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FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDÔNIA
Luana Janaína Souza Vera
ADEQUAÇÃO DA TÉCNICA DA PCR PARA
DIAGNÓSTICO DE M.OZZARDI
Porto Velho – RO
2012
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Luana Janaína Souza Vera
ADEQUAÇÃO DA TÉCNICA DA PCR PARA
DIAGNÓSTICO DE M.OZZARDI
Dissertação apresentada para obtenção do Título de Mestre pelo Curso de Mestrado em
Biologia Experimental/PGBIOEXP do
Departamento de Biologia da Fundação Universidade Federal de Rondônia.
Área de Concentração: Biologia Experimental Orientador: Prof. Dr. Luís Marcelo Aranha Camargo
Cep nº 373/09
Porto Velho – RO
2012
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LUANA JANAÍNA SOUZA VERA
ADEQUAÇÃO DA TÉCNICA DA PCR PARA
DIAGNÓSTICO DE M.OZZARDI
Dissertação apresentada para obtenção do Título de Mestre pelo Curso de Mestrado em
Biologia Experimental/PGBIOEXP do
Departamento de Biologia da Fundação Universidade Federal de Rondônia.
Área de Concentração: Biologia
Experimental CEP /AP 373/09 Data: _____________________________ Resultado: _________________________ BANCA EXAMINADORA Prof. Dr. _____________________________________ ___________________________ Assinatura ___________________________________ Prof. Dr. _____________________________________ ___________________________ Assinatura ___________________________________ Prof. Dr. _____________________________________ ___________________________ Assinatura ___________________________________
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Dedico este trabalho ao pai celestial, que nunca me abandonou,
À Dr.ª Vera, minha amada mãe. Ao meu pai, exemplo de inteligência e dedicação. Às minhas queridas irmãs, Hellen e Juliana. À minha avó, Tereza, e ao meu orientador e eterno mestre, Prof. Dr. Luís Marcelo.
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AGRADECIMENTOS
Nessa caminhada um tanto quanto árdua e cheia de atropelos conheci e convivi com pessoas maravilhosas que deixaram um pouco de si e levaram um pouco de mim, vou levar na lembrança com certeza tudo que aprendi e vivenciei, peço desculpas se por ventura o nome de alguém não foi listado, porem saibam que cada um teve uma grande importância para a concretização do trabalho.
Aos meus companheiros do ICB V – USP, Leozinho, Silvana, Nayana, Joãozinho , pela paciência e dedicação, mesmo nas horas mais difíceis das coletas em campo.
Aos meus queridos Leandro Garrido e Lucas Campana ICB II – USP, pelo sequenciamento das amostras.
Aos professores da minha banca examinadora, por disponibilizarem tempo mesmo com uma rotina repleta de atribuições para a leitura do meu trabalho, do meu sonho...a vocês meu muito obrigada.
Em especial aos professores, Gilberto Fontes, Jansen Medeiros, Andonai Krauze, Almeida, Vera Engracia, Ricardo Godoi, Sergio Basano, que estiveram diretamente ligados a conclusão do trabalho.
Aos meus queridos amigos do IPEPATRO, Lílian, Daniel, Milena, Marlene, pelo apoio e grande ajuda no processamento das minhas amostras e ainda pela paciência, ombro amigo. Ao meu idolatrado mestre e orientador Prof. Dr. Luís Marcelo Aranha Camargo, pelos ensinamentos e longas e valiosas lições que vou levar comigo ao longo da vida, sou e sempre serei grata pelo grande carinho, meu grande amigo, mestre e segundo pai.
A minha querida Juliana Camargo, minha companheira de todas as
expedições....Jujuuuu....receba meu carinho e meus sinceros agradecimentos.
Aos meus professores da UNIR, Dra Manoela Moura, Dra Vera Engracia e Dr Luiz Hidelbrando, pela transmissão de uma fração de seu vasto conhecimento.
A minha família que me deu total apoio nessa caminhada, ao meu pai Marcos Vera, exemplo de inteligência e força, minha vida sem você nada seria possível, a minha amada mãe que para mim sempre foi um exemplo de garra e superação.
As minhas irmãs, Juliana e Cris por fazerem parte da minha vida ...por tudo que passamos juntas.
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As minhas sobrinhas Fernanda e Sarah, minhas pequenas maravilhosas que com um abraço acabam com qualquer mal estar..e transformam espinhos e delicadas rosas...amo vocês.. Ao grande amigo Cledson Junior, pelo carinho,..pelas horas difíceis que teve grande paciência e me presenteou com suas palavras consoladoras.
A minha vó Tereza....meu infinito amor.
A minha meia Irma..Nanda...Fernanda da Silva Alves, por todos os momentos compartilhados.
Ao meu anjo....Uendson....pessoa que escolhi para dividir todos os momentos da minha vida...por me proporcionar momentos maravilhosos....por mostrar, mesmo sem saber, que sou capaz de tudo que mais sonho, basta querer...por me trazer a calma nas horas de maior aflição...amor..vc chegou em minha vida e a transformou completamente....meu porto seguro...minha fortaleza....a vida ao seu lado é sempre mais doce....que fez parte da conclusao deste com minha segunda familia que me acolheu com tanto carinho...minha sogra – mãe Raimunda Lucia, a mulher do sorriso mais doce que já conheci, meus irmãos cunhados, Weverton, Kenya, Uamdemberg e Ueslei, por todos os momentos maravilhosos que me fizeram esquecer que o mundo pode ser tão cruel.
A todas as pessoas que contribuíram direta ou indiretamente para a execução e termino do trabalho, pela paciência e muitas vezes dedicação exclusiva ao trabalho e a mim, meu muito obrigada
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RESUMO
A Mansonelose é uma filariose causada por M.ozzardi, ocorrendo na Amazônia com
prevalências de até 60%. A técnica de diagnóstico habitual (hematoscopia através da gota espessa) tem baixa eficácia para o diagnóstico de pacientes com baixa parasitemia. Neste contexto foi aperfeiçoada a técnica da reação da polimerase em cadeia (PCR) para seu diagnóstico. Quando comparada à gota espessa, a PCR apresenta sensibilidade de 100%, que muito embora tenha apresentado, neste estudo, uma sensibilidade baixa (10,3%) e valor preditivo negativo (VPN) de 100% mostrando eficácia bastante superior à técnica de filtração de membrana uma sensibilidade 88,9% e VPN de 84,6%, quando também comparada à gota espessa de sangue.
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ABSTRACT
Improvement of a PCR test to diagnose infection by M.ozzardi
Mansoneliasis is caused by M.ozzardi. It is widespread in the Amazon region, with prevalence’s as high as 60%.The examination of thick blood smears stained with Giemsa shows low efficacy levels and has been an obstacle to diagnosing individuals with low blood parasitemia. In order to increase diagnosis efficacy, the polymerase chain reaction (PCR) technique was improved. PCR demonstrated best performance, with sensitivity and negative predictive values (NPV) of 100%, although our study demonstrade a low specificity (10.3%). On the other hand, the blood filtration through polycarbonate membrane, showed a sensitivity of 88.9 % and a NPV of 84.6%, and also a low specicity of 37.9%, when compared with the thick blood smears examination.
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LISTA DE FIGURAS
Figura 01 - Microfilárias de M. ozzardi em esfregaços de gota espessa ... 18
Figura 02 - Vetor, Simulium sp. ... 20
Figura 03 - Ovos de Simulium sp. ... 20
Figura 04 - Larva de Simulium sp ... 21
Figura 05 - Ciclo Biológico de M. ozzardi ... 22
Figura 06 - Características diferenciais das microfilárias ... 24
Figura 07 - Técnica da gota espessa ... 23
Figura 08 – Coleta de sangue ... 26
Figura 08 a – Seringa com holder encaixado ... 26
Figura 08 b - Holder desmontado...26
Figura 08 c – Lâmina com membrana já corada ... 26
Figura 09 – Técnica de Knott...27
Figura 10 – Mapa de Lábrea...30
Figura 11 – Gel Poliacrilamida...34
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LISTA DE TABELAS
Tabela 01 - Comparação das técnicas de Filtração por Membrana com a Reaçao de Cadeia Polimerase ... 32
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AM – Estado do Amazonas
DNA – Ácido Desoxirribonucleico
dNTP – Deoxyribonucleotide triphosphate EDTA – Ethylenediaminetetraacetic acid HGE – Hemoscopia da Gota Espessa PCR – Reação em Cadeia da Polimerase TBE – 10mM Tris / 1mM EDTA
TEMED – Tetramethylethylenediamine - (CH3)2NCH2CH2N(CH3)2 TFMP – Filtração em Membrana de Policarbonato
VPN – Valor Preditivo Negativo VPP – Valor Preditivo Positivo
12 SUMÁRIO 1- INTRODUÇÃO ... 14 2- OBJETIVOS ... 16 2.1- Geral ... 16 2.2-Específicos ... 16 3- REVISÃO DA LITERATURA ... 17 3.1- Histórico ... 17 3.2- Agente Etiológico ... 18 3.3- Vetor ... 19 3.4- Ciclo Biológico ... 22 3.5- Manifestações Clínicas ... 23
3.6- Métodos Diagnósticos de M. ozzardi ... 23
3.6.1-Diagnóstico Parasitológico ...23
3.6.2- Gota Espessa de Sangue ...24
3.6.3-Filtração de Sangue em Membrana de Policarbonato ...25
3.6.4-Técnica de Knott ...27
3.6.5- Diagnóstico Molecular...28
3.6.6- Reação em Cadeia da Polimerase ...28
3.6.7- Sequenciamento de DNA...28
3.7- Tratamento... 29
4- METODOLOGIA ... 29
4.1- Técnica de Gota espessa e Técnica da Filtração de Sangue em Membrana de Policarbonato ... 30-31 4.2 Técnica da Reação em Cadeia da Polimerase ... 31
4.3- Técnica de sequenciamento de DNA...32
5- RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 32
6- CONCLUSÃO ... 36
REFERÊNCIAS ... 37
ANEXOS A – E ... 40
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1 INTRODUÇÃO
M.ozzardi está entre os oitos parasitos filarídeos que infectam o homem, sendo endêmico em regiões tropicais da América do Sul e Central. Todavia, no Brasil, só são considerados como problemas de saúde pública Onchocerca volvulus e Wuchereria bancrofti. Dados obtidos sobre aspectos clínicos da infecção são escassos, o que pode levar a interpretação errônea que a infecção humana por Mansonella ozzardi seja considerada não patogênica (ADAMI & HERZOG, 2008).
As manifestações clínicas da mansonelose são muito discutidas, porém a maioria dos autores refere-se a ocorrência de febre moderada, “frieza nas pernas”, dores articulares, adenite acompanhada de tonturas e dor de cabeça (BATISTA et al., 1960). Apesar de serem ainda objeto de questionamentos, estudos recentes revelaram uma nova sintomatologia para a mansonelose, sobretudo pela presença de lesões oculares, com círculos brancos na córnea, que podem evoluir para a cegueira (MEDEIROS et al., 2008).
Esse parasito tem distribuição geográfica limitada às Américas, sendo encontrado entre o México e a Argentina, com exceção do Chile, Uruguai e Paraguai (TAVARES & NETO, 1997).
No Brasil, foi descrito a priori na cidade de Manaus (AM), quando foram registrados focos nos rios Solimões, Purus e Negro (LACERDA & RACHOU, 1956). Esse filarídeo está presente em especial nas regiões das vilas e povoados da zona rural e silvestre, sobretudo entre as populações indígenas (FRAIHA, 1983). O referido parasita foiencontrado, em menor quantidade, nos Estados do Acre, na região norte do Mato Grosso e em Roraima (DEANE et al., 1953; OLIVEIRA, 1963; MORAES et al., 1985).
M. ozzardi é transmitida por insetos de duas famílias de Diptera: Ceratopogonidae e Simuliidae. No Brasil, até o momento, apenas os simulídeos Simulium amazonicum, S. oyapockense e S. argentiscutum são relacionados como transmissores. (CERQUEIRA, 1959;
SHELLEY et al., 1980; MEDEIROS et al., 2004) .
A técnica da Hemoscopia da Gota Espessa (HGE), corada com Giemsa, é o método de diagnóstico clássico para a detecção de M. ozzardi. Embora apresente baixa eficácia, tem sido utilizada em inquéritos epidemiológicos por ser economicamente mais viável, com rápida e fácil obtenção, permitindo a identificação da espécie do parasita, mesmo em locais com ocorrência de infecções mistas com outros filarídeos (FONTES & ROCHA, 2005).
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Existem técnicas de diagnósticos mais eficientes, porém mais trabalhosas, como as técnicas de concentração de Knott, com lise de sangue pela formalina 2% (KNOTT, 1939; FONTES & ROCHA 2005) e a Técnica de Filtração em Membrana de Policarbonato (TFMP), (FONTES & ROCHA, 2005). Morales-Rojas e seus colaboradores testaram, em amostras de tecido, em 2001, a técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) na detecção da M.
ozzardi e consideram-na como a mais eficaz para diagnóstico, porém na ocasião não foi
realizado teste populacional para sua validação, nem o exame do sangue periférico dos pacientes.
Com o intuito de contribuir para o diagnóstico da M. ozzardi, esta pesquisa se preocupa em adequar e avaliar a eficácia da PCR em relação à TFMP, quando comparada à HGE, em estudo populacional e em sangue venoso.
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2 OBJETIVOS
2.1 Geral:
Adequar e Avaliar a eficácia da PCR em relação à TFMP e HGE, em estudo populacional e em sangue venoso.
2.2 Específicos:
Adequar e Padronizar a técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR, para diagnóstico de infecções por M. ozzardi.
Determinar a sensibilidade, especificidade e descrever os parâmetros de eficácia da PCR em relação a TFMP, e HGE.
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3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 Histórico
A pesquisa de Patrick Manson, realizada por volta de 1897, descreveu os primeiros relatos de Mansonella, quando foi identificado o agente infeccioso a partir de microfilárias encontradas em amostras de sangue periférico de índios caraíbas que habitavam a Guiana. Por terem sido coletadas por Ozzardi, recebeu a denominação Filaria ozzardi (MANSON, 1897). Posteriormente, Faust, em 1929, integrou-a ao gênero Mansonella (TAVARES & NETO, 1997).
M.ozzardi (MANSON, 1897) é um filarídeo humano próprio do continente americano,
com focos já detectados na Bolívia, Brasil, Colômbia, Guatemala, Guiana, Ilhas do Caribe, México, Panamá, Peru, Suriname, Venezuela e norte da Argentina (FONTES & ROCHA, 2005).
No Brasil, a primeira descrição de M. ozzardi deu-se em 1949 na cidade de Manaus, quando Maria P. Deane o revelou mediante inquérito que evidenciou a prevalência do parasitismo por filárias entre a população. Das 2.045 pessoas examinadas, 15 (0,6%) apresentaram microfilárias de M. ozzardi (DEANE, 1949). Posteriormente, estudos realizados por Lacerda & Rachou (1956) deixaram óbvio que a mansonelose era encontrada no Estado do Amazonas, nas comunidades ribeirinhas do rio Solimões e em seus afluentes. Além do Estado do Amazonas, a enfermidade foiencontrada no Estado de Roraima (MORAES et al., 1985) e alto Xingu, no Mato Grosso e Acre (OLIVEIRA, 1963). Este filarídeo está presente especialmente nas vilas e povoados da zona rural e silvestre, atingindo principalmente as populações indígenas (FRAIHA, 1983).
Estudo realizado no Estado de Rondônia, as margens dos rios Madeira, Mamoré, Guaporé, Machado e Preto, onde 4452 foram testadas pelo método de gota espessa, demonstrou que na há registro de M.ozzardi na região (BASANO, 2011).
3.2 Agente Etiológico
A Mansonelose é uma filariose que tem como agentes etiológicos os nematodos
Mansonella ozzardi (RACHOU ,1954), M, perstans (FORMICA& BOTTO, 1990; ORIHEL, 1967), M. streptocerca (FISCHER, 1998;CDC, 2010), espécies pertencentes à família
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Onchocercidae (LEIPER, 1911). As três espécies se diferenciam pelas seguintes
características: afinidade por vetores, anatomia, sintomatologia e distribuição geográfica (DOWNES & JACOBSEN, 2009).
As microfilárias de M.ozzardi (figura 01) medem aproximadamente 200µm. São encotradas no sangue periférico, não possuem periodicidade, e concentram-se em capilares do tecido subcutâneo humano (FONTES & ROCHA, 2005). Distinguem-se das demais microfilárias pela ausência de bainha, cauda fina e curta em forma de gancho ou foice, núcleos caudais reduzidos em uma fila de sete a nove elementos e ponta da cauda desprovida de núcleos. Tipicamente, os primeiros núcleos somáticos são dispostos em fila única. As microfilárias possuem uma sobrevida estimada em 32 meses e seu ciclo completa - se em dípteros, seus hospedeiros intermediários (TAVARES & NETO, 1997).
Os vermes adultos de M. ozzardi apresentam dimorfismo sexual. As fêmeas medem aproximadamente 32 a 61 mm de comprimento por 0,15 mm de diâmetro. Seus corpos são transparentes, acompanhados de cutícula lisa e homogênea. Contudo, os machos são menores, e têm entre 24 a 28 mm de comprimento por 0,07 mm de diâmetro. Estes apresentam ainda sistema reprodutor em tubo simples, testículos dispostos na região esofágica, dois espículos (o esquerdo maior que o direito), 11 papilas pericloacais e outros dois pares mais salientes próximos à extremidade posterior (RACHOU & LACERDA, 1954; TAVARES & NETO, 1997).
Figura 01 - Microfilárias de M. ozzardi em esfregaços de gota espessa, coradas com Giemsa. Fonte: DPD, 2010.
Disponível em: <http://www.dpd.cdc.gov/dpdx/html/imagelibrary/Filariasis_il.htm>. Acesso em: set. 2010
Os vermes adultos habitam o mesentério, tecido conjuntivo subperitoneal, e membranas serosas (pleuras e peritônio) do hospedeiro humano (FONTES & ROCHA, 2005), além linfonodos e vasos linfáticos adjacentes ou tecido subcutâneo (NUTMAN, 2001).
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3.3 Vetor
M. ozzardi é transmitida por insetos dípteros das famílias Ceratopogonidae e
Simuliidae. A família Ceratopogonidae está presente nas ilhas do Caribe, sendo que nas Américas Central e do Sul há presença das duas famílias (SHELLEY & COSCARÓN, 2000; FONTES & ROCHA, 2005).
Os dípteros ceratopogonídeos são conhecidos como “mosquito pólvora” e “maruins” no Brasil, “jejénes” nos países com idioma espanhol e “polvorines” na América do Norte (MARCONDES, 2001). Essa família possui vinte e sete gêneros, na qual o Culicoides é o mais expressivo hematófago (MONTEIRO, 2009).
O gênero Culicoides apresenta 924 espécies com vasta distribuição mundial. Destas, 73 são encontradas no Brasil (NEVES et al., 1997). As espécies relacionadas à transmissão de
M. ozzardi são Culicoides furens, C. barbosai e C. phlebotomus (em Trinidad e Tobago)
(DPMIAC, 1994).
Na América do Sul, os principais vetores são insetos do gênero Simulium (FONTES & ROCHA, 2005). Cerca de mil e oitocentas espécies da família Simuliidae foram descritas no mundo (CROSSKEY & HOWARD, 2010). Por volta de noventa espécies já foram identificadas em solo brasileiro (PEPINELLI et al., 2003).
Os principais vetores incriminados para a transmissão de M. ozzardi no Brasil são os simulídeos, S. amazonicum e S, argentiscutum, em especial na região norte do país (SHELLEY et al., 1980; MORAES et al., 1985; TIDWELL & TIDWELL, 1982). Moraes et al. (1985) identificou a espécie S. oyapockense como vetor da M. ozzardi no Estado de Roraima.
Em território brasileiro, são denominados “piuns” nas regiões norte e nordeste, e “borrachudos” nas demais regiões; em outras regiões do globo são também conhecidos como
black flies ou moscas negras (Figura 02) (BRASIL, 2006). Em geral, quando adultos, os
simulídeos são pequenos, têm coloração escura, asas largas de aspecto corcunda (tórax curvado) e pernas curtas (MARCONDES, 2001).
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Figura 02 - Vetor, Simulium sp. Disponível em: <http://www.epa.gov/bioindicators/html/blackflies.html>. Acesso em: nov. 2010
Seus ovos são pequenos, semitriangulares (Figura 03), e eclodem após decorridos dois a sete dias. Em geral, são depositados em grande quantidade, submersos em água, em áreas úmidas ou ao lado do curso da água, em corredeiras ou locais de rápido escoamento de água (BRASIL, 2006; SIMULIIDAE, 2010).
Figura 03 - Ovos de Simuliumsp Fonte: (BRASIL, 2006).
<http://www.epa.gov/bioindicators/html/blackflies.html Acessado em novembro de 2010
As larvas dos simulídeos alimentam-se através de um par de leques filtradores grandes, dispostos na cápsula cefálica (Figura 04). A região ventral, próxima à cabeça, possui um pé, e no final do abdômen apresenta um disco de ganchos, que auxilia na fixação da larva. Suas trocas iônicas são realizadas por papilas anais (BRASIL, 2006). As larvas respiram por meio de brânquias e, após duas ou três semanas, tecem um casulo e se transformam em pupa (MONTEIRO, 2009).
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Figura 04 - Larva de Simulium sp. Disponível em:
<http://www.diptera.info/photogallery.php?photo_id=5036>. Acesso em: nov. 2010
As pupas geralmente, são encontradas abaixo da lâmina d’água, mas também sobrevivem em ambientes úmidos, e se apresentam envoltas em um casulo de seda auxiliadas por um arranjo de ganchos presentes em seu abdômen (BRASIL, 2006).
Os mosquitos simulídeos adultos (Figura 02) são pequenos, com corpo bem definido, medindo de 1 a 2 mm. As asas são largas e fecham-se uma sobre a outra quando em repouso. Possuem probóscide curta do tipo sugadora, antenas pequenas, coloração quase sempre negra ou acinzentada, salvo quando se apresentam na cor castanha, castanha avermelhada ou amarela. Apenas as fêmeas adultas são hematófagas (mamíferos e aves) e os machos se alimentam de néctar das flores. Esse repasto sanguíneo realizado pela fêmea está vinculado à maturação dos oócitos. Os simulídeos são de hábitos diurnos, mas podem ser ativos no crepúsculo, dependendo muito do clima (BRASIL, 2006).
3.4 Ciclo Biológico do Parasito
O ciclo biológico de M.ozzardi é do tipo heteroxênico, envolvendo insetos e humanos.
(01) As fêmeas dípteras, ao realizarem o hematofagismo em indivíduos parasitados,
ingerem as microfilárias, que,(02) após poucas horas no estômago do inseto,(03) atravessam a parede do estômago do inseto e (04) migram para o tórax alojando-se nos músculos deste(05 e 06) Em seguida, transformam-se em larvas L1 após 6 a 10 dias. Com o repasto sanguíneo infectante,(07) a larva passa de L1 para L2. Decorridos 10 a 15 dias, a segunda muda que se transforma em larva infectante L3, medindo cerca de 10 µm cuja migração se dá até a probóscide do inseto. Assim que o inseto pratica o próximo repasto,
(08) as larvas L3 saem pelo lábio do inseto e penetram na pele do hospedeiro.
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sete ou oito meses, produzem as primeiras microfilárias que migram para o sangue periférico (Figura 05) (FONTES & ROCHA, 2005).
Figura 05 - Ciclo Biológico de M. ozzardi. Crédito: Prof. Dr. Fábio Barbieri-EMBRAPA-RO
(LEGENDA ITEM 3.4)
3.5 Manifestações Clínicas
Há poucos estudos sobre aspectos clínicos da infecção por M.ozzardi. Os estudos descritos referem-se ao parasito que determina no organismo humano uma moléstia provavelmente benigna, de evolução lenta, paucissintomática e de prognóstico benigno (BATISTA et al, 1960). Apresenta uma sintomatologia correspondente a febre, cefaleia intensa acompanhada de vertigem, dores articulares especialmente nos joelhos e tornozelos, “frieza nas pernas”, adenite ínguino-crural e placas eritematopruriginosas. Em casos menos comuns, pode ocorrer eosinofilia sanguínea, mais evidentes em pacientes com alta parasitemia. Contudo, a maioria dos indivíduos infectados parece que permanece
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assintomática (BATISTA et al., 1960; TAVARES & NETO, 1997; FONTES & ROCHA, 2005).
A patogenia dos sintomas clínicos da mansonelose pode, por sua vez, ser explicada pela irritação local que as filárias vivas ou mortas provocam, bem como pelos fenômenos alérgicos que acarretam. Similarmente, isso ocorre também no caso das demais filarioses (BATISTA et al., 1960).
Além das lesões cutâneas, há algumas evidências que M. ozzardi pode causar lesões oftalmológicas. Essas lesões oculares ocorrem possivelmente pela presença do verme na estrutura ocular do indivíduo, resultando em conjuntivites e lesões corneanas (BRANCO et al., 1998, BELFORT, inf. Pessoal).
3.6 Métodos Diagnósticos de M. ozzardi 3.6.1 Diagnóstico Parasitológico
O diagnóstico definitivo de M. ozzardi pode ser feito através da visualização do parasito no sangue ou por biópsia da pele (NUTMAN, 2001).
O diagnóstico parasitológico possibilita a observação de microfilárias no sangue periférico de indivíduos parasitados. Via de regra, esse tipo de diagnóstico pode ser realizado por meio das seguintes técnicas: gota espessa de sangue, filtração de sangue em membrana de policarbonato e técnica de Knott (FONTES & ROCHA, 2005).
3.6.2 Gota Espessa de Sangue (HGE)
A HGE, também conhecida como esfregaço em camada espessa, é uma técnica bastante utilizada em inquéritos epidemiológicos, por ser de baixo custo e de grande facilidade na obtenção e processamento das amostras. Com essa técnica, é possível realizar a identificação do filarídeo mediante observação das características morfológicas específicas das microfilárias (Figura 06), podendo ser utilizadas em locais onde ocorrem infecções mistas com outros filarídeos (FONTES & ROCHA, 2005) (WHO, 1987).
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Figura 06 - Características diferenciais das microfilárias. Detalhe da porção anterior e posterior das
microfilárias, distribuição dos núcleos, presença e ausência da bainha. Fonte: Leite, 2008
Esse diagnóstico laboratorial se inicia com a coleta, fazendo-se uma punção na polpa digital do anular esquerdo ou lóbulo da orelha, no qual a pele é fina e com excelente irrigação sanguínea. O procedimento inicia-se com a retirada de aproximadamente 60 µL de sangue, sem o uso de anticoagulante, porque esse produto pode levar a uma perda de até 69% das microfilárias (PARTONO & IDRIS, 1977). Em seguida, é feita a gota espessa de sangue. Transcorridas 5 a 10 horas, faz-se a desemoglobinização, cora-se com Giemsa e visualiza-se ao microscópio com aumento de 10 x e 40 x (Figura 07) (FONTES & ROCHA, 2005).
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A HGE apresenta grande sensibilidade quando o indivíduo infectado tem uma microfilarêmia superior a 10 microfilárias/mL (mf/mL) de sangue (FONTES, 1996). Para aumentar a sensibilidade da técnica, recomenda-se confeccionar mais de uma lâmina para cada paciente (FONTES, 1996). Embora a HGE seja uma técnica de cunho qualitativo, é possível estimar a microfilaremia do indivíduo parasitado, ou seja, pode-se realizar um diagnóstico quantitativo com o uso da HGE mensurada. Para tal, usam-se tubos capilares capazes de determinar o volume de sangue necessário para a confecção da lâmina (MS, 2008).
3.6.3 Técnica de Filtração de Sangue em Membrana de Policarbonato (TFMP)
A TFMP (CHULARERK & DESOWITZ, 1970) é uma técnica que avalia a presença de microfilárias. A técnica consiste em um processo de concentração, no qual um volume de sangue (colhido por meio de punção venosa) é filtrado em uma membrana de policarbonato, com poros de 03 µm a 05 µm de diâmetro. Essa membrana retém as microfilárias existentes, deixando os elementos figurados do sangue atravessarem a mesma (FONTES & ROCHA, 2005). A fixação da membrana é feita através de metanol, ou fixador da coloração Panótico (Renylab®), sua coloração com Giemsa e analisada no microscópio com aumento de 10X.
Em virtude da TFMPutilizar uma quantidade maior de sangue (1 a 10 mL), bem maior que a de HGE (60 µl), possibilita uma maior sensibilidade em seu diagnóstico. Assim, a técnica é vantajosa no diagnóstico em pacientes com baixa densidade de microfilárias, bem como em pacientes após tratamento específico (FONTES & ROCHA, 2005; DREYER, 1994). No entanto, a TFMP é uma técnica que requer um corpo técnico capacitado, de relativo alto custo e execução demorada. Por esses motivos, não é uma técnica rotineiramente utilizada (WEIL et, al., 1997).
Conforme Leite (2003), a TFMP é muito mais eficiente que aHGE, visto que o grau de sensibilidade oferecido pelas técnicas são, respectivamente, 98% e 85%. Sendo assim, ao ser utilizada a técnica TFMP, teremos uma chance 8,6 vezes maior de identificar um indivíduo microfilarêmico (Figura 08) (LEITE et al., 2005).
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Figura 8 a Figura 8b
Figura 8 c Figura 8 d
Figura 08 a – Coleta de sangue.
Figura 08 b– Seringa com Holder encaixado para filtração. Figura 08 c - Holder desmontado.
Figura 08 d – Lâmina com membrana já corada. Prof. Dr. Gilberto Fontes/UFSJ
3.6.4 Técnica de Knott
A técnica de Knott foi assim denominada por ter sido descrita por James Knott no ano de 1939. Trata-se da diluição do sangue em formol a 2% em uma proporção de 1:10( uma parte do sangue coletado com EDTA e nove partes de formol à 2%). Em seguida à diluição em formol, a solução é centrifugada e com o sedimento produz-se a lâmina de gota espessa fixada em metanol e corada em Giemsa (FONTES & ROCHA, 2005).
A sensibilidade da técnica de Knott se torna menor em pacientes com baixa microfilaremia, porque as microfilárias são de difícil identificação e misturam-se ao sedimento, interferindo na visualização ao microscópio (Figura 09) (FONTES & ROCHA, 2005).
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Figura 09 - Técnica de Knott. Fonte: Prof. Dr. Gilberto Fontes/UFSJ
3.6.5 Diagnóstico Molecular
3.6.6 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
A técnica da PCR baseia-se em uma metodologia in vitro de amplificar fragmentos de DNA, possibilitando a amplificação específica de uma fita de DNA complementar por meio de um molde de DNA, através de uma simples reação enzimática. Para que a amplificação aconteça é necessário um primer (iniciador), que é composto por oligonucleotídeos com 15-25 nucleotídeos. Esses são desnaturados e adicionados à fita de DNA molde, ligando-se às sequência de DNA complementar. A síntese de novas fitas se dá pela presença de uma DNA polimerase (Taq DNA Polimerase), termoestável, e dos desoxinucleotídeos (dATP, dCTP, dGTP e dTTP). Assim as novas fitas de DNA são produzidas, amplificando a quantidade do fragmento inicial(STRACHAN & READ, 1999).
Com o intuito de contribuir para o diagnóstico da mansonelose e melhorar a identificação específica de M. ozzardi, Morales-Hojas e seus colaboradores (2001) realizaram os primeiros estudos sobre o método da PCR para a detecção de M. ozzardi em 3 biópsias de tecido humano e comprovaram em um reduzido número de pacientes a eficácia da técnica.
27
3.6.7 Sequenciamento de DNA
Com o avanço da genética em todo o mundo, a técnica para o seqüenciamento de DNA é uma inovação que determina, através do estudo de uma sequência nucleotídica ou parte dela, fornecendo informação sobre a expressão gênica tendo, com isso tem um papel fundamental em contribuir para a análise da eficácia da PCR.
3.7 Tratamento
As drogas macro e microfilaricidas (dietilcarbamazina e suramina sódica) não apresentam eficácia para M.ozzardi. No entanto, a Ivermectina (0,2 mg/kg - dose única) é eficiente na eliminação das microfilárias do sangue periférico em 24 horas, em terapia específica, eliminando a microfilaremia por 18 a até 365 dias (TAVARES & NETO, 1997, BASANO, inf. pessoal). A Ivermectina é uma lactona macrocíclica que se liga aos canais de cloro permitindo que os íons de cloreto penetrem nas células do parasito. As células ficam hiperpolarizadas e causam paralisia muscular nas microfilárias de M. ozzardi, levando à morte o parasito(SERVING HISTORY, 2010). Até o momento, embora não haja estudos muito aprofundados, esta é a droga de escolha para o tratamento.
4 METODOLOGIA
Foram selecionados 47 pacientes escolhidos aleatoriamente de um universo de 232 indivíduos diagnosticados com M. ozzardi pela TFMP. Os indivíduos eram habitantes ribeirinhos do município de Lábrea - AM (07o15’S 64o51’W) (Figura 10), área de elevada prevalência da parasitose e que estavam participando do ensaio clínico sobre a eficácia de invermectina em sua terapêutica.
Aspectos Éticos
O presente studo foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade São Lucas, devidamente credenciado ao CONEP, sob o registro AP/CEP/373/09. (Anexo K).
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Figura 10: Munícipio de Lábrea, Amazonas, área de estudo.
4.TÉCNICA HGE
O método HGE foi empregado de acordo com o seguinte procedimento: o sangue foi coletado a partir da polpa digital (equivalente a 60 µL), utilizando-se lancetas descartáveis e, em seguida, preparadas em lâminas de microscopia; posteriormente, deixou-se secar a temperatura ambiente. Logo após, as lâminas foram lavadas em água destilada, fixadas com metanol, coradas com Giemsa e secadas. As lâminas foram examinadas por duas vezes, utilizando-se um microscópio óptico e objetivas ópticas de 10x e 40x por dois profissionais experientes realizando um ensaio cego.
? ? 2 8
29
4.1 TFMP
O método TFMP foi realizado por filtração de 1 mL de sangue venoso com EDTA, previamente diluído com 10 mL de soro fisiológico a 0,9%. A filtração ocorre através de uma membrana de policarbonato com poros de três a cinco micrômetros de diâmetro (Poretics Corporation® - Livermore-EUA), fixadas com metanol e coradas com Giemsa (FONTES & ROCHA, 2005), em seguida as lâminas já previamente fixadas com metanol e coradas foram analisadas por dois profissionais, em ensaio cego, em microsocópio com o aumento de 10 x.
4.2 Técnica da PCR
Na PCR foi realizada a extração de DNA de acordo com as instruções do Kit Quiamp DNA Blood (Quiagen®). As eluições de DNA, mantidas em microtubos, foram conservadas a – 20ºC. O primer utilizado foi produto amplificado da sequência GenBank AF228564, com a
seguinte sequência 5’GAAAGAAGAAGGATTTTTACT3 e primer reverso 3’
CTTTTCCTCCGCTTAATTATA 5’.
Os primers foram verificados quanto a sua especificidade utilizando um programa Primer-Blast disponível no site :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/primerinfo.html,
na busca foram introduzidos os primers e testados contra o banco de sequências de DNA genômico não redundante completo do NCBI(“NR”).Os resultados estão no anexo C, e demonstram a especificidade do par de primers, e que o produto observado nos géis tem o mesmo tamanho do que o resultado apresentado pelos programas sequenciamento.
A amplificação do DNA foi executada sob as seguintes condições: 94º C – quatro minutos (01 ciclo), 94º C – 45 segundos, 55º C – 30 segundos, 72º C – 45 segundos (35 ciclos), 72º C – cinco minutos (01 ciclo), 4º C – tempo final. A Mix da PCR utilizada foi: 14,75 uL H2O, 2,5 uL de tampão 10X, 1 uL de MgCl2, 2uL de primer, 0,25 uL de dNTP, 5 uL de Taq Polimerase e 4uL de DNA. Para a eletroforese foi utilizado gel de poliacrilamida a 8%, obtendo-se um fragmento de 312 pb. A composição do gel de poliacrilamida de 8% em placa pequena com composição final de 20 mL foi: 11 mL de H2O, 6 mL de poliacrilamida 30%, 2 mL de TBE 10X, 15 µL de TEMED e 200 µL de APS com tempo de corrida de duas horas a 200V (Figura 10).
As duas técnicas (TFMP e PCR) foram comparadas com HGE que é técnica usual para diagnóstico de M.ozzardi. Para comparar a eficácia das técnicas, foram usados os seguintes
30
parâmetros: sensibilidade, especificidade, valor preditivo negativo (VPN), e coeficiente kappa de Cohen (Tabela 1). Utilizou-se o software OpenEpi® para análise estatística, com intervalo de confiança de 95%.
Foi utilizado para controle negativo sangue de crianças recém-nascidas (insento de contaminação ). Como controle positivo, foram utilizadas amostras gentilmente cedidas pelo prof Jansen F. Medeiros (INPA), com microfilaremia acima de 200 mf/mm3.
4.3 Técnica de sequenciamento
Foi utilizado o produto da PCR, método clássico de Sanger, em sequenciador automático, para confirmação se o fruto da amplificação da PCR era de fato M. ozzardi, sendo realizado com a colaboraçao dos alunos Leandro Garrido, Lucas Camoana, ICB 2 USP, departamento de Parasitologia, sob a orientação do Prof Dr. Henrique Krieger.
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
A metodologia sugerida para a técnica da extração e PCR sofreu alterações. A extração, inicialmente feita pelo método Iguchi, porém não obteve resultado satisfatório. Foi então testado, sem sucesso, em fenolclorofórmio, com e sem fervura. A partir daí utilizou-se o Kit da Quiagen®, nos quais se obteve frações de DNA purificado, possibilitando melhor amplificação. Para a técnica da PCR as mudanças foram em nível de tempo de anelamento e extensão dos ciclos, no primeiro MIX, utilizou-se 18,3 uL de água, 2,5 uL de tampão buffer, 0,5 uL de dNTPs, 1,5 uL de primer, 0,2 uL de Taq e 02 uL de DNA, com o seguinte ciclo 94°C – 04 minutos, 94°C – 30 segundos (35 vezes), 55°C – 45 segundos (35 vezes), 72°C -01 minuto (35 vezes), 72°C – 05 minutos (ciclo final), com gel de agarose 02 g, a segunda alteração se descreve da seguinte forma, 16,3 uL de água, 02 uL de buffer, 05 uL de Mg Cl, 1,5 uL primers, 0,2 uL de Taq, 0,4 uL de DNA, com o ciclo 94°C – 04 minutos, 94°C – 30 segundos (35 vezes), 55°C – 45 segundos (35 vezes), 72°C – 01 minuto (35 vezes), 72°C – 05 minutos (tempo final), a mudança que foi padronizada e descrita no método utilizado obteve um MIX de 21 uL e com corrida em gel de poliacrilamida a 8%.
Em suma, dos indivíduos que apresentaram resultado negativo para HGE, 62,1% foram positivas pela TFPM. Dos 89,6%, que foram considerados negativos pela HGE,100% apresentaram-se positivos pela técnica de PCR, enquanto que 100% dos positivos pela HGE evidenciaram os mesmos resultados na PCR. Nesse contexto, a PCR mostrou uma alta sensibilidade e VPN sobre o TFMP quando foi comparado com a HGE. No entanto, ambos os
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métodos apresentaram baixa especificidade e baixo coeficiente kappa em comparação com HGE, ratificando a descrepância entre os métodos (tabela 01).
Morales-Hojas et al. (2001) realizou o primeiro estudo utilizando a técnica da PCR na detecção de M. ozzardi, orientando-se pelo método de detecção de parasitas em 51 amostras de tecido de biópsias humanas coletadas de três regiões endêmicas diferentes. A pesquisa comprovou que a PCR é satisfatória no diagnóstico de M. ozzardi em 90% de suas amostras, enquanto o exame parasitológico de sangue apresentou positividade em 83% das amostras. Destarte, considerou a PCR eficiente para o diagnóstico de M. ozzardi, mesmo considerando-se que o estudo não foi populacional e que a técnica utilizada foi em tecido e não em sangue. A despeito dos resultados encorajadores, os custos da PCR são significantemente maiores quando comparada a TFMP. Há ainda que se considerar as dificuldades de se executar a PCR em condições de campo, fator que, sem dúvida, limita sua aplicação.
Tradicionalmente, os estudos de prevalência sobre a ocorrência de M.ozzardi apontam para baixas prevalências em crianças, provavelmente por possuírem baixa concentração de microfilárias (MEDEIROS et al., 2009; 2009a; MARTINS et al., 2010). O uso da técnica em tela pode modificar este perfil, uma vez que detectará mais casos com baixas microfilaremia em crianças.
Figura 11 - Eletroforese em gel de poliacrilamida a 8%: Coluna 1- Indicador de peso molecular de 312 pb;
32
O produto amplificado, sequenciado correspondeu a sequencia alvo, como demonstrado pelo alinhamento utilizando blast (anexo D).
Tabela 01 - Comparação das técnicas
METODO LABORATORIAL HGE POSITIVA HGE NEGATIVA TOTAL
TFMP(POSITIVA) 16 18 34 TFMP(NEGATIVA) 02 11 13 TOTAL 18 29 47 SENSIBILIDADE 88,9% (67,2-96,9) ESPECIFICIDADE 37,9% (22,69-56,0) VPN 84,6% (57,76-95,67) KAPPA 0,2 (0,004-0,40)
TABELA 01 A – PARAMETROS TFMP COMPARADA A HGE.
METODO LABORATORIAL
HGE POSITIVA HGE NEGATIVA TOTAL
PCR POSITIVA 18 26 44 PCR NEGATIVA 0 3 3 TOTAL 18 29 47 SENSIBILIDADE 100% (82,41-100.0) ESPECIFICIDADE 10,3% (3,6-26,4) VPN 100% (43,8-100,0) KAPPA 0,08 (0,03-0,19)
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Estudo recente realizado por Tang e seus colaboradores (2010) e publicados após este estudo vem de encontro com os resultados aqui esboçados, confirmando a eficácia da técnica da PCR na detecção da filária M. ozzardi. A pesquisa afirma a importância da técnica, pois detecta sequências específicas da espécie, podendo diagnosticar quaisquer formas e fases do ciclo de vida das filárias no hospedeiro humano ou em seu vetor. A técnica de extração utilizada pelo autor se compara a utlizada na pesquisa porém, a amplificação se difere em temperatura e extensão dos ciclos, o uso ainda de primer especifico para M.ozzardi e M.
perstans, fato que aumenta a especificidade da técnica. Além disso, a técnica aqui esboçada,
realiza um estudo populacional, enquanto o autor utilizou cinco pacientes positivos em microscopia para PCR na diferenciação da espécie.
Estudo realizado por Degese e colaboradores (2010), em região endêmica da Argentina, compara a técnica de Knott com a PCR, indicando que a PCR demonstra 100% de sensibilidade frente a técnica de Knott, considerando que a baixa parasitemia justifica o fato, o que confirma o que foi descito na pesquisa e considera a técnica de Knott como diagnóstico complementar. Os autores não fazem referência à especificidade do método.
O diagnóstico microscópico é de especial importância, pois diferencia a microscopia do parasita por meio da visualização de membrana, cauda e bainha (quando existente). Em contraste, a PCR não fornece esse parâmetro, visto que a morfologia é perdida possibilitando somente a visualização da amplicação de fragmento específivco de DNA.
Alguns fatos podem explicar a baixa especificidade dos métodos aplicados. No caso da TFMP, o uso de EDTA, que pode destruir até 69% das microfilárias (PARTONO & IDRIS, 1977). pode justificar o fato. A elevada discrepância observada no índice kappa reforça esta hipótese, pois os 2 métodos (HGE e TFMB) são técnicas visuais.
Em relação ao PCR, a baixa especificidade pode ser justificada por: a-) erros no processo de realização da PCR (duração de ciclos e temperatura) , b-) na comparação entre um método molecular e outro de visualização (kappa muito baixo, demonstrando elevada incongruência entre os métodos) c-) e/ou problemas operacionais durante o processo de coleta e armazenamento de material durante o trabalho de campo, uma vez que o sequenciamento genético confirma que o material amplificado pela PCR de fato era M. ozzardi.
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6 CONCLUSÃO
A PCR apresenta maior sensibilidade e menor especificidade em relação a TFMP, quando comparada a HGE.
A PCR apresenta um custo operacional mais elevado em relação as demais técnicas. Excelente técnica para screening de pacientes com baixa parasitemia (banco de sangue, estudos epidemiológicos).
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40
ANEXOS A – E
41
ANEXO A – Artigo publicado na Revista da Sociedade Brasileira de Medicina
Tropical
Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical 44 (3):380-382,mai-jun,2011
Communication/Comunicação
Improvement of a PCR test to diagnose infection by M.ozzardi
Adequação da técnica da PCR para diagnóstico de infecção de M.ozzardi
Luana Janaína Souza Vera1, Sergio de Almeida Basano1,2, Juliana de Souza Almeida Aranha Camargo1,
Andonai Krauze de França3, Ricardo de Godoi Mattos Ferreira4, Almeida Andrade Casseb3, Jansen
Fernandes Medeiros5,6, Gilberto Fontes7 and Luís Marcelo Aranha Camargo1,8
ABSTRACT
Introduction: Mansonelliasis is caused by M.ozzardi. It is widespread in the Amazon region, with a high prevalence. The common exam of thick blood smears stained with Giemsa shows low efficacy levels and has been an obstacle to diagnosing individuals with low blood parasitemia. Methods: In order to increase diagnosis effi cacy, the PCR technique was improved. Results and Conclusions: PCR demonstrated the best performance, with sensitivity and negative predictive values (NPV) of 100%, followed by blood filtration through membrane filters, which showed a sensitivity of 88.9% and a NPV of 84.6%, when compared to thick blood smears.
Keywords: M.ozzardi. Diagnosis. PCR.
RESUMO
Introdução: A mansonelose é uma filariose causada pela
M.ozzardi, ocorrendo na Amazônia com prevalências de até
60%. A técnica de diagnóstico habitual (hemoscopia através da gota espessa) tem baixa eficácia o para o diagnóstico de pacientes com baixa parasitemia. Métodos: Neste contexto foi aperfeiçoada a técnica da PCR para seu diagnóstico. Resultados e Conclusões: Quando comparada à gota espessa, a PCR
apresenta sensibilidade de 100%, e valor preditivo negativo (VPN) de 100% mostrando eficácia bastante superior à técnica da filtração em membrana que apresenta sensibilidade de 88,9% e VPN de 84,6%, quando também comparada à gota espessa de sangue.
Palavras-chaves: M.ozzardi. Diagnóstico. PCR.
The microfilariae of M.ozzardi (Nematode, Onchocercidae) is the etiological agent of the mansonelliasis. The parasite has a geographic distribution limited to the Americas and it is found from Mexico through Argentina, except Chile, Uruguay, and Paraguay1. This filariasis was first
reported in Brazil in the City of Manaus in the State of Amazonas2 and people infected by M. ozzardi were
later identified along the Solimoes, Purus and Negro Rivers3. These findings reinforce many studies that
have warned that M. ozzardi was widely distributed in
the State of Amazonas4, Brazil; however studies
concerning this filariasis remain scarce5-7.
1. Coordenação de Medicina, Faculdade São Lucas, Porto Velho, RO. 2. Setor de Isolamento, Centro de Medicina Tropical de Rondônia, Porto Velho, RO. 3. Laboratório de Genética, Instituto de Pesquisa em Patologias Tropicais, Porto Velho, RO.
4. Laboratório de Estudos em Bioinformática e Bioestatística, Fundação Oswaldo Cruz Noroeste, Porto Velho, RO.
5. Coordenação de Pesquisas em Ciências
da Saúde, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Manaus, AM. 6. Escola Superior de Ciências da Saúde, Coordenação de Medicina, Universidade Estadual do Amazonas, Manaus, AM.
7. Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal de São João Del Rei, Divinópolis, MG.
8. Departamento de Parasitologia, Instituto de Ciências Biomédicas 5, Monte Negro, RO.
Address to: Dr. Luís Marcelo Aranha Camargo. Rua Francisco Prestes s/n,
76888-000
Monte Negro, RO, Brasil. e-mail: spider@icb5usp.med.br
Received in 07/08/2010 Accepted in 16/11/2010
M.ozzardi is transmitted by insects of the families Ceratopogonidae and Simuliidae (Diptera). Up to now, only the Simuliidaes have been identified as vectors in Brazil8,9. Infection symptomatology has
been widely discussed and according to Batista et al10,
people suffering from mansonelliasis present moderate fever, leg coldness, joint aches, dizziness and headaches. Recently, new symptomatology has been attributed to this filariasis, which is characterized by ocular lesions and white rings on the cornea that may eventually cause blindness11.
Typically, microscopic examination of a thick blood smear (TBS) stained with Giemsa, has been the main method used in epidemiological assays. Despite the low efficacy of TBS, particularly for patients with low microfilaremia, it is more economically feasible, promptly and easily obtained, and also permits identification of the parasite species even in locations where intermingled infections by other filariidaes occur12. More laborious and effective methods are
feasible, such as Knott's concentration method (blood lysis by 2% formalin)12,13, and by filtering the blood
42 PMF is considered the gold-standard. Morales-Rojas
et al first suggested polymerase chain reaction (PCR) as an effective method to detect M. ozzardi14.
This study aimed to standardize the PCR for diagnosing M. ozzardi and compare its effectiveness in relation to the PMF, which is considered the gold-standard for diagnosing the disease compared to the traditional TBS method.
Forty-seven patients infected by M. ozzardi were randomly selected from 232 individuals diagnosed by PMF (Poretics Corporation, Livermore, USA). These individuals lived alongside the rivers in the municipality of Labrea, State of Amazonas, Brazil (07o15’S 64o51’W), an area with high prevalence of
mansonelliasis. The TBS method was used according to the following procedure: blood was collected from the digital pulp (equivalent to 0.06mL) using disposable lancets and then prepared on microscope slides and left to dry at room temperature. Next, the slides were washed with distilled water, fixed with methanol, stained with Giemsa and dried off. The slides were then subjected to microscopic examination using optical objectives of 10x and 40x by two professionals in a blind controlled trial. PMF was conducted by filtering 1mL of venous blood previously diluted with saline 0.9% through a polycarbonate membrane filter of 3-micrometer pore diameter size (Poretics Corporation - Livermore-USA)12.
The PCR method was based on the detection of the GenBank AF228564 DNA fragment from M. ozzardi which comprises the partial sequence of the 18S ibosomal RNA gene, the internal transcribed spacer 1, the complete sequence of the 5.8S ribosomal RNA gene and internal transcribed spacer 2 (ITS2) and the partial sequence of the 28S ribosomal RNA gene13.
The forward primer used was 5’GAAAGAAGAAGGATTTTTACT3’ on the ITS2 and the reverse primer used was 5’CTTTTCCTCCGCTTAATTATA3’on the 28S ribosomal DNA. These genes are commonly used for species identification on molecular bases since they comprise highly conserved sequences next to highly variable ones. The primers were verified using the NCBI primer design on-line tool based on the Primer315 software and showed no unintended DNA
products.
Genomic DNA was extracted from the samples according to the instructions of the Quiamp DNA Blood Kit (Qiagen®). Blood samples of newborns from the city of Porto Velho were taken as negative control. The eluted DNA were maintained in microtubules and stored at -20ºC. The following procedure was used to amplify the DNA sequence: the samples were maintained A) at a temperature of 94°C for 4min (1 cycle); B) at 94°C for 45sec; at 55°C for 30sec; 72°C for 45sec (35 cycles); C) 72°C for 5min (1 cycle), and D) 4°C for 1min (final time). The amplification product up to 312bp was viewed on 10% polyacrylamide gel with bromide staining (Figure 1).
FIGURE 1 - Electrophoresis in 10% polyacrylamide gel showing the PCR results for DNA extracted from blood.
M50pb stands for the 50 base pairs size marker, M100bp for the 100 base pairs size marker and the numbered lanes are: 1: sample 709, positive control; 2: newborn 90, negative control; 3-8: samples 704, 708, 711, 712, 714 and 715; 9: sterile water negative control.
Both the PMF and PCR methods were compared to the common method for M. ozzardi diagnosis (TBS). In order to compare the effectiveness of the methods, the following parameters were considered: sensitivity, specificity, negative predictive value (NPV), and Cohen’s kappa coefficient (Tables 1 and 2). The OpenEpi® software was used for statistical analysis, with a confidence interval (CI) of 95%. The project was submitted to the Research Ethics Committee of the São Lucas College, Porto Velho and was approved under the registry number 344/09.
Of the 29 individuals who presented negative by TBS, 62.1% were identified as positive by PMF, while mong the 18 who were positive by the TBS method, 88.9% showed the same results by PMF. On the other hand, TBS diagnosed 2 cases that were not diagnosed by PMF (false-negatives), despite its greater ensitivity. Regarding the PCR technique, 89.6% of those who presented negative by TBS were positive by PCR, while 100% of the positive cases showed the same results by PCR. Thus, the PCR technique showed the greatest sensitivity and NPV, followed by PMF, when compared to TBS. However, both these methods showed low specificity and low kappa coefficient compared to TBS.
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Despite the encouraging results, the cost of PCR is approximately US$8.60 per test, while PMF has a significantly lower cost, US$0.80 (author’s personal information). The difficulties of performing PCR under field conditions must also be taken into account, since this is an important limiting factor in its application. Traditionally, studies concerning the prevalence of the M. ozzardi indicate its low prevalence rate in young individuals6-8, which is
probably due to their low microfilaria concentration. The advent of PCR for mansonelliasis diagnosis, which shows 100% sensitivity, may help correct this bias by providing new epidemiological information on parasitic infections and by promoting the determination of higher prevalence rates.
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