloração da parte externa dos frutos (estágio 3) com aproximadamente 250 dias após a antese.

TABELA 2: Medidas de diâmetro e circunferência de frutos de Citrus sinensis e Citrus reticulata ao longo do desenvolvimento.

Citrus sinensis Valência Citrus reticulata Ponkan

dias* coleta diâmetro (cm) Circunf. (cm) dias* coleta diâmetro (cm) Circunf. (cm) 0 1 0,15 0,47 0 1 0,15 0,47 7 2 0,3 0,94 7 2 0,3 0,94 14 3 0,45 1,41 14 3 0,35 1,10 21 4 0,75 2,36 35 4 0,85 2,67 42 5 1,5 4,71 49 5 1,8 5,65 56 6 2,5 7,85 64 6 2,5 7,85 71 7 2,8 8,79 80 7 3 9,42 87 8 4 12,56 115 8 4,2 13,19 122 9 4,5 14,13 150 9 5,5 17,27 157 10 5,5 17,27 178 10 5,8 18,22 185 11 5,7 17,89 232 11 7,8 24,50 239 12 6,5 20,41 265 12 7,8 24,50 272 13 6,8 21,35

* Dias após o florescimento

Citrus sinensis

Citrus reticulata

FIGURA 1: Curva de crescimento de frutos de Citrus sinensis e Citrus reticulata.

4.2 Desenvolvimento dos frutos em Citrus

A fim de se evitar repetições descreveremos a anatomia do pericarpo de

Citrus sinensis e Citrus reticulada em conjunto e apenas quando houver diferenças

significativas entre as duas espécies, estas serão relatadas.

Na flor em pré-antese o ovário súpero apresenta epiderme unisseriada, com células alongadas radialmente, com núcleo volumoso. O tecido fundamental é formado por várias camadas de células parenquimáticas nas quais estão dispersas cavidades secretoras de óleo ou oleíferas, em início de formação, localizadas

próximas à epiderme externa e feixes vasculares dispersos na região central do tecido fundamental. A epiderme interna é unisseriada.

Os frutos, para efeito de descrição das alterações anatômicas ocorridas durante o desenvolvimento, foram divididos em três estágios levando-se em conta os dias decorridos após a antese e o tamanho em diâmetro do fruto, segundo o quadro abaixo:

Estágio de

desenvolvimento do fruto Dias após a antese Diâmetro do fruto em cm

I 0 - 60 0,15 – 2,5

II 65 - 90 2,8 – 4,0

III 95 - 280 4,5 – 6,8

Fruto I (Figura 2A – D e 3A - D): apresenta epicarpo unisseriado (Figura 2C e D) com células alongadas no sentido radial com núcleo evidente de posição basal. O mesocarpo é formado por células parenquimáticas, que nesta fase estão em intensa divisão e já pode ser dividido em duas regiões: uma externa, próxima ao epicarpo, onde se encontram inúmeras cavidades oleíferas, já formadas e outras em formação; e uma mais interna onde se encontram cordões procambiais e feixes vasculares já formados (Figura 2C e D). O endocarpo é unisseriado formado por células alongadas radialmente, com núcleo central e volumoso. Nesta fase já se inicia a formação das “vesículas de suco”, que formará o endocarpo vesiculoso (Figura 2B) no lado oposto ao da placenta. As vesículas formadas são derivadas da epiderme interna do ovário e mais camadas subepidérmicas, constituindo-se, então, numa emergência. Próximo à região da placenta são formadas, a partir do endocarpo, outras emergências (Figura 2B) cujas células apicais são secretoras de polissacarídeos evidenciados pela coloração púrpura dada pelo azul de toluidina, aqui denominadas de emergência glandular.

Fruto II (Figura 2E e F; 3E e F): nesta fase as alterações mais significativas são, no mesocarpo, as intensas divisões celulares e o início de formação de espaços intercelulares conspícuos no mesocarpo interno e a o aumento no tamanho, por divisões celulares, das vesículas de suco e da eliminação da secreção das emergências glandulares. Os polissacarídeos liberados inundam todo o lóculo e tem-se o início da lise dessas emergências.

Fruto III (Figura 2G e H; 3G e H): no mesocarpo onde ocorrem as principais alterações tem-se uma região mais externa onde ocorrem as cavidades oleíferas, que já atingiram seu máximo tamanho, sendo maiores em C. reticulata (FIGURA 4 F e G), dispostas por entre células parenquimáticas de arranjo compacto e uma região interna onde estão dispersos os feixes vasculares por entre células parenquimáticas de arranjo bastante frouxo, constituindo o mesocarpo esponjoso. Nesta etapa diferenciamos perfeitamente o flavedo, região mais externa ou “casca” constituída pelo epicarpo e por parte do mesocarpo onde se dispõe as cavidades oleíferas e o albedo, porção mais interna do mesocarpo, o mesocarpo esponjoso. Sendo em C.

reticulata, o mesocarpo é menos espesso quando comparado com C. sinensis

(comparar FIGURA 2G com FIGURA 4G e FIGURA 3G com 5G). Uma linha de separação parece ser formada entre o mesocarpo esponjoso e o endocarpo em C.

reticulata (FIGURA 5 G e H). No endocarpo as vesículas de suco já atingiram seu

maior tamanho, ocupando todo o lóculo, e já estão repletas de suco. As emergências glandulares de polissacarídeos desaparecem nesta fase.

FIGURA 2: Microscopia de luz de fragmentos do fruto de Citrus sinensis seccionado transversalmente mostrando diferentes estágios do desenvolvimento. A-B: Fruto I com 0,15mm de diâmetro, detalhes para vesículas de suco, emergência glandular. C-D: Fruto I com 2,5cm de diâmetro, 56 dias após a antese, D: detalhe do mesocarpo – cavidades oleíferas. E-F: Fruto II com 4cm de diâmetro, 87 dias após a antese. Setas indicando espaços intercelulares, detalhes das vesículas de suco desenvolvidas, presença das emergências glandulares. G-H: Fruto III, maduro, com 6,8cm de diâmetro, cavidades oleíferas bem desenvolvidas, setas indicando mesocarpo esponjoso. EP= epicarpo; MS= mesocarpo; EN= endocarpo; LO= lóculo; CO= cavidade oleífera; EG= emergência glandular; VS= vesícula de suco; SE= septo. Barras= 250µm.

FIGURA 3: Microscopia eletrônica de varredura (fragmentos do fruto) de Citrus sinensis em diferentes estágios do desenvolvimento. A-B: Fruto I, ovário súpero em corte transversal mediano, B: detalhe das vesículas de suco pouco desenvolvidas e emergências glandulares. C-D: Fruto I com 2,5cm de diâmetro, 56 dias após a antese. D: Detalhe do epicarpo e das cavidades oleíferas. E-F: Fruto II com 4cm de diâmetro, 87 dias após a antese, vesículas de suco desenvolvidas, epicarpo e mesocarpo sem distinção morfológica aparente. G-H: Fruto III, maduro, 6,8cm de diâmetro, cavidades oleíferas bem desenvolvidas, espaços intercelulares e mesocarpo esponjoso (seta). EP= epicarpo; MS= mesocarpo; EN= endocarpo; LO= lóculo; CO= cavidade oleífera; EG= emergência glandular; VS= vesícula de suco; SE= septo. Barras= 250µm.

FIGURA 4: Microscopia de luz de fragmentos do fruto de Citrus reticulata seccionado transversalmente mostrando diferentes estágios do desenvolvimento. A-B: Fruto I, ovário súpero da flor na antese com 0,15mm de diâmetro, B: detalhe mostrando as vesículas de suco pouco desenvolvidas. C-D: Fruto I com 2,5cm de diâmetro, 64 dias após a antese, D: detalhe do endocarpo e das vesículas de suco E-F: Fruto II com 4,2cm de diâmetro, 115 dias após a antese, seta indicando os espaços intercelulares, F: detalhe da cavidade oleífera. G-H: Fruto III, maduro, com 10,8cm de diâmetro, cavidades oleíferas bem desenvolvidas, H: mesocarpo esponjoso - as setas indicam espaços intercelulares. EP= epicarpo; MS= mesocarpo; EN= endocarpo; LO= lóculo; CO= cavidade oleífera; VS= vesícula de suco; SE= septo. Barras= 250µm.

FIGURA 5: Microscopia eletrônica de varredura (de fragmentos de frutos) de Citrus reticulata em diferentes estágios do desenvolvimento. A-B: Fruto I, flor na antese, corte transversal mediano, B: detalhe mostrando as vesículas de suco e emergências glandulares no lóculo. C-D: Fruto I, com 2,5cm de diâmetro, 64 dias após a antese, D: epicarpo e as cavidades oleíferas. E-F: Fruto II, com 4,2cm de diâmetro, 115 dias após a antese, epicarpo e mesocarpo com as cavidades oleíferas em desenvolvimento. G-H: Fruto III, maduro, com 7,8cm de diâmetro, mesocarpo esponjoso, linha tracejada indicando possível zona de separação da “casca”. H: detalhe do mesocarpo esponjoso e espaços intercelulares. EP= epicarpo; MS= mesocarpo; EN= endocarpo; LO= lóculo; CO= cavidade oleífera; EG= emergência glandular; VS= vesícula de suco; SE= septo. Barras= 250 µm.

4.3 Análise de sequências homólogas aos genes MADS-box em Citrus No CitEST foram obtidos 182 reads pertencentes à família MADS-box em 6 diferentes espécies de Citrus: Foram observados 115 reads para C. sinenis, formando 28 contigs; C. aurantifolia 3 reads e 2 contigs; C. aurantium 3 reads e 3 contigs; C. reticulata 39 reads e 15 contigs; Lima latifolia 6 reads e 5 contigs e

Poncirus trifoliata 16 reads e 10 contigs. Todos os reads foram inicialmente

comparados com o banco de dados do NCBI (BLASTx; Altschul et al., 1997) e demonstraram similaridade significativa a diferentes homólogos dos genes MADS-box. Após o processo de formação de clusters, 48 clusters foram obtidos (para gênero Citrus) As sequências consenso destes clusters foram consideradas homólogas aos genes da família MADS-box em Citrus. Dos 185 reads obtidos, 25 mostraram similaridade significativa (e-value < 10-5) com sequências de FUL e SHP de Arabidopsis (TABELA 3).

A análise comparativa dos membros da subfamília MIKC de Citrus e de

Arabidopsis resultou em clados contendo membros de ambos os gêneros,

apresentando bootstraps consistentes que asseguram a monofilia dos homólogos. Estes resultados indicam que a divergência entre os clados suportados ocorreu antes da separação entre Rutaceae e Brassicaceae (FIGURA 6). Assim, verificou-se a presença de um clado contendo proteínas de Citrus e de Arabidopsis, relacionadas à AGAMOUS, suportado por um bootstrap de 99. Outro ramo, com bootstrap de 92, conteve as sequências tipo SQUAMOSA de Citrus e Arabidopsis.

A fim de caracterizar as sequências dos homólogos de FUL e SHP obtidas para Citrus, realizou-se um alinhamento utilizando as ferramentas TCOFFEE::REGULAR e BOXSHADE 3.21 com diversas sequências presentes no

banco de dados do NCBI. Os resultados obtidos foram depois caracterizados pela presença de domínios característicos, descritos na literatura, dos genes FUL e SHP (FIGURA 7 e 8). As sequências de Citrus possuem esses domínios característicos de FUL: LMQTLTNSSYQMGGGSGE e LLPAWMLR e de SHP: SSNPGSITEA e QPPLQLV. As sequências de FUL de C. sinensis e C. reticulata apresentaram 100% de similaridade, portanto sendo idênticas, possuindo 244 aminoácidos. Entretanto, quando comparadas com Arabidopsis, que apresenta 243 aminoácidos, há divergências nas sequências de aminoácidos nos domínios ¨I¨ e ¨C¨, característicos da subfamília MIKC. As proteínas SHP de C. sinensis e C. reticulata, são idênticas e compartilham 258 aminoácidos, em contraste com os 247 aminoácidos do homólogo (SHP2) de Arabidopsis. As divergências de sequência foram encontradas na região N-terminal, que antecede o domínios MADS, na região ¨I¨ (intervening) e também no domínio “C” com domínios destacados nas FIGURAS 7 e 8.

4.4 Análise da expressão dos genes FUL e SHP por RT-PCR

Os resultados obtidos no experimento de RT-PCR mostraram fragmentos de 843pb, 357pb e 339pb para os genes EF1-alfa (controle constitutivo), FUL e SHP, respectivamente. Não se observou a amplificação de fragmentos inespecíficos e as reações não apresentaram contaminação (ver o BRANCO). Todos os tecidos analisados apresentaram a produção de bandas de amplificação nas reações de saturação. Entretanto, nas análises observou-se uma expressão preferencialmente maior nos tecidos de fruto para FUL e SHP (FIGURA 9). .

Gene Clone(s) TECIDO >CR05-C3-700-027-A01-UV.F FRUTO >CR05-C3-700-051-F04-CT.F FRUTO >CS00-C3-700-061-C03-CT.F FRUTO >CS00-C3-700-027-B04-CT.F FRUTO >CS00-C3-700-066-F02-CT.F FRUTO >CS00-C3-704-094-A03-CT.F FRUTO >CS00-C3-700-073-G07-CT.F FRUTO >CS00-C3-700-024-C07-CT.F FRUTO >CS00-C3-703-067-E03-CT.F FRUTO >PT11-C1-900-088-B03-CT.F FOLHA >PT11-C2-300-019-F02-CT.F CASCA >PT11-C2-300-039-D01-CT.F CASCA >PT11-C1-900-088-B04-CT.F FOLHA >PT11-C1-900-063-H12-CT.F FOLHA >PT11-C1-900-073-F02-CT.F FOLHA SHATTERP ROOF >LT33-C1-003-056-A03-CT.F FOLHA >CR05-C3-701-105-A04-CT.F FRUTO >CR05-C3-702-070-B03-CT.F FRUTO >CR05-C3-701-087-A08-CT.F FRUTO >CS00-C1-100-096-G09-UV.F FOLHA >CS00-C1-100-001-H09-CT.F FOLHA APETALA 1 >CS00-C3-705-020-D07-CT.F FRUTO >CR05-C3-700-052-D11-CT.F FRUTO >CR05-C3-701-037-F02-CT.F FRUTO FUL >CS00-C3-700-086-D04-CT.F FRUTO

TABELA 3: Clones selecionados do banco de dados do CitEST mostrando similaridade significativa com os genes FUL, AP1 e SHP após comparação com o banco de dados do NCBI. Desta foram utilizados clones para novos sequenciamentos (ANEXOS) e síntese das sondas utilizadas nas hibridizações in situ. Na coluna a direita são dos dados fornecidos pela biblioteca do CitEST: tecidos onde foram encontrados.

FIGURA 6: Análise comparativa dos genes da subfamília MIKC de Arabidopsis thaliana com os homólogos encontrados em Citrus sinensis e Citrus reticulata. Somente os bootstraps superiores a 75 são mostrados. A cor roxa indica o grupo formado pelo clado de AGAMOUS, verde indica o grupo formado por genes tipo SQUAMOSA. Em amarelo, outros homólogos de MADS em Citrus. CS: C.

sinenis; CA: C. aurantifolia; CG: C. aurantium; CR: C. reticulata; LT: Lima latifolia; PT: Poncirus trifoliata

MADS Arabidopsis_thaliana_AGL8 1 MGRGRVQLKRIENKINRQVTFSKRRSGLLKKAHEISVLCDAEVALIVFSSKGKLFEYSTD

Betula_pendula_MADS5 1 MGRGRVQLKRIENKINRQVTFSKRRSGLLKKAHEISVLCDAEVALIVFSTKGKLFEYSTD

Brassica_oleracea_FUL-b 1 MGRGRVQLKRIENKINRQVTFSKRRSGLLKKAHEISVLCDAEVALVIFSSKGKLFEYSTD

Brassica_oleracea_FUL-c 1 MGRGRVQLKRIENKINRQVTFSKRRSGLLKKAHEISVLCDAEVALVVFSSKDKLFEYSTD

Brassica_oleracea_FUL-d 1 MGRGRVQLKRIENKINRQVTFSKRRSGLLKKAHEISVLCDAEVALVVFSSKGKLFEYSTD

Capsicum_annuum_MADS6 1 MGRGRVQLRRIENKINRQVTFSKRRSGLLKKAHEISVLCDAEVGLIVFSSKGKLFEYSTD

Chrysanthemum_x_morifolium_CDM8 1 MGRGRVTLKRIENKINRQVTFSKRRSGLLKKAHEISVLCDADVALIVFSTKGKLCEYSTD

Citrus_reticulata_FUL 1 MGRGRVQLKRIENKINRQVTFSKRRSGLLKKAHEISVLCDAEVALIVFSTKGKLFEYSTD

Citrus_sinensis_FUL 1 MGRGRVQLKRIENKINRQVTFSKRRSGLLKKAHEISVLCDAEVALIVFSTKGKLFEYSTD

Citrus_unshiu_CitMADS5 1 MGRGRVQLKRIENKINRQVTFSKRRSGLLKKAHEISVLCDAEVALIVFSTKGKLFEYSTD

Eucalyptus_globulus_EAP1 1 MGRGRLQLKRIENKINRQITFSKRRAGLLKKAHEISVLCDAEVALIVFSAKGKLFEYSTD

Eucalyptus_globulus_AP2L 1 MGRGRVQLKRIENKINRQVTFSKRRCGLLKKAHEISVLCDADVALIVFSTKGKLFEYATD

Lycopersicon_esculentum_TDR4 1 MGRGRVHLKRIENKINRQVTFSKRRSGLLKKAHEISVLCDAEVGLIVFSTKGKLFEYAND

Malus_domestica_MADS2 1 MGRGRVQLKRIENKINRQVTFSKRRSGLMKKAHEISVLCDAEVALIIFSTKGKLFEYSND

Nicotiana_tabacum_MADS11 1 MGRGRVQLKRIENKINRQVTFSKRRSGLLKKAHEISVLCDAEVGLIVFSTKGKLFEYSTD

Petunia_hybrida_PFG 1 MGRGRVQMKRIENKINRQVTFSKRRSGLLKKAHEISVLCDAEVGLIVFSTKGKLFEYATD

Petunia_hybrida_FBP_26 1 MGRGRVQLKRIENKINRQVTFSKRRSGLLRKAHEISVLCDAEVGLIVFSTKGKLFEYSTD

Pisum_sativum_MADS2 1 MGRGRVQLKRIENKINRQVTFSKRRCGLLKKAHEISVLCDAEVALIVFSNKGKLYEYSSD

Prunus_persica_MADS6 1 MGRGSVQLKRIENKINRQVTFSKRRSGLLKKAQEISVLCDAEVALIVFSTKGKLFEYSTD

S.latifolia_SLM5 1 MGRGRVQLKRIENKINRQVTFSKRRTGLLKKAHEISVLCDADVGLIVFSTKGKLFEYATD

Sinapis_alba_SaMADS 1 MGRGRVQLKRIENKINRQVTFSKRRSGLLKKAHEISVLCDAEVALVIFSSKGKLFEYSTD

Solanum_tuberosum_POTM1-1 1 MGRGRVQLKRIENKINRQVTFSKRRSGLLKKAHEISVLCDAEVGLIVFSTKGKLFEYAND

FUL CAL/AP1 K-BOX Arabidopsis_thaliana_AGL8 61 SCMERILERYDRYLYSDKQLV-GRDVSQSENWVLEHAKLKARVEVLEKNKRNFMGEDLDS

Betula_pendula_MADS5 61 SCMERILERYERYSYADRQLL-ANDLEQNGSWTLEHAKLKARIEVLQRNQKHFVGEDLDS

Brassica_oleracea_FUL-b 61 SCMERILERYDRYLYSDKQLV-GREISQSENWVLEHAKLKARVEVLEKNKRNFMGEDLDS

Brassica_oleracea_FUL-c 61 SSMERILERYDRYLYSDKQLV-GRDISQSENWVLEHAKLKARVEVLEKNKRNFMGEDLDS

Brassica_oleracea_FUL-d 61 SSMERILERYDRYLYSDKQLV-GRDISQSENWVLEHAKLKARVEVLEKNKRNFMGEDLDS

Capsicum_annuum_MADS6 61 SCMERILERYERYSYAERQLN-ATDVETPGSWTLEHAKLKARLEVLQRNQRHYAGEDLDS

Chrysanthemum_x_morifolium_CDM8 61 SSMDRILERYERYSYAEMQLT-STHNESQGSWTLEHAKLKARIELLQKSKRHLMGEELDS

Citrus_reticulata_FUL 61 SCMERILERYERYCYAERQLQ-ANEIEPNGNWTLEYSKLKARMEVLQRNQKHFMGEDLAD Citrus_sinensis_FUL 61 SCMERILERYERYCYAERQLQ-ANEIEPNGNWTLEYSKLKARMEVLQRNQKHFMGEDLAD Citrus_unshiu_CitMADS5 61 SCMERILERYERYCYAERQLQ-ANEIEPNGNWTLEYSKLKARMEVLQRNQKHFMGEDLAD Eucalyptus_globulus_EAP1 61 SCMERILERYERYSYAEHQVL-ASETESIGSWTLEHAKLKARLEVLHRNYRHFMGEDLDS

Eucalyptus_globulus_AP2L 61 CCMERILERYERYSYAESQVL-TNNAETNGNWTLEHAKLKARMEILQKNQKNLMGEELDS

Lycopersicon_esculentum_TDR4 61 SCMERILERYERYSFAEKQLV-PTDHTSPVSWTLEHAKLKARLEVLQRNQKHYVGEDLES

Malus_domestica_MADS2 61 SCMERILERYERYSYTERQLL-ANDNESTGSWTLEHAKLKARVEVLQRNQRHYMGEDLQS

Nicotiana_tabacum_MADS11 61 SCMERILERYERYSYAERQLT-ATDHETPGSWTLEHAKLKARFEVLQRNQRHYAGEDLDS

Petunia_hybrida_PFG 61 SCMERILERYERYSYAERQLV-STDHSSPGSWNLEHAKLKARIEVVQRNQRHYMGEDLDS

Petunia_hybrida_FBP_26 61 SCMERILERYERYSYAERQLSGATDNDTPGSWTLEHAKLKARLEVLQRNQKHYAGEDLDS

Pisum_sativum_MADS2 61 PCMERILERYERYSYAERQHV-PNDQPQNENWIIEHAKLKARLEVIQKNQRNFMGEELDG Prunus_persica_MADS6 61 SCMERILERYERYSYSEKQLL-ANDHESTGSWTLEHAKLKARVEVLQRNCSHFMGEDLQS

S.latifolia_SLM5 61 SCMEKILERYERYSYAERQLT-APDPDSHVSWTLEHAKLKARLEILQKNHRHYMGEDLDT

Sinapis_alba_SaMADS 61 SCMEKILERYDRYLYSDKQLV-GRDISQSENWVLEHAKLKARVEVLEKNKRNFMGEDLDS

Solanum_tuberosum_POTM1-1 61 SCMERLLERYERYSFAERQLV-PTDHTSPGSWTLEHAKLKARLEVLQRNQKHYVGEDLES

Arabidopsis_thaliana_AGL8 120 LSLKELQSLEHQLDAAIKSIRSRKNQAMFESISALQKKDKALQDHNNSLLKKIKEREKKT Betula_pendula_MADS5 120 LSLKELQNLEQQLDSALKHIRSRKNQLMYESISELQRKDKALQEQNNVLAKKVKEKEKEL

Brassica_oleracea_FUL-b 120 LSLKELQSLEHQLHAAIKSIRSRKNQAMFESISALQKKDKALQDHNNALLKKIKEREKNT Brassica_oleracea_FUL-c 120 LSLKELQSLEHQLDAAIKSIRSRKNQAMFESISALQKKDKALQDHNNTLLKKIKEKEKEK Brassica_oleracea_FUL-d 120 LSLKELQSLEHQLDAAIKSIRSRKNQAMFESISALQKKDKALQDHNNTLLKKIKEKEKEK Capsicum_annuum_MADS6 120 LSMKELQNLEQQLDSALKHIRSRKNQLMHESISELQKKDKALQEQNNNLSKQMKEREKQL

Chrysanthemum_x_morifolium_CDM8 120 LTLKELQGLEQQLDTALKHVRLRKNQLMFESISALQKKDKDMQERNNILSKQIKEKEKDA Citrus_reticulata_FUL 120 LSLKELQSVEQQIDSGLKLIRSRKNQLMLQSISELQKKDKLLKEQNNLLAKKVKEKEKLL

Citrus_sinensis_FUL 120 LSLKELQSVEQQIDSGLKLIRSRKNQLMLQSISELQKKDKLLKEQNNLLAKKVKEKEKLL

Citrus_unshiu_CitMADS5 120 LSLKELQSVEQQIDSGLKLIRSRKNQLMLQSISELQKKDKLLKEQNNLLAKKVKEKEKLL

Eucalyptus_globulus_EAP1 120 LSLKDLQNLEQQLESALKHIRSRKNQLMHESISVLQKKDRALQEQNNLLTKKIKEKERAL

Eucalyptus_globulus_AP2L 120 LSLKELQNLEHQLDTALKNIRSRKIQLMCESISELQRKDKALQEQNNMLAKKVKEKEKAL

Lycopersicon_esculentum_TDR4 120 LSMKELQNLEHQLDSALKHIRSRKNQLMHESISVLQKKDRALQEQNNQLSKKVKEREKEV

Malus_domestica_MADS2 120 LSLKELQNLEQQLDSALKHIRSRKNQVMYESISELQKKDKALQEQNNLLAKKVKEKENAV

Nicotiana_tabacum_MADS11 120 LSMKELQNLEHQVDSALKHIRSRKNQLMHESISELQKKDKALQEQNNKLSKQVKEREKEL

Petunia_hybrida_PFG 120 LSMKDLQNLEQQLDSSLKHIRSRKNQLMHESISELQKKDKSLQEQNNLLSKKVKEREKEL

Petunia_hybrida_FBP_26 121 LSMKELQNLEQQLDSALKQIRSRKNQLMHESISELQKKDKALQEQNNKLSKQVKEREKEL

Pisum_sativum_MADS2 120 LSMKELQNLEHQLDSALKQIRSRKNQVVYESISELQKKDKALQEKNNLLTKKIKEKEKAL

Prunus_persica_MADS6 120 LSLKELQNLEQQLDSALKHIRSRKNQVMYESISELQKKDKALQEQNNLLAKKVKEKEKAL

S.latifolia_SLM5 120 LSLKELQNFEHQLDTALKHIRSKKNQLMYESIHELQKKDKALQEHNNTLSKKVKEKEKEK Sinapis_alba_SaMADS 120 LSLKELQSLEHQLHAAIKSIRSRKNQAMFESISALQKKDKVLQDHNNALLKKIKEREKNT Solanum_tuberosum_POTM1-1 120 LNMKELQNLEHQLDSALKHIRSRKNQLMHESISVLQKQDRALQEQNNQLSKKVKEREKEV

FUL Arabidopsis_thaliana_AGL8 180 G---QQEG---QLVQCSNS-SSVLLPQYCVTSSRDG FV--ER---V--Betula_pendula_MADS5 180 ---A-QQAQ-WEQQ----SHTLDS-VPSLLPQPLQSSLNIGGS--QQ---ARG

Brassica_oleracea_FUL-b 180 V---QQGG---QLIQCSNN-ASILQPQYCLTSSRDG FV--GR---V--Brassica_oleracea_FUL-c 180 N----TG-QQEG---QLIQCSNN-SSVLQPQYCVTSSRDG LV--ER---V--Brassica_oleracea_FUL-d 180 N----TG-QQEG---QLIQCSNN-SSVLQPQYCVTSSRDG LV--ER---V--Capsicum_annuum_MADS6 180 ---A-QQHTPWEQQNH---DHLNS-SSFGLPHPFNN-NHLGEV--YPTA---G

Chrysanthemum_x_morifolium_CDM8 180 ---A-HHD-K-EP---QIHAAVPS-LHL---G-ILNNCDA--HQ-A---G

Citrus_reticulata_FUL 180 ---S-QEA-QCREQQQQLNHDWNS-SNVHLMQTLTNS---S--YQMG---G

FIGURA 7: Homólogos de FRUITFULL. Alinhamento utilizando o programa TCOFFEE::REGULAR e BOXSHADE 3.21 com sequências homólogas de FRUITFULL de diferentes espécies.Os domínios estão destacados na barra. As sequências de Citrus sinensis e Citrus reticulata possuem os domínios conservados.

MADS Antirrhinum_majus_PLE_ 1 ---MEFPNQ---D---SESLRKNGRGKIEIKRIENITNRQVTFCKRRNGLLKKAYELSVLCDAEVALVVFS

Arabidopsis_thaliana_SHP_1 1 ---MEEGGS---S-HDAESSKKLGRGKIEIKRIENTTNRQVTFCKRRNGLLKKAYELSVLCDAEVALVIFS

Arabidopsis_thaliana_SHP_2 1 ---MEGGAS---N-EVAESSKKIGRGKIEIKRIENTTNRQVTFCKRRNGLLKKAYELSVLCDAEVALVIFS

Brassica_napus_SHP2 1 ---MEGGAS---D-EVAESSKKIGRGKIEIKRIENTTNRQVTFCKRRNGLLKKAYELSVLCDAEVALVIFS

Citrus_unshiu_CitMADS6 1 MCSSSKLPATMEFPKQ---NPESSSQSKKIGRGKIEIKRIENTTNRQVTFCKRRNGLLKKAYELSVLCDAEVALIVFS

Citrus_sinensis_SHP 1 MCSSSKLPATMEFPKQ---NPESSSQSKKIGRGKIEIKRIENTTNRQVTFCKRRNGLLKKAYELSVLCDAEVALIVFS

Citrus_reticulata_SHP 1 MCSSSKLPATMEFPKQ---NPESSSQSKKIGRGKIEIKRIENTTNRQVTFCKRRNGLLKKAYELSVLCDAEVALIVFS

Poncirus_trifoliata_SHP 1 MCSSSKLPATMEFPKQ---NPESSRQSKKIGRGKIEIKRIENTTNRQVTFCKRRNGLLKKAYELSVLCDAEVALIVFS

Malus_domestica_MADS14 1 ---MEFANQ---APE-SSTQKKLGRGKIEIKRIENTTNRQVTFCKRRNGLLKKAYELSVLCDAEVALIVFS

Petunia_hybrida_FBP6 1 ---MVFPNQ---EFESSSSQRKSGRGKIEIKRIENTTNRQVTFCKRRNGLLKKAYELSVLCDAEVALIVFS

Prunus_persica_SHP 1 ---MEFPNQ---APE-SSSQRKIGRGKIEIKRIENTTNRQVTFCKRRNGLLKKAYELSVLCDAEVALIVFS

Rosa_rugosa_MASAKOD1 1 ---MEFPKQITPADDPE-SSSQKKLGRGKIEIKRIENTTNRQVTFCKRRNGLLKKAYELSVLCDAEVALIVFS

Vitis_vinifera_MADS1 1 ---MGRGKIEIKRIENTTNRQVTFCKRRNGLLKKAYELSVLCDAEVALIVFS

SHP K-BOX Antirrhinum_majus_PLE 63 SRGRLYEYANNSVRATIERYKKASADSSNSVSTSEANTQFYQQEANKLRRQIREIQTSNRQMLGEGVSNMALKDLKSTEA

Arabidopsis_thaliana_SHP_1 65 TRGRLYEYANNSVRGTIERYKKACSDAVNPPSVTEANTQYYQQEASKLRRQIRDIQNSNRHIVGESLGSLNFKELKNLEG

Arabidopsis_thaliana_SHP_2 65 TRGRLYEYANNSVRGTIERYKKACSDAVNPPTITEANTQYYQQEASKLRRQIRDIQNLNRHILGESLGSLNFKELKNLES Brassica_napus_SHP2 65 TRGRLYEYANNSVRGTIERYKKACSDAVNPPSVTEANTQYYQQESSKLRRQIRDIQNLNRHILGESLGSLNLKELKNLEG

Citrus_unshiu_CitMADS6 76 SRGRLYEYANNSVRATIDRYKKACADSSNPGSITEANTQFYQQEATKLRRQIREIQNLNRHILGEALSTLNFKELKNLEA

Citrus_sinensis_SHP 76 SRGRLYEYANNSVRATIDRYKKACADSSNPGSITEANTQFYQQEATKLRRQIREIQNLNRHILGEALSTLNFKELKNLEA

Citrus_reticulata_SHP 76 SRGRLYEYANNSVRAIIDRYKKACADSSNPGSITEANTQFYQQEATKLRRQIREIQNLNRHILGEALSTLNFKELKNLEA

Poncirus_trifoliata_SHP 76 SRGRLYEYANNSVRATIDRYKKACADSSNPGSITEANTQFYQQEATKLRRQIREIQNLNRHILGEALSTLNFKELKNLEA

Malus_domestica_MADS14 65 TRGRLYEYANNSVRATIDRYKKACADSTDGGSVSEANTQFYQQEASKLRRQIREIQNSNRHILGESLSTLKVKELKNLEG

Petúnia_hybrida_FBP6 66 SRGRLYEYANNSVRATIDRYKKHHADSTSTGSVSEANTQYYQQEAAKLRRQIRDIQTYNRQIVGEALSSLSPRGLKNLEG

Prunus_persica_SHP 65 TRGRLYEYANNSVRATIDRYKKACTDSTNGGSVSEANTQFYQQESSKLRRQIREIQNSNRHILGEALSTLNIKELKNLEG

Rosa_rugosa_MASAKOD1 70 TRGRLYEYANNSVRATIERYKKAC-DSSNTGSVTETNVQFYQQEASKLRRQIREIQNSNRHILGEALSTLNVKELKNLEG

Vitis_vinifera_MADS1 50 SRGRLYEYANNSVRTTIERYKKVCSDSSNTGSVSEANAQFYQQEASKLRRQIRDIQNLNRHILGEALSSLNFKELKNLET

Antirrhinum_majus_PLE 143 KVEKAISRIRSKKNELLFAEIEHMQKRELELHNANMFLRAKIAEGERAQQ--QM-NLM-P--GSDYQPM---TSQSYD

Arabidopsis_thaliana_SHP_1 145 RLEKGISRVRSKKNELLVAEIEYMQKREMELQHNNMYLRAKIAEGARLNPDQQESSVIQ--GTTVYESGVSSHDQSQHYN Arabidopsis_thaliana_SHP_2 145 RLEKGISRVRSKKHEMLVAEIEYMQKREIELQNDNMYLRSKITERTGLQ--QQESSVIH--QGTVYESGVTSSHQSGQYN Brassica_napus_SHP2 145 RLEKGIGRVRSKKHEMLVAEIEYMQKREIELQNDNMYLRSKISERAGMQ--QQEASVIHQ-QGTVYESS---SHQSEQYN Citrus_unshiu_CitMADS6 156 RLEKGIGRVRSKKNEMLLAEIEFMEKREIQLQNDNMYLRARISENERAQQERQSESMMQQGGGHVYEPA---ASQPYD

Citrus_sinensis_SHP 156 RLEKGIGRVRSKKNEMLLAEIEFMEKREIQLQNDNMYLRARISENERAQQERQSESMMQQGGGHVYEPA---ASQPYD

Citrus_reticulata_SHP 156 RLEKGIGRVRSKKNEMLLAEIEFMEKREIQLQNDNMYLRARISENERAQQERQSESMMQQGGGHVYEPA---ASQPYD

Poncirus_trifoliata_SHP 156 RLEKGIGRVRSKKNE ---Malus_domestica_MADS14 145 RLEKGISRIRSKKNEILFSEIEFMQKRETELQHHNNFLRAKIAESEREQQQ-QQTHMI-PG--TSYDPS---M-PSNSYD

Petúnia_hybrida_FBP6 146 KLEKAIGRVRSKKNELLFSEIELMQKREIEMQNANMYLRAKIAEVERATQ--QM-NLMHG-GGSEYQQQP-MSSTSQPYD

Prunus_persica_SHP 145 RLEKGISRIRSKKNEMLFAEIEFMQKREMELQNHNNYLRAKIAENERAQQQ-Q-TNMI-QG--TSYDQS---M-PSQSYD

Rosa_rugosa_MASAKOD1 149 RLEKGISRIRSKKNEMLFAEIEYMQKREIELQNHNNFLRAKIAENDRAQQQ-Q-ANMM-PGTLSAYDQS---MPPPQSYD

Vitis_vinifera_MADS1 130 RLEKGISRIRSKKNELLFAEIEYMQKREIELQNSNLFLRAQIAENERAQQ--QM-NLM-P--GSQYESV---PQQPYD

SHP Antirrhinum_majus_PLE 212 VRNFLPMNLMEPNQ--QQYSRH--DQTALQLV

Arabidopsis_thaliana_SHP_1 223 -RNYIPVNLLEPN---QQFSGQ--DQPPLQLV

Arabidopsis_thaliana_SHP_2 221 -RNYIAVNLLEPN---QNSSNQ--DQPPLQLV

Brassica_napus_SHP2 219 -RNYIPVNLLEPN---QNSSDQ--NQPPLQLV Citrus_unshiu_CitMADS6 231 -RNFLPVNLLEPN---HQYARQ-DDQPPLQLV Citrus_sinensis_SHP 231 -RNFLPVNLLEPN---HQYARQ-DDQPPLQLV Citrus_reticulata_SHP 231 -RNFLPVNLLEPN---HQYARQ-DDQPPFQLV Poncirus_trifoliata_SHP 170 --- Malus_domestica_MADS14 217 -RNFFPVILESNN---NHYPR--QGQTALQLV

Petúnia_hybrida_FBP6 221 ARNFLPVNLLEPN---PHYSRQ--DQTALQLV

Prunus_persica_SHP 216 -RNFLPVILEANNNNNNHYSR--HDQTALQLV

Rosa_rugosa_MASAKOD1 223 -RSFLPVILESN----HHYNRQGQNQTPLQLV

Vitis_vinifera_MADS1 199 SQNLLPVNLLDPN---HHYSRH--DQTALQLV

FIGURA 8: Homólogos de SHATTERPROOF. Alinhamento utilizando o programa TCOFFEE::REGULAR e BOXSHADE 3.21 com sequências homólogas de SHATTERPROOF de diferentes espécies. Os domínios estão destacados na barra. As sequências de Citrus sinensis e

Citrus reticulata possuem os domínios conservados.

FIGURA 9: RT-PCR de diferentes tecidos para os genes FRUITFULL e SHATTERPROOF. Os genes são expressos em diferentes tecidos durante o desenvolvimento. Pode-se notar expressão preferencial em frutos. O gene constitutivo EF1-α foi utilizado como controle, segundo descrito em Endo et al., (2006). Branco= reação de PCR sem adição de cDNA. Banda do marcador= 400pb para

FUL e SHP e 850pb para EF1- α.

4.5 Expressão dos genes FUL e SHP por hibridização in situ

Os experimentos de hibridização in situ mostraram a expressão dos genes

FUL e SHP durante o desenvolvimento do fruto de Citrus sinensis. Cortes

histológicos (transversais) das estruturas analisadas: ovário da flor em antese, fruto com 3 cm de diâmetro e fruto maduro com 6,8 cm de diâmetro mostraram sinal positivo quando hibridizados com as sondas antisenso para os respectivos genes. O uso de sondas senso não mostrou sinal de hibridização. Os resultados obtidos para a sonda antisenso do gene FRUITFULL podem ser verificados na FIGURA 10. No ovário da flor em antese o sinal de hibridização é localizado no epicarpo (FIGURAS 10A e B), nas células secretoras – periféricas – das cavidades oleíferas (FIGURAS 10A e B), nas células do endocarpo, sendo concentrado nas células dos primórdios

30

das vesículas de suco (FIGURA 10C) e no tegumento interno da semente (FIGURAS 10A e D). Em frutos de 3cm de diâmetro, os transcritos de FUL foram concentrados nas células secretoras das cavidades oleíferas (FIGURA 10E) e nas células secretoras que compõe a camada mais externa das vesículas de suco (FIGURA 10F e G). Nos frutos maduros (FIGURA 10H) a expressão de FRUITFULL concentra-se nas células do mesocarpo, próximas ao epicarpo (FIGURA 10I), no endocarpo (FIGURA 10J), e nas camadas mais externas das vesículas de suco.

As hibridizações realizadas com a sonda antisense para o homólogo de

SHATTERPROOF em C. sinensis em estágios iniciais do desenvolvimento do fruto

(ovário de flor na antese) mostraram uma concentração de sinal basicamente no epicarpo e no endocarpo (FIGURA 11A), principalmente nos primórdios das vesículas de suco (FIGURA 11B e C). Em frutos de 3cm de diâmetro, o sinal de hibridização tornou-se mais difuso em todos os tecidos do fruto. (FIGURA 11E, F e G). Nos frutos maduros, o padrão de expressão assemelha-se ao observado para o homólogo de FRUITFULL, em todos os tecidos do fruto e nas células secretoras das vesículas de suco, entretanto com menor intensidade (FIGURA 11H, I e J).

FIGURA 10: Hibridização in situ de tecidos de frutos de Citrus sinensis com sonda antisenso para um homólogo do gene FRUITFULL. A-D: Fruto I ovário da flor em antese. O sinal positivo de hibridização (coloração avermelhada) pode ser observado no (B) epicarpo, (C) células secretoras das cavidades oleíferas, (D) endocarpo e tegumento interno das sementes. E-G: Fruto II com 3cm de diâmetro, aproximadamente 70 dias após a antese, sinal nas células secretoras - margeando as cavidades oleíferas - e epicarpo, F-G: nas células secretoras das vesículas de suco. H-J: Fruto III, maduro, com 6,8cm de diâmetro, 270 dias após a antese. Sinal fraco nas regiões mais externas do mesocarpo próximo ao (I) epicarpo e (J) endocarpo e nas vesículas de suco. Barras 250μm.

FIGURA 11: Hibridização in situ de tecidos de fruto de Citrus sinensis com sonda antisenso para um homólogo do gene SHATTERPROOF. A-D: Fruto I ovário da flor em antese. Sinal fraco de hibridização (tons mais avermelhados) generalizado, mais intenso no epicarpo, no mesocarpo próximo ao epicarpo e endocarpo bem como nos primórdios das vesículas de suco. E-G: Fruto II com 3cm de diâmetro, aproximadamente 70 dias após a antese. Um fraco sinal de hibridização é observado de forma generalizada nos tecidos inclusive nas vesículas de suco. H-J: Fruto III, maduro, com 6,8cm de diâmetro, 270 dias após a antese. Um fraco sinal de hibridização é observado de forma generalizada, ausente no interior das cavidades oleíferas, região mediana do mesocarpo e interior das vesículas de suco. Barras 250μm

V DISCUSSÃO

Dentro da família Rutaceae, o gênero Citrus possui frutos tipo baga/hesperídio com mesocarpo branco e esponjoso e endocarpo com segmentos (Agustí, 1995). Os resultados obtidos na análise do crescimento dos frutos de

Citrus sinensis e Citrus reticulata concordam com os dados obtidos por Bain

(1958), Agustí et al. (1995) e Laskowski et al. (2006). O gráfico resultante dos dados de modificação do diâmetro do fruto ao longo de seu desenvolvimento é uma curva sigmóide de crescimento, podendo se diferenciar os três estágios característicos do desenvolvimento dos frutos (divisão/alongamento/ amadurecimento). A observação quanto ao aumento inicial do mesocarpo no primeiro estágio de desenvolvimento, aumento das vesículas de suco no segundo estágio e consequentemente, o preenchimento do lóculo confirmam com as descrições de Bain (1958) e Davies & Albrigo (1994). O fato da “casca” (epicarpo e parte do mesocarpo) de Ponkan ser facilmente destacável no estágio 3 é devido aos processos de diferenciação de um parênquima com espaços intercelulares muito conspícuos, formando quase um aerênquima. Este processo é chamado de

puffing por Reuther (1997).

As descrições das estruturas do epicarpo, mesocarpo e endocarpo das duas espécies em estudo corroboram descrições feitas por Laskowski et al. (2006) dos frutos de Citrus sinensis var. Salustina. As cavidades oleíferas, que estão presentes ainda na região subepidérmica das paredes do ovário, acompanham todo o crescimento do fruto, aumentando em tamanho e em volume de lúmen secretor, são as mesmas das observações de Knight et al. (2001) para frutos de

Citrus sinensis var. L. Osbeck.

Os 182 reads obtidos apresentando similaridade significativa com os genes MADS-box representam apenas 0,07% de todos os reads presentes no CitEST (dos 242.790 reads válidos), tendo C. sinensis maior quantidade de transcritos de MADS porque possui também maior quantidade de reads válidos (Targon et al., 2007). Observamos ainda que Poncirus trifoliata possui um homólogo putativo para SHP. No entanto, uma vez que esta sequência estava incompleta, não demos continuidade à sua análise. Provavelmente as outras espécies de Citrus que possuem sequências depositadas no CitEST também possuem homólogos aos genes FUL e SHP. Entretanto, devido ao pequeno número de sequências depositadas para estas espécies no CitEST não foi possível a obtenção de homólogos destes genes para as mesmas.

As sequências de FUL e SHP de C. sinensis e C. reticulata apresentaram 100% de similaridade entre si, entretanto as diferenças encontradas com as sequências já caracterizadas de Arabidopsis estão nos domínios ¨I¨ (responsável pela especificidade na formação de dímeros) e “C” (responsável pela estabilização da estrutura formada pelos dímeros) (Kaufmann et al., 2005), podendo ser identificado nas FIGURAS 9 e 10, em alinhamento feito com outras sequências depositadas em diversos bancos de dados disponíveis na internet. Essas divergências, relacionadas com especificidade, podem ser de extrema importância para a evolução da função destes genes em frutos carnosos, como os de Citrus, em relação às funções conhecidas para as proteínas FUL e SHP em plantas de frutos secos, como os de Arabidopsis (Gu et al., 1998; Ferrándiz et al., 1999; Liljegren et al., 2000). A grande uniformidade observada nas comparações das sequências de Citrus entre si indica uma provável conservação da função destas proteínas nas diferentes espécies de Citrus.

O dendograma mostrado na FIGURA 8 mostra clados formados por sequências de Citrus e de Arabidopsis com bootstraps consistentes, indicando a divergência dos clados como sendo anterior à divergência das famílias Rutaceae e Brassicaceae (seguindo a trabalho de Parenicova et al., 2003 como referência para as construção das árvores filogenéticas). Estas observações são semelhantes aos relatos da literatura que afirmam que a divergência das diferentes subfamílias dos genes MADS precede a divergência das angiospermas (Purugganan et al., 1995; Becker & Theiβen, 2003). Endo et al. (2006) caracterizou os genes CitMADS5 e CitMADS6 de Citrus unshiu, como sendo os possíveis homólogos de FUL e SHP, respectivamente, daquela espécie, fazendo parte do mesmo clado com bootstraps significativos.

Comparando as sequências de aminoácidos dos homólogos de FUL e SHP obtidas para C. sinensis e C. reticulata com as de C. unshiu (Endo et al., 2006), obtivemos 100% de similaridade, mais uma vez indicando a provável conservação de função destes fatores de transcrição em Citrus.

Os resultados obtidos com os alinhamentos das sequências de aminoácidos dos homólogos de FUL e SHP de C. sinensis e C. reticulata com os respectivos homólogos oriundos de plantas de outras famílias indicam a conservação da sequência de domínios específicos, contendo aminoácidos praticamente invariantes (FIGURA 7 e 8; Ver Apêndices). Estes domínios conservados foram detalhadamente descritos para a família MIKC no trabalho de Parenicova et al. (2003) e utilizados na caracterização dos homólogos encontrados em Citrus, indicando a possibilidade dos mesmos exercerem funções biológicas importantes (Kramer et al., 2004; Shan et al., 2007). No entanto,

mesmo em plantas modelo, a função biológica e a relevância da conservação das sequências destes domínios ainda não foram desvendadas.

As RT-PCR realizadas em Citrus sinensis, com primers específicos, mostraram uma ampla expressão dos genes FUL e SHP em diferentes tecidos. Endo et al. (2006) indicaram que homólogos de FUL em Citrus possuem expressão em raiz, folha, flor, caule, fruto (“casca” e vesículas de suco); e que transcritos de SHP puderam ser detectados em tecidos de semente, raiz, flor e fruto (“casca” e vesículas de suco). No entanto, este padrão de expressão generalizado foi observado apenas quando as reações de PCR foram realizadas em condições de saturação (40 ciclos). Em reações realizadas a 30 ciclos (número de ciclos suficiente para que bandas fossem observadas em todos os tecidos com o emprego de primers para o gene de expressão constitutiva) foram observadas bandas para os homólogos de FUL e SHP preferencialmente em tecidos do fruto.

Os genes FUL e SHP foram inicialmente identificados na planta-modelo A.

thaliana (Gu et al., 1998; Liljegren et al., 2000; Ferrándiz et al., 2000a; Dinneny &

Yanofsky, 2004). Em Arabidopsis a expressão de SHP é limitada aos tecidos reprodutivos e, mais especificamente, aos tecidos que formam o pistilo e, posteriormente, o fruto. O produto do gene SHP está relacionado ao controle da determinação da identidade e da ontogênese dos diferentes tecidos do fruso seco de Arabidopsis (síliqua), bem como das estruturas teciduais necessárias para a deiscência da síliqua (Gu et al., 1998; Liljegren et al., 2000; Ferrándiz et al., 2000a; Dinneny & Yanofsky, 2004). Desta forma, há uma forte correlação entre o padrão de expressão de SHP e sua função durante o desenvolvimento reprodutivo.

Já o gene codificador de FUL, descrito inicialmente como um parceiro molecular de SHP, possui um padrão de expressão mais amplo, sendo também expresso em meristemas (Ferrándiz et al., 2000a; Muller et al., 2001; Preston & Kellogg, 2007). Este padrão de expressão mais amplo é evolutivamente conservado em outras plantas além de Arabidopsis (Muller et al., 2001; Preston & Kellogg, 2007). Suspeita-se que a função de FUL em meristemas reprodutivos, onde o mesmo é responsável pela transição do meristema da inflorescência para o meristema floral, em associação com outros genes do clado AP1 (Ferrándiz et

al., 2000a), seja igualmente conservada (Muller et al., 2001; Preston & Kellogg,

2007). Em Arabidopsis, mutantes ful apresentam, além do fenótipo característico no desenvolvimento do fruto, outras modificações morfológicas, incluindo anomalias na estrutura da inflorescência. Desta forma, pode-se supor que a expressão do homólogo de FUL em outros tecidos de Citrus, mesmo que de maneira reduzida, como indicado nos experimentos de RT-PCR não-saturada, possua outros papéis biológicos além do controle do desenvolvimento dos frutos.

Busi et al. (2003) relatam expressão de TDR4 (um homólogo de FUL em tomate) e TAGL2, TAGL11 e TAGL12 (parálogos de SHP) em tecidos de tomate por RT-PCR. Observaram um padrão de expressão que relaciona uma possível função destes genes ao desenvolvimento dos frutos, apesar de terem igualmente observado menores concentrações dos transcritos destes genes em tecidos vegetativos.

Os resultados das hibridizações in situ em Citrus sinensis corroboram o padrão de expressão observado nos experimentos de RT-PCR uma vez que foram detectados transcritos nos tecidos de fruto em diferentes fases do desenvolvimento. Estes resultados concordam ainda com os observados por Endo