Introdução à Bioquímica

(1)

Dra

Dra. . FernandaFernanda CanduriCanduri Laboratório

Laboratório de de SistemasSistemas BioMolecularesBioMoleculares.. Departamento

Departamento de de FísicaFísica. UNESP. UNESP São

São José do Rio José do Rio PretoPreto. SP.. SP.

Introdução

à

_à

Bioquímica

_Bioquímica

Enzimas

(2)

Enzimas

!

Catálise

!

Cinética

enzimática

!

Inibição

enzimática

!

Regulação

“Toda enzima é uma proteína, mas nem toda proteína é uma enzima”

Laboratório

Laboratóriode de SistemasSistemasBioMolecularesBioMoleculares. . DepartamentoDepartamentode de FísicaFísica. . CâmpusCâmpusRio Rio PretoPreto.. www.

(3)

Informações

gerais

1.

1. As As enzimasenzimas tem um tem um enormeenorme poderpoder catalíticocatalítico

2.

2. SãoSão altamentealtamente específicasespecíficas

3.

3. A A formaçãoformação de um de um complexocomplexo enzimaenzima--substratosubstrato é o é o

primeiro

primeiro passopasso nana catálise enzimáticacatálise enzimática

4.

4. As As enzimasenzimas aceleramaceleram reaçõesreações, , estabilizandoestabilizando estadosestados

de

de transiçãotransição

5.

5. A A atividadeatividade catalíticacatalítica de de muitasmuitas enzimasenzimas sãosão

reguladas

(4)

Características

gerais

_gerais

!

! As As enzimasenzimas sãosão catalisadorescatalisadores de de reaçõesreações biológicasbiológicas

!

! DiferemDiferem dos dos catalisadorescatalisadores químicosquímicos emem váriosvários aspectosaspectos::

1.

1. VelocidadeVelocidade de de reaçãoreação maismais rápidasrápidas –– de 10de 1066 a 10a 101212 vezesvezes

maiores

2.

2. CondiçõesCondições reacionaisreacionais maismais brandasbrandas –– temperaturastemperaturas

inferiores

inferiores a 100a 100oo_C,_C,_pressão_pressão _atmosférica_atmosférica _{e pH}_{e pH}_quase_quase _neutro_neutro

3.

3. MaiorMaior especifidadeespecifidade dada reaçãoreação –– imensamenteimensamente maiormaior do do queque

catalisadores

catalisadores químicosquímicos emem relaçãorelação à à identidadeidentidade dos dos seusseus substratos

substratos ((reagentesreagentes) e dos ) e dos seusseus produtosprodutos 4.

4. CapacidadeCapacidade de de regulaçãoregulação –– a a atividadeatividade catalíticacatalítica podepode variarvariar

em

em respostaresposta àsàs concentraçõesconcentrações de de outrasoutras substânciassubstâncias

Laboratório

(5)

Nomenclatura

!

! As As enzimasenzimas sãosão comumentecomumente denominadasdenominadas

adicionando

adicionando--se o se o sufixosufixo ––asease aoao nomenome do do substrato

substrato, , ouou a a umauma expressãoexpressão queque descrevadescreva suasua ação

ação catalíticacatalítica

Ex.:

urease

"

catalisacatalisa a a hidrhidróóliselise dada ururééiaia

á

lcool

desidrogenase

"

catalisacatalisa a a oxida

(6)

Classificação

!

! As As enzimasenzimas foramforam classificadasclassificadas de de acordoacordo com a com a

natureza

natureza dada reaçãoreação químicaquímica queque catalisamcatalisam

1. Oxido-redutases (reações de oxidação-redução ou transferência de elétrons)

2. Transferases (transferem grupos funcionais como amina, fosfato, acil, carboxil)

3. Hidrolases (reações de hidrólise de ligação covalente)

4. Liases (catalisam a quebra de ligações covalentes e a remoção de moléculas de água, amônia e gás carbônico)

5. Isomerases (reações de interconversão entre isômeros óticos ou geométricos)

6. Ligases (catalisam reações de formação de novas moléculas a partir da ligação entre duas pré-existentes, sempre às custas de energia)

(7)

!

! A A União InternacinalUnião Internacinal de de BioquímicaBioquímica e e BiologiaBiologia Molecular Molecular

(IUBMB)

(IUBMB) adotouadotou um um esquemaesquema de de classificação funcional classificação funcional sistemática

sistemática e de e de nomenclaturanomenclatura

!

! Para Para cada enzima são atribuídos dois nomescada enzima são atribuídos dois nomes –– nome nome

alternativo

alternativo e e nome sistemáticonome sistemático –– e um e um númeronúmero de de classificação

classificação de de quatro subdivisõesquatro subdivisões

Exemplo

Exemplo::

Carboxipeptidase

Carboxipeptidase A (A (nomenome recomendadorecomendado)) Peptidil

Peptidil--LL--aminoácidoaminoácido--hidrolasehidrolase ((nomenome sistemáticosistemático)) EC 3.4.17.1

(8)

Especificidade

dos

_dos

substratos

_substratos

!

Complementaridade

geométrica

!

Complementaridade

eletrônica

!

Mudanças

conformacionais (

ajuste

induzido

)

Modelo

chave

-

fechadura

da

função

enzimática

Laboratório

(9)

Complementaridade geométrica e eletrônica

(10)

Presença

de

cofatores

e

coenzimas

!

! CofatoresCofatores:: CuCu2+2+, Fe, Fe2+2+, Zn, Zn2+2+

Cd

Cd2+2+ _{e Hg}_{e Hg}2+ 2+ _-_- _efeito_efeito _tóxico_tóxico

Um

Um exemploexemplo enzimaenzima--cofatorcofator cataliticamentecataliticamente ativoativo é é chamado

chamado de de holoenzimaholoenzima.. A

A proteínaproteína enzimaticamenteenzimaticamente inativainativa resultanteresultante dada remoçãoremoção do

do cofatorcofator dada holoenzimaholoenzima é é chamadachamada de de apoenzimaapoenzima apoenzima

apoenzima + + cofator cofator _↔_↔ holoenzimaholoenzima ((ativaativa))

Laboratório

(11)

!

! CoenzimasCoenzimas: : NADNAD++ ((nicotinamidanicotinamida adeninaadenina

dinucleotídeo

dinucleotídeo) ) –– associamassociam--se se temporariamentetemporariamente (co(co- -substrato

substrato))

Muitas vitaminas

Muitas vitaminas sãosão precursorasprecursoras das das coenzimascoenzimas..

Muitos

Muitos organismosorganismos nãonão conseguemconseguem sintetizarsintetizar certascertas porções

porções das coenzimasdas coenzimas essenciaisessenciais. Tais. Tais substânciassubstâncias devem

devem estarestar presentespresentes nana dietadieta dessesdesses organismosorganismos –– são

são as as vitaminasvitaminas.. !

! GruposGrupos prostéticosprostéticos –– associamassociam--se se

permanentemente

permanentemente ((ligaçãoligação covalentecovalente)) Ex:

(12)

Energia

de

ativação

e

coordenadas

de

reação

!

! Grande Grande parteparte do do nossonosso conhecimentoconhecimento sobresobre o o modomodo

como

como as as enzimasenzimas catalisamcatalisam reaçõesreações químicasquímicas é é proveniente

proveniente dada teoriateoria do do estadoestado de de transiçãotransição –– 19301930

!

! ConsiderandoConsiderando umauma reaçãoreação bimolecular bimolecular envolvendoenvolvendo 3 3

átomos

átomos::

H

H_A_A––HH_B_B + H+ H_C_C "" H_H_A_A + ₊H_H_B_B–_–H_H_C_C H

H_C_C devedeve aproximaraproximar--se se dada molmolééculacula diatdiatôômicamica HH_A_A--HH_B_B de de modo modo que exista

que exista um um complexo instável complexo instável de de elevada energia elevada energia representado por

representado por HH_A_A……_H_H

B

B……HHCC

Laboratório

(13)

O

O pontoponto de de mais alta energiamais alta energia éé chamadochamado de de estadoestado de

(14)

Os reagentes se aproximam ao longo de uma rota de

energia livre mínima

energia livre mínima -- as as coordenadas de reaçãocoordenadas de reação desses desses reagentes

reagentes

!

! Caso os átomos no sistema reacional sejam de tipos Caso os átomos no sistema reacional sejam de tipos

diferentes diferentes

A + B

"

X

"

P + Q

em que A e B s

em que A e B sãão os reagentes, P e Q so os reagentes, P e Q sãão os produtos e o os produtos e X representa o estado de transi

X representa o estado de transiçãçãoo ∆

∆G, a energia livre do estado de transiG, a energia livre do estado de transiçãção subtrao subtraíída da da da energia livre dos reagentes

energia livre dos reagentes éé a a energia livre de ativaenergia livre de ativaçãçãoo A concentra

A concentraçãção do estado de transio do estado de transiçãção o éé pequena (10pequena (10--1313 _a_a

10

10--1414_s)_s)

Laboratório

(15)

A decomposição do estado de transição em produtos é A decomposição do estado de transição em produtos é

postulada como sendo o processo determinante da postulada como sendo o processo determinante da

(16)

!

! Quanto maior for o valor de Quanto maior for o valor de ∆∆G, menor será a velocidade G, menor será a velocidade

da reação da reação

!

! menor será o no. de moléculas de reagentes com menor será o no. de moléculas de reagentes com

energia térmica suficiente para alcançar a energia livre

do estado de transição

!

! Os Os catalisadores catalisadores atuam reduzindo a energia livre do atuam reduzindo a energia livre do

estado de transição da reação catalisada. estado de transição da reação catalisada.

!

! A diferença entre os valores de A diferença entre os valores de ∆∆G de uma reação nãoG de uma reação não-

-catalisada e de uma reação -catalisada indica a eficiência

catalisada e de uma reação catalisada indica a eficiência

do catalisador.

Laboratório

(17)

!

! Um catalisador Um catalisador reduzreduz a barreira de energia livre na a barreira de energia livre na

mesma proporção tanto para a reação direta como para mesma proporção tanto para a reação direta como para

a reversa. a reversa.

!

! A probabilidade de a reação ocorrer em uma ou outra A probabilidade de a reação ocorrer em uma ou outra

direção depende somente da diferença de energia livre direção depende somente da diferença de energia livre

entre os reagentes e produtos. entre os reagentes e produtos.

!

! Se Se ∆∆GG_reação_reação < 0, a reação ocorrerá espontaneamente dos < 0, a reação ocorrerá espontaneamente dos

reagentes em direção aos produtos; se

reagentes em direção aos produtos; se _∆_∆GG_reação_reação > 0, a > 0, a reação reversa ocorrerá de modo espontâneo

(18)

Mecanismos

catalíticos

1.

1. catálisecatálise ácidoácido--basebase

2.

2. catálisecatálise covalentecovalente –– formaçãoformação transitóriatransitória de de

uma

uma ligaçãoligação covalentecovalente entreentre o o catalisadorcatalisador e o e o substrato

substrato

3.

3. CatáliseCatálise porpor íonsíons metálicosmetálicos –– metaloenzimasmetaloenzimas. Os . Os

íons

íons metálicosmetálicos participamparticipam de de processosprocessos catalíticos

catalíticos de de trêstrês maneirasmaneiras::

(a)

(a) ligamligam--se se aoao substratosubstrato (b)

(b) MediamMediam reaçõesreações de de oxidaçãooxidação--reduçãoredução (c)

(c) EstabilizamEstabilizam eletrostaticamenteeletrostaticamente, , ouou protegemprotegem cargascargas

negativas

Laboratório

(19)

4.

4. CatáliseCatálise eletrostáticaeletrostática –– exclusãoexclusão de de umauma molécula

molécula de de águaágua do do sítiosítio ativoativo quandoquando o o substrato

substrato se se ligaliga. . As As interaçõesinterações eletrostáticaseletrostáticas são

são muitomuito maismais fortes do fortes do queque emem soluçõessoluções aquosas

aquosas

5.

5. EfeitoEfeito de de proximidadeproximidade e e orientaçãoorientação 6.

6. CatáliseCatálise porpor ligaçãoligação preferencialpreferencial do do estadoestado de de transição

transição –– enzimasenzimas tensionamtensionam mecanicamentemecanicamente seus

seus substratossubstratos emem direçãodireção aoao estadoestado de de transição

(20)

RNase A – exemplo de reação enzimática

mediada pela catálise ácido-básica

(21)

Cinética

de

_de

reação

_reação

!

! CinéticaCinética químicaquímica

Reação

Reação de de estequiometriaestequiometria globalglobal A

A "" PP Processos

Processos molecularesmoleculares simplessimples A

A "" I_I₁₁ "" I_I₂₂ "" P_P sendo

(22)

!

! A A velocidadevelocidade de de umauma reaçãoreação é é proporcionalproporcional à à

frequência

frequência nana qualqual as as moléculasmoléculas reatantesreatantes colidem

colidem..

!

! A A constanteconstante de de proporcionalidadeproporcionalidade é a é a constanteconstante

de

de velocidadevelocidade (k)(k)

!

! Para a Para a reaçãoreação A A "" P, a P, a velocidadevelocidade (v) de (v) de

forma

formaçãçãoo do do produtoproduto éé

V = d[P]/

dt

= d[A]/

dt

= k[A]

A

A velocidadevelocidade dada reaçãoreação é é proporcionalproporcional à à concentração

concentração do do reatantereatante, , emem qualquerqualquer pontoponto no tempo.

no tempo.

Laboratório

(23)

!

! ReaçãoReação de de primeiraprimeira ordemordem –– unimolecularunimolecular

A

A "" PP considerando

considerando a a reareaçãçãoo

2A

2A "" PP

!

! ReaReaçãçãoo de de segundasegunda ordemordem –– bimolecularbimolecular

Sua

Sua velocidadevelocidade instantâneainstantânea éé V = d[A]/

V = d[A]/dtdt = k[A]= k[A]22

A

A velocidadevelocidade dada reaçãoreação é é proporcionalproporcional aoao quadradoquadrado da

(24)

Considerando

Considerando a a reação reação

A + B

A + B "" PP

!

! TambémTambém é é reaçãoreação de de segundasegunda ordemordem, com , com umauma

velocidade

velocidade instantâneainstantânea

V = d[A]/

dt

=

-

d[B]/

dt

= k[A][B]

!

! ConsideradaConsiderada de de primeiraprimeira ordemordem emem relaçãorelação a [A] a [A]

e de

e de primeiraprimeira ordemordem emem relaçãorelação a [B]a [B]

Laboratório

(25)

Equações

de

_de

velocidade

_velocidade

!

! DescreveDescreve o o processoprocesso de de umauma reaçãoreação emem funçãofunção

do tempo e

do tempo e podepode ser ser derivadaderivada de de equaçõesequações queque descrevem

descrevem a a velocidadevelocidade instantâneainstantânea dada reaçãoreação

!

! SendoSendo assimassim, a , a equaçãoequação de de velocidadevelocidade de de

primeira

primeira ordemordem é é obtidaobtida a a partirpartir dada equaçãoequação

v = d[P]/

dt

=

-

d[A]/

dt

= k[A]

Rearranjando

Rearranjando,,

d[A]/[A] = d

(26)

Integrando

Integrando entreentre osos limiteslimites de [A]de [A]₀₀ atéaté [A], a [A], a concentração

concentração no tempo tno tempo t

resulta

resulta emem

ln

ln[A] = [A] = lnln[A][A]₀₀ ––ktkt ou

ou o o antilogaritmoantilogaritmo de ambos de ambos osos ladoslados dada equaçãoequação [A] = [A]

[A] = [A]₀₀ ee--ktkt

Laboratório

www.biocristalografiabiocristalografia..dfdf..ibilceibilce..unespunesp..brbr

∫

[ ]

=

−

∫

] [ ₀

ln[

]

0 A A t

dt

k

A

d

(27)

!

A

reação

de

primeira

ordem

resulta

em

uma

(28)

Característica

da

reação

de

primeira

ordem

!

! O tempo O tempo parapara a a decomposiçãodecomposição de de metademetade do do

reatante

reatante inicialmenteinicialmente presentepresente ((meiomeio tempo) ttempo) t_1/2_1/2 é

é umauma constanteconstante e e independeindepende dada concentraçãoconcentração inicial

inicial do do reatantereatante

!

! SubstituindoSubstituindo, [A] = [A], [A] = [A]₀₀/2, /2, quandoquando t=tt=t_1/2_1/2

ln

ln ([A]([A]₀₀/2/[A]/2/[A]₀₀) = kt) = kt_1/2_1/2 t

t_1/2_1/2 = = lnln 2/k = 0,69/k2/k = 0,69/k

Laboratório

(29)

Para

Para umauma reaçãoreação de de segundasegunda ordemordem com um com um únicoúnico tipo

tipo de de reatantereatante, 2A , 2A "" PP A

A variaçãovariação dada [A] com o tempo é [A] com o tempo é diferentediferente dada anterior.anterior. se v = d[A]/

se v = d[A]/dtdt = k[A]= k[A]22

Então Então, ,

de

de maneiramaneira queque 1/[A] = 1/[A]1/[A] = 1/[A]₀₀ + + ktkt é

é umauma equaçãoequação linear linear emem termostermos de 1/[A] e t.de 1/[A] e t. O

O meiomeio tempo é tempo é expressoexpresso porpor tt_1/2_1/2 = 1/k[A]= 1/k[A]₀₀

∫

[ ]

−

=

−

∫

] [ ₀

_[

_]

2 0

]

[

A A t

dt

k

A

d

(30)

Para

Para determinardeterminar a a constanteconstante de de velocidadevelocidade parapara a a reação

reação A + B A + B "" P_P, _,é_é mais_mais f_fá_ácil_cil aumentar_aumentar a _a concentra

concentraçãçãoo de um de um reatantereatante emem relarelaçãção ao outroo ao outro quando

quando [B] >> [A],[B] >> [A], a [B] a [B] nnããoo éé significantementesignificantemente alterada

alterada durantedurante a a reareaçãçãoo A

A velocidadevelocidade dada reareaçãçãoo dependedepende de [A],de [A], queque éé limitante

limitante

Assim

Assim, a , a reareaçãçãoo pareceparece ser de ser de primeiraprimeira ordemordem emem rela

relaçãçãoo a [A] a [A] ((reareaçãçãoo de pseudo de pseudo primeiraprimeira ordemordem))

Laboratório

(31)

Cinética

enzimática

_enzimática

!

! As As enzimasenzimas catalisamcatalisam umauma enormeenorme variedadevariedade de de reaçõesreações

usando

usando difierentesdifierentes combinaçõescombinações dos dos seisseis mecanismosmecanismos catalíticos

catalíticos básicosbásicos::

1.

1. CatáliseCatálise ácidoácido--básicabásica

2.

2. CatáliseCatálise covalentecovalente

3.

3. CatáliseCatálise porpor íonsíons metálicosmetálicos

4.

4. CatáliseCatálise eletrostáticaeletrostática

5.

5. CatáliseCatálise porpor meiomeio de de efeitosefeitos de de proximidadeproximidade e e orientaçãoorientação

6.

(32)

!

! AlgumasAlgumas enzimasenzimas atuamatuam somentesomente emem umauma únicaúnica

molécula

molécula de de substratosubstrato

!

! OutrasOutras atuamatuam emem duasduas ouou maismais moléculasmoléculas

diferentes

diferentes, , cujacuja ordemordem de de ligaçãoligação podepode ouou nãonão ser ser obrigatória

obrigatória !

! O O inícioinício dos dos estudosestudos sobresobre cinéticacinética enzimáticaenzimática foifoi

em

em 1902, 1902, porpor Adrian BrownAdrian Brown

!

! EleEle investigouinvestigou as as velocidadesvelocidades de de hidrólisehidrólise dada

sacarose

sacarose pelapela enzimaenzima _β_β--frutofuranosidasefrutofuranosidase de de leveduras

leveduras..

SACAROSE + H

SACAROSE + H₂₂O O "" GLICOSE + FRUTOSE_{GLICOSE + FRUTOSE}

Laboratório

(33)

Quando

Quando [[sacarosesacarose] >> [] >> [enzimaenzima], a ], a velocidadevelocidade de de reação

reação tornatorna--se se independenteindependente dada concentraçãoconcentração

!

! Adrian Brown Adrian Brown propôspropôs entãoentão queque a a reaçãoreação global é global é compostacomposta

por

por duasduas reaçõesreações elementareselementares, , nasnas quaisquais o o substratosubstrato forma forma um

um complexocomplexo com a com a enzimaenzima, , queque se se decompõedecompõe emem produtoproduto e e enzimaenzima k1 k2 k1 k2 E + S E + S _↔_↔ES ES "" P + EP + E K K--11 !

! QuandoQuando a a concentraçãoconcentração de de substratosubstrato for for altaalta o o suficientesuficiente

para

para converter converter completamentecompletamente a a enzimaenzima nana suasua forma ES, a forma ES, a segunda

(34)

Cada

reação

elementar

descrita

é

caracterizada

por

uma

constante

de

velocidade

: k

₁₁

e k

_-_-₁₁

para

a

reação

direta

e

reversa

da

formação

do

complexo

ES

!

! KK₂₂ parapara a a decomposiçãodecomposição de ES de ES emem P, a P, a segundasegunda

reação

!

! A A segundasegunda reaçãoreação é é irreversívelirreversível

k1 k2 k1 k2

E + S

_↔

ES

"

P + E

K K--11 Laboratório

(35)

A

equação

_equação

de

_de

Michaelis

_Michaelis

-

_-

Menten

_Menten

!

! EmEm um um esquemaesquema cinéticocinético complexocomplexo, a , a velocidadevelocidade

de

de formaçãoformação de de produtosprodutos podepode ser ser expressaexpressa comocomo o

o resultadoresultado dada multiplicaçãomultiplicação dada constanteconstante de de velocidade

velocidade dada reaçãoreação aoao formarformar produtosprodutos e a e a concentração

concentração do do seuseu intermediáriointermediário imediatamenteimediatamente anterior.

anterior.

!

! A A expressãoexpressão geralgeral parapara a a velocidadevelocidade dada reaçãoreação

k1 k2 k1 k2

E + S

_↔

ES

"

P + E

K K--11

(36)

Velocidade

global

da

produção

de ES

!

Diferença

entre

as

velocidades

das

reações

elementares

que

levam

à

sua

formação

e das

que

resultam

no

seu

consumo

:

d[ES] /

dt

= k

₁₁

[E][S]

–

k

_-_-₁₁

[ES]

–

k

₂₂

[ES]

!

Essa

equação

não

pode

ser

integrada

sem

considerações

que

a

simplifiquem

.

Laboratório

(37)

1.

1. ConsideraçãoConsideração de de queque a a reaçãoreação estáestá emem equilíbrioequilíbrio 1913

1913 –– LeonorLeonor MichaelisMichaelis e Maud e Maud MentenMenten supuseramsupuseram que

que kk₁₁ >> k>> k₂₂, de , de maneiramaneira queque a a primeiraprimeira etapaetapa da

da reaçãoreação alcancealcance o o equilíbrioequilíbrio

K

_s_s

= k

_-_-₁₁

/k

₁₁

= [S][E] / [ES]

onde

onde KK_s_s é a é a constanteconstante de de dissociaçãodissociação dada primeiraprimeira etapa

etapa dada reaçãoreação O

O complexocomplexo enzimaenzima--substratosubstrato ESES é é conhecido comoconhecido como o

(38)

2.

2. PostuladoPostulado dada reaçãoreação no no estadoestado estacionárioestacionário, , tendotendo assim

assim um valor um valor constanteconstante d[ES] /

d[ES] / dtdt = 0= 0 As

As quantidadesquantidades [ES] e [E] [ES] e [E] nãonão sãosão diretamentediretamente mensuráveismensuráveis, , com

com exceçãoexceção dada concentraçãoconcentração dada enzimaenzima,, [E]

[E]_T_T = [E] + [ES]= [E] + [ES] Que

Que podepode ser ser facilmentefacilmente determinadadeterminada A

A equaçãoequação de de velocidadevelocidade podepode entãoentão ser ser derivadaderivada

Laboratório

(39)

A

A equaçãoequação d[ES] / d[ES] / dtdt = k= k₁₁ [S][E] [S][E] –– kk_-_-₁₁ [ES] [ES] –– kk₂₂ [ES] é [ES] é combinada

(40)

Produzindo

Produzindo:: K

K₁₁ [E][S] = [E][S] = kk_-_-₁₁[ES] + [ES] + kk₂₂[ES][ES] se [E] = [E]

se [E] = [E]_T_T –– [ES], [ES], rearranjandorearranjando,, ([E]

([E]_T_T –– [ES]) [S][ES]) [S] / [ES] = / [ES] = kk_-_-₁₁ + k+ k₂₂ / k/ k₁₁ A

A constanteconstante de de MichaelisMichaelis (K(K_M_M) é ) é definidadefinida comocomo K

K_M_M = k= k_-_-₁₁ + k+ k₂₂ / k/ k₁₁ Então

Então,,

K

K_M_M [ES] = [ES] = ([E]([E]_T_T –– [ES]) [S][ES]) [S]

Laboratório

(41)

Resolvendo

Resolvendo parapara [ES],[ES], [ES] = [E]

[ES] = [E]_T_T [S] / K[S] / K_M_M + [S]+ [S] A

A expressãoexpressão parapara a a velocidadevelocidade inicialinicial (v(v₀₀) ) dada reaçãoreação, , a a velocidadevelocidade v = d[P] / v = d[P] / dtdt = k= k₂₂ [ES] [ES] emem t=0t=0 torna torna--sese v

v₀₀ = (d[P] / = (d[P] / dtdt))_t=0_t=0 = k= k₂₂ [ES][ES] = k= k₂₂ [E][E]_T_T[S] / K[S] / K_M_M + [S]+ [S] [E]

(42)

!

! O O usouso dada velocidadevelocidade inicialinicial minimizaminimiza fatoresfatores

complicadores

complicadores comocomo osos efeitosefeitos de de reaçõesreações reversíveis

reversíveis, e a , e a inativaçãoinativação progressivaprogressiva dada enzimaenzima

!

! A A velocidadevelocidade máximamáxima, , VV_máx_máx ocorreocorre a a elevadaselevadas

concentrações

concentrações de de substratosubstrato, , nana qualqual a a enzimaenzima está

está saturadasaturada, , ouou sejaseja, , inteiramenteinteiramente nana forma forma ES

ES

V

_máx_máx

= k

₂₂

[E]

_T_T

Laboratório

(43)

Combinando

as

equações

,

v

v₀₀ = d[P] / = d[P] / dtdt = k= k₂₂ [ES] e [ES] e

V

_máx_máx

=

k

₂₂

[E]

_T_T e

e

v

v₀₀ = k= k₂₂ [ES] = [ES] = kk₂₂ [E][E]_T_T[S] / K[S] / K_M_M + [S],+ [S], obtem

obtem--sese

v

v₀₀ = = VV_máx_máx [S] / K[S] / K_M_M + [S]+ [S] Essa

Essa expressãoexpressão ((eqeq. de . de MichaelisMichaelis--MentenMenten) é a ) é a equação

equação básicabásica dada cinéticacinética enzímáticaenzímática

Ela

(44)

! A

! A funçãofunção de de saturaçãosaturação parapara a a ligaçãoligação de Ode O₂₂ à à mioglobina

mioglobina tem a tem a mesmamesma forma forma algébricaalgébrica

Laboratório

(45)

Significância

da

constante

de

Michaelis

!

! KK_M_M –– definiçãodefinição operacionaloperacional simplessimples

quando quando

[S] = K

_M_M

,

a a equaçãoequação vv₀₀ = = VV_máx_máx [S] / K[S] / K_M_M + [S]+ [S] torna torna--sese

v

₀₀

=

V

_máx_máx

/ 2

De

De modomodo queque:: K

K_M_M é a é a concentraçãoconcentração de de substratosubstrato nana qualqual a a velocidade

(46)

Se a

Se a enzimaenzima tivertiver valor valor pequenopequeno de Kde K_M_M, , elaela atingiráatingirá a

a máximamáxima eficiênciaeficiência catalíticacatalítica emem baixasbaixas [S][S]

!

! KK_M_M é é únicoúnico parapara cadacada enzimaenzima--substratosubstrato !

! A magnitude do KA magnitude do K_M_M variavaria bastantebastante com a com a

identidade

identidade dada enzimaenzima e a e a naturezanatureza do do substratosubstrato

!

! É É tambémtambém umauma funçãofunção dada temperaturatemperatura e do pH.e do pH.

Laboratório

(47)

Enzima Enzima Enzima

Enzima SubstratoSubstratoSubstratoSubstrato KKKK_m_m_m_m (mM)(mM)(mM)(mM) Catalase H₂O₂ 25 Hoxoquinase Glicose Frutose 0,151,5 Quimiotripsina N-benzoltirosinamida N-formiltirosinamida N-acetiltirosianamida Gliciltirosinamida 2,5 12,0 32 122 Anidrase carbônica HCO₃- _9,0

Glutamato desidrogenase Glutamato

α-cetoglutarato NH₄+ NAD_ox NAD_red 0,12 2,0 57 0,025 0,018

(48)

K

_cat_cat

/ K

_M_M

é

uma

medida

da

eficiência

catalítica

!

! KK_cat_cat ((constanteconstante catalíticacatalítica) de ) de umauma enzimaenzima podepode

ser

ser definidadefinida comocomo::

K

_cat_cat

=

V

_máx_máx

/ [E]

_T_T Número

Número de de reciclagemreciclagem de de umauma enzima enzima "" representa

representa o o no. de no. de processosprocessos reacionaisreacionais queque cada

cada ssíítiotio ativoativo catalisacatalisa porpor unidadeunidade de tempo.de tempo. Pela

Pela eqeq. . VV_máx_máx = k= k₂₂ [E][E]_T_T um

um sistemasistema simples simples comocomo o o modelomodelo de de reaçãoreação de de Michaelis

(49)

!

! QuandoQuando [S] << K[S] << K_M_M, , poucopouco ES é ES é formadoformado..

Consequentemente

Consequentemente,,

[E] ~ [E]

_T_T

então

então, se, se

v

₀₀

= k

₂₂

[E]

_T_T

[S] / K

_M_M

+ [S] ,

A

A eqeq. se . se reduzreduz aa

v

₀₀

~ (k

₂₂

/ K

_M_M

) [E]

_T_T

[S] ~ (

k

_cat_cat

[E][S] / K

_M_M

)

Há

Há um um limitelimite máximomáximo parapara o valor de o valor de kk_cat_cat / K/ K_M_M Ele

Ele nãonão podepode ser ser maiormaior do do queque kk₁₁ A

(50)

Enzimas

mais

eficientes

tem

valores

de

k

_cat_cat

/K

_M_M

próximos

ao

limite

para

reações

controladas

por

difusão

de 10

88

_{a 10}

99

_M

--11

_s

--11 !

!

Estas

enzimas

catalisam

uma

reação

quase

todas

as

vezes

que

encontram

uma

molécula

de

substrato

Atingem

um

estado

de

perfeição

catalítica

Laboratório

(51)

Análise

dos dados

cinéticos

!

! HáHá váriosvários métodosmétodos parapara determinardeterminar osos valoresvalores dos dos

parâmetros

parâmetros dada eqeq. de . de MichaelisMichaelis--MentenMenten ((VV_máx_máx e Ke K_M_M))

!

! Para Para valoresvalores elevadoselevados de [S], a de [S], a velocidadevelocidade inicialinicial vv₀₀

aproxima

aproxima--se de se de VV_máx_máx

!

! É É muitomuito difícildifícil determinardeterminar VV_máx_máx com com precisãoprecisão a a partirpartir do do

gráfico

gráfico de vde v₀₀ versus [S]. O valor de versus [S]. O valor de VV_máx_máx é é subestimadosubestimado

!

! Um Um métodométodo maismais adequadoadequado foifoi formuladoformulado porpor Hans Hans

Lineweaver

Lineweaver e Dean Burk e Dean Burk "" usamusam o o inversoinverso dada eqeq. de . de MM

(52)

!

A

eq

. de

Michaelis

-

Menten

v

₀₀

=

V

_máx_máx

[S] / K

_M_M

+ [S]

!

a

eq

. de

Lineweaver

-

Burk

1 / v

₀₀

= (K

_M_M

/

V

_máx_máx

) 1 / [S] + 1 /

V

_máx_máx é

é umauma eqeq. linear . linear nana forma de 1/ vforma de 1/ v₀₀ e 1 / [S]e 1 / [S] Necessita

Necessita--se se trabalhartrabalhar com com umauma faixafaixa de [S] de [S] entreentre ~0,5 K

~0,5 K_M_M atéaté ~5 K~5 K_M_M Desvantagem

Desvantagem: : PontosPontos comprimidoscomprimidos à à esquerdaesquerda do do gráfico

gráfico

Laboratório

(53)

Valores pequenos

Valores pequenos de [S] de [S] "" pequenos erros em_{pequenos erros em} v_v₀₀, _, e

(54)

A

cinética

em

estado

estacionário

não

pode

estabelecer

um

mecanismo

de

reação

sem

ambiguidade

!

! EstaEsta cinéticacinética fornecefornece informaçõesinformações sobresobre as as

velocidades

velocidades de de formaçãoformação e e decomposiçãodecomposição de ESde ES

!

! MasMas nãonão esclareceesclarece sobresobre a a naturezanatureza de ESde ES !

! A A reaçãoreação podepode ocorrerocorrer porpor meiomeio de de váriosvários estadosestados

intermediários intermediários E + S E + S _↔_↔ES ES _↔_↔EX EX _↔_↔EP EP _↔_↔E + PE + P ou ou E + S E + S _↔_↔ES ES _↔_↔EX EX ouou EY EY _↔_↔EP EP _↔_↔E + PE + P “

(55)

Reações

bissubstrato

!

! ReaçõesReações enzimáticasenzimáticas queque requeremrequerem múltiplosmúltiplos

substratos

substratos e e formamformam múltiplosmúltiplos produtosprodutos

!

! ReaçõesReações do do tipotipo

E

A + B

A + B _↔_↔P + QP + Q são

são responsáveisresponsáveis porpor ~60% das ~60% das reaçõesreações bioquímicasbioquímicas conhecidas

conhecidas.. Reações

Reações de de transferasetransferase

E

(56)

Reações

Reações sequenciaissequenciais

!

! MecanismoMecanismo ordenadoordenado !

! MecanismoMecanismo aleatórioaleatório

!

! ReaçõesReações de de pinguepingue--ponguepongue

Reações

Reações de de transferênciatransferência de de gruposgrupos, , nasnas quaisquais um

um ouou maismais produtosprodutos sãosão liberadosliberados antes antes queque todos

(57)

Inibição

enzimática

_enzimática

!

! MuitasMuitas substânciassubstâncias alteramalteram a a atividadeatividade de de umauma

enzima

enzima associandoassociando--se se reversivelmentereversivelmente a a elaela, , influenciando

influenciando a a ligaçãoligação do do substratosubstrato e/e/ouou seuseu no. de

no. de reciclagemreciclagem..

!

! As As substânciassubstâncias queque reduzemreduzem a a atividadeatividade de de umauma

enzima

enzima sãosão conhecidasconhecidas comocomo inibidoresinibidores

!

! Grande Grande parteparte do arsenal do arsenal farmacêuticofarmacêutico modernomoderno

é

(58)

Os

Os inibidoresinibidores atuamatuam atravésatravés de de umauma variedadevariedade de de mecanismos

mecanismos !

! AlgunsAlguns sãosão substânciassubstâncias queque se se assemelhamassemelham

estruturalmente

estruturalmente aosaos substratossubstratos dada enzimaenzima, , masmas não

não reagemreagem, , ouou reagemreagem muitomuito lentamentelentamente

!

! EstasEstas substânciassubstâncias sãosão usadasusadas parapara investigarinvestigar a a

natureza

natureza químicaquímica ouou conformacional do conformacional do sítiosítio ativo

ativo dada enzimaenzima parapara tentartentar elucidarelucidar seuseu mecanismo

mecanismo catalíticocatalítico

!

! OutrosOutros inibidoresinibidores afetamafetam a a atividadeatividade catalíticacatalítica

sem

sem interferirinterferir nana ligaçãoligação do do substratosubstrato

!

! MuitosMuitos realizamrealizam ambos ambos osos processosprocessos

Laboratório

(59)

Inibição

competitiva

!

Uma

substância

que

compete

diretamente

com o

substrato

normal

pelo

sítio

de

ligação

de

uma

enzima

é um

inibidor

competitivo

!

Esse

inibidor

é

semelhante

ao

substrato

,

mas

difere

-

se dele

por

não

poder

reagir

como

(60)

!

! O O modelo geral paramodelo geral para a a inibição competitivainibição competitiva é é

dado

dado pelo esquemapelo esquema de de reação reação K K₁₁ KK₂₂ E + S E + S _↔_↔ ES ES "" P + E_{P + E} + + K K _-_-₁₁ I I ↓↑ ↓↑ KK_I_I EI + S EI + S "" NNÃÃO HO HÁÁ REAREAÇÃÇÃOO

(61)

Neste

Neste casocaso, presume, presume--se se queque I (I (inibidorinibidor) ) ligaliga--se se reversivelmente

reversivelmente à à enzimaenzima e e estáestá emem equilíbrioequilíbrio com com ela

ela

K

_I_I

= [E][I] / [EI]

e EI (

e EI (complexocomplexo enzimaenzima--inibidorinibidor) é ) é cataliticamentecataliticamente inativo

inativo

Um

Um inibidorinibidor competitivocompetitivo reduzreduz a a concentraçãoconcentração de de enzima

enzima livrelivre disponíveldisponível parapara a a ligaçãoligação do do substrato

(62)

A

A eqeq. de MM . de MM parapara umauma reaçãoreação inibidainibida competitivamentecompetitivamente tem um

tem um termotermo adicionaladicional queque se se refererefere à à fraçãofração de [E]de [E]_T_T queque liga

liga a I a I parapara formarformar EI([E]EI([E]_T_T + [ES] + [EI])+ [ES] + [EI]) v

v₀₀ = = VV_máx_máx [S] / [S] / _α_αKK_M_M + [S]+ [S] É a

É a eqeq. de MM . de MM modificadamodificada porpor um um fatorfator _α_α, , definidodefinido comocomo α

α = 1 + [I] / k= 1 + [I] / k₁₁ a é

a é umauma funçãofunção dada concentraçãoconcentração do do inibidorinibidor e e suasua afinidade

afinidade pelapela enzimaenzima, , nãonão podepode ser ser menormenor do do queque 1.1. Uma

Uma concentraçãoconcentração de de substratosubstrato infinitamente grandeinfinitamente grande podepode sobrepujar

sobrepujar osos efeitosefeitos do do inibidorinibidor

Laboratório

(63)

A

A presençapresença de I de I fazfaz com com queque a [S] a [S] pareça mais pareça mais diluída

(64)

KI

pode

ser

medido

!

! O O rearranjorearranjo dada eqeq. v. v₀₀ = = VV_máx_máx [S] / [S] / ααKK_M_M + [S]+ [S]

na

na forma dos forma dos duplosduplos recíprocosrecíprocos resultaresulta emem 1/v 1/v₀₀ = (= (_α_αKK_M_M / / VV_máx_máx) 1 / [S] + 1 / ) 1 / [S] + 1 / VV_máx_máx O gráfico O gráfico desta equação desta equação é linear e tem é linear e tem uma uma inclinação de inclinação de α αKK_M_M / / VV_máx_máx

(65)

O K

O K_I_I pode ser calculado pela determinação de valores de pode ser calculado pela determinação de valores de _α_α em diferentes concentrações de inibidor para uma enzima

em diferentes concentrações de inibidor para uma enzima

de K

de K_M_M conhecidoconhecido

!

! A comparação dos valores de KA comparação dos valores de K_I_I de inibidores competitivos de inibidores competitivos

com diferentes estruturas pode fornecer informações sobre com diferentes estruturas pode fornecer informações sobre

as propriedades de ligação do sítio ativo de uma enzima e as propriedades de ligação do sítio ativo de uma enzima e

do seu mecanismo catalítico. do seu mecanismo catalítico.

!

! Os estudos de inibição competitiva também são utilizados Os estudos de inibição competitiva também são utilizados

para determinar a afinidade de análogos do estado de

transição pelo sítio ativo de uma enzima

!

! O estudo de inibidores é o carroO estudo de inibidores é o carro--chefe do desenvolvimento chefe do desenvolvimento

(66)

Inibição não

Inibição não--competitivacompetitiva

!

! O inibidor ligaO inibidor liga--se diretamente ao complexo enzimase diretamente ao complexo enzima-

-substrato, mas não à enzima livre substrato, mas não à enzima livre

K K₁₁ KK₂₂ E + S E + S _↔_↔ ES ES "" P + E_{P + E} K K _–_–₁₁++ I I ↓↑ ↓↑ K´K´_I_I ESI

ESI "" NNÃÃO HO HÁÁ REAREAÇÃÇÃOO

Neste caso, a etapa de ligação do inibidor tem a constante Neste caso, a etapa de ligação do inibidor tem a constante

de dissociação de dissociação

K´

K´_I_I= [ES][I] / [ESI]= [ES][I] / [ESI]

Laboratório

(67)

O inibidor não

O inibidor não--competitivo não se assemelha ao substrato. competitivo não se assemelha ao substrato. Ele provavelmente distorce o sítio ativo, fazendo com que a

Ele provavelmente distorce o sítio ativo, fazendo com que a

enzima seja

enzima seja cataliticamente cataliticamente inativa.inativa.

O gráfico consiste em linhas paralelas com inclinação de O gráfico consiste em linhas paralelas com inclinação de

K

(68)

O inibidor afeta a função catalítica da enzima, mas

não sua ligação pelo substrato.

Portanto, só é significativa em enzimas com

múltiplos substratos

Laboratório

(69)

Inibição Mista

Se tanto a enzima como o complexo enzima

Se tanto a enzima como o complexo enzima--substrato substrato ligarem o inibidor, ligarem o inibidor, K K₁₁ KK₂₂ E + S E + S _↔_↔ ES ES "" P + E_{P + E} + + K K _–_–₁₁++ I I II ↓↑ ↓↑ KK_I_I _↓↑_↓↑ K´K´_I_I EI

(70)

Este inibidor liga

Este inibidor liga--se aos sítios enzimáticos que se aos sítios enzimáticos que participam tanto da ligação do substrato, como da

participam tanto da ligação do substrato, como da

catálise

!

! As constantes de dissociaçãoAs constantes de dissociação

K

_I_I

= [E][I] / [EI] e K´

_I_I

= [ES][I] / [ESI]

não são necessariamente equivalentes

não são necessariamente equivalentes Os valores de K

Os valores de K_M_M e e VV_máx_máx são modulados pela presença do são modulados pela presença do inibidor.

inibidor.

Tem características de ambos inibidores, competitivos e

não

não--competitivoscompetitivos

Laboratório

(71)

No gráfico, as linhas para diferentes valores de [I] cruzam

No gráfico, as linhas para diferentes valores de [I] cruzam- -se à esquerda do eixo 1/v se à esquerda do eixo 1/v₀₀.. Quando k Quando k_I_I=k´=k´_I_I ( (_α_α==_α_α´), a ´), a interseção é no interseção é no eixo 1/[S] eixo 1/[S]

(72)

A inibição mista é uma característica importante na cinética

de enzimas

de enzimas multissubstratosmultissubstratos

!

! A inativação irreversível assemelhaA inativação irreversível assemelha--se à inibição se à inibição

não competitiva.

!

! O inibidor será um O inibidor será um inativadorinativador !

! Os Os inativadores inativadores reduzem o nível efetivo da [E]reduzem o nível efetivo da [E]_T_T

e portanto

e portanto VV_máx_máx para todos os valores de [S] para todos os valores de [S] sem alterar K

sem alterar K_M_M

Laboratório

(73)

Regulação

da

_da

atividade

_atividade

enzimática

_enzimática

!

Um

organismo

deve

poder

regular as

atividades

catalíticas

das

suas

enzimas

, a

fim

de

coordenar

seus

processos

metabólicos

, responder

às

mudanças

do

meio

(74)

Formas

de

_de

regulação

_regulação

da

_da

atividade

_atividade

enzimática

1.

1. Controle

Controle

da

disponibilidade

da

enzima

!

! VelocidadeVelocidade de de síntesesíntese e e degradaçãodegradação

2.

2. Controle

Controle

da

atividade

da

enzima

!

! AlteraçõesAlterações estruturaisestruturais influenciaminfluenciam nana afinidadeafinidade dada

ligação

ligação do do substratosubstrato

!

! LigaçãoLigação de de pequenaspequenas moléculasmoléculas –– efeitosefeitos alostéricosalostéricos

Enzimas

Enzimas alostéricas alostéricas sãosão amplamenteamplamente distribuídasdistribuídas nana natureza

natureza e e tendemtendem a a ocuparocupar posiçõesposições chaveschaves nana regulação

regulação nasnas rotasrotas metabólicasmetabólicas São

São proteínasproteínas simétricassimétricas queque contémcontém subunidadessubunidades

!