Fernanda Moura Vargas Dias. Tese de Doutorado em Ciências Fisiológicas (Fisiologia Cardiovascular)

nas diferenças de reatividade de anéis isolados de

aorta de ratos infartados com e sem sinais de

insuficiência cardíaca

Fernanda Moura Vargas Dias

Tese de Doutorado em Ciências Fisiológicas

(Fisiologia Cardiovascular)

Programa de Pós-graduação em Ciências Fisiológicas

Universidade Federal do Espírito Santo

nas diferenças de reatividade de anéis isolados de

aorta de ratos infartados com e sem sinais de

insuficiência cardíaca

Fernanda Moura Vargas Dias

Tese de Doutorado submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas da Universidade Federal do Espírito Santo como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Ciências Fisiológicas.

Aprovada em 18 de outubro de 2011 por:

_____________________________________________ Profa. Dra. Ivanita Stefanon – Orientadora, UFES _____________________________________________

Prof. Dr. Dalton Valentim Vassallo, UFES

_____________________________________________ Profa. Dra. Lusiane Maria Bendhack, FCFRP-USP

_____________________________________________ Prof. Dr. José Geraldo Mill, UFES

____________________________________________ Prof. Dr. Fausto Edmundo Lima Pereira, NDI - UFES _____________________________________________ Profa. Dra. Ivanita Stefanon – Coordenadora do PPGCF- UFES

Dias, Fernanda Moura Vargas 1980

Participação da Na+K+-ATPase e dos canais para K+ nas diferenças de reatividade de anéis isolados de aorta de ratos infartados com e sem sinais de insuficiência cardíaca [Vitória] 2011

193 p., 29,7 cm (UFES, D. Sc., Ciências Fisiológicas, 2011) Tese, Universidade Federal do Espírito Santo, PPGCF Professor Orientador: Ivanita Stefanon

1. Infarto do Miocárdio 2. Reatividade Vascular 3. Insuficiência cardíaca 4. Na+K+ -ATPase 5. Canais para K+ 6. Espécies Reativas de Oxigênio.

Dedico este aos que eu mais amo, aos que me amam incondicionalmente, aos que me apóiam sempre, àqueles a quem eu devo tudo o que sou e tudo o que acredito. Mãe (Edna), Pai (Ricardo), Irmãos (Jú e Cau) e ao meu amor (Fabiano). Dedico este trabalho ao meu bebê, Fabiano Junior, meu precioso, minha vida. Todos eles constituem o meu grande tesouro. ‖Porque onde estiver o vosso coração, aí estará também o vosso tesouro” (Mt. 6:21).

"Aprender é a única coisa de que a mente nunca se cansa, nunca tem medo e nunca se arrepende." (Leonardo da Vinci).‖

A Deus que meu deu forças, que me amparou, que me amou incondicionalmente, que me ensinou e me acolheu. Ao meu Deus que me iluminou, me deu sabedoria, me guiou em seus caminhos e me fez chegar até aqui. “Tudo é do Pai, toda honra e toda a glória, porque é dele a Vitória alcançada em minha vida”.

Ao meu marido querido marido, meu amor, minha vida, Fabiano Moura Dias, que sempre me incentivou. Obrigada pelo apoio nos momentos em que eu pensava que não conseguiria. Pela doçura, carinho e felicidade que preenchem a minha vida. À minha família por me conduzir até aqui. A minha amada mãe pelo apoio incondicional, por sua dedicação a minha educação e a minha felicidade. Obrigada por estar ao meu lado em todos os momentos.

Por me apoiarem em todas as minhas decisões. Pelo imenso amor, carinho e amizade. Pai, Mãe, Jú e Cau.

À minha sogra Laura, pelo exemplo de perseverança e coragem, pela sabedoria e por todo apoio.

À minha orientadora querida, Ivanita Stefanon, por ter aberto as portas do seu laboratório e do seu coração para que eu pudesse aprender um pouco mais. Pelo seu exemplo e conduta, pelo carinho, paciência, incentivo e dedicação ao meu trabalho.

Ao querido chefe, Dalton Valentim Vassallo, por ser um exemplo de mestre, por sua sabedoria e por tornar agradáveis todos os locais por onde passa.

À Aurélia e Rogério que ficaram ao meu lado sempre e foram além de amigos, companheiros de experimento.

Aos amigos e companheiros de vida Nelson Coimbra, Flávia Paro, Cristina e Fabiana por todo apoio, amizade e doçura. Por ouvirem meus desabafos, me apoiarem e me incentivarem e me fazerem sorrir nos dias tristes.

À Jonaína e Mayla por terem me ensinado, pela ajuda e incentivo ao meu trabalho. A todos os colegas do laboratório de eletromecânica da UFES e do laboratório de reatividade vascular da USP pela convivência e pela paciência para me ensinarem.

Tabela 1 – Dados ponderais dos grupos Sham, Inf e IC 30 dias após IM ... 95 Tabela 2 – Dados hemodinâmicos dos grupos Sham, Inf e IC 30 dias após IM ... 97 Tabela 3 – Efeitos do L-NAME, TEA, Aminopiridina, Apamina, Iberiotoxina e duplo bloqueio com Apamina +Iiberiotoxina sobre a Rmax e pEC50 no relaxamento induzido

pela acetilcolina em aortas de ratos Sham 30 dias após a cirurgia fictícia para indução ao infarto do miocárdio ... 121 Tabela 4 – Efeitos do L-NAME, TEA, Aminopiridina, Apamina, Iberiotoxina e duplo bloqueio com Apamina +Iiberiotoxina sobre a Rmax e pEC50 no relaxamento induzido

pela acetilcolina em aortas de ratos Inf 30 dias após o infarto do miocárdio ... 125 Tabela 5 – Efeitos do L-NAME, TEA, Aminopiridina, Apamina, Iberiotoxina e duplo bloqueio com Apamina + Iberiotoxina sobre a Rmax e pEC50 no relaxamento induzido

pela acetilcolina em aortas de ratos IC 30 dias após o infarto do miocárdio ... 129 Tabela 6 – Sumário dos resultados obtidos pela curva de relaxamento induzido pelo KCl com endotélio intacto (E+), após a remoção do endotélio, após a incubação com L-NAME ou TEA; Expressão protéica das enzimas e-NOS, p-eNOS e α-1 Na+

K+ -ATPase; Fluorescência produzida por oxidação do dihidroetídio em animais Sham, Inf e IC ... 144 Tabela 7 – Sumário dos resultados obtidos pela curva de relaxamento induzido pela ACh em anéis de aorta com endotélio intacto (E+) e após a incubação com L-NAME, TEA, Aminopiridina, Apamina, Iberiotoxina e duplo bloqueio com Apamina +Iberiotoxina de ratos Sham, Inf e IC ... 145

Figura 1: Procedimento para indução ao infarto do miocárdio através da oclusão da artéria coronária descendente anterior esquerda. A) Toracotomia entre o 3º e 4º espaços intercostais; B) Exteriorização do coração e amarradura da artéria coronária descendente anterior esquerda. ... 72 Figura 2: A) Sistema de avaliação hemodinâmica composto por um cateter (PE-50, Clay-Adams), conectado a um transdutor de pressão (Stathan P23 AA), acoplado a um pré-amplificador (MP100, Funbec, São Paulo, SP) que por sua vez, foi conectado a um conversor analógico digital (MP100, Biopac Systems, Inc; CA). O registro foi adquirido por um computador Pentium 4, 3.06 Ghz; B) Ampliação de parte da imagem para visualização da incisão cirúrgica (região esquerda do pescoço), para canulação da artéria carótida; cânula PE-50; e cicatriz da toracotomia para indução ao infarto do miocárdio. ... 74 Figura 3: Avaliação por planimetria das fatias da área infartada (AI) e da área remanescente ao infarto no ventrículo esquerdo (VE). As bordas das fatias são contornadas e medidas por contagem de pontos em papel milimetrado com área calculada em mm2. Cada quadrado pequeno apresenta lado igual a 1 mm e delimita uma área de 1 mm2. A área total representa a soma das áreas do ventrículo esquerdo remanescente e área de cicatriz. A área de cicatriz foi calculada pela porcentagem da área total. Coração do rato 54, infartado (Inf).. ... 76 Figura 4: Figura demonstrando a medida histológica da área de infarto (coloração com picrosirius red). Com uma ferramenta chamada ―segmented line‖, do programa Image J, era delineada uma linha pontilhada sobre a superfície do coração a ser medida. Após o delineamento, clicava-se em ―perimeter‖ e o perímetro da superfície era fornecido pelo programa. O cálculo da porcentagem de infarto (AI%) foi realizado pela divisão do perímetro da cicatriz na superfície endocárdica (CEN) pelo perímetro endocárdico total (PEN) mais o perímetro da cicatriz epicárdica (CEP) dividido pelo perímetro epicárdico total (PEP), dividido por 2, e multiplicado por 100. ... 78 Figura 5: Organograma da divisão dos grupos experimentais, trinta dias após o infarto do miocárdio (IM), a partir dos critérios estabelecidos como sinalizadores de insuficiência cardíaca citados na literatura científica. Cirurgia fictícia de infarto do miocárdio (Sham); ratos infartados sem sinais de insuficiência (Inf); ratos infartados com sinais de insuficiência (IC). Pressão diastólica final no ventrículo esquerdo (PDfVE); Razão entre a massa do ventrículo direito e a massa corporal (VD/MC); Razão entre a massa dos pulmões e a massa corporal (PP/MC). ... 79 Figura 6: Aorta torácica imersa em uma placa de Petri contendo solução de Krebs, após a remoção do tecido conjuntivo e adiposo adjacente à artéria e sendo dividida em segmentos cilíndricos entre 3-4 mm (Modificado de Angeli, 2009). ... 80 Figura 7: Preparação dos anéis isolados de aorta para avaliação da reatividade vascular ―in vitro‖. Sistema de aquisição de dados Biopac Systems (modificado de Dias, 2007). ... 81 Figura 8: Registro com curvas representando o teste da viabilidade do músculo liso vascular com KCl e avaliação da integridade funcional do endotélio. Avaliação da viabilidade do músculo liso vascular com KCl: A) Período de estabilização inicial (45 min permanecendo na tensão de 1g); B) Adição de KCl (75 mM) ao banho; C)

(75 mM); G) Lavagem dos anéis com solução Krebs-Henseleit; H) Período de estabilização (30 min). Avaliação da integridade funcional do endotélio: I) Pré-contração com fenilefrina (Fe) 10-4 M; J) Platô da contração induzida pela Fe; L) Adição de acetilcolina (ACh) 10-3 M. O tempo foi registrado em minutos, eixo horizontal (intervalo de 80 min) e a força em gramas (g), eixo vertical. ... 82 Figura 9: Registro com curvas representando avaliação da atividade funcional da Na+K+-ATPase sensível à OUA em aortas de ratas com e sem sinais de insuficiência cardíaca após o infarto do miocárdio. A) Perfusão por 30 minutos com solução Krebs sem potássio; B) Pré-contração com fenilefrina (Fe) 10-4 M; C) Platô da contração induzida pela Fe; D) Primeira curva de KCl (adição de 1, 2, 5 e 10 mM ao banho em intervalos de 2' 30''); E) Lavagem com solução Krebs sem potássio; F) Adição de OUA 10-4 M e estabilização por 30 minutos; G) Pré-contração com Fe 10-4 M; H) Platô da contração induzida pela Fe; I) Segunda curva de KCl (adição de 1, 2, 5 e 10 mM ao banho em intervalos de 2' 30''). O tempo foi registrado em minutos, eixo horizontal (intervalo de 80 min) e a força em gramas (g), eixo vertical. Caso um fármaco fosse utilizado durante este protocolo, o mesmo era administrado nos períodos A) e F), e incubado por no mínimo 30 minutos. ... 83 Figura 10: Esquema demonstrativo do protocolo experimental da avaliação da resposta vasodilatadora dependente do endotélio. Foi realizada a incubação por 30 minutos com o fármaco a ser estudado. Após, o término do período de incubação, adicionou-se fenilefrina (Fe 10-4 M) ao banho. Quando o platô da contração à Fe foi atingido realizou-se a curva concentração-resposta à acetilcolina, adicionando-se concentrações crescentes de acetilcolina ao banho (10-11 a 3 x 10-5). ... 86 Figura 11: Dados ponderais dos animais Sham, Infarto (Inf) e Infarto com sinais de insuficiência cardíaca (IC), 30 dias após o infarto: A) Massa corporal (MC); B) Razão entre a massa do ventrículo esquerdo e a massa corporal (VE/MC); C) Razão entre a massa do ventrículo direito e a massa corporal (VD/MC); D) Razão entre a massa dos pulmões e a massa corporal (PP/MC). Os resultados foram expressos como média ± EPM, considerando significantes as diferenças para P< 0,05. ANOVA uma via com post hoc de Tukey: *P< 0,05 vs. Sham; +P< 0,05 vs. Inf ... 98 Figura 12: Área de cicatriz, medida por planimetria, dos animais Infarto (Inf) e Infarto com sinais de insuficiência cardíaca (IC) trinta 30 dias após o infarto. A) Porcentagem da área de cicatriz; B) Razão entre o perímetro da área de cicatriz do ventrículo esquerdo em mm2 e a massa corporal em gramas (VE/MC). Os resultados foram expressos como média ± EPM, considerando significantes as diferenças para P< 0,05. Para análise estatística foi utilizado teste t de Student não pareado ... 99 Figura 13: A) Correlação entre a razão da massa dos pulmões pela massa corporal (PP/MC) e a AI% de todos os animais. B) Correlação entre a AI% e a razão VE/MC de todos os animais; C) Correlação entre a AI% e a VD/MC de todos os animais. Os resultados foram expressos como correlação linear, com coeficiente de correlação de Pearson A) r= 0,39 e P= 0,13 (não houve correlação); B) r= -0,28 e P= 0,28 (não houve correlação); C) r= -0,23 e P= 0,24 (não houve correlação). ... 101 Figura 14: Avaliação histológica da área de cicatriz após o infarto. A) Fotografia das lâminas de corações de animais trinta dias após infarto do miocárdio, coradas com picrosirius red (corte de 5 μm). À esquerda, área de cicatriz do animal infartado sem insuficiência (Inf) e à direita do animal infartado com insuficiência (IC); B) Resultado

total (PEN) mais o perímetro da cicatriz epicárdica (CEP) dividido pelo perímetro epicárdico total (PEP), dividido por 2, e multiplicado por 100. Os resultados foram apresentados como média ± EPM, considerando significantes as diferenças para P< 0,05. Para análise estatística foi utilizado teste t de Student não pareado ... 102 Figura 15: Curvas de relaxamento induzido pelo KCl, em aorta de ratos Sham, 30 dias após a cirurgia fictícia para indução ao infarto. Anéis isolados de aorta com endotélio íntegro (E+), após a remoção mecânica do endotélio (E-), após a incubação com L-NAME e tetraetilâmonio (TEA). A) Grupo Sham E+ vs. Sham E-. B) Grupo Sham E+ vs. Sham L-NAME. C) Grupo Sham E+ vs. Sham TEA. Todas as comparações foram realizadas antes e após a incubação por 30 minutos com OUA (100 µM). A resposta de relaxamento ao KCl foi expressa como porcentagem de contração à fenilefrina. Os resultados foram expressos como média ± EPM. Foi realizada ANOVA duas vias, post hoc de Bonferroni. Valores foram considerados significantes com P< 0,05...104 Figura 16: Curvas de relaxamento induzido pelo KCl, em aorta de ratos sem sinais de insuficiência cardíaca (Inf), 30 dias após o infarto. Anéis isolados de aorta com endotélio íntegro (E+), após a remoção mecânica do endotélio (E-), após a incubação com L-NAME e tetraetilâmonio (TEA). A) Grupo Inf E+ vs. Inf E-. B) Grupo Inf E+ vs. Inf L-NAME. C) Grupo Inf E+ vs. Inf TEA. Todas as comparações foram realizadas antes e após a incubação por 30 minutos com OUA (100 µM). A resposta de relaxamento ao KCl foi expressa como porcentagem de contração à fenilefrina. Os resultados foram expressos como média ± EPM. Foi realizada ANOVA duas vias, post hoc de Bonferroni. Valores foram considerados significantes com P< 0,05...106 Figura 17: Curvas de relaxamento induzido pelo KCl, em aorta de ratos com sinais de insuficiência cardíaca (IC), 30 dias após o infarto. Anéis isolados de aorta com endotélio íntegro (E+), após a remoção mecânica do endotélio (E-), após a incubação com L-NAME e tetraetilâmonio (TEA). A) Grupo IC E+ vs. IC E-. B) Grupo IC E+ vs. IC L-NAME. C) Grupo IC E+ vs. IC TEA. Todas as comparações foram realizadas antes e após a incubação por 30 minutos com OUA (100 µM). A resposta de relaxamento ao KCl foi expressa como porcentagem de contração à fenilefrina. Os resultados foram expressos como média ± EPM. Foi realizada ANOVA duas vias, post hoc de Bonferroni. Valores foram considerados significantes com P< 0,05....108 Figura 18: Curva de relaxamento induzido pelo KCl, em aorta de ratos com endotélio íntegro (E+), 30 dias após o infarto. A) Grupo Inf E+ vs. Sham E+. B) Grupo IC E+ vs. Sham E+. C) Grupo IC E+ vs. Inf E+. Todas as comparações foram realizadas antes e após a incubação por 30 minutos com OUA (10-4 M). A resposta de relaxamento ao KCl foi expressa como porcentagem de contração à fenilefrina. Os resultados foram expressos como média ± EPM. Foi realizada ANOVA duas vias, post hoc de Bonferroni. Valores foram considerados significantes com P< 0,05 .... 110 Figura 19: Curva de relaxamento induzido pelo KCl, em aorta de ratos com endotélio removido mecanicamente (E-), 30 dias após o infarto. A) Grupo Inf E- vs. Sham E-; B) Grupo IC E- vs. Sham E-; C) Grupo IC E- vs. Inf E-. Todas as comparações foram realizadas antes e após a incubação por 30 minutos com OUA (10-4 M). A resposta de relaxamento ao KCl foi expressa como porcentagem de contração à fenilefrina. Os resultados foram expressos como média ± EPM. Foi

Figura 20: Curva de relaxamento induzido pelo KCl, em anéis de aorta de ratos incubados por 30 minutos com L-NAME (100 mM), 30 dias após o infarto. A) Grupo Inf L-NAME vs. Sham L-NAME; B) Grupo IC L-NAME vs. Sham L-NAME; C) Grupo IC L-NAME vs. Inf L-NAME. Todas as comparações foram realizadas antes e após a incubação por 30 minutos com OUA (10-4 M). A resposta de relaxamento ao KCl foi expressa como porcentagem de contração à fenilefrina. Os resultados foram expressos como média ± EPM. Foi realizada ANOVA duas vias, post hoc de Bonferroni. Valores foram considerados significantes para P< 0,05 ... 114 Figura 21: Curva de relaxamento induzido pelo KCl, em anéis de aorta de ratos incubados por 30 minutos com TEA (100 mM), 30 dias após o infarto. A) Grupo Inf TEA vs. Sham TEA; B) Grupo IC TEA vs. Sham TEA; C) Grupo IC TEA vs. Inf TEA. Todas as comparações foram realizadas antes e após a incubação por 30 minutos com OUA (10-4 M). A resposta de relaxamento ao KCl foi expressa como porcentagem de contração à fenilefrina. Os resultados foram expressos como média ± EPM. Foi realizada ANOVA duas vias, post hoc de Bonferroni. Os valores foram considerados significantes para P< 0,05 ... 116 Figura 22: Curva de relaxamento induzido pela acetilcolina (ACh), em aorta torácica de ratos Sham, 30 dias após a cirurgia fictícia para indução ao infarto. A) Comparação entre os grupos Sham com endotélio intacto (E+) e Sham incubado com N(W)-nitro-L-arginina metil éster (100 μM) (L-NAME); B) Comparação entre os grupos Sham E+ e Sham incubado com tetraetilamônio (2 mM) (TEA); C) Comparação entre os grupos Sham E+ e Sham incubado com 4-Aminopiridina (5 mM) (4-AP). O período de incubação com os fármacos foi de 30 minutos. A resposta de relaxamento à ACh foi expressa como a porcentagem da contração residual à fenilefrina. Os resultados foram expressos como média ± EPM. O Teste t de Student não pareado foi utilizado para avaliar a diferença entre os grupos que foram consideradas significantes para P< 0,05 comparados com Sham E+ ... 119 Figura 23: Curva de relaxamento induzido pela acetilcolina (ACh), em aorta torácica de ratos Sham, 30 dias após a cirurgia fictícia para indução ao infarto. A) Comparação entre os grupos Sham com endotélio intacto (E+) e Sham incubado com Apamina (0,5 μM) (Apam); B) Comparação entre os grupos Sham E+ e Sham incubado com Iberiotoxina (30 nM) (Iberio); C) Comparação entre os grupos Sham E+ e Sham incubado com Apamina mais Iberiotoxina (0,5 μM, 30 nM respectivamente) (Apam+Iberio); O período de incubação com os fármacos foi de 30 minutos. A resposta de relaxamento à ACh foi expressa como a porcentagem da contração residual à fenilefrina. Os resultados foram expressos como média ± EPM. O Teste t de Student não pareado foi utilizado para avaliar a diferença entre os grupos que foram consideradas significantes para P< 0,05 comparados com Sham E+ ... 120 Figura 24: Curva de relaxamento induzido pela acetilcolina (ACh), em aorta torácica de ratos Inf, 30 dias após o infarto. A) Comparação entre os grupos Inf com endotélio intacto (E+) e Inf incubado com N(W)-nitro-L-arginina metil éster (100 μM) (L-NAME); B) Comparação entre os grupos Inf E+ e Inf incubado com tetraetilamônio (2 mM) (TEA); C) Comparação entre os grupos Inf E+ e Inf incubado com 4-aminopiridina (5 mM) (4-AP). O período de incubação com os fármacos foi de 30 minutos. A resposta de relaxamento à ACh foi expressa como a porcentagem da

grupos que foram consideradas significantes para P< 0,05 ... 123 Figura 25: Curva de relaxamento induzido pela acetilcolina (ACh), em aorta torácica de ratos Inf, 30 dias após o infarto do miocárdio. A) Comparação entre os grupos Inf com endotélio intacto (E+) e Inf incubado com apamina (0,5 μM) (Apam); B) Comparação entre os grupos Inf E+ e Inf incubado com iberiotoxina (30 nM) (Iberio); C) Comparação entre os grupos Inf E+ e Inf incubado com apamina mais iberiotoxina (0,5 μM, 30 nM respectivamente) (Apam+Iberio); O período de incubação com os fármacos foi de 30 minutos. A resposta de relaxamento à ACh foi expressa como a porcentagem da contração residual à fenilefrina. Os resultados foram expressos como média ± EPM. O Teste t de Student não pareado foi utilizado para avaliar a diferença entre os grupos que foram consideradas significantes para P< 0,05 ... 124 Figura 26: Curva de relaxamento induzido pela acetilcolina (ACh), em aorta torácica de ratos IC, 30 dias após o infarto. A) Comparação entre os grupos IC com endotélio intacto (E+) e IC incubado com N(W)-nitro-L-arginina metil éster (100 μM) (L-NAME); B) Comparação entre os grupos IC E+ e IC incubado com tetraetilamônio (2 mM) (TEA); C) Comparação entre os grupos IC E+ e IC incubado com 4-aminopiridina (5 mM) (4-AP). O período de incubação com os fármacos foi de 30 minutos. A resposta de relaxamento à ACh foi expressa como a porcentagem da contração residual à fenilefrina. Os resultados foram expressos como média ± EPM. O Teste t de Student não pareado foi utilizado para avaliar a diferença entre os grupos que foram consideradas significantes para *P< 0,05 ... 127 Figura 27: Curva de relaxamento induzido pela acetilcolina (ACh), em aorta torácica de ratos IC, 30 dias após o infarto do miocárdio. A) Comparação entre os grupos IC com endotélio intacto (E+) e IC incubado com apamina (0,5 μM) (Apam); B) Comparação entre os grupos IC E+ e IC incubado com iberiotoxina (30 nM) (Iberio); C) Comparação entre os grupos IC E+ e IC incubado com apamina mais iberiotoxina (0,5 μM, 30 nM respectivamente) (Apam+Iberio); O período de incubação com os fármacos foi de 30 minutos. A resposta de relaxamento à ACh foi expressa como a porcentagem da contração residual à fenilefrina. Os resultados foram expressos como média ± EPM. O Teste t de Student não pareado foi utilizado para avaliar a diferença entre os grupos que foram consideradas significantes para *P< 0,05 ... 128 Figura 28: Comparação das curvas de relaxamento induzido pela acetilcolina (ACh) em aorta torácica de ratos Sham (preto) e Inf (azul) 30 dias após o infarto do miocárdio. A) Anéis com endotélio intacto (E+) e após a incubação com L-NAME (100 µM); B) Após a incubação com TEA (2 mM); C) Após a incubação com 4-AP (5 mM); D) Diferença da área sobre a curva (dAUC) antes e após a incubação com TEA; E) dAUC antes e após a incubação com 4-AP. O período de incubação com os fármacos foi de 30 minutos. A resposta de relaxamento à ACh foi expressa como a porcentagem da contração residual à fenilefrina. Os resultados foram expressos como média ± EPM. O Teste t de Student não pareado foi utilizado para avaliar a diferença entre os grupos que foram consideradas significantes para P< 0,05 ... 131 Figura 29: Comparação das curvas de relaxamento induzido pela acetilcolina (ACh) em aorta torácica de ratos Sham (preto) e Inf (azul) 30 dias após o infarto do miocárdio. A) Após a incubação com Apamina (Apam, 0.5 µM); B) Após a incubação com Iberiotoxina (Iberio, 30 nM); C) Após a incubação com Apamina mais

incubação com Apam+Iberio. O período de incubação com os fármacos foi de 30 minutos. A resposta de relaxamento à ACh foi expressa como a porcentagem da contração residual à fenilefrina. Os resultados foram expressos como média ± EPM. O Teste t de Student não pareado foi utilizado para avaliar a diferença entre os grupos que foram consideradas significantes para P< 0,05 ... 132 Figura 30: Comparação das curvas de relaxamento induzido pela acetilcolina (ACh) em aorta torácica de ratos Sham (preto) e IC (vermelho) 30 dias após o infarto do miocárdio. A) Anéis com endotélio intacto (E+) e após a incubação com L-NAME (100 µM); B) Após a incubação com TEA (2 mM); C) Após a incubação com 4-AP (5 mM); D) Diferença da área sobre a curva (dAUC) antes e após a incubação com TEA; E) dAUC antes e após a incubação com 4-AP. O período de incubação com os fármacos foi de 30 minutos. A resposta de relaxamento à ACh foi expressa como a porcentagem da contração residual à fenilefrina. Os resultados foram expressos como média ± EPM. O Teste t de Student não pareado foi utilizado para avaliar a diferença entre os grupos que foram consideradas significantes para P< 0,05 ... 134 Figura 31: Comparação das curvas de relaxamento induzido pela acetilcolina (ACh) em aorta torácica de ratos Sham (preto) e IC (vermelho) 30 dias após o infarto do miocárdio. A) Após a incubação com Apamina (Apam, 0.5 µM); B) Após a incubação com Iberiotoxina (Iberio, 30 nM); C) Após a incubação com Apamina mais Iberiotoxina; D) Diferença da área sobre a curva (dAUC) antes e após a incubação com Apam; E) dAUC antes e após a incubação com Iberio; F) dAUC antes a após a incubação com Apam+Iberio. O período de incubação com os fármacos foi de 30 minutos. A resposta de relaxamento à ACh foi expressa como a porcentagem da contração residual à fenilefrina. Os resultados foram expressos como média ± EPM. O Teste t de Student não pareado foi utilizado para avaliar a diferença entre os grupos que foram consideradas significantes para P< 0,05 ... 135 Figura 32: Comparação das curvas de relaxamento induzido pela acetilcolina (ACh) em aorta torácica de ratos Inf (azul) e IC (vermelho) 30 dias após o infarto do miocárdio. A) Anéis com endotélio intacto (E+) e após a incubação com L-NAME (100 µM); B) Após a incubação com TEA (2 mM); C) Após a incubação com 4-AP (5 mM); D) Diferença da área sobre a curva (dAUC) antes e após a incubação com TEA; E) dAUC antes e após a incubação com 4-AP. O período de incubação com os fármacos foi de 30 minutos. A resposta de relaxamento à ACh foi expressa como a porcentagem da contração residual à fenilefrina. Os resultados foram expressos como média ± EPM. O Teste t de Student não pareado foi utilizado para avaliar a diferença entre os grupos que foram consideradas significantes para P< 0,05 ... 137 Figura 33: Comparação das curvas de relaxamento induzido pela acetilcolina (ACh) em aorta torácica de ratos Inf (azul) e IC (vermelho) 30 dias após o infarto do miocárdio. A) Após a incubação com Apamina (Apam, 0,5 µM); B) Após a incubação com Iberiotoxina (Iberio, 30 nM); C) Após a incubação com Apamina mais Iberiotoxina; D) Diferença da área sobre a curva (dAUC) antes e após a incubação com Apam; E) dAUC antes e após a incubação com Iberio; F) dAUC antes a após a incubação com Apam+Iberio. O período de incubação com os fármacos foi de 30 minutos. A resposta de relaxamento à ACh foi expressa como a porcentagem da contração residual à fenilefrina. Os resultados foram expressos como média ± EPM.

Figura 34: Expressão protéica da isoforma endotelial da sintase do óxido nítrico (eNOS), por meio da técnica de Western Blot, em segmentos de artéria aorta torácica de ratos dos grupos Sham (n= 6), Inf (n= 6) e IC (n=6). Na parte superior da figura estão as bandas de Western Blot representativas da expressão da eNOS e da α-actina. Os resultados foram expressos como média ± EPM. Razão entre a densidade das bandas da eNOS e da α-actina. Os resultados não foram significantes para P< 0.05... ... 139 Figura 35: Expressão protéica da forma fosforilada da sintase endotelial do óxido nítrico, no resíduo Ser1177 (p-eNOS), por meio da técnica de Western Blot, em segmentos de artéria aorta torácica de ratos dos grupos Sham (n= 12), Inf (n= 16) e IC (n=16). Na parte superior da figura estão as bandas de Western Blot representativas da expressão da p-eNOS e da α-actina. Os resultados foram expressos como média ± EPM. Razão entre a densidade das bandas da p-eNOS e da α-actina. B) Normalização da densidade das bandas da p-eNOS considerando Sham como 100%. *P< 0,05 IC vs. Sham; +P< 0,05 IC vs. Inf ... 140 Figura 36: Razão da expressão protéica da sintase endotelial do óxido nítrico e da forma fosforilada da sintase endotelial do óxido nítrico, no resíduo Ser1177 (p-eNOS). Técnica de Western Blot, em segmentos de artéria aorta torácica de ratos dos grupos Sham (n= 6), Inf (n= 8) e IC (n=8). Na parte superior da figura estão as bandas de Western Blot representativas da expressão da p-eNOS, eNOS e da α-actina. Os resultados foram expressos como média ± EPM. Razão entre a densidade das bandas da eNOS/p-eNOS. Os resultados não foram significantes, pois o P> 0,05 ... 141 Figura 37: Razão da expressão protéica da isoforma α-1 Na+K+-ATPase. Técnica de Western Blot, em segmentos de artéria aorta torácica de ratos dos grupos Sham (n= 5), Inf (n= 7) e IC (n=7). Na parte superior da figura estão as bandas de Western Blot representativas da expressão da isoforma α-1 Na+

K+-ATPase e da α-actina. Os resultados foram expressos como média ± EPM. Razão entre a densidade das bandas da α-1 Na+

K+ATPase/α-actina. Os resultados não foram significantes, pois o P> 0,05 ... 142 Figura 38: Produção in situ de O2.- em aortas de ratos após 30 dias do infarto do miocárdio. A) Cirurgia fictícia (Sham); B) Infartados sem sinais de insuficiência cardíaca, Inf; C) Infartado com sinais de Insuficiência cardíaca, IC ... 143 Figura 39: Esquema sumarizando os principais resultados encontrados no presente trabalho. ... 170

1, 4, 5 - inositol trifosfato (IP3)

3 - isobutil-l-metilxantina (IBMX –inibidor da fosfodiesterase) 3, 5 - monofosfato cíclico de guanosina (GMPc)

5 - trifosfato de guanosina (GTP)

3,5 - monofosfato cíclico, 8 - bromoadenosina (8-brcAMP – análogo do AMPc) Acetilcolina (ACh)

Aminopridina (4-AP, inibidor dos canais para K+ voltagem dependentes)

Apamina (Apam, inibidor dos canais para K+ ativados por Ca+2 de baixa condutância) Área de cicatriz de infarto do miocárdio (AI)

Arginina vasopressina (AVP)

Canais para K+ voltagem dependentes (Kv)

Canais para K+ ativados por Ca+2 de larga condutância (BKCa)

Canais para K+ ativados por Ca+2 de baixa condutância (SKCa)

Concentração intracelular de Ca+2 ([Ca+2]cit)

Concentração intracelular de Na+ ([Na+]cit)

de Adenosina difosfato (ADP) de Adenosina trifosfato (ATP) Diacilglicerol (DAG)

Endotélio íntegro (E+)

Endotélio removido mecanicamente (E-) Enzima conversora de angiotensina (ACE) Espécies reativas do oxigênio (EROS) Erro padrão da média (EPM)

Fator de necrose tumoral alfa (TNF-α)

Fator hiperpolarizante derivado do endotélio (EDHF) Fator natriurético atrial (FAN)

Fator natriurético cerebral (FNC) Flavina adenina de nucleotídeo (FAD) Flavina mononucleotídeo (FMN) Freqüência cardíaca (FC)

Grupo infartadas que desenvolveram sinais de insuficiência cardíaca (IC) Hipertensão arterial sistêmica (HAS)

Iberiotoxina (Iberio, inibidor dos canais para K+ ativados por Ca+2 de larga condutância)

Infarto do miocárdio (IM)

Inibidor ―não-seletivo‖ da sintase do óxido nítrico (NOS) N(W)

-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME)

Insuficiência cardíaca (IC) Massa corporal (MC) Massa dos pulmões (PP)

Monofosfato cíclico de adenosina (AMPc) monóxido de carbono (CO)

Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH) Ouabaína (OUA)

Óxido nítrico (NO)

Pressão diastólica final do ventrículo esquerdo (PDfVE) Pressão sistólica do ventrículo esquerdo (PSVE)

Primeira derivada temporal de pressão positiva (dP/dt+) Primeira derivada temporal de pressão negativa (dP/dt-) Prostaciclina (PGI2)

Prostaglandina A1 (PGA1)

Prostaglandina E2 (PGE2)

Prostaglandina F2α (PGF2α)

Prostaglandina H2 (PGH2)

Proteína cinase A (PKA) Proteína cinase C (PKC) Proteína cinase G (PKG)

Razão entre a massa da área de infarto e a massa corporal (AI/MC) Razão entre a massa dos pulmões e a massa corporal (PP/MC)

Razão entre a massa do ventrículo direito e a massa corporal (VD/MC)

Razão entre a massa do ventrículo esquerdo e a massa corporal (VE/MC) Resistência vascular periférica (RVP)

Sensibilidade (pEC50)

Serotonina (5-HT)

Sintase de óxido nítrico endotelial (eNOS) Sintase de óxido nítrico (NOS)

Sistema nervoso central (SNC) Sistema nervoso simpático (SNS) Sistema renina-angiotensina (SRA)

Sistema renina-angiotensina-aldosterona (SRAA) Sulfeto de hidrogênio (H2S)

Tetraetilamônio (TEA, inibidor não seletivo dos canais para K+) Tetrahidrobiopterina (BH4)

Tromboxano A2 (TXA2)

Ventrículo Direito (VD) Ventrículo esquerdo (VE)

Introdução: A Na+K+-ATPase e os canais para K+ são essenciais para a regulação do potencial de membrana das células do músculo liso vascular (MLV). A ativação ou a inibição destes canais por fatores vasoativos neurais, humorais e locais possibilitam a modulação fisiológica do tônus vascular. Evidências demonstram que a gênese das alterações da reatividade vascular encontradas em doenças como a hipertensão arterial e o diabetes podem estar relacionadas ao aumento do estresse oxidativo e a alteração da biodisponibilidade de NO que influenciariam o funcionamento da Na+K+-ATPase e dos canais para K+ do MLV. Embora vários trabalhos demonstrem alteração da reatividade vascular após o infarto do miocárdio (IM), nenhum estudo até o presente momento avaliou a participação dos canais para K+ e da Na+K+ATPase nas alterações da reatividade vascular que ocorrem em uma fase crônica após o IM, em ratos com área de cicatriz (AI) semelhante, com e sem sinais de insuficiência cardíaca (IC). Objetivo: Avaliar a atividade funcional da Na+K+-ATPase sensível à ouabaína (OUA) e dos canais para K+ em anéis de aorta de ratos após o IM, com mesma AI, com e sem sinais de IC. Materiais e Métodos: 89 ratos Wistar machos (220-360 g) foram distribuídos em: cirurgia fictícia (Sham, n= 37), animais após o IM sem sinais de IC (Inf, n= 27) e com sinais IC (IC, n= 25). O IM foi induzido cirurgicamente através da oclusão da artéria coronária anterior esquerda. 30 dias após o IM, os animais foram pesados, anestesiados (Uretana, 1,2 g/ kg, i.p.), cateterizados e as medidas hemodinâmicas foram realizadas. Em seguida, os animais foram sacrificados, os dados ponderais foram avaliados pela razão entre a massa úmida do ventrículo direito (VD/MC), ventrículo esquerdo (VE/MC) e pulmões (PP/MC) pela massa corporal (MC) de cada animal. Os anéis de aorta foram removidos, perfundidos com solução de Krebs e gaseificados com mistura carbogênica. A atividade funcional da Na+K+-ATPase sensível à OUA foi verificada pela técnica de relaxamento induzido pelo potássio (0-10 mM), antes e após a incubação com OUA, em anéis com endotélio intacto (E+), sem endotélio (E-) e após a incubação com L-NAME. A participação dos canais para K+ na reatividade vascular foi realizada pela técnica de relaxamento induzido pela acetilcolina (ACh), na presença do L-NAME e dos bloqueadores dos canais para K+: tetraetilamônio (TEA, não seletivo), Aminopridina (4-AP, inibidor dos canais para K+ voltagem dependentes - Kv), Iberiotoxina (inibidor dos canais para K+ ativados por Ca+2 de

larga condutância - BKCa), Apamina (inibidor dos canais para K+ ativados por Ca+2

de baixa condutância - SKCa) e duplo bloqueio com Apamina e Iberiotoxina. Foi

realizada a avaliação da expressão protéica das isoformas α1 da Na+

K+-ATPase e da eNOS através do Western blot. Foi realizada a quantificação da produção do ânion superóxido (O2.-) ―in situ” por fluorescência produzida pela oxidação do

dihidroetídeo (DHE). A AI foi avaliada por contagem de pontos em papel milimetrado (planimetria) e por histologia com a coloração com picrosirius red. Realizou-se avaliação da sensibilidade (pEC50) e da resposta máxima (Rmax). Para comparar os

resultados entre os grupos foi realizada ANOVA 1 e 2 vias, post hoc Bonfferroni e post hoc Tukey, além do Teste t Student quando necessário. Além disso, Os valores foram considerados significantes para *P< 0,05. Os protocolos experimentais foram aprovados (005/2007) pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA-EMESCAM). Resultados: Não houve diferença entre a AI (Inf: 33,67 ± 1,62; IC: 38,7 ± 2,45 %), a massa corporal (Sham: 322 ± 7; Inf: 341 ± 5; IC: 337 ± 7 g) e a razão VE/MC (Sham: 2,12 ± 0,03; Inf: 2,19 ± 0,05; IC: 2,27 ± 0,07 mg/g) entre os grupos estudados. Verificou-se, porém, aumento das razões VD/MC (Sham: 0,64 ± 0,09; Inf: 0,74 ±

IC: 19,65 ± 2,13*+; *+P< 0,05) nos animais IC quando comparados com Inf e Sham. O relaxamento induzido pelo KCl foi maior em animais Inf quando comparados com os animais Sham e IC. Entretanto a remoção do endotélio, bem como incubação com L-NAME ou TEA foram capazes de abolir as diferenças entre os grupos. No grupo IC houve aumento do relaxamento induzido pelo KCl na presença de OUA quando comparados com os Sham. A remoção do endotélio e a incubação com TEA foram capazes de abolir as diferenças entre os grupos Sham e IC, mas a incubação com NAME não. No grupo IC comparado com Sham e Inf, a incubação com L-NAME diminuiu o relaxamento induzido pelo KCl. Após a incubação com TEA houve diminuição da Rmax e sensibilidade dos anéis de aorta dos animais Inf e IC à ACh comparados com os Sham. A dAUC realizada com as curvas de ACh antes e após a incubação com 4-AP foi maior nos animais Inf comparados com Sham e IC. Embora o bloqueio isolado com Apamina ou Iberiotoxina não tenha ocasionado diferenças nas dAUCs entre os grupos, o duplo bloqueio resultou em uma dAUC maior no grupo IC quando comparado com Sham e Inf. Não houve diferença na expressão protéica da α1 da Na+

K+ATPase entre os grupos. Entretanto, a expressão protéica da eNOS e p-eNOS estava diminuída nos animais IC. Além disso, houve maior produção de O2.- nos grupos Inf e IC comparados com Sham. Conclusões: Em uma

fase crônica após o IM experimental, em ratos com AI semelhante com e sem sinais de IC, existem diferenças nos mecanismos de relaxamento vascular que induzem a caracterização de dois grupos com respostas funcionais distintas. Dentre os mecanismos envolvidos estão o aumento da participação dos canais para K+ e do estresse oxidativo após o IM, bem como a expressão diminuída da eNOS e p-eNOS no grupo de animais IC. Além disso, sugere-se que nos animais Inf os canais Kv

estejam contribuindo mais para o relaxamento vascular, enquanto os animais IC, parecem depender mais dos canais KCa. As diferenças no relaxamento vascular, de

acordo com os protocolos utilizados no presente trabalho, não estariam relacionadas à alteração da função e expressão da Na+K+-ATPase entre os grupos.

Introduction: Na K -ATPase and K channels are essential for the regulation of membrane potential in the vascular smooth muscle cells (VSMC). The activation or inhibition of these channels by neural, humoral and local vasoactive factors enable the physiological modulation of vascular tone. Studies show that the genesis of changes in vascular reactivity found in diseases such as hypertension and diabetes may be related to increased oxidative stress and alteration of NO bioavailability that influence the Na+K+-ATPase and K+ channels of the VSM . Although several studies demonstrate changes in vascular reactivity after myocardial infarction (MI), no study to date evaluated the involvement of Na+K+-ATPase and K+ channels in the alterations of vascular reactivity that occur in a chronic phase after MI, in rats with similar scar area (SA), with and without signs of heart failure (HF). Objective: To evaluate the functional activity of the Na+-K+-ATPase ouabain (OUA)-sensitive and K+ channels in aortic rings of rats, after MI, with similar SA, with and without signs of HF. Materials and Methods: 89 male Wistar rats (220-360 g) were divided into: Sham operation (Sham, n = 37), animals after MI without signs of HF (Inf, n = 27) with signs of HF (HF, n = 25). The MI was surgically induced by occlusion of the left anterior coronary artery. 30 days after MI, animals were weighed, anesthetized (urethane, 1.2 g / kg, ip), catheterized and hemodynamic measurements were performed. The animals were sacrificed and the mass data were evaluated by the ratio of wet mass of the right ventricle (RV/BW), left ventricle (LV/BW) and lung (Lung/BW) by body mass (BW) of each animal. The aortic rings were removed, superfused with Krebs solution and aerated with carbogen mixture. The functional activity of the Na+-K+ -ATPase OUA-sensitive was investigated by the relaxation induced by potassium (0-10 mM) before and after OUA incubation, in rings with intact (E+) and removed endothelium (E-), and after L-NAME incubation. The participation of K+ channels in vascular reactivity was performed using the acetylcholine (ACh) induced relaxation after L-NAME and K+ channels blockers incubation: tetra-ethylammonium (TEA, non-selective blockers of K+ channels), Aminopiridin (4-AP, voltage-dependent K+ channels inhibitor - Kv), Iberiotoxin (blocker of Ca2+ channels sensitive of

large-conductance - BKCa), Apamina (blocker of Ca2+ channels sensitive of

small-conductance - SKCa) and the association of iberiotoxin and apamin. We performed

the evaluation of α1 Na

+-K+-ATPase and eNOS protein expression by Western blot. The production of superoxide anion (O2.-) "in situ" was performed by the fluorescence

produced by oxidation of dihidroethidium (DHE). The SA was assessed by counting of the points on graph paper (planimetry) and histology with picrosirius red staining. We carried out evaluation of sensitivity (pEC50) and maximal response (Rmax) to ACh

induced relaxation. To compare results between groups was performed ANOVA 1 and 2 ways, post hoc tests Tukey, Bonfferroni and Student t. Values were considered significant for *P < 0.05. The experimental protocols were approved (005/2007) by the Ethics Committee on Animal Use (CEUA-EMESCAM). Results: There were no differences between the SA (Inf: 33.67 ± 1.62, HF: 38.7 ± 2.45%), body mass (Sham: 322 ± 7; Inf: 341 ± 5, HF: 337 ± 7 g) and the ratio LV/BW (Sham: 2.12 ± 0.03; Inf: 2.19 ± 0.05, IC: 2.27 ± 0.07 mg/ g) between groups. However, there were increased in the RV/BW (Sham: 0.64 ± 0.09; Inf: 0.74 ± 0.04, HF: 1.25 ± 0.08*+ mg/g; *+P <0.01), Lung/BW (Sham: 4.41 ± 0.35, Inf: 3.91 ± 0.48, HF: 8.34 ± 0.69*+ mg/ g *+P< 0.01) and LVEDP (Sham: 5.26 ± 0.52, Inf: 7.20 ± 0.64, IC: 19.65 ± 2.13*+; *+P < 0.05) in the IC group when compared with Sham and Inf. The K+-induced relaxation was higher in Inf compared to Sham and HF animals. However, the endothelium removal,

OUA compared with Sham. Removal of the endothelium and incubation with TEA were able to abolish the differences between the Sham and HF groups, but the L-NAME incubation did not. In the HF group compared with Sham and Inf, L-L-NAME incubation decreased the K+-induced relaxation. After incubation with TEA, Rmax and

the sensitivity of aortic rings to ACh Inf and HF decreased compared with Sham. The dAUC performed with the curves of ACh before and after incubation with 4-AP was higher in Inf animals compared with Sham and HF. Although the blocking with Apamin or Iberiotoxin has not caused the differences between the dAUC of groups, the double block resulted in the dAUC higher in HF group compared with Sham and Inf. There was no difference in protein expression of α1 Na+K+-ATPase between groups. However, the α1 Na

+-K+-ATPase, p-eNOS and eNOS protein expression was diminished in the HF animals. In addition, a higher production of O2.- in the Inf group

compared with Sham and HF. Conclusions: In a chronic phase after experimental MI in rats with similar AI, with and without signs of HF, differences exist in mechanisms that induce vascular relaxation characterization of two distinct groups with functional responses. Among the mechanisms involved are increasing the participation of K+ channels and oxidative stress after MI, as well as decreased expression of eNOS and p-eNOS in the HF group of animals. Moreover, it is suggested that the Inf animals Kv channels are contributing more to the vascular

relaxation, while the HF animals, seem to depend on the channels of KCa. Differences

in vascular relaxation, according to the protocols used in this study, no relation to the change in function and expression of Na+K+-ATPase between the groups.

1 INTRODUÇÃO ... 26 1.1 INFARTO DO MIOCÁRDIO ... 26 1.2 INSUFICIÊNCIA CARDÍACA CONGESTIVA PÓS-INFARTO DO MIOCÁRDIO ... 28

1.2.1 Remodelamento cardíaco ... 29 1.2.2 Ativação neurohumoral ... 31 1.2.3 Reatividade vascular e disfunção endotelial ... 34 1.3 Na+K+-ATPase ... 38 1.3.1 As subunidades da Na+K+-ATPase ... 39 1.3.1.1 Subunidade catalítica α ... 39 1.3.1.2 A subunidade glicosilada β ... 41 1.3.1.3 A subunidade regulatória γ ... 41 1.3.2 Mecanismos de regulação da Na+K+-ATPase ... 43 1.3.2.1 Eventos que envolvem a sinalização das ações hormonais ... 43 1.3.2.2 Regulação da Na+K+-ATPase por íons e ATP ... 45 1.3.2.3 Hormônios na regulação da Na+K+-ATPase ... 46 1.3.2.4 Fatores vasoativos derivados do endotélio na regulação da Na+K+ -ATPase ... 47 1.3.2.5 Regulação da Na+K+-ATPase através dos seus inibidores endógenos ... 50 1.4 FISIOLOGIA DOS CANAIS PARA POTÁSSIO DO MÚSCULO LISO

VASCULAR ... 54 1.4.1.1 Canas de K+ voltagem dependentes (Kv) ... 56

1.4.1.2 Canas de K+ ativados por cálcio (KCa) ... 57

1.4.1.2.1 Canas de K+ ativados por cálcio de larga condutância (BKCa) ... 58

1.4.1.2.2 Canas de K+ ativados por cálcio de baixa (SKCa) e intermediária

condutância (ISKCa) ... 60

1.4.1.3 Canais para potássio sensíveis ao ATP (KATP) ... 61

1.4.1.4 Canais para potássio retificadores de influxo (KIR) ... 63

1.4.1.5 Canais para K+ com dois poros por domínio (K2P) ... 64

2. OBJETIVOS ... 70 2.1 OBJETIVO GERAL ... 70

3.1 COMITÊ DE ETICA ... 71 3.2 ANIMAIS EXPERIMENTAIS ... 71 3.3 PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS ... 71 3.3.1 Infarto agudo do miocárdio ... 71 3.3.2 Medidas hemodinâmicas e avaliação da função ventricular esquerda... 73 3.3.3 Avaliação dos dados ponderais ... 75 3.3.4 Avaliação da área de infarto do miocárdio ... 75 3.3.5 Separação dos Grupos Experimentais ... 79 3.3.6 Preparação dos anéis isolados de aorta ... 80 3.3.7 Estudo da atividade funcional da Na+K+-ATPase sensível à ouabaína ... 83

3.3.7.1 Modulação do endotélio sobre a resposta de relaxamento ao KCl e sobre a capacidade da ouabaína de inibir a atividade funcional da Na+K+ -ATPase ... 84 3.3.7.2 Efeito do bloqueio com L-NAME sobre resposta de relaxamento ao KCl e sobre a capacidade da ouabaína de inibir a atividade funcional da Na+K+ -ATPase ... 84 3.3.7.3 Efeito do bloqueio com tetraetilamônio (TEA) sobre resposta de

relaxamento ao KCl e sobre a capacidade da ouabaína de inibir a atividade funcional da Na+K+ -ATPase ... 85 3.3.8 Avaliação da resposta vasodilatadora dependente do endotélio ... 85

3.3.8.1 Efeito do bloqueio com L-NAME sobre a resposta vasodilatadora dependente do endotélio ... 86 3.3.8.2 Efeito dos bloqueadores dos canais para potássio sobre a resposta vasodilatadora dependente do endotélio ... 87 3.3.9 Quantificação da produção do ânion superóxido (02.-) ―in situ‖. ... 87 3.3.9.1 Fluorescência produzida pela oxidação do dihidroetídeo (DHE). ... 87 3.3.10 Quantificação da expressão protéica através do Western blot ... 87 3.4 EXPRESSÃO DOS RESULTADOS E ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 90 3.5 FÁRMACOS E REAGENTES UTILIZADOS ... 92 4. RESULTADOS ... 94 4.1 AVALIAÇÃO DOS PARÂMETROS HEMODINÂMICOS ... 94 4.2 AVALIAÇÃO DOS PARÂMETROS PONDERAIS ... 96

DIAS APÓS O INFARTO – COMPARAÇÃO INTRAGRUPO ... 103 4.4.1 Grupo Sham ... 103 4.4.2 Grupo Inf ... 105 4.4.3 Grupo IC ... 107 4.5 ATIVIDADE FUNCIONAL DA Na+K+-ATPase SENSÍVEL À OUABAÍNA 30 DIAS APÓS O INFARTO – COMPARAÇÃO INTERGRUPOS ... 109

4.5.1 Comparação da atividade funcional da Na+K+-ATPase sensível à OUA em aortas de ratos com endotélio intacto dos grupos Sham, Inf e IC ... 109 4.5.2 Comparação da modulação do endotélio sobre a atividade funcional da Na+K+-ATPase sensível à OUA nos anéis de aorta de ratos Sham, Inf e IC ... 111 4.5.3 Diferença da participação do NO sobre a atividade funcional da Na+K+ -ATPase sensível à OUA em anéis de aorta dos grupos Sham, Inf e IC ... 113 4.5.4 Diferença da participação dos canais para K+ sobre a atividade funcional da Na+K+-ATPase sensível à OUA em anéis de aorta dos grupos Sham, Inf e IC ... 115 4.6 AVALIAÇÃO DA PARTICIPAÇÃO DOS CANAIS PARA K+ NA RESPOSTA VASODILATADORA DEPENDENTE DO ENDOTÉLIO ... 118

4.6.1 Avaliação da participação dos canais para K+ na resposta vasodilatadora dependente do endotélio nos animais Sham ... 118 4.6.2 Avaliação da participação dos canais para K+ na resposta vasodilatadora dependente do endotélio nos animais infartados sem sinais de IC ... 122 4.6.3 Avaliação da participação dos canais para K+ na resposta vasodilatadora dependente do endotélio nos animais infartados com sinais de IC ... 126 4.6.4 Comparação da participação dos canais para K+ na resposta

vasodilatadora dependente do endotélio em animais Inf e Sham ... 130 4.6.5 Comparação da participação dos canais para K+ na resposta

vasodilatadora dependente do endotélio em animais IC e Sham ... 133 4.6.6 Comparação da participação dos canais para K+ na resposta

vasodilatadora dependente do endotélio em animais Inf e IC ... 136 4.7 RESULTADOS DA AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO PROTÉICA ... 139 4.7.1 Western Blot para detecção das isoformas eNOS e p-eNOS da sintase do óxido nítrico ... 139

4.8 QUANTIFICAÇÃO DA PRODUÇÃO DE ÂNION SUPERÓXIDO (O2 ) “in situ”

ATRAVÉS DA FLUORESCÊNCIA PRODUZIDA PELA OXIDAÇÃO DO

DIHIDROETÍDIO (DHE) ... 143 5 DISCUSSÃO ... 146

5.1 CARACTERIZAÇÃO DOS GRUPOS EXPERIMENTAIS ATRAVÉS DA

AVALIAÇÃO PONDERAL, ÁREA DE INFARTO E HEMODINÂMICA ... 148 5.2 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE FUNCIONAL DA Na+K+-ATPase SENSÍVEL À OUABAÍNA EM ANIMAIS SHAM, Inf E IC ... 153 5.3 AVALIAÇÃO DA PARTICIPAÇÃO DOS CANAIS PARA K+ NA RESPOSTA VASODILATADORA DEPENDENTE DO ENDOTÉLIO NOS ANIMAIS SHAM, Inf E IC ... 157 5.4 AVALIAÇÃO DAS ISOFORMAS α-1 Na+

K+ATPase, eNOS, p-eNOS DA

SINTASE DO ÓXIDO NÍTRICO DO MLV ... 166 5.5 QUANTIFICAÇÃO DA PRODUÇÃO DE ÂNION SUPERÓXIDO (O2.-) ―in situ”

ATRAVÉS DA FLUORESCÊNCIA PRODUZIDA PELA OXIDAÇÃO DO DHE .... 168 6 CONCLUSÃO ... 170 7 REFERÊNCIAS ... ...171

1 INTRODUÇÃO

1.1 INFARTO DO MIOCÁRDIO

O infarto do miocárdio (IM) é considerado a morte tecidual decorrrente de uma obstrução arterial. A baixa perfusão tecidual evolui com sinais e sintomas que são conseqüência da hipóxia e da morte das células cardíacas (Sharpe, 1993; Zornoff et al; 2009).

No Brasil, dentre diversas causas avaliadas pelo Ministério da Saúde em 2008, as doenças do aparelho circulatório representaram 40,8% das mortes em pessoas com mais de 60 anos. Quando foram avaliadas as causas por doenças específicas, o infarto agudo do miocárdio representou 39,3 mortes, a cada 100.000 habitantes, em relação a causas específicas de morte, em todas as idades. O Espírito Santo superou o coeficiente de mortalidade brasileiro por causas específicas, pois em 2009 apresentou o alarmante número de 49,7 mortes a cada 100.000 habitantes sendo ocasionada por infarto agudo do miocárdio (DATASUS, 2011a).

As conseqüências econômicas e sociais das mortes por IM agravam-se quando se constata que os índices de mortalidade aumentam significativamente dentre as pessoas na fase economicamente ativa. Assim, muitos indivíduos de uma faixa etária onde é grande o retorno social pelo trabalho, vão a óbito, ou sobrevivem com graus variados de incapacidade física (DATASUS, 2011b). Dessa forma, é importante compreender as alterações que ocorrem no sistema cardiovascular após o IM a fim de reduzir a morbimortalidade.

A isquemia miocárdica pode resultar da formação de placa de aterosclerose, do desenvolvimento de trombose e da vasoconstrição excessiva (Libby e Theroux, 2005). Os locais mais comuns de oclusão das coronárias por placas de aterosclerose são: 1) no ramo descendente anterior da artéria coronária esquerda; 2) na artéria coronária direita; e 3) no ramo circunflexo da artéria coronária esquerda (Lee et al., 1996; Libby e Theroux, 2005).

Dentre as possibilidades relacionadas com o tempo de evolução da isquemia, o miocárdio sofre progressiva agressão representada pelas áreas de hipóxia, lesão e

necrose, sucessivamente (Pesaro, 2004). Após a agressão ao miocárdio, ocorre o reparo cardíaco que é um complexo processo envolvendo respostas neuroendócrinas, diversos componentes pró-inflamatórios e o remodelamento da matriz extracelular.

A ativação neuroendócrina após o infarto do miocárdio envolve principalmente três sistemas: o sistema nervoso autônomo simpático (SNS); a ativação da produção e liberação do fator natriurético atrial (FAN); e a ativação do sistema renina-angiotensina-aldosterona (SRAA) (Mill et al., 1990).

A ativação do SNS ocasiona um aumento de descarga nervosa nos troncos simpáticos periféricos dirigidos para os rins, coração, vasos e, particularmente, para a supra-renal. Há, portanto, um aumento da concentração circulante de adrenalina, proveniente da supra-renal, como também, há uma elevação da noradrenalina, proveniente do aumento da atividade dos nervos simpáticos. O FAN é um hormônio peptídico que é liberado, dentre outros locais, pelos miócitos atriais quando submetidos ao estiramento. Francis et al. (2001) relacionam a elevação persistente do FAN aos casos que evoluem para insuficiência cardíaca (IC). A ativação do SRAA resulta, em grande parte, no aumento da produção e liberação de renina pelos rins. Como conseqüência da produção e liberação de renina pelo aparelho justaglomerular, aumenta a concentração plasmática de angiotensina II e de aldosterona. Os principais efeitos fisiológicos desta elevação no plasma estariam relacionados a uma tentativa de aumento da volemia, a fim de manter uma perfusão do tecido miocárdico adequada em situações de baixo débito (Skeggs et al., 1976).

Após o IM e a perda de tecido contrátil na área da cicatriz, o coração passa a usar, primeiramente, sua reserva sistólica (representada pelo aumento da atividade contrátil do miocárdio) a fim de manter a perfusão sistêmica. Isso ocorre basicamente pelo aumento da atividade simpática (Pfeffer et al; 1992). Secundariamente, a manutenção do débito cardíaco depende da reserva diastólica, ou seja, do aumento da eficiência sistólica através da ativação do mecanismo de Frank-Starling (Klein et al; 1967). O próximo passo para manutenção da função cardíaca após a perda do miocárdio da área da cicatriz é o remodelamento ventricular.

O remodelamento é um termo utilizado para descrever os processos de reparo das câmaras cardíacas que resultam na alteração da geometria ventricular e diminuição da função cardíaca (Dorn, 2002). Segundo Sutton e Sharpe (2000), o IM

pode ser dividido em duas fases: 1) fase precoce (dentro de 72 horas após o IM); 2) fase tardia (após 72 horas de IM). A fase tardia pode se estender enquanto persistam os estímulos bioquímicos que dependem do tamanho, local e transmuralidade do IM. Nesta fase a concentração de uma série de moduladores pode estar aumentada, tais como: angiotensina II; endotelina 1, catecolaminas, fator de necrose tumoral, interleucina 1 e 6, bem como fatores de crescimento. Estas substâncias funcionariam como moduladores regulando os eventos iniciais do infarto, como a reação inflamatória, além de promoverem efeitos hemodinâmicos e inotrópicos que contribuem para a estabilização dos pacientes. A concentração plasmática destas substâncias pode voltar ao normal dentro de uma semana, ou, em alguns casos, pode ser mantida elevada. Modelos experimentais têm demonstrado que o aumento da concentração dos moduladores podem tanto desencadear quanto regular o remodelamento cardíaco (Rouleau et al; 1991; Nian et al; 2004). Após o IM, o remodelamento ventricular é o principal fator causador da IC (Gaballa e Goldman, 2002; Pfeffer, 2002).

1.2 INSUFICIÊNCIA CARDÍACA CONGESTIVA PÓS-INFARTO DO MIOCÁRDIO

A insuficiência cardíaca congestiva é uma síndrome clínica complexa de caráter sistêmico, definida como disfunção cardíaca que cursa com inadequado suprimento sanguíneo para atender necessidades metabólicas tissulares, na presença de retorno venoso normal, ou é capaz de fazê-lo somente com elevadas pressões de enchimento (Hirsch et al., 1991; Davidoff et al., 2004; Bocchi et al; 2009). Ela é a via final comum da maioria das doenças que acometem o coração, sendo um dos mais importantes desafios clínicos atuais na área da saúde. Trata-se de um problema epidêmico em progressão. Mais de 2/3 (69,8%) das hospitalizações por IC que foram realizadas no ano de 2007 ocorreram em pessoas com mais de 60 anos (DATASUS, 2011a).

No Brasil, a principal etiologia da IC é a cardiopatia isquêmica crônica associada à hipertensão arterial. Em determinadas regiões do país e em áreas com precária condição sócio-econômica, ainda existem formas de IC associadas à

doença de Chagas e a cardiopatia valvar reumática crônica, que são situações especiais de IC em nosso meio (Bocchi et al; 2009). O mecanismo responsável pelos sinais e sintomas clínicos apresentados pelo paciente com IC pode ser decorrente da disfunção sistólica, diastólica ou de ambas, acometendo um ou ambos os ventrículos. Nos adultos, em aproximadamente 60% dos casos está associada à disfunção ventricular esquerda sistólica e no restante 40% à disfunção diastólica, devendo ser realçado que esta última vem sendo mais observada com o aumento da expectativa de vida da população (Zdanowicz, 2002; Bocchi et al; 2009)

A progressão da IC, como uma síndrome de baixo débito, gera o desenvolvimento de mecanismos compensatórios responsáveis pela manutenção da pressão arterial e da adequada perfusão dos órgãos vitais, como a retenção de sódio e água, bem como a vasoconstrição periférica. O remodelamento cardíaco, a ativação neurohumoral, a resposta pró-inflamatória e a disfunção endotelial constituem um ajuste de curto prazo. Em longo prazo, estes mecanismos podem instalar-se, e clinicamente, apresentarem-se como IC (Nasa et al., 1996; Braunwald e Bristow, 2000). Em seguida estes mecanismos serão descritos sucintamente.

1.2.1 Remodelamento cardíaco

À medida que o infarto se consolida, uma dilatação ventricular seria indispensável para manter o débito cardíaco em valores compatíveis com a vida. Desta forma, o sangue bombeado pelo coração deve ser capaz de perfundir os tecidos de acordo com a demanda metabólica do organismo. A necrose dos miócitos e o aumento da sobrecarga ventricular disparam uma cascata de sinalização bioquímica intracelular capaz de promover hipertrofia, dilatação e formação de cicatriz de colágeno. Inicialmente, a hipertrofia ventricular é uma resposta adaptativa benéfica à sobrecarga hemodinâmica por estabilizar a função contrátil, mas sua evolução colabora para a disfunção ventricular progressiva (Spann et al., 1967; Rossini et al; 2010; Mill et al; 2011). O enrijecimento da parede ventricular, secundário à instalação da hipertrofia causa elevação do estresse sistólico e diastólico de parede (Pfeffer e Braunwald, 1990; Matos-Souza et al; 2008). Essa

hipertrofia pode ter um efeito benéfico do ponto de vista energético, já que, segundo a relação de Laplace o estresse gerado na parede ventricular depende da pressão multiplicada pelo raio dividido pelo dobro da espessura da parede da cavidade. Assim, um dado aumento da pressão ventricular pode ser compensado pelo aumento da hipertrofia concêntrica, normalizando o estresse de parede.

Por outro lado, o estresse diastólico final na sobrecarga de volume dispara a replicação dos sarcômeros em série, que resulta em alongamento individual dos miócitos. Este aumento do comprimento celular causa um aumento no volume ventricular total resultando em hipertrofia excêntrica (Pfeffer e Braunwald, 1990; Carabello, 2002; Zornoff et al; 2009). A deterioração progressiva dos ventrículos, a disfunção sistólica e diastólica instaladas pelo contínuo processo de remodelamento levam a diminuição da fração de ejeção, prejuízo no mecanismo de Frank-Starling e descompensação do estresse sistólico, anteriormente evitado de acordo com a Lei de Laplace. O aumento da pós-carga deixa efetivamente de resultar no aumento da pré-carga e o coração gasta muita energia para realizar sua performance de bomba o que resulta em falência da bomba cardíaca (Gerdes, 2002).

Além da hipertrofia após o IM, ocorre aumento na deposição de colágeno na matriz extracelular, o que contribui para alterar o desempenho sistólico e reduzir a complacência da câmara, dificultando o enchimento do ventrículo (Mill et al., 1990; Mill e Vassallo, 2001; Zornoff et al; 2009). O tecido hipertrofiado não possui as mesmas características funcionais do tecido do miocárdio normal. A densidade capilar cai proporcionalmente à hipertrofia e a reserva do fluxo coronariano é reduzida (Marcus et al., 1983). As reservas de substratos de alta energia, como a fosfocreatina, reduzem-se, principalmente no subendocárdio. Assim, a hipertrofia predispõe a um quadro crônico de mecanismos compensatórios que resultam na IC (Mill et al., 1990; Olivetti et al., 1991; Mill e Vassallo, 2001; Matos-Souza et al; 2008).

1.2.2 Ativação neurohumoral

A ativação neurohumoral caracteriza um estado em que os sistemas neural e hormonal são ativados para manter a perfusão adequada dos órgãos vitais (como por exemplo, a circulação cerebral e coronariana) que poderiam sofrer com as conseqüências de uma disfunção cardíaca (Middlekauff e Mark, 1998). Esta ativação inclui o SNS, o SRAA, a arginina vasopressina (AVP), e o FAN.

A ativação do SNS é um aspecto presente nos estágios mais recentes da disfunção ventricular e está envolvida na progressão e no aumento da mortalidade na IC (Francis et al., 1993). Grassi et al; (1995) utilizaram uma técnica de registros através da microneurografia para avaliar a atividade do sistema nervoso simpático no nervo peroneal em humanos e observaram que a atividade do SNS para os vasos sanguíneos dos músculos estava aumentada em pacientes com IC secundária à disfunção do VE. Por outro lado, Benedict et al; (1993) não encontraram os mesmos resultados quando avaliaram pacientes com IC secundária à disfunção do VD. Contudo, estes resultados sugerem que a ativação do SNS reflete mais do que a clínica IC, mas também uma disfunção do VE (Matos-Souza et al; 2008). Em pacientes com IC, a atividade do SNS no coração está aumentada três vezes mais que o normal, sendo ele o primeiro órgão alvo desta ativação. Além disso, os rins e a circulação muscular são também precocemente envolvidos (Rundqvist et al., 1997).

A contínua e prolongada atividade adrenérgica, bem como a vasoconstrição periférica leva a um aumento da pós-carga, diminuição do débito cardíaco e da perfusão renal, contribuindo para o aumento da retenção de água e sódio. Ao mesmo tempo, aumenta a FC e o gasto energético do miocárdio, podendo ocasionar hipertrofia, isquemia, taquiarritmias e danos aos miócitos (Middlekauff e Mark, 1998; Braunwald e Bristow, 2000; Zdanowicz, 2002).

Embora seja conhecida a ativação do SNS durante a IC, as vias envolvidas neste processo ainda não estão completamente claras. Os possíveis mecanismos envolvidos são: atenuação da sensibilidade dos mecanorreceptores arteriais e cardíacos; alteração pressórica na artéria e no capilar pulmonar; exacerbação do quimiorreflexo periférico e central; ativação das aferências simpáticas cardíacas que estão relacionadas à sensação de dor cardíaca durante a isquemia coronariana;

ativação dos aferentes renais sensíveis a estímulos mecânicos ou químicos; ativação do SRA, atenuação da resposta inibitória para o SNC; ativação da resposta excitatória para o sistema nervoso central (SNC); e mudanças nos fatores humorais e locais do cérebro afetando a regulação neural simpática central (Middlekauff e Mark, 1998; De Angelis et al., 2004).

O aumento do tônus adrenérgico resulta no aumento da resistência vascular periférica (RVP) que acontece tanto por estimulação direta, quanto indireta, da contração do músculo liso. A liberação aumentada não só de catecolaminas, mas também de endotelina, e indiretamente, a ativação do SRAA, contribuem para restaurar a pressão e a volemia (Zdanowicz, 2002; Ledoux et al., 2003).

Na IC há um aumento na quantidade de angiotensina II tecidual e circulante que aumenta a pré-carga e a pós-carga, causando remodelamento cardíaco e vascular. A angiotensina II estimula a liberação de endotelina-1, um potente vasoconstritor, bem como de aldosterona, que estimula a reabsorção renal de sódio. Outras ações importantes da angiotensina II são a facilitação da ativação do músculo liso vascular pelas catecolaminas, bem como a redução da sua recaptação pelos terminais pré-sinápticos e a ativação central do SNS (Falkenhahn et al., 1994; Griendling et al., 1997).

Uma importante função da angiotensina II refere-se ao seu envolvimento na modulação da biodisponibilidade do óxido nítrico (NO) por meio do estímulo à produção de ânion superóxido. Há evidências de que o ânion superóxido inativa o NO, alterando a função endotelial. A inibição da síntese de superóxido ou o uso de "varredores" de radicais livres pode melhorar a função endotelial. A diminuição do NO é encontrada em várias doenças que cursam com disfunção endotelial como a hipertensão arterial (Panza et al., 1990; Drexler, 1998), a hipercolesterolemia (Creager et al., 1990), a IC (Lopez e Casado, 2001) e o diabetes (Vallance, 1992). A diminuição da biodisponibilidade do NO durante a IC pode ocorrer por dois motivos: acentuada diminuição da expressão da sintase do óxido nítrico endotelial (eNOS); e aumento da liberação vascular de ânion superóxido (Schafer et al., 2004). Outros hormônios que também se apresentam em elevadas concentrações em pacientes com IC são os peptídeos natriuréticos. O FAN e o fator natriurético cerebral (FNC) são secretados pelo coração em resposta ao estiramento do átrio desencadeado pelo aumento da pressão de enchimento ventricular. Suas ações sobre o músculo liso vascular (MLV), sobre os rins e supra-renais causam, respectivamente,