INSTRUÇÕES DE USO
Ensaio ThromboType
®(HPA 1-6, 15)
REF THROMBOTYPE IVD
INDICE UTILIZAÇÃO ... 2 SUMÁRIO E EXPLICAÇÃO ... 2 PRINCÍPIO ... 2 REAGENTES ... 2 PRECAUÇÕES ... 2 ATENÇÃO ... 3 COLHEITA DA AMOSTRA ... 3 PROCEDIMENTO ... 3 Material fornecido ... 3
Material Adicional Necessário ... 4
Procedimento do Teste ... 4
CONTROLO DE QUALIDADE ... 7
INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS ... 8
LIMITAÇÕES ... 8
CARACTERÍSTICAS ESPECÍFICAS DE PERFORMANCE ... 8
REFERÊNCIAS ... 9
Ensaio ThromboType 2 303481.IFUPT REV E UTILIZAÇÃO
O ensaio ThromboType é um ensaio para a determinação molecular de HPA-1 (PlA), HPA-2 (Ko), HPA-3 (Bak), HPA-4 (Pen), HPA-5 (Br), HPA-6 (Ca), e HPA-15 (Gov), usando a amplificação por PCR de ADN genómico humano.
SUMÁRIO E EXPLICAÇÃO
Os aloantigénios plaquetários humanos (HPAs) estão associados com alterações de aminoácidos nas glicoproteínas plaquetárias. Embora não alterem a função destas proteínas, as modificações alteram as conformações locais das proteínas. Os determinantes antigénicos resultantes podem ser alvo de anticorpos e originar respostas aloimunes e autoimunes que causam doenças hemorrágicas que podem ser letais como a refracteriedade à transfusão de plaquetas, púrpura pós-transfusicional e trombocitopénia neonatal aloimune. Até à data, os métodos serológicos de tipagem serológica têm sido limitados pela ausência de aloantisoros bem caracterizados e pela escassez de plaquetas em doentes trombicitopénicos. Contudo, com os avanços na imunogenética plaquetária é agora possível genotipar indivíduos para as diferenças nucleotídicas individuais que caracterizam os alelos dos polimorfismos HPA.
O ensaio ThromboType é uma alternativa aos testes plaquetários serológicos e um auxiliar do matching HLA na selecção de plaquetas compatíveis para receptores aloimunizados. O ensaio ThromboType contém os reagentes necessários para executar uma amplificação por PCR específica de alelos em ADN genómico isolado e identificar o genótipo individual para HPA-1, 2, 3, 4, 5, 6 e 15 usando um gel de agarose como etapa final.
PRINCÍPIO
O ensaio utiliza uma reacção de PCR com primers específicos de alelo na qual o produto de amplificação apenas é produzido se o alelo estiver presente. Estas amplificações determinam a presença de alelos para os polimorfismos plaquetários HPA-1 (PLA), 2 (Ko), 3 (Bak), 4 (Pen), 5 (Br), 6 (Ca), e 15 (Gov) em amostras de ADN. Primeiro o ADN genómico é isolado da amostra usando um dos muitos kits comerciais ou técnicas validadas que produzem ADN genómico com elevado grau de pureza. A amostra de ADN é amplificada usando os tubos e reagentes de amplificação fornecidos. Após a amplificação, pipeta-se uma aliquota de cada reacção para um poço de um gel de agarose. Uma electroforese de 15 – 20 minutos separa os produtos PCR por tamanho. O gel é então examinado sob luz UV. A presença de uma banda PCR de tamanho correcto indica a presença do alelo na amostra de ADN. As bandas dos primers de controlo interno demonstram que as condições de cada tubo PCR foram as correctas. O gel pode ser fotografado como registo permanente do ensaio.
REAGENTES
Número máximo de testes por kit:
Ensaio ThromboType: 8 testes por kit
Todos os reagentes devem ser armazenados como indicado nos respectivos rótulos.
PT a/b 404567 Tubos de Primers HPA: tubos PCR com primers específicos de alelo liofilizados na superfície interna. Os
tubos estão armazenados em sacos reseláveis. Prontos a usar.
a : Tubos púrpura. Tubos consecutivos contêm primers específicos para os alelos a de (por ordem)
HPA-1, 2, 3, 4, 5, 6, 15 e um tubo vazio marcado com um ponto preto.
b: Tubos verdes. Tubos consecutivos contêm primers específicos para os alelos b de (por ordem)
HPA-1, 2, 3, 4, 5, 6, 15 e um tubo vazio marcado com um ponto preto.
LAD 404542 ADN 100 bp: ADN de cadeia dupla em fragmentos, começando em 100 pares de bases (bp) e
aumentando em escalas de 100 bp para 1000 bp, em tampão Tris. Pronto a usar.
PR 404549 2X Reagente PCR: Tampão Tris-KCl contendo cloreto de magnésio, primers de oligonucleotídos,
deoxinucleotidos trifosfato livres (dNTPs), e outros componentes. Diluir antes de usar.
E-Gel 404607 E-Gel 48 Gel: gel de agarose (4%) usado para a separação dos produtos PCR. Pronto a usar.
Não usar reagentes turvos ou contaminados.
Não utilizar os reagentes para além do seu prazo de validade. Não usar géis com aspecto partido ou seco.
Os tubos PCR e reagentes contidos no kit não devem ser usados com qualquer outro tipo de teste.
A substituição dos componentes por outros que não sejam fornecidos no kit pode conduzir a resultados inconsistentes ou errados.
PRECAUÇÕES REF
Devido às diferenças entre termocicladores pode ser necessário o laboratório estabelecer parâmetros ajustáveis ao programa de ciclos de temperatura para obter resultados válidos.
Não isolar amostras de ADN a partir de sangue heparinizado. A heparina pode interferir com a amplificação PCR.
A reacção de PCR é patenteada pela Roche Molecular Systems e F. Hoffman LaRoche Ltd. Para informação sobre licenças para efectuar uma amplificação por PCR contactar (nos EUA) o Director de licenciamento na Roche Molecular Systems, Inc., 1145 Atlantic Avenue, Alameda, California 94501, ou (fora dos EUA) o gestor do licenciamento PCR, F. Hoffmann-La Roche Ltd, Grenzacherstr.124, CH-4070 Basel, Suiça.
Boas Préticas Laboratoriais para a Amplificação por PCR
A forte capacidade da reacção de PCR na amplificação de sequências de ADN torna-a especialmente sensível a contaminações mesmo por pequenas quantidades de ADN externo. Assim, devem ser feitos todos os esforços para evitar a introdução prévia de material amplificado nas amostras teste. Estas contaminações cruzadas podem ser reduzidas separando fisicamente as áreas de pré-amplificação das áreas de pós-amplificação, de preferência em salas separadas. Pode ser usada uma câmara biológica na preparação do ADN para minimizar a formação de aerossóis potencialmente contaminantes. Uma câmara isolada na área de pré-amplificação pode oferecer um melhor controlo no espaço de preparação das reacções de PCR-. Para a pós-pré-amplificação, executar todo o processo sobre plástico com papel absorvente para evitar derrames. Este deve ser eliminado como lixo perigoso. Cada área de trabalho deve ter o seu conjunto de pipetadores. A partilha de qualquer equipamento entre as duas áreas deve ser evitada e qualquer equipamento da área “pós” deve ser limpo com agente inactivador de ADN (por exemplo, lixívia a 10% fresca) antes de ser transferido para a área “pré”. Usar pontas novas em cada pipetagem. Usar vestuário diferente nas duas áreas e mudar frequentemente de luvas. Finalmente, ao efectuar o ensaio colocar o controlo do kit e o controlo ambiental (controlo negativo-água em vez de ADN genómico) depois das amostras.
ATENÇÃO
Ao terminar o ensaio, eliminar o material como lixo perigoso e descontaminar o material não descartável com lixívia 10% ou outro agente inactivador de ADN.
A fonte de UV usada para visualizar as bandas do produto PCR emite uma forte luz ultravioleta que pode danificar os olhos e pele. Usar sempre roupas de protecção e óculos bloqueadores de UV ou máscara ao operar com fonte de UV.
O E-Gels contém uma pequena quantidade de brometo de etídeo como marcador de ADN. O brometo de etídeo é um conhecido mutagénio humano. Não abrir as cassetes de gel. Deitar fora todos os componentes, quando usados, de acordo com os regulamentos locais.
COLHEITA DA AMOSTRA
Isolar o ADN com um método validado ou com um kit comercial com esse fim.
Resuspender o ADN em água estéril ou Tris 10 mM, pH 8.0 – 9.0. As amostras não devem ser rehidratadas em soluções com mais de 0.5 EDTA mM ou outros agentes que possam interferir com a PCR.
As amostras de ADN podem ser processadas imediatamente após isolamento ou armazenadas num congelador non-defrosting ou a menos de –20oC por um longo período (um ano ou mais) sem afectar os resultados. O ensaio ThromboType para amostras congeladas (-20°C) diluídas em tampão Tris/EDTA (10 mM Tris, pH 8.0 – 9.0/0.5 mM EDTA) e armazenadas em tubos de rosca com tampa anelar O mostraram uma concordância de 100% com resultados de sequenciação de ADN com essas mesmas amostras. Mais informação sobre a estabilidade das amostras quando congeladas está disponibilizada pelos dois produtores de kits de isolamento de ADN, (sítios da Gentra Systems e QIAgen ).
As amostras de ADN devem estar entre 10 – 200 ng/μL, com uma razão de 260 nm/280 nm entre 1.60 e 1.90.
A presença de excesso de proteína contaminante ou ARN, heparina, EDTA ou outros agentes pode interferir com a amplificação PCR do ADN purificado.
PROCEDIMENTO
NOTA: Os frascos podem conter mais reagente do que o descrito nas etiquetas. Assegure-se da correcta medição dos reagentes
através da utilização de um dispositivo apropriado, quando fizer as diluições.
Material fornecido
Armazenamento a 2-8°C
1. Oito sacos resseláveis, cada um contendo
Uma tira de 8 Tubos de Amplificação (púrpura) para os alelos a de HPA-1, 2, 3, 4, 5, 6, 15
Uma tira de 8 Tubos de Amplificação (verde) ) para os alelos b de HPA-1, 2, 3, 4, 5, 6, 15 2. 4 x 450 L 2X Reagente PCR
Ensaio ThromboType 4 303481.IFUPT REV E FS 4. 3 x seladores
Armazenamento a 15-25°C
1. 3 x 4% E-Gel48
Material Adicional Necessário
Para a reacção de PCR
Taq Polimerase, nativa ou recombinante, 5U/μL. Não usar outras polimerases termoestáveis ou preparações de taq polimerase “hot start”.
Termociclador programável com bloqueio para tubos PCR de 0.2 mL. Protectors de silicone
Micropipetas ajustáveis a volumes 1 – 1,000 µL estéreis e pontas descartáveis. Água livre de ADN e ADN-ase
Banho de gelo ou blocos frios para tubos de 0.6 mL ou 1.5 mL e tubos PCR de 0.2 mL PCR Suporte de tubos PCR (0.2 mL)
Vórtex
Tubos de microcentrifugação cónicos de polipropileno com fecho de pressão (0.5 - 1.7 mL), livres de ADN e ADN-ase Lixívia a 10% ou outro agente inactivador de ADN
Para a Electroforese e Análise
E-Base Motherbase
Suporte de tubos PCR (0.2 mL)
Micropipetas ajustáveis a volumes 1 – 20 µL estéreis e pontas descartáveis. Papel absorvente
Fonte de UV
Lixívia a 10% ou outro agente inactivador de ADN Água desionizada ou destilada
Sistema de documentação de gel
Opcional
Micropipetas ajustáveis a volumes 5 µL e 10 µL estéreis e pontas descartáveis. Pipeta electrónica ou pipeta com capacidade de dispensar 25 µL e pontas estéreis
Procedimento do Teste
Início
1. Isolar o ADN genómico de todas as amostras a serem testadas. Cada amostra deve ter uma concentração de ADN na gama dos 10 – 200 ng/µL e uma razão A260 nm/A280 nm entre1.60 e 1.90.
2. Programar um termociclador com o programa de PCR do ensaio ThromboType. O programa é o seguinte:
94oC 30 segundos 94oC 1 segundo 57oC 30 segundos 6 ciclos 72oC 10 segundos 94oC 1 segundo 65oC 30 segundos 27 ciclos 72oC 10 segundos 72oC 12 segundos 4oC Manter
NOTA: Este programa de ciclos foi desenvolvido no ABI PE9700 a correr em Max mode. Devido às diferenças entre termocicladores cada instrumento tem de ser validado amplificando amostras conhecidas para estabelecer a performance. Se as bandas forem fracas aumentar o tempo dos tempos de annealing em aumentos de 1 seg até um máximo de 35 seg, até que o produto seja aceitável. Se aparecerem bandas arrastada,s fracas ou bandas de primer diméricas, reduzir ambos os tempos de annealing em 1 seg. até um mínimo de 25 seg, até que estas deixem de aparecer.
PCR
3. Ligar o termociclador previamente para que as temperaturas requeridas sejam atingidas. Verificar o programa de ciclos para assegurar que não foi alterado.
4. Manter a Taq polimerase e o 2X Reagente PCR em gelo ou em bloco frio.
5. Preparar as superfícies de trabalho antes de usar limpando-as com lixívia 10% ou outro agente inactivador de ADN.
6. Determinar o número de amostras a testar. Marcar um tubo de microcentrifugação de polipropileno de 0.6 mL ou 1.5 mL de fecho em mola para cada amostra. Marcar um tubo de microcentrifugação adicional para o controlo negativo. Estes serão usados para preparar os master mixes. Colocar em gelo ou num bloco frio.
7. Estabelecer um mapa com a sequência dos tudos de PCR mostrando as posições de cada tubo para cada amostra.
8. Para cada amostra a ensaiar seleccionar um saco de tubos de PCR carregados com primer. Cada amostra necessitará de uma tira a (púrpura) e uma tira b (verde). Colocar estas tiras num bloco de PCR frio ou em gelo com os tubos a em cima dos tubos b para cada amostra e tubos vazios (marcados com os pontos pretos) para a direita. Estes tubos serão então orientados (da esquerda para a direita) HPA 1,2,3,4,5,6,15 e um tubo vazio.
9. Usar a Coluna B da Tabela 1 para preparar a diluição de trabalho da Taq polimerase (concentração final de 0.5 U/L) num tubo de microcentrifugação de 0.6 mL ou1.5 mL. Usar água livre de ADN para diluir a enzima. Manter a Taq diluída no gelo ou em bloco frio.
Diluição da Taq polimerase
A B
# Amostras Taq diluída
1 2.4 L Taq 21.6 L água 24 L 2 4.4 L Taq 39.6 L água 44 L 3 6.0 L Taq 54.0 L água 60 L 4 8.0 L Taq 72.0 L água 80 L 5 9.8 L Taq 88.2 L água 98 L 6 11.5 L Taq 103.5 L água 115 L 7 13.5 L Taq 121.5 L água 135 L 8 15.0 L Taq 135.0 L água 150 L
10. Marcar um tubo de microcentrifugação (0.6 mL ou 1.5 mL) para cada amostra a ser testada e um para o controlo negativo. Estes são os tubos master mix.
11. Preparar um master mix para cada amostra usando os cálculos da Tabela 2. Contudo, se as concentrações de ADN estiverem entre os 20 ng/µL e 100 ng/μL pode ser utilizado o método mais simples descrito na Tabela 3.
O utilizador pode desenvolver um protocolo alternativo desde que a mix de amplificação permita dispensar por tubo PCR:
12.5 μL 2X Reagente PCR 0.5 Unit Taq polimerase
40 – 200 ng AND genómico humano
Água livre de ADN a um volume final de 25 µL Usar a Tabela 2 como guia.
Ensaio ThromboType 6 303481.IFUPT REV E Preparação das Master Mixes das Amostras
16 tubos PCR X 25 µL = 400 µL Volume de ADN (a)= 16 X 100 ng/tubo ÷ ADN conc(ng/µL).* Volume de água Taq polimerase @ 0.5U/µL 2X Reagente PCR Volume Total de Master Mix 400 µL 1600 ng ÷ ADN
conc (ng/µL) = (a)µL + 184 µL – (a) + 16 µL + 200 µL = 400 µL
*A gama de concentração de ADN é 10 – 200 ng/µL
Preparação Simplificada das Master Mixes
Volume de Água 2X Reagente PCR Taq Polimerase
(0.5 U/µL) Amostra de ADN
Volume Total de Master Mix 152 μL 200 μL 16 μL 32 μL 400 μL
12. Preparar um controlo negativo master mix combinando 25 L de 2X Reagente PCR, 2 L de Taq polimerase, e 23 L de água livre de ADN.
13. Fechar todos os tubos master mix e misturar no vórtex durante 3 – 5 segundos cada. 14. Remover e eliminar as tampas nas tiras dos tubos PCR.
15. Pipetar, para cada amostra, 25 μL da master mix correspondente para cada um dos primeiros 7 tubos de PCR da tira a (púrpura) e da tira b (verde). Deixar o tubo 8 de cada tira vazio.
16. Pipetar 25 μL do master mix do controlo negativo para UM dos tubos PCR vazios de qualquer tira. 17. Cobrir todos os tubos com um selador adequado aos tubos PCR.
18. Examinar os tubos de PCR após selados. Remover quaisquer bolhas no fundo dos tubos PCR. Quaisquer gotas remanescentes devem ser diluídas no volume de reacção o que pode ser feito batendo com os tubos na bancada ou com uma breve centrifugação numa centrifuga de placas.
NOTA: É fundamental que não haja bolhas na base dos tubos PCR e que não existam quaisquer gotículas nas paredes dos tubos de
PCR. A existência destas pode resultar na perda de amplificação específica de alelo.
19. Iniciar o programa ensaio ThromboType no termociclador. Assim que o bloco atingir os 70oC, parar o programa. Transferir os tubos do gelo ou bloco frio para o termociclador e colocar uma ou mais tiras de tubos PCR vazios no bloco oposto aos tubos do ensaio.
20. Colocar um amortecedor de silicone sobre o selador para cobrir cada tubo; assegurar o alinhamento correcto do amortecedor e a sua manutenção com o termociclador aquecido.
NOTA: É importante manter a pressão no selador dos tubos de PCR para evitar fugas durante os passos de altas temperaturas no
programa. Para o conseguir, devem ser colocados tubos de PCR vazios extra no bloco à volta dos tubos do ensaio de forma a que a tampa aquecida esteja suportada em todas as extremidades quando está fechada. O amortecedor de silicone ajuda a manter a pressão adequada e compensa pequenas variações no peso dos tubos de PCR.
21. Resumir o programa de ciclos. O programa leva ~ 55 minutos.
22. Quando o termociclador atingir o ultimo passo do programa (a manutenção a 4oC), remover os tubos do termociclador e transferi-los para um suporte de tubos de PCR. Se a electroforese não for feita imediatamente, armazenar os tubos no frigorífico (2 a 8oC) até 3 dias ou no congelador a menos de –20o
C até 7 dias.
Detecção
NOTA: Os passos de detecção têm de ser efectuados numa área separada da utilizada como área de pré-PCR. Os dispositivos não
devem ser partilhados entre estas áreas para evitar contaminações.
23. Preparar a área de trabalho com papel absorvente e instalar o E-Base Motherbase, água desionizada, 100 bp ADN , e pipetadores neste local.
NOTA: O procedimento a seguir descreve a detecção num único E-Gel que pode comportar até 3 amostras. Se tiverem sido
amplificadas mais de 3 amostras, os produtos necessitarão de correr mais geis para a detecção.
25. Remover o E-Gel da sua embalagem e remover os pentes. Se necessário, limpar a placa superior com um pano do laboratório húmido. Marcar com um marcador.
26. Transferir o gel para baixo dos dois eléctrodos na E-Base Motherbase e instalar o gel de maneira que os seus eléctrodos façam contacto com os eléctrodos do dispositivo.
27. Pipetar 10 L de água desionizada para cada poço necessário para um produto PCR (14 poços para cada amostra mais um para o controlo negativo). Não adicionar água aos 4 poços exteriores (marcados M) para o 100 bp ADN.
28. Para cada amostra, furar o selador de cada tubo de PCR com a ponta da pipeta nova. Pipetar 5 μL de cada produto do poço apropriado do gel. Não furar o selador de um tubo de PCR até o produto estar pronto a ser transferidos para um gel.
NOTA: Uma pipeta multi-canal de pequeno volume torna mais rápido o carregamento das amostras e diminui a possibilidade de
erro no carregamento.
NOTA: Para cada amostra, pipetar as amplificações a e b em poços adjacentes no gel ajuda na interpretação dos resultados.
29. Furar o selador do controlo negativo e pipetar 5 μL do produto para o respectivo poço.
30. Pipetar 15 L de 100 bp ADN em cada um dos quatro poços exteriores (marcados M) reservados para a ladder ou marcador de peso molecular.
NOTA: Se apenas se processar uma amostra o 100 bp ADN Ladder ou marcador de peso molecular não necessita de ser pipetado
em todos os 4 poços do canto. Contudo, quaisquer amostras corridas no gel devem sempre ser limitadas por linhas contendo o marcador de peso molecular de 100 bp ADN Ladder para que as bandas dos produtos de PCR possam ser determinadas com rigor.
31. Ligar a Motherbase. Aparecerá uma luz vermelha e o contador iluminar-se-á. Usar o botão de energia (direita) para ligar o mode EG (em vez do mode EP).
32. Usar o botão da esquerda e selecionar o cronómetro para 17 minutos.
NOTA: Pode-se obter uma separação adequada de bandas fazendo correr o gel durante 15 minutos. Contudo, a separação das
bandas é melhorada se for de 17-20 minutos. Não correr por mais de 20 minutos.
33. Pressionar o botão de energia (direita) para iniciar a electroforese. A luz vermelha passará a verde durante o processo.
34. No final da electroforese a luz verde passará a uma luz vermelha intermitente e soará um alarme. Pressionar o botão de energia para parar o processo. A luz vermelha intermitente ficará fixa. Desligar o dispositivo e remover o gel da Motherbase.
35. Levar o gel para a fonte UV para observar as bandas produto. O gel deve ser visto e registado em vinte minutos. Se se desejar um registo do ensaio deve ser tirada uma fotografia do gel usando um sistema de documentação de géis.
CONTROLO DE QUALIDADE
O controlo interno produz um produto de 85 bp se a reacção PCR for carregada com ADN humano amplificável de 40 ng ou mais . Esta banda deve aparecer em todas as linhas para qualquer amplificação excepto o controlo negativo. Contudo, a amplificação
específica de alelo compete com o controlo PCR interno; o produto do controlo interno pode ser ténue ou ausente em todas as
linhas positivas para um alelo. Assim, a ausência da banda de controlo interno de uma linha na qual aparece uma banda específica de alelo não é motivo de preocupação. Contudo, se se tiver colocado ADN num tubo PCR e não se observarem bandas controlo ou específicas de alelo na sua linha, há forte possibilidade de falha na amplificação. Tais falhas podem ser resultado da deterioração de um reagente, de um termociclador incorrectamente programado, amostra de ADN fracamente purificada, quantidade insuficiente de amostra de ADN na reacção de PCR, ou falha ao colocar um reagente durante a preparação do PCR. Para estas amplificações os resultados são inválidos. Estas amostras devem ser testadas novamente, de preferência com ADN fresco.
O marcador de peso molecular 100 bp ADN Ladder é um indicador de tamanho objectivo para as bandas de produtos PCR; os poços com o 100 bp ADN Ladder devem ser incluídos em todas as electroforeses. As bandas do 100 bp ADN Ladder devem aparecer nítidas e bem separadas. Qualquer ensaio em que estas bandas apareçam esbatidas ou comprimidas umas nas outras deve ser repetido. Os resultados não devem ser reportados.
As bandas de dímeros de primers podem-se formar com certas amostra de ADN e termocicladores. Estas bandas de menos de 85 bp não afectam a tipagem com o ensaio ThromboType1. Se as bandas dos dímeros de primers forem uma preocupação, os
Ensaio ThromboType 8 303481.IFUPT REV E
A linha controlo negativo (água) não deve ter nenhuma banda de produto PCR, específica de alelo ou controlo interno. A presença de quaisquer linhas de produtos PCR específicos nas linhas controlo negativo é indicativa de um erro técnico ou reagente
contaminado. Os resultados são inválidos e o ensaio deve ser repetido. Os resultados não devem ser reportados.
INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
A presença de uma banda específica de tamanho correcto numa linha é um resultado positivo para esse alelo. Referir à lista de tamanhos dos produtos de PCR específicos de alelo estão indicados em baixo e à lista dos artefactos PCR observados para o ensaio ThromboType (p. 8). A ausência de uma banda de produto específico de alelo de uma linha indica a ausência desse alelo da amostra (resultado negativo). A banda controlo interno está presente como indicação de uma amplificação bem sucedida. Um produto PCR sem a banda controlo e sem a banda específica de alelo indica falha na amplificação. A amostra tem de ser testada novamente para esse alelo.
Produto Tamanho do Produto PCR (bp)
HPA-1 124 HPA-2 153 HPA-3 260 HPA-4 178 HPA-5 228 HPA-6 135 HPA-15 (Gov) 117 Controlo 85
Notar que para todos os sistemas HPA as amplificações a e b de uma amostra produzem relativamente a mesma quantidade de produto PCR se o alelo estiver presente. As amostras heterozigóticas devem produzir bandas de produto a e b de intensidade semelhante para os todos os sete sistemas HPA tipados por este ensaio. Uma amostra na qual uma banda produto específica de alelo é fraca comparada com outra banda específica de alelo para um sistema provavelmente não é heterozigótica. A banda fraca é provavelmente devida a um erro técnico ou “read-through”. “Read-through” é uma amplificação de baixo nível pelos primers específicos de alelo de uma amostra de ADN sem esse alelo. Tais amostras devem ser novamente ensaiadas usando uma quantidade menor de ADN. Após o reensaio o aparecimento, no tubo em questão, de uma banda de intensidade semelhante à do alelo alternado indica um resultado positivo para a reacção em questão e a amostra deve ser tipada como positiva para o alelo , um verdadeiro heterozigótico. Este resultado sugere um erro técnico como causa do resultado originalmente suspeito. O aparecimento de uma banda fraca após o reensaio indica um verdadeiro “read-through” ou falso positivo; a amostra deve ser classificada como negativa para aquela alelo.
LIMITAÇÕES
O ensaio ThromboType contém material para a amplificação de sequências em ADN genómico pela reacção de amplificação em cadeia pela polimerase e a subsequente detecção qualitativa de sequências de HPA 1 - 6 e 15 (Gov) específicas de alelo por electroforese em gel de agarose. Variações desconhecidas nas sequências génicas relevantes podem afectar negativamente os resultados.
Para assegurar os melhores resultados com o ensaio ThromboType, as amostras de ADN devem ter uma concentração entre 10 ng/L e 200 ng/µL com uma razão de A260/A280 de 1.60 – 1.90. Uma fraca amplificação pode ser resultado da adição de uma quantidade insuficiente de ADN à reacção PCR, ou de amostra de ADN fracamente purificada.
Os resultados falso negativos podem ser consequência de amostras manuseadas inadequadamente, erros de procedimento, inibidores da amplificação, ou ADN genómico não adequado como amostra.
A contaminação na transferência de ácidos nucleicos, excesso de AND genómico nas amplificações, ou a não utilização das temperaturas indicadas pode originar resultados falso positivos.
Este ensaio foi desenvolvido com ADN humano adulto. Não foi validado para amostras pré-natais.
Este ensaio demonstrou uma correcta performance quando executado em termocicladores ABI PE9700, 9600, e 2720 e o MJ Research (agora BioRad) ou Mini-termociclador com tampa aquecida e o Mastercycler EP da Eppendorf. Para utilização do ensaio noutros termocicladores pode ser necessário ajustar alguns dos parâmetros de ciclos. Os termocicladores devem ser calibrados e mantidos de acordo com as instruções do fabricante.
Rigor
O rigor do ensaio ThromboType foi estabelecido por dois estudos comparativos diferentes:
Comparação entre ensaio ThromboType e um ensaio de tipagem molecular
Foram genotipadas trinta e seis amostras cobrindo uma vasta gama de alelos com o ensaio ThromboType para HPA – 1a/b, HPA – 2a/b, HPA – 3a/b, HPA – 4a/b, HPA – 5a/b, HPA – 6a/b, e HPA 15a/b. As amostras também foram testadas por outro ensaio de tipagem molecular numa avaliação externa independente. Obtiveram-se catorze resultados para cada amostra (504 resultados totais). Uma única amostra rara foi tipada apenas no sistema HPA – 6 a/b. A análise dos 506 resultados mostrou uma concordância de 99.8% entre os dois métodos.
Comparação dos resultados ensaio ThromboTypecom sequenciação de ADN
Foram testadas quarenta e seis amostras com o ensaio ThromboType cobrindo uma vasta gama de alelos. Também foi efectuada sequenciação de AND para o genotipo HPA – 1a/b, HPA – 2a/b, HPA – 3a/b, HPA – 4 a/b, HPA – 5a/b, HPA – 6a/b, e HPA – 15a/b das amostras. Os resultados do ensaio ThromboType mostraram uma concordância de 100% com os resultados obtidos pela sequenciação de ADN.
Precisão do Ensaio
Foi determinada a reprodutibilidade do ensaio ThromboType. Foram testadas três amostras em duplicado representando uma gama de alelos com o ensaio ThromboType em nove dias separados. Os resultados mostraram uma concordância de100% entre os duplicados e os resultados diários.
Artefactos observados na PCR
1. As misturas de reacção HPA-3 (3a ou 3b) podem gerar uma banda arrastada (smear) de fragmentos de ADN não específicos. O tamanho deste „smear“ varia de cerca de 300 bp a maior. Se aparecer num tubo que gerou uma banda específica de alelo fraca o esfregaço parece crescer para fora da banda específica do alelo. Ocasionalmente aparece uma banda difusa de >500 bp em vez do esfregaço, ou pode ser visualizado no esfregaço. Estes artefactos não mostraram ter qualquer efeito no aparecimento ou ausência do produto PCR específico de alelo, e portanto não têm efeito na tipagem.
2. As misturas reacionais de HPA-3 podem gerar um artefacto de PCR fraco, com aproximadamente 165 bp de comprimento. Muitas vezes isso aparece conjuntamente com o esfregaço de amplificações de alelos negativos descritos em 1.
3. As misturas de reacção HPA-5 podem gerar uma banda dupla em vez de uma banda singular a partir de uma amostra positiva para o alelo a partir dos tubos de primers 5a e 5b. A banda dupla não tem efeito na tipagem. Se uma amostra for negativa para o alelo a reacção não produzirá nenhuma das bandas.
4. São frequentemente observados dímeros de primers e primers não incorporados. São bandas de baixo peso molecular, frequentemente mal focadas, mais pequenas que o produto de controlo interno de 85 bp. Devem ser ignoradas.
5. Bandas readthrough – bandas específicas de alelo fracas da amplificação de uma amostra negativa para o alelo – podem ser observadas especialmente com cargas de ADN elevadas.
1. Williamson LM, et. al.; “The Natural History of Fetomaternal Alloimmunization to the Platelet-specific Antigen HPA-1a (PLA1
, Zwa) as Determined by Antenatal Screening”; Blood 1998, vol. 92: 2280 – 2287
2. Davornen A, et. al.; “Human Platelet Antigen-specific Alloantibodies Implicated in 1162 Cases of neonatal alloimmune thrombocytopenia”; Transfusion 2004, vol 44: 1220 – 1225
3. Newman PJ, et. al.; J Clin Invest 1989; vol. 83(5):1778-81 4. Kuijpers JW, et. al.; J Clin Invest 1992; vol. 89(2):381-4 5. Lyman S, et. al.; Blood 1990; vol. 75(12):2343-8 6. Wang R, et. al.; J Clin Invest 1992; vol. 90(5):2038-43 7. Santoso S, et. al.; J Clin Invest 1993; vol. 92(5):2427-32 8. Wang R, et. al.; Blood 1993; vol. 82(11):3386-91 9. Schuh AC, et. al.; Blood 2002; vol. 99(5):1692-8 10. Skogen B, et. al.; Transfusion 1994; vol. 34:955-960
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REFERÊNCIAS
