Paulo Cesar de Campos Barbosa
Aplicações de Fluorescência Induzida por Laser em
Monitoramento Ambiental
Tese de Doutorado Tese apresentada como requisito parcial para obtenção do título de Doutor pelo Programa de Pós-Graduação em Física da PUC-Rio.
Orientador: Raul Almeida Nunes
Rio de Janeiro, julho de 2003
Paulo Cesar de Campos Barbosa
Aplicações de Fluorescência Induzida por Laser em
Monitoramento Ambiental
Tese apresentada como requisito parcial para obtenção do título de Doutor pelo Programa de Pós-Graduação em Física da PUC-Rio. Aprovada pela Comissão Examinadora abaixo assinada.
Prof. Raul Almeida Nunes Orientador Departamento de Ciências dos Materiais e Metalurgia - PUC-Rio Dra. Heloísa Vargas Borges IBAMA Prof. Isabel Cristina dos Santos Carvalho Departamento de Física - PUC-Rio Dr. José Antônio Moreira Lima Petrobras Profa. Margareth Simões Penello Meirelles UERJ Prof. Rodolfo Pinheiro da Rocha Paranhos UFRJ
Prof. Ney Augusto Dumont Coordenador Setorial do Centro Técnico Científico - PUC-Rio Rio de Janeiro, 13 de agosto de 2003
Todos os direitos reservados. É proibida a reprodução total ou parcial do trabalho sem autorização da universidade, do autor e do orientador.
Paulo Cesar de Campos Barbosa Graduado em Física pela PUC-Rio em 1997, mestre em Física pela PUC-Rio em 1999. Analista de sistemas do Centro de Pesquisas da Petrobras, trabalha com automação de laboratórios e outros desenvolvimentos de sistemas.
Ficha Catalográfica Barbosa, Paulo Cesar de Campos
Aplicações de fluorescência Induzida por laser em monitoramento ambiental / Paulo Cesar de Campos Barbosa; orientador: Raul Almeida Nunes. – Rio de Janeiro : PUC, Departamento de Física, 2003.
[19], 120 f. : il. ; 30 cm
Tese (doutorado) – Pontifícia Universidade Católica do Rio de Janeiro, Departamento de Física.
Inclui referências bibliográficas.
1. Física – Teses. 2. Fluorescência. 3. Laser. 4. Fitoplâncton. 5. Meio ambiente. 6. Clorofila. 7. Lidar. 8. Sensoriamento remoto. I. Nunes, Raul Almeida. II. Pontifícia Universidade Católica do Rio de Janeiro. Departamento de Física.
CDD: 530
À Silvia, pelo apoio e a Felipe e Ana Clara, pela inspiração. A minha mãe, pela força. A meu pai, pelo exemplo.
Agradecimentos
Ao Rodolfo Paranhos, pelo apoio imprescindível. À Eliane Gonzales pela abertura para cooperação. À Cristina Bentz, pela pronta e prestimosa cooperação.
Ao Flávio, Délio, Fernando José e demais colegas do Cenpes, pelo apoio descompromissado.
À Capes, à Petrobras e à PUC-Rio, pelos auxílios concedidos, sem os quais este trabalho não poderia ter sido realizado. Ao programa RHAE-MCT, ao IEAPM e à FEEMA que também apoiaram esta iniciativa.
A todos os professores e funcionários da PUC-Rio com os quais interagi, em particular ao Marcos Henrique, pela ajuda e pelo conhecimento disponibilizado.
Ao Raul, especialmente, pelo exemplo, pela capacidade de compreender, pela sensibilidade ao distender e pressionar nas horas certas, pelo engajamento às boas causas e, sobretudo, pelo privilégio do convívio e da amizade. E pelo excelente café...
Resumo
Barbosa, Paulo Cesar. Aplicações de Fluorescência Induzida por Laser em Monitoramento Ambiental. Rio de Janeiro, 2003. 139p. Tese de Doutorado – Departamento de Física, Pontifícia Universidade Católica do Rio de Janeiro.
A tomada de consciência dos riscos ambientais em escala global e o desenvolvimento científico e tecnológico têm incrementado a demanda pelo sensoriamento das condições ambientais marítimas.
A distribuição da população do fitoplâncton é o indicador mais utilizado para avaliar a qualidade e a biomassa de ambientes marinhos. Uma característica diferencial do fitoplâncton é a presença da clorofila a, que apresenta fluorescência in vivo na região do vermelho do espectro visível, e que permite o uso de técnicas de sensoriamento remoto para sua detecção.
Um radar-laser baseado na detecção da fluorescência do alvo é mais comumente denominado LIF-LIDAR (Laser Induced Fluorescence - LIght Detection And Ranging) e se constitui em uma ferramenta útil para o monitoramento da distribuição de clorofila a nos oceanos, principalmente quando se utiliza uma radiação laser na faixa de comprimento de onda associada à cor verde.
O LIDAR-PUC, cuja fonte de excitação é o 2º harmônico de um laser de Nd-YAG, foi ajustado para a detecção e discriminação espectral de emissões inelásticas decorrentes da excitação a 532nm; em especial, a fluorescência da clorofila a.
Nesta tese foram desenvolvidos algoritmos para a extração de parâmetros de interesse ambiental, em especial a concentração relativa da clorofila a. Estas metodologias foram testadas quanto a sua repetitividade, linearidade e aplicabilidade em ambiente real. Finalmente, os valores calculados foram analisados em conjunto, indicando sua utilidade para o monitoramento efetivo de ambientes marinhos.
Palavras-chave
Fluorescência; laser; sensoriamento remoto; LIDAR; clorofila; meio ambiente; fitoplâncton; LIF
Abstract
Barbosa, Paulo Cesar. Applications of Laser Induced Fluorescence to Environmental Monitoring. Rio de Janeiro, 2003. 139p. PhD Thesis - Departamento de Física, Pontifícia Universidade Católica do Rio de Janeiro.
Global scale environmental risks and scientific and technological development have increased demands on marine environment monitoring.
Phytoplankton distribution is the most frequently used marker employed to assess biomass in marine environment. Analysis of chlorophyll-a plays a central role on phytoplankton studies once this pigment, present in every phytoplankton algae species, exhibits fluorescence in the red region of visible spectrum, thus allowing its detection by remote sensing techniques.
A radar-laser based on fluorescence detection, usually called a LIF-LIDAR (Laser Induced Fluorescence - LIght Detection And Ranging), is a valuable tool for monitoring chlorophyll-a distribution in ocean waters, especially when green light lasers are employed.
LIDAR-PUC was settled to function with its second harmonic Nd-YAG laser as excitation source. The equipment was adjusted for detection and spectral discrimination of inelastic emissions resulting from excitation at 532nm, with special attention to chlorophyll a fluorescence.
In this study, algorithms were developed for the extraction of environmental parameters such as relative chlorophyll a concentration. These algorithms were analyzed regarding the following aspects: repeatability, linearity and applicability to the real world. Finally, ensembles were analyzed, pointing to their usefulness for effective marine environment monitoring.
Palavras-chave
Fluorescence; laser; remote sensing; LIDAR; chlorophyll; environment; phytoplankton; LIF
Sumário
1 Introdução 20 2 Objetivos 27 3 Aspectos Teóricos 29 3.1. Espalhamentos Inelásticos 29 3.1.1. Fluorescência 29 3.1.2. Espalhamento Raman 36 3.2. Fotossíntese 403.3. Normalização de sinal de fluorescência pelo espalhamento Raman da
água 46 4 Materiais e Métodos 50 4.1. LIDAR-PUC 50 4.2. Configuração e montagem 53 4.2.1. Medidas Embarcadas 56 4.2.2. Medidas em laboratório 57
4.3. Medidas com fluorímetro e espectrofotômetro 58
4.4. Extração das bandas de interesse 59
4.5. Estatística Espacial 62
4.5.1. Semivariograma 62
4.5.2. Kriging 63
4.5.3. Coeficiente de correlação e coeficiente de correlação localizado 65
4.6. Fator de ajuste para equação linear 65
4.7. Desconvolução de espectros 66
5 Experimentos 71
5.1. Variação da posição do pico do espalhamento Raman com a
Temperatura 71
5.2. Estudo de replicatas 74 5.3. Avaliação da correlação entre concentrações relativa e absoluta de
clorofila a 75
5.3.1. Avaliação de linearidade das concentrações relativa e absoluta de
Clorofila a em águas costeiras 75
5.3.2. Medidas sobre culturas de algas 76
5.3.3. Estudo de mesocosmo – simulação da Baía de Guanabara 80 5.3.4. Medidas temporais de águas de uma mesma localidade 83 5.3.5. Comparação entre medidas in situ e amostras testemunho 86
5.4. Mapas Sinóticos 88
5.4.1. Região do entorno da plataforma de Pargo 90 5.4.2. Região do emissário da estação de tratamento de efluentes de
Cabiúnas 97
5.4.3. Região do emissário submarino de Ipanema 108
5.4.4. Região de alto mar, Bacia de Campos 114
6 Discussão e Conclusões 125
7 Referências Bibliográficas 133
Abreviações
[Cl-abs] – Concentração absoluta de clorofila a [Cl-rel] – Concentração relativa de clorofila a DPR% – Desvio Padrão Relativo percentual
IEAPM – Instituto de Estudos Oceanográficos Almirante Paulo Moreira LIDAR – LIght Detection And Ranging
LIF – Laser Induced Fluorescence MOD – Matéria Orgânica Dissolvida.
UTM – Sistema de coordenadas Universal Transverse Mercator.
Lista de figuras
Figura 1 - A função de onda vibracional no estado eletrônico excitado com maior coincidência com a função de onda vibracional anterior, no estado fundamental, terá maior probabilidade de ocorrer. 30 Figura 2 - Esquema de excitação e decaimento dos elétrons. Os níveis excitados à esquerda exemplificam estados singletos. O nível eletrônico excitado da
direita representa um tripleto. 32
Figura 3 - Possibilidades de composição de spins para um par de elétrons 32 Figura 4 - Espectro de fluorescência de água costeira medido pelo LIDAR-PUC. O pico da emissão Raman está em 651nm (excitação em 532nm). 37 Figura 5 - Esquema dos espalhamentos Rayleigh (elástico) e Raman(inelástico). 40 Figura 6 - Cloroplasto. Os tilacóides são os filamentos observados, em geral
agrupados nos grana. 41
Figura 7 - Espectros de absorção de diferentes pigmentos presentes nas membranas tilacóides, comparados com o espectro da luz do sol que atinge a
superfície da Terra 43
Figura 8 - Esquema da disposição das estruturas moleculares nas membranas
tilacóides. 44
Figura 9 - Diagrama do LIDAR: (1) Oscilador dos pulsos de strobe, (2) sistema de controle do CCD, (3) Câmera CCD, (4) Conjunto de lentes, (5) intensificador de imagem, (6) monocromador, (7) cabo de fibra óptica, (8) filtro, (9) telescópio, (10) Espelho rotativo, (11) filtro, (12) gerador de 3o harmônico, (13) dobrador de freqüência, (14) laser, (15) sistema de refrigeração, (16) fonte de alimentação do laser, (17) eletrônica de controle do LIDAR, (18)
Computador. 51
Figura 10 - Linha superior: Controle da lâmpada; linha do meio: controle do Q-switch; linha inferior: controle do intensificador de imagens. Os valores embaixo de cada coluna especificam a duração de cada intervalo de tempo.53
Figura 11 – Espectros dos leds de calibração 55
Figura 12 - Esquema de instalação do LIDAR no navio Astro-Garoupa 56
Figura 13 - Esquema de funcionamento do LIDAR em laboratório 57 Figura 14 - As linhas verdes representam a configuração coaxial e as linhas azuis
a configuração não-coaxial. 58
Figura 15 - Ajuste de uma curva gaussiana à banda do espalhamento Raman para
águas oceânicas (oligotróficas). 60
Figura 16 - Faixas de interesse das bandas de clorofila a e MOD após a subtração
da emissão Raman. 60
Figura 17 – Composição do espectro do LIDAR para águas costeiras. 61 Figura 18 – Curva de transmissão do filtro QC13, utilizado para impedir que a radiação do 2º harmônico do laser de Nd-YAG atinja o detector. 69 Figura 19 – Espectro do LIDAR, com presença da radiação do laser retroespalhada elasticamente (área em destaque). O pico do laser foi utilizado como função de transferência do sistema de detecção. 69 Figura 20 – Espectro original, espectro corrigido pela distorção do filtro QC13 e
espectro desconvoluído e corrigido. 70
Figura 21 – Sobreposição dos picos de espalhamento Raman de monômeros e polímeros da água. A salinidade e a temperatura interferem na formação das pontes de hidrogênio que afetarão os modos vibracionais da molécula de água, alterando a relação entre os dois picos. 72 Figura 22 - Relação entre a temperatura e a posição do pico da gaussiana ajustada
à banda do espalhamento Raman. 74
Figura 23 - Ajuste linear entre concentração clorofila a x concentração relativa de
clorofila a 76
Figura 24 - Ajuste linear para as relações entre concentração relativa e concentração absoluta de clorofila a para as diferentes culturas de algas. 78 Figura 25 - Bandas de clorofila a com gaussiana ajustada. A área preenchida é a utilizada na integração da contribuição da clorofila a no espectro de
fluorescência. 80
Figura 26 - relação da clorofila a relativa, obtida com o LIDAR e clorofila a absoluta (método fluorimétrico). Os pontos azuis indicam medidas realizadas no 1º dia, vermelho no 3º dia, amarelo no 5o dia, preto no 6º dia e
verde no 7º dia. 81
Figura 27 - Intensidades comparadas entre os dias. Os espectros obtidos em cada
dia foram somados e normalizados pela altura do pico do espalhamento Raman, para comparação. Azul: 1º dia; vermelho: 3º dia; amarelo: 5º dia;
verde: 7º dia. 82
Figura 28 – Variação da temperatura com o tempo. A linha vermelha indica o limite da temperatura para caracterização de águas do tipo ACAS. 85 Figura 29 – Ajuste de curvas para o conjunto de dados de amostras coletadas em um mesmo local. Os conjuntos foram classificados como “anterior” e “posterior” à linha de corte definida na Tabela 4. 85 Figura 30 - Ajuste linear para concentrações absoluta e relativa de clorofila a para
medidas realizadas em alto mar. 87
Figura 31 - Ajuste linear para as concentrações absoluta e relativa para águas
costeiras 88
Figura 32 – Legenda de cores utilizada para os mapas. As cores foram distribuídas entre os valores mínimo e máximo de cada grid. 89 Figura 33 – Mapa da bacia de Campos com as regiões estudas. 1- Entorno da plataforma de Pargo. 2- Próximo à estação de tratamento de efluentes de Cabiúnas, 3- Região superior próxima à foz do rio Paraíba do Sul. 90 Figura 34 - Mapa sinótico gerado por kriging simples - valor máximo: 0,1488;
valor mínimo: 0,0830. 91
Figura 35 - Mapa sinótico de concentração relativa de clorofila a, gerado por kriging ordinário - valor máximo: 0,1559; valor mínimo: 0,0540. 92 Figura 36 – Variação dos valores da concentração relativa de clorofila a interpolada (por kriging ordinário) para diferentes seções no mapa da Figura
35. 93
Figura 37 - Valores da concentração relativa de clorofila a obtidos a partir dos espectros (observado) e valores recalculados, para os mesmos pontos, da concentração relativa clorofila a a partir do modelo gerado por kriging
simples (calculado). 93
Figura 38 –Valores da concentração relativa de clorofila a obtidos a partir dos espectros (observado) e valores recalculados, para os mesmos pontos, da concentração relativa clorofila a a partir do modelo gerado por kriging
ordinário (calculado). 94
Figura 39 - Mapa sinótico de concentração relativa de MOD, gerado por kriging
simples. valor máximo: 0,0439; valor mínimo: 0,0303. 95 Figura 40 - Mapa sinótico de concentração relativa de MOD, gerado por kriging ordinário - valor máximo: 0,0552; valor mínimo: 0,0217. 95 Figura 41 - Coeficiente de correlação entre MOD e clorofila a relativa, localizado.
Raio de definição de proximidade: 550m. 96
Figura 42 - Mapa de distribuição de [Clorofila a] superposto com a informação da correlação localizada entre as concentrações relativas de MOD e clorofila a. Coeficiente de correlação entre clorofila a e MOD de medidas próximas (550m, conforme o círculo). Coeficiente de +correlação: maior que 0,35 (n
- correlacionados),entre 0,35 e –0,35 (n - descorrelacionados) e menor que –0,35 (n - anticorrelacionados). O fundo colorido mostra a variação da
concentração relativa de clorofila a. 97
Figura 43 - Valores observados e calculados de clorofila a relativa utilizando
kriging simples. 98
Figura 44 – Mapa de clorofila a relativa gerado por kriging ordinário. Os transects coloridos indicam a posição das seções utilizadas na Figura 46. 99 Figura 45 - Valores observados e calculados de clorofila a relativa utilizando
kriging ordinário. 100
Figura 46 – Valores interpolados da concentração relativa de clorofila a para os pontos das seções ilustradas na Figura 44. 101 Figura 47 – Valores de concentração relativa de clorofila a interpolada para
seções sobrepostas à trajetória do barco. As barras pretas acompanham a transição para região com menor população fitoplanctônica. 102 Figura 48 - Locais de amostragem de testemunhos. O asterisco mostra a posição do dispersor do emissário da estação de tratamento de efluentes de Cabiúnas.
103 Figura 49 - Relação entre concentração relativa de clorofila a e concentração
absoluta de clorofila a 103
Figura 50 - Mapa de concentração absoluta de clorofila a. A barra à direita mostra a relação entre as cores apresentadas e a concentração de clorofila a 104 Figura 51 – Intensidade do pico do espalhamento Raman para cada uma das
medidas realizadas. 105
Figura 52 - Mapa de distribuição de MOD gerado por kriging ordinário 106
Figura 53 - Mapa de distribuição de [Clorofila a] superposto com a informação da correlação localizada entre as concentrações relativas de MOD e clorofila a. Coeficiente de correlação entre clorofila a e MOD de medidas próximas (1500m, conforme o círculo). Coeficiente de +correlação: maior que 0,35 (n
- correlacionados),entre 0,35 e –0,35 (n - descorrelacionados) e menor que –0,35 (n - anticorrelacionados). O fundo colorido mostra a variação da concentração relativa de clorofila a.Correlação MOD x clorofila a relativa. Os valores dos coeficientes de correlação estão coligidos na Figura 54, com os pontos coloridos como referenciados neste mapa. 107 Figura 54 - Coeficiente de correlação localizada entre concentrações relativas de MOD e clorofila a. Raio de definição de proximidade: 1500m. 108 Figura 55 - Valores observados e calculados de clorofila a relativa utilizando
kriging simples. 109
Figura 56 - Valores observados e calculados de clorofila a relativa utilizando
kriging ordinário 110
Figura 57 - Mapa de clorofila a relativa gerado por kriging ordinário 110 Figura 58 - Mapa de distribuição de [Clorofila a] superposto com a informação da correlação localizada entre as concentrações relativas de MOD e clorofila a. Coeficiente de correlação entre clorofila a e MOD de medidas próximas (550m, conforme o círculo). Coeficiente de +correlação: maior que 0,35 (n
- correlacionados),entre 0,35 e –0,35 (n - descorrelacionados) e menor que –0,35 (n - anticorrelacionados). O fundo colorido mostra a variação da concentração relativa de clorofila a.Correlação MOD x clorofila a relativa. Os valores dos coeficientes de correlação estão coligidos na Figura 59, com os pontos coloridos como referenciados neste mapa. 111 Figura 59 - Coeficiente de correlação localizado entre concentrações relativas de MOD e clorofila a. Raio de definição de proximidade: 550m. 112 Figura 60- Valores observados e calculados de concentração relativa de MOD
utilizando kriging ordinário. 113
Figura 62 – Comparação de espectros. O espectro em vermelho foi obtido na região de maior fluorescência de clorofila (n. 12). O espectro em verde foi obtido nesta campanha em região mais próxima à costa. O espectro em preto é característico de áreas costeiras. O espectro em azul é característico de alto
mar (águas oligotróficas). 114 Figura 63 - Mapa de clorofila a relativa gerado por kriging ordinário 115 Figura 64 - Valores observados e calculados de clorofila a relativa utilizando
kriging ordinário. 116
Figura 65 - Coeficiente de correlação entre MOD e clorofila a relativa, localizado.
Raio de definição de proximidade: 1500m. 117
Figura 66 - Mapa de distribuição de [Clorofila a] superposto com a informação da correlação localizada entre as concentrações relativas de MOD e clorofila a. Coeficiente de correlação entre clorofila a e MOD de medidas próximas (1500m, conforme o círculo). Coeficiente de +correlação: maior que 0,35 (n - correlacionados),entre 0,35 e –0,35 (n - descorrelacionados) e menor que –0,35 (n - anticorrelacionados). O fundo colorido mostra a variação da concentração relativa de clorofila a.Correlação MOD x clorofila a relativa. Os valores dos coeficientes de correlação estão coligidos na Figura 65, com os pontos coloridos como referenciados neste mapa. 117 Figura 67 - Comparação entre concentração relativa de clorofila a e coeficiente de correlação localizado entre concentração relativa de clorofila a e concentração relativa de MOD. As intensidades de concentração estão associadas ao eixo vertical esquerdo (azul) e os coeficientes de correlação estão associados ao eixo direito (preto). O eixo horizontal apresenta a distância entre os locais de medição adjacentes. 118 Figura 68 – Localização dos pontos de amostragem tendo como fundo o mapa da concentração relativa da clorofila a. A altura das hastes representa a intensidade da concentração absoluta de clorofila a. 119 Figura 69 – Comparação entre as médias locais (raio de 2500m) das concentrações relativas de clorofila a (preto) e MOD (azul) 120 Figura 70 – Imagem RADARSAT – modo ScanSAR Narrow A - da região de estudo. As manchas escuras foram ressaltadas. 121 Figura 71 – Mapa de concentração relativa de clorofila a, sobreposto à imagem de radar. A razão de aspecto do mapa foi transformada para a apresentação de pixel quadrado, conforme a imagem de satélite. 122 Figura 72 – Transects nos mapas gerados. 1º mapa: região de Cabiúnas, transect 1; 2º mapa: região da plataforma de Pargo, transect 2; 3º mapa: região de alto
mar, transect 3. 129 Figura 73 – Comparação dos valores calculados da concentração relativa de clorofila a nos transects apresentados na Figura 72. Os transects não estão em escala. O transect 1 tem 14,5km, o transect 2 tem 4,0km e o transect 3 tem 63,8km. Em relação aos mapas, os transects estão com seus pontos aqui
alinhados da esquerda para a direita. 130
Lista de tabelas
Tabela 1 - Concentração de clorofila, em µg/l, da cultura padrão. 77 Tabela 2– Tabela com as equações dos ajustes lineares apresentados na Figura 24,
com seus fatores de ajuste respectivos. 78
Tabela 3– Lista dos coeficientes de correlação entre as concentrações relativas de
MOD e clorofila a. 82
Tabela 4 – Dados comparativos entre concentração relativa e concentração
absoluta de clorofila a. 84
Tabela 5 – Concentração absoluta de clorofila a para as amostra de testemunho 119
Desaprender 8 horas por dia Ensina os princípios.
Manoel de Barros
Os oceanos cobrem mais de 70% da superfície terrestre e, compreensivelmente, têm papel fundamental no equilíbrio ecológico do planeta. As atividades humanas não poupam de interferência qualquer ecossistema e avançam cada vez mais sobre o ambiente marinho. Sob esta pressão histórica e econômica, a sociedade é instada a melhor conhecer e monitorar os mares, tanto para a exploração de suas riquezas quanto para a preservação de seus recursos. A disseminação da compreensão da interligação dos fenômenos naturais em escala global reforça esta necessidade, trazendo à pauta de nossa civilização a busca de estabilidade nas condições ambientais e de equilíbrio na utilização de energia.
A cada ano, 1017 kJoule de energia livre do sol é capturada e utilizada para biossíntese pelos organismos fotossintéticos. Isto é mais de dez vezes o consumo anual mundial de energia gerada por combustível fóssil (mesmo este, produtos de fotossíntese ocorrida a milhões de anos).
As células fotossintetizadoras produzem O2 e carboidratos às expensas de CO2 e H2O produzidos pelas células heterotróficas, que, por sua vez, consomem O2 e carboidratos. Portanto, os organismos heterotróficos e os fotossintetizadores vivem em equilíbrio na biosfera. O ser humano, imerso neste ambiente, depende fundamentalmente de suas interações com os organismos fotossintetizadores para a continuidade de sua sobrevivência. O desenvolvimento de equipamentos e metodologias que quantifiquem a massa orgânica existente, em diferentes escalas, e a sua dinâmica in vivo (controlada pela variação de diversos parâmetros) é requisito básico para a compreensão dos processos de produção natural de energia e equilíbrio ambiental.
Estes processos de quantificação devem se valer dos fenômenos naturais que podem ser diretamente observados no meio físico. A fluorescência é a denominação que se dá ao espalhamento inelástico de luz gerado pelo decaimento de estados excitados para o estado fundamental em intervalo de tempo menor que 10-5s [Skoog & Leary, 1992]. As principais estruturas moleculares que exibem fluorescência são as moléculas com anéis de carbono com ligações duplas. Os
aparatos fotossintéticos presentes tanto nas plantas superiores como no fitoplâncton, incluindo as cianobactérias,contém proteínas diretamente associadas à captura de fótons (pigmentos-antena), que dispõem de anéis de carbono e que apresentam fluorescência. A clorofila a é um desses pigmentos e está presente em todos os seres que executam a fotossíntese [Raven et alli, 1978].
Como o fitoplâncton (incluindo as cianobactérias) é o único material em suspensão nos oceanos que contém clorofila, este pigmento tem sido utilizado como marcador da biomassa fitoplanctônica [Falkowski & Kolber, 1995]. A fluorescência natural da clorofila a, que apresenta um máximo em torno de 685nm, é um parâmetro utilizado para se estimar a quantidade de clorofila a presente em uma determinada amostra.
Apesar de se saber que a razão carbono/clorofila das comunidades fitoplanctônicas naturais é variável, a baixíssima concentração de pigmentos na água do mar faz da fluorescência da clorofila a o sinal mais específico que pode ser convenientemente medido em tempo real (e associado à biomassa), seja in situ ou remotamente [Falkowski & Kolber, 1995], e uma medida padrão para se estimar a biomassa nos oceanos.
Monitorar a fluorescência dos pigmentos para obter informações do sistema fotossintético de produção primária de energia é uma idéia com virtudes: a fluorescência é percebida externamente ao organismo fotossintetizante, podendo ser detectada de maneira não invasiva e não destrutiva; além disso, pode ser detectada à distância, permitindo, assim, o uso de técnicas de sensoriamento remoto. Medidas de fluorescência podem ser realizadas em diferentes escalas, tanto espaciais (de micrômetros a quilômetros) como temporais (de microssegundos a meses).
Medidas em tempo-real são particularmente interessantes para entender as respostas fotossintéticas do fitoplâncton uma vez que essas algas não são fixas no espaço. Relacionar seu movimento com a hidrodinâmica dos oceanos requer medições em escalas temporal e espacial adequadas.
A tomada de consciência dos riscos ambientais em escala global e o desenvolvimento científico e tecnológico têm incrementado a demanda por sensoriamento das condições ambientais de grandes áreas do mar. O impacto dessas pesquisas vão desde a previsão de “marés vermelhas” (ocorrências explosivas de crescimento de algas tóxicas, ingeridas por moluscos que podem
ser, eventualmente, ingeridos pelos homens) que provocam intoxicação em milhares de pessoas todos os anos, até a organização de turismo sustentável nesses ambientes. Os sistemas para sensoriamento remoto desenvolvidos para estes fins estão, geralmente, embarcados em satélites ou aeronaves, mas conjuntos de bóias ou equipamentos instalados em navios também já são utilizados para compor redes de informação ambiental.
Para avaliar remotamente a quantidade de clorofila a presente em reservatórios naturais de água, duas categorias de medições são empregadas: as técnicas passivas e as ativas. Os métodos passivos procuram medir as alterações da radiação eletromagnética proveniente da água, seja ela absorvida ou espalhada (elástica ou inelasticamente), sem fazer incidir sobre o alvo qualquer fonte artificial de radiação, e correlacioná-la à concentração de clorofila. Em óbvia contrapartida, os métodos ativos utilizam um fonte de “excitação” artificial.
O espectro de emissão luminosa natural das massas d’água é afetado por um grande número de fatores físico-químicos. A radiação solar, as condições atmosféricas e a latitude, além da própria composição da matéria orgânica e inorgânica presente são alguns dos principais fatores de interferência. A identificação da assinatura da clorofila a, através de seu espectro de absorção é complexa e nem sempre categórica. Diversos trabalhos foram e estão sendo desenvolvidos para modelar o espectro de emissão natural [CoastLooc Server] para diferentes aplicações, uma vez que esta medida é atualmente a metodologia mais adequada a ser empregada quando utiliza-se equipamentos embarcados em satélites. Em termos gerais, algumas faixas espectrais são convenientemente escolhidas, de acordo com os espectros de absorção da água do mar, da clorofila a e, eventualmente, de algum outro pigmento acessório importante. De acordo com esses espectros, é criado um modelo de irradiação correlacionando as faixas selecionadas e os pigmentos. Então, um grande conjunto de medidas com provas de campo é efetuado e o modelo é ajustado empiricamente, através de métodos de regressão linear, para calcular a quantidade de clorofila. Esta metodologia já se mostra bastante eficiente em seus resultados para águas oligotróficas, onde a composição da matéria orgânica dissolvida é praticamente toda devida à decomposição do próprio fitoplâncton e, portanto, as intensidades das diferentes faixas espectrais apresentam-se de alguma forma correlacionadas com a quantidade da clorofila presente. A detecção da fluorescência naturalmente
induzida da clorofila a é uma tecnologia que parece ser promissora para ser embarcada em satélites. Seu maior entrave é a dificuldade de distinguir o baixo sinal decorrente da fluorescência do restante da radiação de fundo.
Considerando as técnicas ativas: a utilização de uma fonte artificial de luz gera no meio uma conseqüente perturbação. Um sistema detector irá registrar a excitação gerada pela fonte artificial superposta à emissão natural. Este sinal de fundo poderá ser subtraído medindo-se com o mesmo detector a emissão em um instante próximo anterior, portanto não submetido à fonte artificial, minimizando os efeitos de uma série dos fatores que alteram a composição da radiação retroespalhada desde a massa d’água até o detector.
Para medir remotamente a fluorescência da massa d’água é desejável uma alta potência de excitação. Lasers pulsados são adequados para esta finalidade. Algumas características dos lasers devem ser levadas em conta na análise de sua utilização no sensoriamento de clorofila a: por um lado, a excitação a partir de fótons com energia bem definida no espectro de excitação gera um espectro de emissão bem definido, associado à freqüência (portanto, à energia) desses fótons e, deste modo, comparável aos dados laboratoriais (ao contrário da luz solar, que excita os fluoróforos com todo o espectro de excitação). Por outro lado, a dificuldade de sintonizar freqüências diferentes, com a potência de radiação desejada, é um fator limitante. A pouca divergência do feixe do laser, fundamental para uma adequada relação de potência por unidade de área excitada, produz medidas pontuais; este fato deve ser levado em conta no tratamento estatístico das informações. O tempo de duração do pulso de luz pode ser um fator importante quando se desejar obter discriminação espacial (em profundidade) da emissão da fluorescência.
Um LIDAR (Light Detection And Ranging), ou radar-laser, como preferem alguns autores, é basicamente composto por um laser como fonte emissora de luz, um sistema de detecção, que inclui um telescópio e equipamento optoeletrônico de alta sensibilidade para discriminação/detecção de fótons, e um sistema de hardware e software para controle e sincronismo do conjunto microprocessado para aquisição de dados. O objetivo deste aparato é analisar os meios atravessados pelo feixe do laser através da medida dos espalhamentos, absorções ou reemissões decorrentes. A utilização de um LIDAR, instalado em um helicóptero, para monitoramento da clorofila a no oceano, data de 1973 [Kim, 1993]. Empregou-se,
neste caso, um laser de corante (emitindo em 590nm) como fonte de excitação e fotomultiplicadora acoplada a um dos dois filtros (centrados em 685nm e 735nm) utilizados para a seleção da faixa espectral de interesse. Neste primeiro experimento, em que pese os problemas para quantificar a fluorescência e associá-la a alguma referência de concentração de clorofiassociá-la a, a possibilidade de detecção remota da fluorescência foi demonstrada.
Porém, o problema básico do monitoramento remoto com um LIDAR é o fato de ser necessário encontrar algum procedimento de calibração, baseado em parâmetros contidos no próprio sinal detectado, para que se possa obter medidas quantitativas. É impossível calibrar um LIDAR da mesma forma que, por exemplo, um espectrofluorímetro, pois as condições de propagação da luz (e de sua interação com o meio) não podem ser controladas. Desta forma, é necessário algum padrão interno ao próprio sinal para a calibração e todas as medidas quantitativas devem ser extraídas através de razões (ou diferenças) de pelo menos duas bandas espectrais do mesmo sinal, uma delas sendo o sinal de calibração. No caso da fluorescência da água do mar, a normalização do sinal da fluorescência pelo espalhamento Raman da água [Klysko & Fadeev, 1978][Bristow et alli, 1981], decorrente da mesma excitação pelo laser, possibilitou a leitura de um resultado livre de uma série de fatores ópticos não controláveis que alteram a intensidade do espectro de emissão de fluorescência. A partir de 1980 [Hoge & Swift, 1981], algumas iniciativas empregando esta metodologia começaram a apresentar resultados consistentes [Demidov, 1995].
A interpretação dos espectros de fluorescência deve levar em conta os processos físicos, químicos e biológicos que alteram este tipo de emissão. A fluorescência é um fenômeno que compete com a conversão fotossintética no aproveitamento dos fótons absorvidos pelos pigmentos-antena; se o mecanismo de aproveitamento de fótons para a fotossíntese sofre alguma mudança, aumentando sua eficiência ou diminuindo-a, a intensidade da fluorescência também se alterará. Um grande número de fatores altera o processo da fotossíntese (espécie, idade, temperatura e disponibilidade de luz, água ou nutrientes são alguns desses fatores). Deste modo, o estudo da fluorescência dos pigmentos (como as clorofilas) presentes no aparato fotossintético é um desenvolvimento complexo mas revelador da produtividade fitoplanctônica. A utilização simultânea de técnicas passiva e ativa, através de um LIDAR, para obtenção de concentração de
clorofila a já foi realizada [Hoge et alli, 1986]. A divergência entre as duas medidas pode indicar uma alteração das condições ambientais.
Outros procedimentos para análise da fluorescência da clorofila a, como o monitoramento do tempo de decaimento [Guignon et alli, 1997] ou processos de saturação da emissão [Fadeev et alli, 1997], já foram propostos e realizados in situ e in vivo. A adaptação destas técnicas ou a criação de opções para o monitoramento remoto da dinâmica dos sistemas fotossintetizantes é um campo ainda em aberto.
Concomitantemente com o desenvolvimento da técnica da detecção da fluorescência da clorofila, sistemas LIDAR foram também empregados para monitoramentos com outras finalidades [Hoge & Swift, 1986b]. Através da fluorescência de outras espécies moleculares foram realizados estudos para a detecção de óleo [Hoge & Swift, 1983] [Hengstermann & Reuter, 1990] [Piskozub et alli, 1997] e da matéria orgânica dissolvida (MOD) na água [Bristow et alli, 1985], além da detecção de concentração de corante [Hoge & Swift, 1981b] para análises de diluição e correntes. Pela detecção da intensidade do sinal devido ao espalhamento Raman da água [Hoge & Swift, 1983b], o grau de turbidez da água foi inferido.
Aplicações sobre a vegetação terrestre enfocaram a determinação de stress por meio da fluorescência das clorofilas a e b. Utilizando-se da razão de intensidades de determinadas faixas espectrais [Valentini et alli, 1993] foi possível discriminar diferentes espécies vegetais e também identificar stress natural (como falta de água ou deficiência de nutrientes) em partes de plantações [Barbini et alli, 1993] [Nunes et alli, 1997].
Entre outras aplicações, os sistemas LIDAR foram empregados em estudos sobre a concentração de clorofila a e outros fluoróforos em águas costeiras ou submetidas a influências antropogênicas [Reuter et alli, 1993], para validação de dados gerados por satélite [Schmitz-peiffer et alli, 1990] e para monitoramento de derrames de óleo [Brown et alli, 1997].
Nos últimos anos, novos sistemas LIDAR estão sendo desenvolvidos. É importante citar o sistema construído para gerar imagens através de escaneamento de áreas [Fingas & Brown, 2002] e o LIDAR super-ativo [Wright, 1996] [Chekalyuk, 2003]. Neste sistema dois pulsos de laser são lançados sincronizados
sobre um mesmo local, um logo após o outro. A radiação retroespalhada gerada pelos dois pulsos é analisada. A interação do primeiro pulso com o fitoplâncton produz uma reação de fechamento dos centros de reação da fotossíntese. Desta forma, o segundo pulso encontra esses centros de reação fechados, o que resulta em uma alteração na fluorescência observada (em relação ao primeiro pulso), indicativa do máximo de fluorescência possível. Esta técnica e conhecida como “Pump & Probe”. A razão da fluorescência gerada pelos dois pulsos fornece informações adicionais sobre o fitoplâncton e sua atividade fotossintética.
2 Objetivos
As demandas sociais sobre o controle ambiental exigem, cada vez mais, sistemas eficientes de monitoramento do meio-ambiente. Os sistemas LIF-LIDAR1 apresentam grande potencial para sua utilização de forma rotineira, devido às boas perspectivas para automação de sua operação e de seus resultados, fornecendo rapidamente informações ambientais em diferentes contextos. Para que isto seja possível é necessário conhecer a sensibilidade e limitações de cada LIDAR, uma vez que sua construção não é realizada em escala industrial. Além disso, cada sistema deve ser contemplado com um procedimento particular de processamento dos dados, que deve ser desenvolvido de acordo com o LIDAR e a aplicação destinada.
O objetivo desta tese é o desenvolvimento de métodos de extração de informações de interesse no monitoramento ambiental a partir de espectros gerados pelo LIDAR-PUC, construindo uma ferramenta de suporte a estudos oceanográficos. Para tanto foi necessário desenvolver algoritmos e metodologias não só para a extração dessas informações de interesse de cada espectro, como também para a compreensão, visualização e análise de um conjunto de medidas. Este aspecto é especialmente importante uma vez que uma medida sobre o fitoplâncton em um determinado local e hora tem, em geral, pouca representatividade quando analisado isoladamente. A massa d’água está em constante movimento e a dinâmica do fitoplâncton é impressionante: o turnover médio do carbono fitoplanctônico gira em torno de 30 dias, enquanto atinge 30 anos para as plantas terrestres [Falkowski & Kolber, 1995]. É a análise dos dados em conjunto que possibilitam um esclarecimento sobre as condições ambientais.
Cabe ressaltar que o presente estudo visa oferecer uma tecnologia desenvolvida para a utilização em águas tropicais, direcionando soluções adaptadas para a realidade brasileira, que inclui (mais aí não se esgota) a
1 LIF: Laser Induced Fluorescence
compreensão da produtividade primária na região, a necessidade de rápido acúmulo de conhecimento sobre a vasta região costeira e o monitoramento apropriado das atividades offshore de extração de petróleo.
A base deste estudo foi centrada no desenvolvimento de método para o cálculo da concentração relativa da clorofila a. Este algoritmo foi testado quanto a sua repetitividade, comparando-o com resultados de técnicas tradicionais (como a fluorimetria – EPA 445.0) e quanto a sua linearidade em relação à concentração de clorofila a obtida por esses métodos tradicionais ou em relação a diluições específicas. Outros fatores com potencial influência na taxa de fluorescência da clorofila a, como a composição do fitoplâncton e a variação das condições naturais (dia/noite) foram avaliados.
Como o espectro de fluorescência é o resultado de uma composição de sinais, outros parâmetros foram calculados e avaliados. Estas incursões exploratórias são importantes porque abrem caminho para a avaliação do ambiente por diferentes visões utilizando apenas um equipamento, instrumento este que tem a capacidade de disponibilizar rapidamente um grande conjunto de dados. Desta forma, um breve ensaio foi realizado para estudar a utilização da banda do espalhamento Raman presente nos espectros gerados pelo LIDAR-PUC na avaliação da temperatura da água. Também foi desenvolvido um algoritmo para o cálculo da concentração relativa da MOD. Estes valores foram, então, analisados em conjunto com a concentração relativa da clorofila a, visando a identificação de padrões de correlacionamento.
Finalmente, os conjuntos de espectros obtidos em diferentes campanhas foram analisados e processados, gerando mapas. Esses mapas foram então confrontados com dados e outras informações particulares de cada área analisada, como o objetivo de inserir o ferramental aqui desenvolvido na análise dos estudos ambientais pertinentes em cada caso.
3 Aspectos Teóricos
3.1.Espalhamentos Inelásticos
Os sinais de interesse detectados em um espectro de um LIF-LIDAR são, basicamente, decorridos de espalhamentos inelásticos, isto é, interações onde há transferência de energia da radiação para a matéria ou, mais raramente (e, conseqüentemente, com menor intensidade), da matéria para a radiação. Neste capítulo estão descritos os dois espalhamentos inelásticos que serão determinantes na construção da instrumentação realizada: a fluorescência e a linha Stokes do espalhamento Raman da molécula de água.
3.1.1.Fluorescência
A absorção de um fóton por uma molécula, levando à excitação de um elétron a um estado eletrônico mais elevado é, em geral, acompanhada de uma transição de estado vibracional.
Como a massa dos núcleos é muito maior que a dos elétrons, aqueles podem ser considerados estáticos na escala do tempo da transição eletrônica (princípio de Frank-Condon). Com o elétron em um nível eletrônico mais energético, os núcleos irão reagir a esta nova configuração situando-se em um estado vibracional diferente (Figura 1). Formalmente temos
' ' ' if vv f v i v if f v f el i v i el if µ µ µ S µr = Ψ Φ Ψ Φ ≈ Φ Φ = ; Equação 1 Onde 2 2 ' ' f v i v vv
S = Φ Φ são chamados de fatores de Frank-Condon, Φ representa a função de onda dos estados vibracionais, Ψ representa a função de onda dos estados eletrônicos e µ é momento de dipolo associado.
Figura 1 - A função de onda vibracional no estado eletrônico excitado com maior coincidência com a função de onda vibracional anterior, no estado fundamental, terá maior probabilidade de ocorrer.
Após a excitação a um estado vibracional mais excitado, a molécula tende a relaxar por meio da interação com o meio circundante.
A relaxação de um nível vibracional mais alto para o nível vibracional de mais baixa energia de um certo estado eletrônico pode ocorrer em 10-12s (ou menos) em meios condensados. Processos de conversão interna, isto é, a passagem da molécula de um estado eletrônico de mais alta energia com nível vibracional de mais baixa energia para um estado eletrônico de mais baixa energia, mas com nível vibracional excitado, ocorrem também na escala de tempo de 10-12s.
Decaimentos não-radiativos podem continuar a ocorrer até o estado fundamental (também por conversão interna). Esses decaimentos ocorrem em tempos que variam de 10-12s a 10-6s.
A taxa de decaimento radiativo situa-se em torno de 107s-1 a 108s-1 para uma transição óptica forte (alta taxa de decaimento radiativo). Como essas emissões ocorrem muito mais provavelmente do nível vibracional menos energético (1012s-1 para transições vibracionais contra 108s-1 para transições fluorescentes), portanto,
após haver ocorrido decaimentos não-radiativos, na maioria dos casos, a energia do fóton emitido é menor que a do fóton absorvido. A fluorescência de uma molécula é o decaimento de um estado excitado
0 v exc
el Φ
Ψ para o estado fundamental por meio de emissão espontânea de um fóton.
A ocorrência de fluorescência em uma molécula (quando excitada por luz com um determinado comprimento de onda) está vinculada à comparação dos coeficientes de decaimento pelo(s) caminho(s) não-radiativo(s). A fluorescência acontece quando a taxa de decaimento radiativo é pelo menos comparável à taxa de decaimento não-radiativo.
Uma das características mais atrativas da espectroscopia de fluorescência é sua sensibilidade, se comparada com a espectroscopia de absorção.O limite de detecção das técnicas fluorimétricas é, em geral, de uma a três ordens de magnitude menor do que as de espectrofotometria de absorção. Seu limite de detecção está, tipicamente, na escala de partes por bilhão Esta alta sensibilidade se deve à existência de detectores capazes de detectar um fóton (detectores photon counting). Já os detectores de espectroscopia por absorção se baseiam na detecção de uma redução da intensidade da radiação incidente, o que faz necessário medir radiações de grande intensidade que estão fora da faixa de operação dos dispositivos photon counting.
Outra vantagem acessória é a grande faixa de concentração do fluoróforo em que as medidas de intensidade guardam uma relação linear, simplificando assim o procedimento laboratorial de rotina. Igualmente importante, é o fato de os métodos de espectroscopia por fluorescência serem muito mais seletivos. Em contrapartida, esta técnica se limita a um número relativamente pequeno de estruturas moleculares que apresentam emissão fluorescente após a absorção de fótons.
A fluorescência ocorre tanto em sistemas químicos simples como complexos, sejam gases, líquidos ou sólidos. O tipo de fluorescência em que a radiação absorvida é reemitida sem alteração de freqüência é chamada de fluorescência ressonante. As bandas de fluorescência molecular, contudo, encontram-se, muito mais freqüentemente, centradas em comprimentos de onda maiores (energias menores) que o da linha de ressonância.
A Figura 2 mostra esquematicamente as diferentes formas de decaimento para elétrons excitados. Duas dessas transições, a fluorescência e a fosforescência, são radiativas, pois envolvem a liberação de fótons. Porém, outras formas de transição não radiativas podem ocorrer.
Fosforescência Conversão Interna e externa Fluorescência Absorção Singletos Tripleto Relaxação vibracional Cruzamento intersistema
Figura 2 - Esquema de excitação e decaimento dos elétrons. Os níveis excitados à esquerda exemplificam estados singletos. O nível eletrônico excitado da direita representa um tripleto.
A Figura 3 mostra a outra alternativa de decaimento que ocorre quando a molécula em estado excitado troca seu spin total realizando um cruzamento intersistema do estado onde S = 0 (singleto) para um estado com S = 1 (tripleto). Neste estado, o decaimento ao estado fundamental por emissão radiativa de um fóton de maior comprimento de onda é denominado fosforescência. Como a taxa de cruzamento intersistemas é baixa (até 101s-1), fosforescência é um processo “lento”.
Estado fundamental Singleto Tripleto
Figura 3 - Possibilidades de composição de spins para um par de elétrons
Os processos não radiativos para a desexcitação da molécula são a relaxação vibracional, a conversão interna, a conversão externa e o cruzamento intersistemas. Como descrito a seguir, esses processos podem competir com as transições radiativas ou mesmo complementá-las.
Relaxação vibracional: Uma molécula pode ser excitada a qualquer um dos níveis vibracionais dos níveis eletrônicos mais energéticos durante um processo de excitação eletrônica. Em um solvente, entretanto, este "excesso" de energia vibracional é muito rapidamente perdido para o meio, resultando em um pequeno acréscimo na temperatura deste e levando o elétron ao mais baixo nível vibracional do estado excitado. O processo de relaxação vibracional é tão eficiente que o tempo de vida dos níveis vibracionais é da ordem de 10-12s ou menos. Desta forma, a banda de fluorescência associada a esta transição eletrônica , quando existente, ocorre a energias menores que da excitação inicial.
Conversão interna: Este fenômeno ocorre quando os níveis vibracionais de um estado eletrônico de mais baixa energia se superpõem, em energia, aos níveis vibracionais de outro estado eletrônico de maior energia para o qual o elétron foi excitado. Assim, o elétron pode decair para o estado eletrônico de menor energia de forma não radiativa. Esta conversão interna, além de impedir a emissão fluorescente, pode ser responsável pela pré-dissociação destas moléculas, uma vez que a transferência do elétron para um estado vibracional alto de um estado eletrônico menos energético pode provocar a ruptura da ligação molecular.
Conversão externa: A desativação de estados eletrônicos excitados podem envolver interações e transferência de energia entre a molécula excitada e o solvente ou outros solutos da solução. Esta conversão externa é experimentada quando se verifica o efeito na intensidade da fluorescência devido à mudança do solvente. Baixa temperatura e alta viscosidade, que diminuem a colisão entre partículas, geralmente levam a um aumento da fluorescência.
Cruzamento intersistemas: Este é o processo no qual o spin do elétron excitado é invertido e, por exemplo, permite a migração deste para um estado tripleto. Este processo é mais comum em moléculas contendo átomos pesados. As interações spin/órbita ficam mais fortes na presença de tais átomos e, desta forma, a mudança do spin é favorecida. A presença, na solução, de espécies paramagnéticas, tais como o oxigênio molecular, também promove o cruzamento intersistemas, diminuindo a fluorescência.
Estes mecanismos limitam a fotoluminescência a um número relativamente pequeno de sistemas. A rota mais favorável para o decaimento é aquele que minimiza o tempo de vida dos estados excitados. Desta forma, o decaimento por fluorescência será observado se o sistema apresentar características estruturais e ambientais que façam este decaimento rápido o suficiente em relação aos processos não radiativos.
A fluorescência raramente ocorre para excitações com radiação ultravioleta de comprimento de onda menor que 250nm (~5eV), pois tal radiação é constituída por fótons com energia suficiente para causar a desativação da molécula por dissociação ou pré-dissociação2.
É observado empiricamente que a fluorescência é mais encontrada em compostos nos quais a transição de mais baixa energia é do tipo π* à π. Este fato pode ser compreendido pelo maior coeficiente de absorção deste tipo de transição que para transições do tipo π* à n (da ordem de 100 a 1000 vezes maior).
Sabe-se empiricamente que moléculas que possuem estrutura rígida fluorescem mais. A falta de rigidez provavelmente causa um aumento na taxa de conversão interna diminuindo a fluorescência. Igualmente conhecido é o fato de que há um aumento da fluorescência quando corantes fluorescentes são adsorvidos em superfícies sólidas. Aqui também a rigidez estrutural, adicionada pela superfície, pode ser responsável pelo efeito observado. Outro fator de alteração da intensidade da fluorescência é a presença de oxigênio dissolvido. Neste caso, há, freqüentemente, a diminuição da fluorescência. Duas razões concorrem para este efeito: a ocorrência de indução fotoquímica da oxidação das espécies fluorescentes ou, o que é mais comum, o cruzamento intersistema,
2 A pré-dissociação deve ser diferenciada da dissociação. Na dissociação, a
radiação absorvida leva o elétron diretamente para um nível vibracional suficientemente energético para causar a ruptura da ligação. No caso da pré-dissociação, a radiação leva inicialmente o elétron a um nível eletrônico de mais alta energia. Posteriormente, por cruzamento intersistema, o elétron passa a um nível eletrônico baixo mas em um nível vibracional mais energético. A pré-dissociação ocorre quando este nível vibracional tem energia suficiente para causar a ruptura da ligação.
levando a molécula a um estado excitado tripleto, em virtude das propriedades paramagnéticas do oxigênio molecular.
Para o cálculo da concentração de um fluoróforo a partir de sua fluorescência, levamos em conta que a potência da radiação fluorescente é proporcional à radiação do feixe incidente que é absorvido pelo sistema. Isto é,
(
)
F= ′K P0−P ; Equação 2
onde P0 é a potência do feixe incidente e P sua potência após atravessar um
comprimento b do meio.
Para relacionar a potência da radiação fluorescente F com a concentração c do fluoróforo, escreve-se a lei de Beer na forma
P P bc 0 10 = −ε ; Equação 3
onde ε é o coeficiente de absorção e o produto εbc a absorbância A. Substituindo a Equação 3 na Equação 2 temos
(
bc)
P K
F = ′ 0 1−10−ε ; Equação 4
expandindo o termo entre parênteses em série de Taylor obtemos
(
) (
)
F= ′K P bc− bc + bc 0 2 3 2 303 2 303 2 2 303 3 . . ! . ! ... ε ε ε ; Equação 5Para valores de εbc < 0.02, todos os termos subseqüentes no colchete são pequenos quando comparados com o primeiro. Desta forma, utilizando-se apenas o primeiro termo, o erro da Equação 5 em relação à Equação 4 será de no máximo 2,5%. Quando a concentração de fluoróforos é pequena o suficiente para satisfazer esta condição, pode-se, então, escrever
Kc bc P K F = 0ε = ' 303 , 2 ; Equação 6
Para a situação objeto desta tese, que envolve a determinação de clorofila a no mar, pode-se calcular até que concentração de clorofila a na água do mar, analisada em uma cubeta simples, com 1cm de largura, se enquadra a Equação 6 com um erro máximo de 2,5%. Utilizando um coeficiente de absorção típico [Campbell & Esaias, 1983] em torno de 0,05 l/(µg.m), as concentrações até 45 µg/l apresentam um erro máximo de 2,4%, o que satisfaz a condição para utilização da equação 2.5.
Na análise deste cálculo, vale acrescentar que outros dois fenômenos são capazes de produzir desvios nesta relação linear: a absorção e a auto-extinção. A auto-absorção ocorre quando o comprimento de onda de emissão se sobrepõe ao pico de absorção do fluoróforo. Desta forma, a radiação emitida sofre um decréscimo na medida que atravessa a solução, pois uma parte é reabsorvida pelo fluoróforo. A auto-extinção ocorre por colisão entre os fluoróforos, provavelmente de uma maneira análoga à conversão externa. Os efeitos de ambos os fenômenos crescem com o aumento da concentração.
Para medidas realizadas diretamente sobre o mar é necessário levar em conta os múltiplos espalhamentos sofridos pela radiação, que irão afetar o total de luz disponível a cada profundidade. Modelos de transferência radiativas foram utilizados para desenvolver a relação da concentração de um fluoróforo em uma coluna de água do mar, quando medido por um LIDAR (neste caso, conforme descrito na Equação 12, é linear a relação entre a potência detectada da fluorescência e a concentração do fluoróforo). Segundo simulações modeladas por computador [Poole & Esaias, 1982], concentrações maiores que 1µg/l devem ser integradas em, no máximo, 3m. Deve-se também levar em conta que, segundo Falkowski [Falkowski & Kolber, 1995], o valor médio da concentração da clorofila a nos oceanos do mundo é de 0,2 µg/l.
3.1.2. Espalhamento Raman
A Figura 4 apresenta um espectro típico da radiação retroespalhada da água do mar. Em que pese a ocorrência de importantes bandas de fluorescência ao longo do espectro, o pico mais intenso deste espectro (excitado em 532nm) tem outra natureza.: é decorrente da emissão Raman da água.
Emissão (
u.a.)
Figura 4 - Espectro de fluorescência de água costeira medido pelo LIDAR-PUC. O pico da emissão Raman está em 651nm (excitação em 532nm).
O espalhamento Raman é um espalhamento inelástico da radiação por um material, isto é, um quantum de energia (um fônon) é transferido entre o quantum de radiação e o material, de tal forma que a luz espalhada contém fótons com energia menor (linha Stokes) ou maior (linha anti-Stokes) que o da excitação.
Para descrever completamente o espalhamento Raman é necessário utilizar tanto a teoria de grupos como a teoria de perturbações de ordens superiores. Entretanto, é possível obter uma compreensão clássica do fenômeno considerando-o decorrente da ação do campo elétrico da onda eletromagnética sobre as cargas do material [Andrew & Demidov, 1995]. Ao contrário do processo de simples absorção, que requer a existência na molécula de um momento de dipolo elétrico, o efeito Raman está associado à polarizabilidade da molécula, mesmo que esta não possua momento de dipolo.
Considerando, por simplicidade, a interação da luz com uma única molécula, expressa-se o momento de dipolo desta molécula como:
(
)
∑
+ + + + = ,... , , ,jkl i l k j ijkl k j ijk j ij i i p E E E E E E P α β γ L ; Equação 7onde i,j,k,l representam as coordenadas espaciais x, y e z e ΣEi é o campo elétrico da radiação incidente. O termo pi expressa a possibilidade de um momento de dipolo permanente. Dos componentes restantes, induzidos pela
presença do campo elétrico, vamos fixar nossa atenção sobre o termo linear em E. Os termos de ordens mais altas em Ei expressam processos (não-lineares), como o espalhamento hiper-Raman, e que não serão de interesse aqui.
Tanto o momento de dipolo pi como a polarizabilidade αi,j podem variar no tempo, se a molécula vibra. Expandindo pi e αi,j como séries de Taylor em termos das coordenadas generalizadas qn, que descrevem os n modos vibracionais (qn são os deslocamentos atômicos de cada modo) temos:
∑
∂
∂
+
=
= n n q n i i iq
q
p
p
p
0 0 ;∑
∂ ∂ + = = n n q n ij ij ij q q 0 0 α α α Equações 8Considerando os deslocamentos qn pequenos, pode-se aproximar a dependência temporal de qn e escrever:
( )
t q( )
tqn = 0ncosωn ;
( )
t E(
t)
Ei = 0i cos ω L Equações 9
Substituindo as Equações 8 e Equações 9 na Equação 7 (desprezando os termos de mais alta ordem) têm-se
( )
( )
(
)
[
]
[
(
)
]
{
}
∑
∑
∑
+ − + + ∂ ∂ + + + ∂ ∂ + = = = ,... , , , 0 0 0 0 0 0 0 cos cos cos cos l k j i n L n L n q n ij n oj L j ij n n n q n i i i t t q q E t E t q q p p P L ω ω ω ω α ω α ω ; Equação 10 O termo∑
( )
∂ ∂ = n n n q n i t q q p ω cos 0 0está associado à absorção no
infra-vermelho. O termo α0ijE0jcos
( )
ωLt representa a absorção associada ao espalhamento Rayleigh, na mesma freqüência da radiação incidente. Finalmente,o termo
∑
{
[
(
)
]
[
(
)
]
}
− + + ∂ ∂ = n L n L n q n ij n oj t t q q E α cos ω ω cos ω ω 0 0 representa a partedo momento de dipolo que é induzido pela luz e também é proporcional à freqüência de oscilação de αi,j. Se 0
0 ≠ ∂ ∂ = q n ij q α
para determinado valor do par i,j, dois termos aparecem; correspondem à reemissão de fótons. Estes são os espalhamentos Raman Stokes e anti-stokes, respectivamente, com energia com valor para maior ou menor de um quantum de energia associado à diferença de energia dos modos vibracionais da molécula.
Esta descrição, entretanto, não explica a diferença das intensidades das linhas Stokes e anti-Stokes. Para isto é necessário analisar o fenômeno quanticamente. Neste caso, considera-se uma interação de dois fótons com um fônon da molécula. A variação de energia do fóton espalhado (reemitido) é vista como associado a um processo de emissão ou absorção de fônons quando do relaxamento da molécula.
Naturalmente, o decaimento para níveis vibracionais de maior energia que o estado fundamental é sempre possível, gerando um fóton de menor energia que o inicial. Já para aniquilar um fonon, gerando um fóton com maior energia que o inicial, um elétron deve estar em um nível vibracional de maior energia, e esta probabilidade depende da temperatura. Desta forma, a razão entre as linhas Stokes e anti-stokes refletem o fator de Boltzmann (e(−hν/kT)). Apesar de este não ser o único fator determinante das intensidades das linhas Stokes e anti-Stokes, é possível compreender, ainda que qualitativamente, esta diferença entre suas intensidades.
Stokes, E = hν - ∆E
∆E
∆E
Espalhamento Rayleigh Espalhamento Raman
Anti-Stokes, E = hν + ∆E
Figura 5 - Esquema dos espalhamentos Rayleigh (elástico) e Raman(inelástico).
A intensidade de um pico Raman depende de maneira complexa da possibilidade de polarização da molécula, da intensidade da fonte e da concentração da molécula ativa, entre outros fatores. A potência da emissão Raman cresce com a quarta potência da freqüência da fonte de excitação (similar ao espalhamento Rayleigh: 4 2 02 4 3 16 E c I π α ë
= , onde λ é o comprimento de onda e E0 a amplitude do vetor de campo elétrico). A intensidade do Raman é em geral
diretamente proporcional à concentração da molécula ativa. Se o estado virtual corresponde a um estado real, esta transmissão é denominada Raman-ressonante.
3.2.Fotossíntese
A captura da energia solar por organismos fotossintetizadores e sua conversão em energia química por meio da reação de síntese de compostos orgânicos é, em última instância, a fonte de praticamente toda a energia biológica [Lehninger et alli, 1993].
A equação geral da fotossíntese descreve a reação de oxi-redução (mediadas por uma série de substâncias presentes o cloroplasto) na qual H2O doa elétrons (e prótons) para a redução de CO2 e sua transformação em carboidrato (CH2O):
(
CH O)
O O H CO luz 2 2 2 2 + → + ; Equação 11A fotossíntese engloba dois processos: as reações “claras”, que ocorrem apenas quando as plantas estão iluminadas, e as reações de fixação de carbono, ou reações escuras, que ocorrem tanto sob luz quanto na escuridão.
Nas células fotossintéticas eucariotas, tanto as reações claras quanto as de fixação de carbono se dão no cloroplasto (Figura 6). O cloroplasto é envolvido por uma membrana externa que é permeável a íons e pequenas moléculas. Uma membrana interna envolve o compartimento interno. Neste compartimento interno há várias vesículas (ou sacos) achatadas, envolvidas por uma outra membrana, chamadas tilacóides, que são normalmente dispostas em pilhas chamadas granas. As membranas tilacóides são separadas da membrana interna do cloroplasto. Os pigmentos fotossintéticos e todas as enzimas necessárias para as reações a luz estão embutidas na membrana tilacóide. O fluido ao redor dos tilacóides, o estroma, contém a maior parte das enzimas necessárias para as reações de fixação de carbono, quando moléculas de ATP e NADPH, produtos da fase clara, são utilizados para reduzir o CO2 para formar glicose e outros produtos orgânicos. Neste trabalho, serão relatadas apenas as reações que envolvem luz.
Grana Estroma
Figura 6 - Cloroplasto. Os tilacóides são os filamentos observados, em geral agrupados nos grana.3
A absorção de luz se dá através de certos tipos de moléculas instaladas nas membranas tilacóides chamadas pigmentos-antena. Destes, os mais importantes são as clorofilas, pigmentos verdes, com um anel de porfirina (com Mg no centro)
3 Figura obtida em [Raven et alli, 1978]
ligado a uma longa cadeia de carbono. A estrutura do anel de porfirina apresenta uma forte absorção na região visível do espectro. Por esta razão as clorofilas apresentam coeficientes de absorção de luz especialmente altos e são, portanto, particularmente adequados para absorver a luz visível durante a fotossíntese.
Os cloroplastos das plantas superiores sempre contêm dois tipos de clorofila. Um deles é, invariavelmente, a clorofila a e o segundo tipo, em muitas espécies, é a clorofila-b. Apesar de os dois pigmentos serem verdes, seus espectros de absorção são ligeiramente diferentes (Figura 7), permitindo que se complementem na absorção de luz na região do visível. A maioria das plantas superiores contém duas vezes mais clorofila a que clorofila-b. As clorofilas das bactérias diferem muito pouco dos pigmentos das plantas.
Além das clorofilas, as membranas tilacóides contêm pigmentos secundários (conhecidos como pigmentos acessórios). Os carotenóides e as ficobilinas absorvem luz em comprimentos de onda diferentes dos absorvidos pelas clorofilas, conforme pode ser verificado na Figura 7 e são, portanto, receptores suplementares de luz.
As proporções relativas das clorofilas e dos pigmentos acessórios são características para cada espécie de planta. A variação dessas proporções é responsável pela diversidade de cor dos organismos fotossintetizantes (tanto na vegetação superior como no fitoplâncton).
