Fundamentos de Imunologia-Roitt

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Roitt

Imunologia

Fundamentos de

Peter J.

Delves

| Seamus J.

Martin

| Dennis R.

Burton

| Ivan M.

Roitt

12

(2)

Roitt

Fundamentos

de Imunologia

Roitt | Fundamentos d

e Imunologia.

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áginas não sequenciais e

em

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Peter J. Delves

O professor Delves concluiu seu doutorado na University of London em 1986 e leciona Imunologia na UCL (University College London). Suas pesquisas têm como foco os aspectos moleculares do reconhecimento dos antígenos. É autor e editor de vários livros de Imunologia e ensina esta disciplina em diferentes níveis de complexidade.

Seamus J. Martin

O professor Martin concluiu seu doutorado na National University of Ireland em 1990 e foi pós-doutorando na University College London (com Ivan Roitt) e no Te La Jolla Institute for Allergy and Immunology, Califórnia, EUA (com Doug Green). Desde 1999, ocupa a Smurﬁt Chair of Medical Genetics do rinity College Dublin e também é diretor pesquisador da Science Foundation Ireland. Suas pesquisas são direcionadas para os vários aspectos da morte celular programada (apoptose) no sistema imune e no câncer, e seus trabalhos nesta área renderam-lhe vários prêmios. Participou como autor de dois livros sobre apoptose e foi eleito como membro da Royal Irish Academy em 2006 e da European Molecular Biology Organisation (EMBO) em 2009.

Dennis R. Burton

O professor Burton formou-se bacharel em Química na University of Oxford em 1974 e concluiu o doutorado em Bioquímica Médica na University of Lund na Suécia em 1978. endo trabalhado por um período na University of Sheﬃeld, transferiu-se em 1989 para o Scripps Research Institute em La Jolla, Califórnia, onde é professor de Imunologia e Biologia Molecular. Seu interesse em pesquisa está voltado para anticorpos, respostas humorais aos patógenos e desenvolvimento de vacinas, principalmente em relação ao HIV.

Ivan M. Roitt

O professor Roitt nasceu em 1927 e realizou seus estudos na King Edward’s School, em Birmingham, e no Balliol College, em Oxford. Em 1956,

juntamente com Deborah Doniach e Peter Campbell, fez a descoberta clássica dos autoanticorpos contra tireoglobulina na tireoidite de Hashimoto, o que ajudou a fundamentar o conceito geral da relação entre autoimunidade e doenças humanas. Esse trabalho desdobrou-se em um estudo intensivo dos fenômenos autoimunes na anemia perniciosa e na c irrose biliar primária. Em 1983, foi eleito membro da Royal Society, membro honorário do Royal College of Physicians e indicado membro honorário da Royal Society of Medicine.

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Roitt

Fundamentos

de Imunologia

Peter J. Delves

PhD

Division of Infection and Immunity UCL — Londres, Reino Unido

Seamus J. Martin

PhD, FCD, MRIA

Te Smurﬁt Institute of Genetics rinity College — Dublin, Irlanda

Dennis R. Burton

PhD

Department of Immunology and Molecular Biology Te Scripps Research Institute — La Jolla, Califórnia, EUA

Ivan M. Roitt

MA, DSc(Oxon), FRCPath, Hon FRCP (Lond), FRS Centre for Investigative and Diagnostic Oncology Middlesex University — Londres, Reino Unido

12ª edição

Tradução

Carlos Henrique de A. Cosendey(Capítulos 1 a 5, 16 a 18 e Glossário) Médico

Cláudia Lúcia Caetano de Araújo(Capítulos 6 a 15) Médica

Revisão técnica

Arnaldo Feitosa Braga de Andrade

Professor Associado do Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia da Faculdade de Ciências Médicas da UERJ. Coordenador Geral de Pós-Graduação da Faculdade de Ciências

Médicas da UERJ. Pós-Doutorado em Imunologia pela ufts University, Boston, MA, EUA.

Doutor e Mestre em Ciências (Microbiologia) pela UFRJ. Graduado em Medicina pela Universidade Federal do Ceará.

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Q Os autores deste livro e a �� . empenharam seus melhores esforços para assegurar que as

informações e os procedimentos apresentados no texto estejam em acordo com os padrões aceitos à época da publicação. Os autores e a Editora não podem ser responsabilizados por quaisquer danos a pessoas ou bens, devido à aplicação incorreta ou uso impróprio do conteúdo apresentado nesta obra, como resultado de qualquer declaração difamatória, violação de propriedade intelectual ou direitos de privacidade, mesmo que decorrente de negligência ou de outra conduta, ou de qualquer uso de ideias, instruções, procedimentos, produtos ou métodos contidos neste material.

Q Os autores desta edição e a Editora se empenharam para citar adequadamente e dar o devido crédito a todos os detentores de

direitos autorais de qualquer material utilizado neste livro, dispondo-se a possíveis acertos posteriores caso, inadvertida e involuntariamente, a identiﬁcação de algum deles tenha sido omitida.

Q ROI’S ESSENIAL IMMUNOLOGY, WELFH EDIION

All Rights Reserved. Authorised translation from the English language edition published by Blackwell Publishing Limited. Responsibility for the accuracy of the translation rests solely with Editora Guanabara Koogan Ltda, and is not the responsibility of Blackwell Publishing Limited. No part of this book may be reproduced in any form without the written permission of the original copyright holder, Blackwell Publishing Limited.

Esta edição é uma publicação por acordo com a Blackwell Publishing Limited, Oxford. raduzida pela Editora Guanabara Koogan Ltda. da versão original na língua inglesa. A responsabilidade pela exatidão da tradução é somente da Editora Guanabara Koogan Ltda, não tendo a Blackwell Publishing Limited nenhuma responsabilidade pela mesma.

Q Direitos exclusivos para a língua portuguesa

EDITORA GUANABARA KOOGAN LTDA.

Uma editora integrante do GEN | Grupo Editorial Nacional

ravessa do Ouvidor, 11

Rio de Janeiro – RJ – CEP 20040-040

els.: (21) 3543-0770/(11) 5080-0770 | Fax: (21) 3543-0896

www.editoraguanabara.com.br | www.grupogen.com.br | editorial.saude@grupogen.com.br

Q Reservados todos os direitos. É proibida a duplicação ou reprodução deste volume, no todo ou em parte, sob quaisquer formas

ou por quaisquer meios (eletrônico, mecânico, gravação, fotocópia, distribuição na internet ou outros), sem permissão expressa da Editora.

Q Capa: Editora Guanabara Koogan

Editoração eletrônica: Imagem Virtual Editoração Ltda.

Q Ficha catalográﬁca

R643r

Roitt, Ivan M. (Ivan Maurice),

1927-Roitt, fundamentos de imunologia /Peter J. Delves ... [et al.]; tradução por Carlos Henrique de A. Cosendey, Cláudia Lúcia Caetano de Araújo; revisão técnica Arnaldo Feitosa Braga de Andrade. — [Reimpr.]. — Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2013.

552p. : il.; 28 cm

radução de: Roitt’s essential immunology, 12th ed. ISBN 978-85-277-2142-4

1. Imunologia. 2. Sistema imunológico. 3. Imunidade. I. Delves, Peter J. II. ítulo. III. ítulo: Fundamentos de imunologia. 12-3377. CDD: 616.079

CDU: 612.017

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Prefácio

Bem-vindo à nova edição do Roitt | Fundamentos de Imunologia ! Quando Ivan escreveu a primeira edição há mais de 40 anos, pretendia que o texto parecesse um diálogo com o leitor, em vez de uma preleção, e decidimos manter esse estilo. Como disciplina, a Imunologia é fascinante e dinâmica, e, para convencê-lo de que este tema é absolutamente merecedor de sua atenção, esta edição foi inteiramente atualizada.

Por esse motivo, além da inclusão de várias ilustrações novas:

Q Ampliamos a descrição dos padrões moleculares associados ao patógeno e ao risco (PAMP & DAMP)

Q Acrescentamos uma seção sobre células dendríticas e sua participação no processamento dos antígenos, incluindo

apresentação cruzada

Q Atualizamos as seções sobre receptores das células B e NK Q Aprofundamos a descrição do tráfego dos linfócitos

Q Incorporamos as últimas descobertas sobre subtipos de células , principalmente T17 e a diversidade

de células  reguladoras

Q Acrescentamos informações mais recentes sobre mecanismos de destruição das células NK e dos linfócitos 

citotóxicos

Q Aprofundamos as explicações sobre os efeitos do envelhecimento nas respostas imunes

Q Reescrevemos praticamente todo o capítulo sobre vacinas, com nova ênfase nos seus mecanismos de ação

convencionais e à base de carboidratos, assim como novas abordagens para o desenvolvimento de vacinas (inclusive vacinologia reversa), avanços efetuados com as vacinas contra malária e ação dos adjuvantes

Q Acrescentamos informações inéditas sobre estados de imunodeﬁciência recém-descobertos, sobre a origem da AIDS e

os inúmeros (e sempre crescentes) fármacos usados em seu tratamento e sobre os resultados alcançados com as mais recentes pesquisas sobre vacinas contra o HIV

Q Esclarecemos as descobertas recentes sobre transformações celulares que resultam em câncer, a manipulação do

sistema imune pelos tumores e as relações entre infecção, inﬂamação e câncer

Q Reescrevemos substancialmente o capítulo sobre doenças autoimunes.

Esperamos que esta leitura seja agradável e proveitosa.

Peter J. Delves Seamus J. Martin Dennis R. Burton Ivan M. Roitt

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Agradecimentos

Os autores são sinceramente gratos à equipe editorial formada por Elizabeth Johnston, Laura Murphy e Cathryn Gates, da Wiley-Blackwell, pelo apoio, e a Ruth Swan, pela gerência de projeto. odos nos sentimos em débito com os coedito-res de Immunology , J. Brostoff, D. Roth e D. Male, e sua editora, Mosby, e com os seguintes autores que nos permitiram utilizar ou modificar suas ilustrações: J. Brostoff e A. Hall pela Figura 15.11; J. Horton pela Figura 11.19; e J. Taverne pelas Figuras 12.23 e 12.24.

IMR gostaria de agradecer à secretária Christine Griﬃn pela ajuda incansável.

DRB deseja agradecer principalmente a Amandeep Gakhal, Erin Scherer, Rena Astronomo e Wendellien Oswald, pela inestimável contribuição, e a Jenny Woof, Ann Freeney, Beatrice Hahn, Jim Marks, Don Mosier, Paul Sharp, Robyn Stanﬁeld, James Stevens e Mario Stevenson, pelos comentários utilíssimos.

PJD gostaria de agradecer especialmente a Per Brandtzaeg, Volker Bringkmann, Greg Campbell, Peter Lydyard, Rand Swenson e Ulrich Wahn.

SJM é grato especialmente a Ed Lavelle, Sean Cullen, Cristina Munoz-Pinedo e a todos os membros do seu laboratório pelos comentários, pelas sugestões e pelo apoio, bem como a Mia, Madeleine e Jamie, pelo apoio e pela tolerância. Alguns pesquisadores cederam generosamente ilustrações para esta edição, e expressamos nossa gratidão incluindo seus

nomes nas legendas das ﬁguras pertinentes.

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Abreviaturas

(sc)Fv Fragmento de ligação de antígeno V H + V L (cadeia

única)

5H 5-hidroxitriptamina

AARMD Agente antirreumático modiﬁcador de doença

AAV Vírus adenoassociado

Ac Anticorpo

ACh-R Receptor de acetilcolina

AC ransferência adotiva de células

ACH Hormônio adrenocorticotróﬁco

ADA Adenosina desaminase

ADCC Citotoxicidade celular dependente de anticorpos

AEP Asparagina endopeptidase

Ag Antígeno

AID Citidina desaminase induzida por ativação

AIDS Síndrome de imunodeﬁciência adquirida

AIRE Regulador autoimune

ALBA Addressable laser bead assay

ANCA Anticorpos contra citoplasma de neutróﬁlos

APC Célula apresentadora de antígeno

AR Artrite reumatoide

ARRE-1 Elemento responsivo 1 de receptor de antígeno ARRE-2 Elemento responsivo 2 de receptor de antígeno

AR erapia antirretroviral

ASFV Vírus da febre suína africana

AZ Zidovudina (3'-azido-3'-desoxitimidina)

BAFF Fator ativador de células B da família do fator de necrose tumoral

BCG Forma atenuada do bacilo Calmette-Guérin da tuberculose

BCR Receptor de células B

BSA Albumina sérica bovina

Btk irosinoquinase de Bruton

BUDR Bromodesoxiuridina

C Complemento

Ca(b/g/d) Parte constante da cadeiaa (b/g/d) do receptor de

células  (CR)

Cadeia J Cadeia polipeptídica no dímero de IgA e IgM

CALLA Antígeno comum da leucemia linfoblástica aguda

cAMP Monofosfato de adenosina cíclico

CCP Proteína de controle do complemento

CD Conjunto de diferenciação

CDR Regiões determinantes de complementaridade da

porção variável da imunoglobulina ou do receptor de células 

CEA Antígeno carcinoembrionário

Célula B Linfócito que amadurece na medula óssea Célula  Linfócito derivado do timo

CFA Adjuvante completo de Freund

cGMP Monofosfato de guanosina cíclico

CGS Cromoglicato sérico

CH(L) Região constante da cadeia pesada (leve) das

imunoglobulinas

ChIP Imunoprecipitação de cromatina

CHIP Proteína inibidora da quimiotaxia

CLA Antígeno cutâneo associado ao linfócito

CLIP Peptídio de cadeia invariante associado à classe II

CMV Citomegalovírus

CMVH Citomegalovírus humano

Cn Componente “n” do complemento

Cn Componente “n” ativado do complemento

Cna Pequeno peptídio derivado de ativação proteolítica de Cn

CpG Motivo dinucleotídico fosfato de citosina-guanosina

CR(n) Receptor do componente “n” do complemento

CRP Proteína C reativa

CSR roca recombinante de classe

CLR Receptor de lectina do tipo C

DAF Fator acelerador do decaimento

DAG Diacilglicerol

DAMP Padrão molecular associado a risco

DCJv Doença de Creutzfeldt-Jakob variante

DII Doença intestinal inﬂamatória

DMID Diabetes melito insulinodependente

DNP Dinitrofenil

DO Densidade óptica

DH Hipersensibilidade do tipo tardio

DP Vacina contra difteria, tétano e coqueluche

EAIE Encefalomielite autoimune (alérgica) experimental

EBV Vírus Epstein-Barr

EEB Encefalopatia espongiforme bovina

EE Encefalopatia espongiforme transmissível

ELISA Ensaio imunossorvente ligado à enzima

EM Esclerose múltipla

EF Eosinóﬁlo

EPE Exotoxinas piogênicas estreptocócicas

EPO Eritropoetina

ES Célula-tronco embrionária

F(ab’)2 Fragmento divalente de imunoglobulina que se liga

ao antígeno após digestão por pepsina

F(B) Fator (B etc.)

Fab Fragmento monovalente de imunoglobulina que se liga ao antígeno após digestão por papaína

FACS Separador de células ativado por ﬂuorescência

FasL Ligante de Fas

Fc Originalmente, fragmento de imunoglobulina que

podia ser cristalizado; atualmente, parte não Fab da imunoglobulina

FC Fator de célula 

FcgR Receptor de fragmento Fc da IgG

Flt-3 irosinoquinase 3 semelhante a FMS

FR Fator reumatoide

g.v.h. Enxertoversus hospedeiro

GADS Proteína adaptadora relacionada com GRB2

G-CSF Fator estimulador de colônias de granulócitos GEF Fatores de troca de nucleotídio guanina

GeneD Minigene de diversidade que conecta os segmentos V e J para formar a região variável

Gene J Gene que liga o segmento V ou D à região constante

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x Fundamentos de Imunologia

GeneV Gene da região variável para receptor de imunoglobulina ou célula 

GM-CSF Fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos

gpn Glicoproteína comnkDa

GRB2 Proteína 2 de ligação ao receptor de fator do crescimento

GSK3 Glicogênio sintase quinase 3

H-2 Complexo principal de histocompatibilidade do camundongo

H-2D/K/L (A/E) Loci principais para a classe I clássica (classe II) de moléculas MHC murinas

HAMA Anticorpos humanos contra camundongos

HAA Anticorpo humano antitoxina

HBsAg Antígeno de superfície do vírus da hepatite B

HCG Gonadotroﬁna coriônica humana

HEL Lisozima de ovo de galinha

HEV Endotélio de parede alta de vênula pós-capilar

HIV Vírus de imunodeﬁciência humana

HLA Complexo principal de histocompatibilidade

humana HLA-A/B/C (DP/

DQ/DR) Loci moléculas MHC humanas principais para a classe I clássica (classe II) de

HMG Grupo de alta mobilidade

HPN Hemoglobinúria paroxística noturna

HRF Fator de restrição homólogo

HSA Antígeno termoestável

HSC Célula-tronco hematopoética

hsp Proteína do choque térmico

HLV Vírus de leucemia de células  humano

H-Y Antígeno de transplante masculino

ICAM-1 Molécula de adesão intercelular 1

iCn Componente “n” inativado do complemento

Id (aId) Idiótipo (anti-idiótipo)

IDC Células dendríticas interdigitadas

IDO Indolamina 2,3-dioxigenase

IFNa Interferona (também IFNb, IFNg)

IFR Fator regulado por interferon

Ig Imunoglobulina

Ig a/Ig b Cadeias peptídicas de membrana associadas a sIg

(receptor de célula B)

IgG Imunoglobulina G (também IgM, IgA, IgD, IgE)

IgIV Imunoglobulina intravenosa

IgSF Superfamília de imunoglobulina

IL-1 Interleucina-1 (também IL-2, IL-3 etc.)

IL Irradiação linfoide total

iNOS Sintase do óxido nítrico induzível

IP3 rifosfato de inositol

ISCOM Complexo imunoestimulante

IAM Motivo de ativação baseado na tirosina do imunorreceptor

IIM Motivo de inibição baseado na tirosina do imunorreceptor

JAK Janus quinases

Ka (d) Constante de aﬁnidade de associação (dissociação) (geralmente reações Ag-Ac)

kDa Unidades de massa molecular em quilodáltons KIR Receptoreskiller semelhantes à imunoglobulina KLH Hemocianina de caracol marinho ( Megathura

crenulata )

LAK Célulakiller ativada por linfocina

LAMP Proteínas de membrana associadas ao lisossomo

LA Conexão para ativação de células 

LAS Estimulador tireóideo de ação prolongada

LBP Proteína ligadora de LPS

LCMV Vírus da coriomeningite linfocítica Lea/b/x _{Antígenos do grupo sanguíneo de Lewis}a/b/x

LES Lúpus eritematoso sistêmico

LFA-1 Antígeno funcional linfocitário 1

LGL Grande linfócito granular

LHRH Hormônio liberador do hormônio luteinizante

LIE Linfócito intraepitelial

LIF Fator inibidor de leucemia

LLA- Leucemia linfoblástica aguda 

LMC Linfólise mediada por células

LPS Lipopolissacarídio (endotoxina)

LRR Repetição rica em leucina

L(B) Leucotrieno (B etc.)

mAb Anticorpo monoclonal

MAC Complexo de ataque à membrana

MadCAM Molécula de adesão celular da mucosa (adressina) MAL ecido linfoide associado à mucosa

MAM Mitógeno de Mycoplasma arthritidis

MAP quinase Proteinoquinase ativada por mitógeno

MAPKKK Multiproteinoquinase ativada por mitógeno

MBG Membrana basal glomerular

MBL Lectina ligadora de manose

MBP Proteína básica principal de eosinóﬁlos (também

denominada proteína básica mielínica)

MCP Proteína cofator de membrana (regulação de

complemento)

MCP-1 Proteína quimiotática 1 de monócitos

M-CSF Fator estimulador de colônias de macrófagos

MDP Muramil dipeptídio

ME Microscópio eletrônico

MHC Complexo principal de histocompatibilidade

MICA Cadeia A relacionada com MHC classe I MIDAS Local de adesão dependente de íons metálicos MIF Fator inibidor da migração de macrófagos MIIC Compartimentos enriquecidos de MHC classe II

MLA Monofosforil lipídio A

MLR Reação linfocitária mista

MMV Vírus de tumor mamário de camundongo

MO Medula óssea

MRSA Staphylococcus aureus resistente a meticilina

MSC Célula-tronco mesenquimatosa

MSH Hormônio estimulador de melanócitos

MP Proteína microssômica de transporte de

triglicerídios

MuLV Vírus da leucemia murina

MF Macrófago

NADP Nicotinamida adenina dinucleotídio fosfato

NAP Peptídio ativador de neutróﬁlos

NB Nitroazul de tetrazólio

NCF Fator quimiotático de neutróﬁlos

NFA Fator nuclear de células  ativadas

NFkB Fator de transcrição nuclear

NK Célulasnatural killer

NLR Receptor NOD (nod-like receptor )

NOD Camundongo diabético não obeso

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Fundamentos de Imunologia xi

NO

.

Óxido nítrico

NZB Camundongo negro da Nova Zelândia

NZB × W Camundongo negro da Nova Zelândia × híbrido

branco F1 da Nova Zelândia

.

_O₂ _{Ânion superóxido}

ORF Estrutura de leitura aberta

OS Cepa de frangos obesos

Ova Ovalbumina

PAF(-R) (Receptor) de fator ativador de plaquetas PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida PAMP Padrão molecular associado ao patógeno

PCA Anaﬁlaxia cutânea passiva

PCR Reação da cadeia da polimerase

PERV Retrovírus endógenos de porco

PG(E) Prostaglandina (E etc.)

PHA Fitoemaglutinina

phox Fagócito oxidase

PI3K Fosfatidilinositol 3-quinase

PIAS Proteína inibidora de SA ativado

pIgR Receptor de Ig polimérica

PIP2 Fosfatidilinositol difosfato

PKC Proteinoquinase C

PKR Proteinoquinase dependente de RNA

PLC Fosfolipase C

PLCg2 Fosfolipase Cg2

PMN Neutróﬁlo polimorfonuclear

PPD Derivado proteico puriﬁcado do Mycobacterium tuberculosis

PRR Receptores de reconhecimento de padrão

PFE Politetraﬂuoroetileno

PI Púrpura trombocitopênica idiopática

PK Proteína tirosinoquinase

PWM Mitógeno da erva-dos-cancros (Phytolacca americana )

RANES Regulado por meio de ativação de quimiocina

expressa e secretada por célula  normal

RAS este radioalergossorvente

RE Retículo endoplasmático

RH Resposta de hipersensibilidade

Rh(D) Grupo sanguíneorhesus (D)

RIP Promotor de insulina de rato

RLR Receptor helicase semelhante a RIG

RNAi Interferência no RNA

ROI Intermediários de oxigênio reativos

RSA Resistência sistêmica adquirida

RSS Sequência de sinal de recombinação

SAP Amiloide sérico P

SAP Proteína ativadora de esﬁngolipídio

SARS Síndrome respiratória aguda grave

SARS-CoV Coronavírus associado à SARS

SC Componente secretor da Ig

SCF Fator de célula-tronco

scFv Fragmento da região variável de cadeia única do anticorpo (V H + V L unidas por um ligante ﬂexível)

SCID Imunodeﬁciência combinada grave

SDF Fator derivado do estroma

SDS Dodecil sulfato de sódio

SDS-PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio

SEA (B etc.) Enterotoxina A deStaphylococcus aureus

(enterotoxina B etc.)

SEREX Análise sorológica de bibliotecas de expressão de cDNA recombinante

sIg Imunoglobulina de superfície

siRNA RNA de interferência curto

SIV Vírus da imunodeﬁciência de símios

SLI Imunoterapia alergênica por via sublingual

SLP76 Domínio SH2 (com 76 kDa) contendo proteína de leucócito

SOCs Supressor de sinalização de citocina

SRID Imunodifusão radial simples

SSA Superantígeno estreptocócico

SA ransdutor de sinal e ativador de transcrição ACI Interagente de ativador transmembrana e

modulador de cálcio e ligante de cicloﬁlina [CAML]

AP ransportador associado ao processamento de antígeno

B uberculose

c Célula  citotóxica

CR1(2) Receptor de células  com cadeiasg/d (com cadeias a/b)

d Desoxinucleotidil transferase terminal

FM ubo fotomultiplicador

G-A-L Polilisina com cadeias laterais polialanil com ligações aleatórias com tirosina e ácido glutâmico

GFb Fator transformador do crescimento-b

T(1/2/3/9/17) Células  auxiliares (subpopulação 1, 2, 3, 9 ou 17)

HF Fator tumoral tímico

Tp Precursor de célula  auxiliar

LR Receptorestoll-like

M ransmembrana

NF Fator de necrose tumoral

NP rinitrofenol

PO rombopoetina

reg Célula  reguladora

s Célula  supressora

SAb Anticorpos tireoestimulantes

SH(R) Hormônio tireoestimulante (receptor)

SLP Linfopoetina do estroma tímico

SS oxina da síndrome do choque tóxico

UNEL Marcação terminal de dUP (desoxiuridina

trifosfato) mediada por d

VCAM Molécula de adesão da célula vascular

VCP Proteína contendo valosina

VEGF Fator de crescimento da célula endotelial vascular

V H Parte variável da cadeia pesada da Ig

VIMP Proteína de membrana que interage com VCP

VIP Peptídio intestinal vasoativo

V L Parte variável da cadeia leve da Ig

VLA Antígeno muito tardio

VLP Partícula semelhante a vírus

VNR Número variável de repetições seriadas

VP1 Peptídio 1 vírus-especíﬁco

V a(b/g/d) Parte variável da cadeiaa(b/g/d) do CR

V k/l Parte variável da cadeia levek/l

XL Ligado ao X

ZAP-70 Proteína de 70 kDa associada à cadeia zero

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Bem-vindo à nova edição do

Roitt | Fundamentos de Imunologia

. Nesta página, você saberá como

aproveitar ao máximo todos os recursos de aprendizagem disponíveis neste livro.

Como usar este livro

Cada capítulo tem sua própria página de abertura, com os tópicos principais que serão abordados e seções intituladas

Para lembrar _{, que oferecem conceitos essenciais sobre o}

tema.

Ao longo de todo o texto, você encontrará quadros co m Marcos Históricos, indicados pelo ícone ao lado, que apresentam avanços fundamentais para a Imunologia.

O livro de texto está repleto de fotografias, ilustrações e tabelas para melhor visualização e compreensão do conteúdo.

MΦ

Guia do leitor

Linfócito pequeno Plasmócito Mastócito Macrófago (MΦ) Leucócito polimorfonuclear (polimorfo) Origina Inibe/destrói Estimula Via bloqueada

Ao final de cada capítulo há um resumo para estudo e revisão.

Esperamos que faça uma boa leitura.

Boa sorte em seus estudos!

Guia para o leitor

Em todas as ilustrações, foram usadas formas padronizadas para as células e as vias que mais se repetem. A legenda a seguir apresenta o significado de cada forma.

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Material

Suplementar

Este livro conta com os seguintes materiais suplementares:

Q Questões de múltipla escolha

Q Ilustrações da obra em formato de apresentação (restrito a docentes)

Para ter acesso a esse conteúdo, que é gratuito, o docente ou leitor deve se cadastrar em http://gen-io.grupogen.com.br. Além disso, para que este material especíﬁco seja válido, é necessário que se informe o código existente na etiqueta colada na parte

interna da capa do livro.

GEN-IO (GEN | Informação Online) é o repositório de material suplementar e de serviços relacionados com livros publicados pelo GEN | Grupo Editorial Nacional, o maior conglomerado brasileiro

de

Guanabara Koogan, Santos, Roca, AC Farmacêutica, Forense, Método, LTC, E.P.U. e Forense Universitária.

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Parte 1: Fundamentos de Imunologia

1. Imunidade Inata

3 2. Imunidade Adquirida Específica

36 3. Anticorpos

54 4. Receptores de Membrana para Antígenos

80 5. Interação Primária com o Antígeno

116 6. Métodos Imunológicos e suas Aplicações

146 7. Anatomia da Resposta Imune

195 8. Ativação de Linfócitos

212 9. Produção de Efetores

234 10. Mecanismos de Controle

272 11. Ontogenia e Filogenia

292 Parte 2: Imunologia Aplicada

12. Estratégias Concorrentes durante a Infecção

323 13. Vacinas

356 14. Imunodeficiência

380 15. Alergia e Outras Hipersensibilidades

406 16. Transplante

436 17. Imunologia dos Tumores

459 18. Doenças Autoimunes

492 Glossário

529 Índice Alfabético

541 Sumário

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Capítulo 6

Métodos Imunológicos

e suas Aplicações

Tópicos principais

Produção programada de anticorpos 147 Purificação de antígenos e anticorpos por cromatografia de afinidade 154 Modulação da atividade biológica por anticorpos 154 Imunodetecção de antígenos em células e tecidos 155 Detecção e quantificação de antígenos por anticorpos 162

Mapeamento de epítopos 167

Estimativa de anticorpos 168

Detecção da formação de imunocomplexos 174 Isolamento de subpopulações de leucócitos 175 Análise da expressão gênica 177 Avaliação da atividade funcional 178 Manipulação do sistema imune em modelos animais 183 Uso da engenharia genética em células e organismos modelos 185 Terapia gênica em seres humanos 188

Para lembrar

Agora que o leitor conhece bem todos os principais elementos dos sistemas imunes inato e adaptativo, é recomendável avaliar como é possível manipular esses elementos in vitroe in vivo, seja em busca de ampliar o conhecimento sobre a imunidade, seja para a elaboração de reagentes (basicamente com o emprego de anticorpos) que possam ser usados em uma imensidão de aplicações. Também é muito útil saber como os imunologistas desvendam o conhecimento que nós, com coragem, tentamos resumir nestas páginas. Esperamos que os métodos e as aplicações descritos neste capítulo

expliquem, em termos práticos, como se mede a produção de citocinas por subgrupos de células T, a produção de anticorpos por células B, a apoptose induzida por células NK e assim por diante.

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Capítulo 6 | Métodos Imunológicos e suas Aplicações 147

Introdução

Este capítulo é organizado de modo a avançar das técnicas moleculares para as celulares e, depois, para o emprego de animais. A princípio, descreveremos como é possível produzir e purificar anticorpos, usá-los para purificar seu antígeno específico a partir de misturas complexas de antígenos, empregá-los na simulação funcional de ligantes naturais a fim de estimular a função celular ou, ao contrário, inibir funções específicas, além de muitas outras aplicações. Em seguida, atentaremos para uma série de variações sobre o tema do uso de anticorpos para detectar antígenos em células, tecidos, líquidos e suportes sólidos (como arranjos de proteínas) e investigaremos como é possível mapear as regiões distintas em um antígeno reconhecidas por anticorpos ou receptores das células T (i. e., seus epítopos específicos). A segunda metade do capítulo é dedicada a métodos celulares, empregados para avaliar a funcionalidade e as interações entre células do sistema imune. Explicaremos como é possível isolar células do sistema imune, identificar seu fenótipo, fazer sua avaliação funcional e manipulá-las geneticamente, tanto in vitro quanto in vivo. Depois, veremos alguns dos modelos animais usados com frequência por imunologistas e como é possível produzir animais modificados por engenharia genética.

Muitos dos procedimentos expostos neste capítulo foram meticulosamente desenvolvidos e aperfeiçoados por várias gerações de imunologistas e variam de fáceis a muito complexos. Convém lembrar que, quando fazemos afirmações como “foi gerado um anticorpo”, o trabalho implicado costuma exigir muitos meses ou até anos. Do mesmo modo, enquanto bastam dois segundos para dizer “knockout do gene X no camundongo”, você pode ter certeza de que o procedimento ocupou alguém durante alguns anos.

Produção programada de anticorpos

Além de serem muito convenientes para a proteção do corpo contra agentes infecciosos nocivos, os anticorpos também são reagentes incrivelmente úteis e extraordinariamente específi-cos para detecção e quantificação de outras proteínas e de muitas outras substâncias. Os anticorpos têm, literalmente, numerosas aplicações práticas, que abrangem a purificação de proteínas por meio de colunas de afinidade com anticorpos, a detecção de hormônios circulantes em amostras de sangue ou urina para diagnóstico clínico, a exploração da expressão e da localização subcelular de proteínas, a imunoterapia no câncer e o uso como antídotos em picadas de cobra e aranha. Na verdade, para o cientista pesquisador, é muito difícil ima-ginar um mundo sem anticorpos, pois essas moléculas são usadas dia a dia como sondas muito específicas e confiáveis para detecção de quase todas as proteínas existentes sob o sol, em um sem-número de contextos. Devemos agora atentar, em termos práticos, para o mecanismo de produção em labo-ratório dessas proteínas de maravilhosa adaptabilidade. Geração de anticorpos policlonais

Embora seja possível produzir anticorpos contra quase todas as substâncias orgânicas, algumas moléculas incitam respostas de anticorpos com muito mais rapidez que outras. De modo geral, as proteínas são excelentes imunógenos (i. e., substân-cias que provocam resposta imune), embora quase sempre a resposta imune seja concentrada contra pequenas regiões da proteína (chamadas epítopos ou determinantes antigênicos) que abrangem cerca de cinco a oito aminoácidos. Como já comentamos (veja o Capítulo 5), epítopo é a estrutura mínima

necessária para o reconhecimento por anticorpos, e uma molécula relativamente grande, como uma proteína, c ostuma conter muitos epítopos. Desse modo, a injeção do antígeno médio em um animal quase sempre induz a produção de uma mistura de anticorpos contra diferentes epítopos no antígeno. Também possível que alguns anticorpos nessa mistura sejam direcionados contra epítopos também existentes em outros antígenos. Diz-se que esses anticorpos apresentam reatividade cruzada contra o outro antígeno ao qual se ligam. As peque-nas moléculas orgânicas costumam ser imunógenos insatisfa-tórios quando injetadas sozinhas; o sistema imune parece ser incapaz de reconhecer com eﬁciência essas estruturas. Apesar disso, os imunologistas descobriram que é possível tornar essas moléculas visíveis para o sistema imune mediante ligação covalente a uma proteína carreadora, como a albumina sérica bovina (BSA, do inglês, bovine serum albumin), que tem imunogenicidade intrínseca. Essas pequenas moléculas são denominadas haptenos (veja a Figura 5.6).

A técnica convencional de produção de anticorpo contra uma proteína de interesse é a injeção de pequenas amostras da proteína (da ordem de microgramas) em um animal como o coelho. No entanto, a administração do antígeno raramente é suﬁciente para provocar uma resposta imune vigorosa, mesmo quando o antígeno contém alta proporção de deter-minantes estranhos; é necessária a coadministração de um adjuvante (Figura 6.1). Ainda que não esteja totalmente claro o mecanismo de ação dos adjuvantes, um papel importante é ativar as células dendríticas (DC, do inglês, dendritics cells ) e outras células apresentadoras de antígeno ( APC, do inglês, antigen-presenting cells ) no local de implantação do antígeno (veja a p. 31). O Capítulo 1 explicou que a ativação

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Capítulo 6 | Métodos Imunológicos e suas Aplicações 153 Glutamato Alanina b _{Anticorpo original} Arginina Fenilalanina + + – Ab Ag Ab Ag φ φ Imunotoxina d Toxina F(ab’)₂ c

a _{Fragmento Fv de cadeia única} N C N C V_H V_L V_L

Mutante com afinidade aumentada N N C C V_H1 V_H2 V_L1 V_L2 V_H

Anticorpo bivalente biespecífico (diabody )

Figura 6.5 Outros anticorpos produzidos por engenharia genética. (a) Um único gene que codifica VH e VL unidas por uma sequência de comprimento adequado dá origem a um fragmento de ligação a antígeno de cadeia única Fv (scFv). (b) A

mutagênese local-específica de resíduos na região determinante de complementaridade (CDR) ou em suas adjacências possibilita o aumento da afinidade do anticorpo. (c) Duas construções de ScFV expressas simultaneamente associam-se para formar um

anticorpo bivalente com duas especificidades (diabody ). Esses anticorpos biespecíficos têm vários empregos. Note que um

anticorpo biespecífico (Ac) contra dois epítopos diferentes no mesmo antígeno (Ag) tem afinidade muito maior em razão do “bônus” da cooperação entre os dois locais de ligação (veja a p. 126). (d) Podem-se construir possíveis “balas mágicas” pela fusão do gene para uma toxina (p. ex., ricina) com Fab.

ralhamento” de genes no qual um gene V H que codiﬁca um

anticorpo de aﬁnidade razoável é combinado aleatoriamente a um pool de genes V L e submetido à seleção antigênica. O

processo pode ser ainda mais ampliado pela mistura de V L

proveniente dessa associação com um pool de genes V H .

Também se mostrou possível embaralhar CDR individuais entre regiões variáveis de anticorpos de aﬁnidade moderada obtidos por panning em antígeno, assim criando anticorpos de alta aﬁnidade a partir de coleções relativamente peque-nas. O isolamento de fragmentos V HH de cadeia pesada de

alta aﬁnidade de anticorpos de lhamas imunizados é mais uma técnica.

Outros novos anticorpos foram criados. Em uma constru-ção, dois fragmentos scFv associam-se para formar um anti-corpo com duas especiﬁcidades diferentes (Figura 6.5c). Outra é constituída por um domínio de região variável de cadeia pesada única (DAB) cuja aﬁnidade pode ser muito alta

— da ordem de 20 nM. Caso se conseguisse superar a “ade-sividade” desses minianticorpos, seria possível explorar seu pequeno tamanho para a penetração tecidual. A criação de possíveis “balas mágicas” para imunoterapia pode empregar a fusão de uma toxina (p. ex., ricina) com um anticorpo Fab (Figura 6.5d).

Campos de anticorpos

Os genes para um anticorpo monoclonal podem ser expres-sos em grande quantidade não só no leite de animais lac-tantes, mas também os vegetais podem ser aproveitados com esse objetivo. Os “planticorpos”foram expressos em

banana, batata e tabaco. É possível imaginar um fazendeiro que emprega tecnologia de ponta e chama a atenção de um visitante confuso para um campo de cultivo de toxoide antitetânico, outro de polissacarídio antimeningocócico e assim por diante. Vegetais multifuncionais seriam muito

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156 Fundamentos de Imunologia

Nãotratadas anti_-Fas

Figura 6.7 Ativação do receptor induzida por anticorpo. Células T Jurkat transformadas foram divididas em dois grupos: um não

tratado e o outro tratado com anticorpo IgM anti-Fas durante 4 horas. A ligação cruzada do receptor Fas (CD95) ao anticorpo ativa o receptor e inicia uma cascata de transdução que culmina na ativação de uma série de cisteína proteases, chamadas caspases, que provocam apoptose na célula estimulada. As células apoptóticas exibem vesículas na membrana plasmática e colapso da célula em pequenos fragmentos ou vesículas chamadas “corpos apoptóticos”. Efeitos semelhantes são observados quando o ligante natural, FasL, é usado no lugar do anticorpo anti-Fas. (Gentilmente cedida pelo Dr. Colin Adrain, Dept. of Genetics, Trinity College, Dublin, Irlanda.)

a distribuição de um autoantígeno tireoidiano que reage com os autoanticorpos existentes no soro de um paciente com doença de Hashimoto, um tipo de doença autoimune da tireoide. O processo exigiria o isolamento da IgG do soro do paciente, conjugação com ﬂuoresceína e aplicação a um corte de tireoide humana sobre lâmina. O exame ao microscópio de ﬂuorescência mostraria a coloração brilhante do citoplasma das células epiteliais foliculares (veja a Figura 18.1a).

Vejamos outro exemplo para ilustrar a versatilidade dessa técnica. Acabamos de produzir um anticorpo monoclonal contra um fator de transcrição (NFkB, por exemplo)

impor-tante para a ativação de macrófagos induzida por LPS e a produção de IL1b. Poderíamos comparar macrófagos em

repouso com macrófagos tratados com LPS para veriﬁcar se o fator de transcrição tem alguma ação “interessante” após exposição dos macrófagos ao LPS. O Capítulo 1 (veja a Figura 1.9) mostrava que NFkB normalmente está preso no

citoplasma e seu acesso ao núcleo é impedido pela interação

com seu inibidor, IkB. Após a estimulação do receptor

TLR4 com LPS, é acionada uma cadeia de eventos de trans-dução de sinal que culmina na degradação de IkB, o que

libera NFkB para translocação até o núcleo e início da

transcrição gênica (veja a Figura 1.9). Assim, ao usarmos um anticorpo contra NFkB observaríamos que, embora os

macrófagos em repouso contenham grande quantidade de NFkB, ele parece estar todo no citoplasma. Entretanto,

certamente notaríamos que em poucos minutos depois da exposição ao LPS, quase todo o NFkB havia entrado no

núcleo (Figura 6.9).

O uso de dois (ou mesmo três) antissoros conjugados com corante que emitem fluorescência em diferentes comprimen-tos de onda (Figura 6.10) torna possível a identificação simul-tânea de vários antígenos diferentes ao mesmo tempo. Na Figura 2.7e, a coloração direta de plasmócitos fixados com uma mistura de anti-IgG marcada com rodamina e anti-IgM conjugada com fluoresceína mostra, de modo engenhoso, que

Fluoresceína Lâmina Antígeno Corte de tecido a Luz excitante Anticorpo não marcado Anticorpo marcado com fluoresceína Anti-imunoglobulina marcada com fluoresceína Antígeno Anticorpo em_plasmócito c

b

Teste direto Teste indireto Teste sanduíche

Figura 6.8 A base dos testes de anticorpos por fluorescência para identificação de antígenos teciduais ou seus anticorpos. =marcado

com fluoresceína

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158 Fundamentos de Imunologia Contraste de fase Composto Citocromo c Tubulina Figura 6.11 Microscopia de imunofluorescência confocal.

Célula HeLa humana imunocorada com anticorpo anti-b-tubulina de camundongo detectada com Ig

anticamundongo marcada com FITC (verde) e anticorpo anticitocromoc de coelho

detectado com Ig anticoelho marcada com vermelho do Texas (vermelho). As células também foram coradas pelo corante de ligação do DNA, DAPI (azul). A figura também mostra uma imagem em contraste de fase da mesma célula para comparação. As imagens foram adquiridas com microscópio confocal Olympus Fluoroview 1.000. (Cortesia da Dra. Petrina Delivani, Dept. of Genetics, Trinity College Dublin, Irlanda.)

a nitidez da imagem é muito maior que na microscopia de imunofluorescência convencional (Figura 6.11). Uma unidade de varredura X-Y possibilita a avaliação quantitativade todo o plano da amostra e, com recursos ópticos adequados, é possível fazer o uso simultâneo de três ou quatro fluorocromos diferen-tes. Osoftwaredo aparelho processa imagens fluorescentes

tri-dimensionais a partir de uma série automática dessas imagens X-Y acumuladas no eixo Z (Figura 6.12) e gira-as ao comando do operador. Essas pilhas de imagens no eixo Z são usadas para reconstruir a visão tridimensional de uma célula, um tecido ou uma organela e oferecem imagens excelentes da estrutura celular e molecular. Experiências com a técnica de lapso de tempo também podem ser realizadas com microscópio confo-cal e com frequência transformam nossa compreensão dos eventos antes só vistos em imagens instantâneas. Muitas vezes, realmente é preciso ver para crer!

Citometria de fluxo

Quando uma população de células é imunocorada para determinado marcador (CD4, por exemplo) um subgrupo da população pode expressar esse marcador em altos níveis, outro subgrupo pode expressar o mesmo marcador em baixos níveis e o restante pode ser negativo. Para aumentar ainda mais a complexidade, pode-se desejar fazer a avaliação simultânea da expressão de outro marcador (CD8, por

exemplo) para verificar se a expressão dessas proteínas é mutuamente exclusiva. A avaliação da porcentagem de células de uma população que expressa CD4 ou CD8, ou ambos, por microscopia de fluorescência ou microscopia confocal seria muito trabalhosa, pois exigiria a contagem manual de várias centenas de células para obter dados con-fiáveis. Além do trabalho, essas análises também seriam bas-tante subjetivas e os resultados variam de acordo com a habilidade do operador. Felizmente, o citômetro de fluxo

é um instrumento que torna essas avaliações triviais, pois analisa os níveis de ﬂuorescência associados a milhares de células por minuto de modo altamente reprodutível e quan-titativo (Figura 6.13)

Em sua forma mais básica, o citômetro de ﬂuxo é um instrumento equipado com sistema de controle de líquido capaz de deslocar milhares de células em ﬁla única através

de uma câmara estreita iluminada por laser . A passagem de

uma célula imunomarcada através da câmara de fluxo ( flow cell ) excita o fluorocromo associado à célula pelo laser . A emissão do fluorocromo é percebida por um detector foto-multiplicador sensível que possibilita a quantificação precisa da fluorescência associada à célula. Desse modo, é possível discriminar rapidamente entre células negativas, levemente positivas ou altamente positivas para determinado marcador ou antígeno. A maioria dos citômetros de fluxo modernos

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Anti-CD3

Anti-CD68

Anti-CD20 Anti-CD3 (marrom)

Anti-CD20 (vermelho)

Anti-CD21

H-E

Figura 6.16 Análise imuno-histoquímica de centros foliculares de tonsila humana. Amostras de tonsila humana foram

preparadas com o corante histoquímico hematoxilina e eosina (H-E) ou imunocoradas com anticorpos contra CD21 (receptor 2 do complemento, expresso em células dendríticas foliculares e células B), CD68 (expresso em macrófagos), CD3 (células T), CD20 (células B) ou uma associação de anti-CD3 e anti-CD20, como mostra a figura. (Imagens gentilmente cedidas pelo Dr. Andreas Kappeler, University of Bern, Suíça.)

Detecção e quantificação de antígenos por anticorpos

Imunoensaio de antígeno por ELISA

A capacidade de medir a concentração de um analito (i. e., uma substância a ser medida) pela ocupação fracionária de seu rea-gente de ligação especíﬁca é uma característica de todo sistema de união a ligantes (Marco histórico 6.1), mas como é possível aumentar a quantidade de anticorpos contra quase todas as estruturas, a aplicação é mais versátil no imunoensaio.

Analitos grandes, como hormônios proteicos, costumam ser estimados por ensaio não competitivo de dois locais no qual tanto o agente de ligação ao ligante original quanto o reagente de detecção marcado são anticorpos (Figura M6.1.1). Ao usar anticorpos monoclonais contra dois epítopos diferen-tes no mesmo analito, o sistema tem maior capacidade de discriminar entre dois analitos relacionados; se a reatividade cruzada fracionária do primeiro anticorpo para um analito relacionado for igual a 0,1 e a do segundo também for 0,1, a leitura ﬁnal de reatividade cruzada será de apenas 0,1 × 0,1, ou seja, 1%. Existem ensaios altamente sensíveis para uma variedade surpreendente de analitos com emprego de sondas quimioluminescentes e ﬂuorescentes com resolução temporal.

No caso de moléculas pequenas, como fármacos ou hormô-nios esteroides, em que é inviável a ligação a dois locais, convém usar ensaios competitivos (Figura M6.1.1).

O ELISA (ensaio imunossorvente ligado a enzima) é um dos mais usados para medida de antígenos, tais como as citocinas, no soro ou em líquido de cultura celular. A técnica é bastante direta e implica imobilização de anticorpo contra a proteína de interesse nas cavidades plásticas de uma placa de microtitulação. Os locais de ligação a proteínas livres na placa são bloqueados por incubação com uma proteína irre-levante como a albumina. Em seguida, amostras contendo o antígeno de interesse são acrescentadas às cavidades revestidas com anticorpos e incubadas por algumas horas para que haja

captura do antígeno pelo anticorpo. Após a lavagem para

remover o material não ligado, o antígeno ligado é detectado

pelo acréscimo de um segundo anticorpo contra um local de ligação no antígeno diferente do local reconhecido pelo anti-corpo de captura. Agora o antígeno está situado entre os dois anticorpos, o que dá origem aos termos “ELISA sanduíche”

ou ensaio de captura de antígeno. O anticorpo de detecção

é conjugado a uma enzima, como a peroxidase de raiz-forte ou fosfatase alcalina, que, após acréscimo do substrato enzi-mático, gera um produto de reação colorido ou

quimiolumi-Roitt | Fundamentos de Imunologia. Amostras de páginas não sequenciais e em

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174 Fundamentos de Imunologia Controle Nº do soro 5.120 2.560 1.280 640 320 160 80 40 20 10 D i l u i ç ã o d o s o r o 46 18 58 21 26 11 70 52

Figura 6.29 Prova de hemaglutinaçãopara autoanticorpos

antitireoglobulina. Células recobertas por tireoglobulina foram acrescentadas a diluições de soros de pacientes. Células não recobertas foram acrescentadas a uma diluição 1:10 de soro como controle. Em uma reação positiva, as células

sedimentam-se no fundo da cavidade como um tapete. Por causa do formato de “V” dessas cavidades em corte transversal, nas reações negativas as células se depositam na base do “V”, formando um botão pequeno e reconhecido com facilidade. O inverso da máxima diluição do soro que produz uma reação positiva inquestionável é denominado título. Os títulos, da esquerda para a direita, são: 640, 20, > 5.120, neg, 40, 320, neg, > 5.120. O controle no caso do soro nº 46 foi ligeiramente positivo e é preciso repetir o teste nesse soro depois da

absorção com células não recobertas.

Medição do marcador Tubo plástico

lavagem lavagem

Acrescentar Ag Acrescentar soro_{do paciente} Acrescentar anti-Ig_marcada

lavagem

Figura 6.30 Imunoensaio em fase sólida para anticorpos.Para reduzir a ligação inespecífica de IgG à fase sólida após adsorção

do primeiro reagente, é comum acrescentar uma proteína irrelevante, como leite em pó desnatado ou albumina sérica bovina, para bloquear todos os locais livres no plástico. Note que a conformação de uma proteína costuma se alterar após a ligação ao plástico, por exemplo, um anticorpo monoclonal que distingue entre as formas apo e holo do citocromo c em solução combina-se

igualmente bem às duas proteínas na fase sólida. Às vezes o acoplamento covalente ao plástico carboxiderivado ou a captura do substrato antigênico (Ag) por anticorpo em fase sólida diminui esse efeito.

A conjugação com a vitamina biotina é usada com frequência, pois esse conjugado é detectado com facilidade por sua reação com a avidina ou estreptavidina ligada à enzima (a segunda tem menor ligação de fundo); ambas ligam-se com especiﬁ-cidade e aﬁnidade extraordinárias (K = 1015_M–1_).

Os sistemas quimioluminescentes por reação de luminol catalisada por HRP, nos quais a luz do substrato luminol oxidado é intensiﬁcada e a duração do sinal é aumentada por um reagente potencializador, garantem maior sensibili-dade e variação dinâmica. Cabe fazer menção especial aos

ensaios de ﬂuorescência com resolução temporal que empre-gam quelatos de terras raras, como európio 3+, embora esses tenham um papel mais importante em ensaios de antígenos.

Detecção da formação de imunocomplexos

Muitas técnicas para detecção de complexos circulantes foram descritas e, por causa das variações de tamanho, da capacidade de ﬁxação do complemento e da classe Ig dos diferentes complexos, convém aplicar mais de um método. Dois métodos bastante adequados para uso geral são:

1 Precipitação de complexos de IgG do soro em concentra-ções de polietilenoglicol que não reduzem de maneira sig-niﬁcativa a quantidade de monômeros de IgG, seguida por estimativa de IgG no precipitado por imunodifusão radial simples (SIRD, do inglês,single radial immunodiﬀusion) ou

nefelometria comlaser ; e

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Capítulo 6 | Métodos Imunológicos e suas Aplicações 177

Marco histórico 6.2 Separador de células ativado por fluorescência (FACS)

O FACS foi desenvolvido pelo casal Herzenberg (Leonard e Leonore) e seus colegas para medir as moléculas de superfície em leucócitos individuais por sua reação com anticorpos monoclonais marcados com fluorocromo e para usar os sinais gerados na separação de células de fenótipo definido em mistura heterogênea.

Nesse aparelho elegante mas complexo, as células

fluorescentes fluem obedientemente em fila única e passam por um feixe delaser . A avaliação quantitativa do sinal

fluorescente em tubo fotomultiplicador em posição adequada transmite um sinal para a célula quando esta

emerge em uma única gotícula; a célula adquire carga e pode ser separada em um campo elétrico (Figura M6.2.1). A sofisticação pode ser ainda maior com o uso delasers e

fluorocromos adicionais e dispersão da luz tanto frontal quanto a 90°. A seção sobre citometria de fluxo oferece mais detalhes e descreve o uso dessa técnica para análise multiparamétrica quantitativa de populações de uma única célula (veja a Figura 6.14). É suficiente dizer que esses últimos aparelhos de FACS possibilitam o isolamento de células com fenótipo complexo de uma população heterogênea com alto grau de discriminação.

Campo elétrico + Líquido envolvente ( sheath fluid ₎ Suspensão de células coradas Laser _(s) Sinal de carga Detectores de fluorescência Detectores de dispersão da luz 1 2 3 A A A

Células marcadas Células não marcadas

–

Figura M6.2.1 Princípio do FACS para citometria de fluxo da fluorescência em células coradas (círculos com aro verde) e

separação física das células não coradas. O sinal de carga pode ser ativado para separar células de alta e baixa fluorescência e, usando dispersão da luz, grandes e pequenas, bem como mortas e vivas.

(hanging drops ); por ocasião da transferência para condições

de cultura normal de órgãos depois de algumas horas, há reagregação em lobos intactos, como em um passe de mágica, e então se revelam os vários processos de diferenciação e maturação.

É possível produzir animais com basicamente uma única especiﬁcidade de células T mediante a introdução de genes de receptora eb de células T oriundos de um clone de células T,

como um transgene (veja adiante); como os genes já estão reorganizados, sua presença em todas as células T em desenvol-vimento desativam todas as outras recombinações do gene V b.

Não houve sucesso na clonagem de células B primárias, pois elas morrem logo depois da introdução em cultura celular. É possível, porém, cultivar hibridomas de células B imortalizadas ou linhagens de células transformadas por EBV, e, a exemplo das células T, foram gerados animais transgênicos que expressam o mesmo anticorpo em todas as células B.

Análise da expressão gênica

A análise dos padrões de expressão gênica pode dizer muito sobre o que uma célula ou uma população de células está fazendo, ou prestes a fazer, em determinado momento. Para analisar a coorte de genes expressos por uma população de células, seja em nível constante ou em resposta a dado estí-mulo, extrai-se e analisa-se o RNA mensageiro (mRNA) por um método que possibilita a detecção dos genes de interesse. A análise do mRNA pode ser feita por Northern blot , no qual uma única sonda gênica é hibridizada com a amostra de mRNA, ou por PCR via transcriptase reversa (RT-PCR), na qual, para ampliﬁcar os genes de interesse, faz-se pri-meiro uma cópia cDNA usando a transcriptase reversa e, em seguida, faz-se a ampliﬁcação do gene por meio de

primersespecíﬁcos complementares à sequência de interesse. Embora as técnicas de Northern blot e RT-PCR possam

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uma linhagem celular cujos crescimento e sobrevivência dependam de uma citocina específica. As células individuais que sintetizam citocinas podem ser contadas no citômetro de fluxo por permeabilização e coloração intracelular com anti-corpo marcado (veja adiante); outra opção é a técnica ELISPOT (veja adiante). Como de costume, a biologia mole-cular oferece informações úteis, já que é mais sofisticada, pois células T transfectadas com uma construçãolacZ acentuadora

de IL-2 acionam a expressão de lacZ b-galactosidase quando

há ativação da resposta da citocina IL-2 (veja a p. 219), o que pode ser facilmente revelado com um substrato enzimático ﬂuorescente ou cromogênico.

A capacidade das células T citotóxicas de destruírem os alvos celulares por mecanismos extracelulares geralmente é avaliada por um ensaio de liberação de cromo. As células-alvo são marcadas com 51_{Cr e a liberação de proteína radioativa}

para o meio maior que a observada em controles é o índice de citotoxicidade. O teste é repetido com diferentes propor-ções de células efetoras e células-alvo. Uma técnica seme-lhante é empregada para medir a destruição extracelular por células NK de alvos recobertos ou não recobertos por anti-corpos. Agora, é preciso atenção na interpretação de ensaios

in vitro. Como é possível manipular as condições de cultura

dentro de limites amplos, pode-se obter um resultado que não

seria alcançado in vivo. Vamos ilustrar esse ponto tomando como referência a citotoxicidade para células murinas infec-tadas pelo vírus da coriomeningite linfocítica (LCMV, do inglês,lymphocytic choriomeningitis virus ) ou vírus da

estoma-tite vesicular (VSV, do inglês, vesicular stomatitis virus ). A

técnica in vitro mais sensível é a liberação de cromo das células-alvo após estimulação secundária dos linfócitos. No entanto, isso leva 5 dias, durante os quais relativamente poucos precursores de células T citotóxicas CD8 de memória reproduzem-se e ultrapassam o limiar necessário para que o ensaio seja mensurável. Apesar disso, um ensaio de citotoxi-cidade fraco nessas condições não foi reﬂetido por nenhuma das avaliações in vivoda função antiviral, o que signiﬁca que não tiveram relevância biológica.

Detecção de subgrupos de células T por coloração para expressão de citocinas

A produção de citocinas por populações de células T foi, durante muitos anos, realizada na população, usando ensaios ELISA, por exemplo. O motivo é que as citocinas, com algumas exceções, costumam ser secretadas rapidamente à medida que são sintetizadas. No entanto, duas técnicas tornam possível medir a produção de citocinas diretamente na célula. Uma delas emprega inibidores da exportação de

Linfócitos não marcados

Análise por citometria de fluxo

Linfócitos marcados com CFSE Proliferação de linfócito Ag-específico Incubar com CFSE

Coloração com CFSE

N ú m e r o d e c é l u l a s Acrescentar APC Ag+

N ú m e r o d e c é l u l a s

N ú m e r o d e c é l u l a s 0 0 1 2 3 104 103 102 101 100 CFSE 104 103 102 101 100 CFSE Não estimuladas anti-CD3

(a) (b) 0 0 1 2 3 4 5 6 7

Coloração com CFSE Coloração com CFSE

N ú m e r o d e c é l u l a s N ú m e r o d e c é l u l a s

Figura 6.35 Análise de proliferação celular por marcação com CFSE.

Podem-se marcar linfócitos, ou outras células com potencial proliferativo, com o corante lipofílico fluorescente, CFSE, e depois analisar a distribuição do corante fluorescente entre as células-filhas. (a) Representação esquemática de uma experiência de marcação com CFSE e os gráficos correspondentes obtidos por citometria de fluxo. (b) Células T periféricas humanas foram marcadas com CFSE e estimuladas com anticorpos monoclonais anti-CD3 que recobriam uma placa durante 4 dias. Imagem à esquerda: ausência de estimulação; imagem à direita: estimulação com anti-CD3. Os números e as barras na parte superior de cada histograma referem-se aos respectivos picos de divisão, e o pico de células não divididas está na extrema direita de cada histograma. (Cortesia do Dr. Antione Attinger.)

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célula precursora por alíquota. Desse modo, é possível calcu-lar a frequência de precursores na suspensão celucalcu-lar original. A Figura 6.38 mostra um exemplo com alguns detalhes.

Aﬁrmou-se que a análise de diluição limitante costuma subestimar a verdadeira frequência dos precursores. É prová-vel que isso ocorra porque as células geralmente são sobrevi-vem muito bem quando cultivadas em isolamento (i. e., uma

só célula por cavidade), já que a maioria das células, com poucas exceções, requer sinais de outras células para sobrevi-ver. Martin Raff mostrou que as células costumam sofrer apoptose na ausência desses sinais. Uma medida precisa da porcentagem de linfócitos que tem um receptor antigênico específico é obtida por citometria de fluxo das células coradas com antígeno marcado. No caso das células B isso é bastante

40 20 10

Nº de células que respondem por cavidade × 10–3 2,5 1,25 0,625 0,3125 0 10 20 30 40 50 60 70 0 10 20 30 40 50 60 -10 a L i s e e s p e c í f i c a ( % ) 10 20 40 60 80 100 1 2 3 4 b C a v i d a d e s n e g a t i v a s ( % ) 5 5 5

Nº de células que respondem por cavidade × 10–3

Figura 6.38 Análise de diluição limitante da frequência de precursores de células T citotóxicas em células esplênicas de um

camundongo BALB/c estimuladas com células esplênicas C57BL/6 irradiadas como antígeno. As células esplênicas reativas de BALB/c foram organizadas em 24 réplicas em cada concentração testada junto com antígeno e um excesso de fatores auxiliares T. Observou-se a geração de citotoxicidade em cada cavidade por acréscimo de células tumorais do haplótipo C57BL/6 marcadas com51_{Cr (EL-4); em seguida, a citotoxicidade foi revelada por medida da liberação no meio de material intracelular solúvel marcado} com51_{Cr. (a) Os pontos mostram a porcentagem de lise específica de cavidades individuais. A linha tracejada indica três desvios} padrão acima do controle de liberação média, e cada ponto acima dessa linha é contado como positivo para citotoxicidade. (b) Os dados são representados em gráfico em termos da porcentagem de cavidades negativas em cada concentração de células reativas acima da faixa de titulação dos dados (5 × 10–3_{/cavidade a 0,625 × 10}–3_{/cavidade). A linha tracejada foi desenhada em 37% de} cavidades negativas e corta a linha de regressão, apontando uma frequência de precursores (Tcp) de 1 em 2.327 células reativas. A linha de regressão tem valor r2_{de 1,00 nessa experiência. (Reproduzida com permissão de Simpson E. & Chandler P. (1986) In:} Weir D.M. (ed.) Handbook of Experimental Immunology,Figura 68.2. Blackwell Scientific Publications, Oxford.)

104 103 102 101 100 FL1-H 104 103 102 101 100 FL1-H Anexina V-FITC Anexina V-FITC C o n t a g e m C o n t a g e m (a) (b)

Figura 6.37 Análise da apoptose por marcação com anexina V. A fosfatidilserina (PS) é exteriorizada na lâmina externa da

membrana plasmática durante a apoptose e pode ser detectada com facilidade usando-se a proteína de ligação à PS, anexina V. (a) Células linfoblastoides T humanas não tratadas; e (b) células linfoblastoides T apoptóticas foram coradas com anexina V conjugada a FITC (Dados gentilmente cedidos pela Dra. Gabriela Brumatti.)