(22) Data de Depósito: 31/08/2004 (43) Data de Publicação: 24/10/2006 (RPI 1868)

República Federativa do Brasil Ministério do Desenvolvimento, Indústria

e do Comércio Exterior Instituto Nacional da Propriedade Industrial

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PI 0414073-7 A

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(54) Título: MÉTODO PARA INDUZIR UMA RESPOSTA IMUNE CONTRA INFECÇÃO POR ROTAVÍRUS A PARTIR DE UM SOROTIPO DE ROTAVÍRUS, E, USO DE UMA CEPA DE ROTAVÍRUS ATENUADO DE UM SOROTIPO

(30) Prioridade UnioniSta: 02/09/2003 US 60/499,430; 01/07/2004 GB 0414787.2

(71) Depositante(s): Glaxosmithkline Biologicals S.A. (BE)

(72) Inventor(eS): Brigitte Desiree Alberte Colau, Beatrice Arsene Virginie De Vos

(74) Procurador: Momsen, Leonardos & Cia

(86) Pedido Internacional: PCT EP2004/009725 de 31/08/2004

(87) Publicação Internacional: wo 2005/021033 de 10/03/2005

(57) Resumo: "MÉTODO PARA INDUZIR UMA RESPOSTA IMUNE CONTRA INFECÇÃO POR ROTAVÍRUS A PARTIR DE UM SOROTIPO DE ROTAVÍRUS, E, USO DE UMA CEPA DE ROTAVÍRUS ATENUADO DE UM SOROTIPO". A invenção proporciona um método de indução de uma resposta imune contra infecção por retrovírus de um sorotipo de rotavírus, o método compreendendo administrar a um indivíduo uma composição compreendendo uma vacina de rotavírus atenuado de um sorotipo diferente.

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"MÉTODO PARA INDUZIR UMA RESPOSTA IMUNE CONTRA INFECÇÃO POR ROTAVÍRUS A PARTIR DE UM SOROTIPO DE ROTAVÍRUS, E, USO DE UMA CEPA DE ROTAVÍRUS ATENUADO DE UM SOROTIPO"

5 CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se às formulações de vacina de rotavírus. A invenção refere-se ao uso de uma população de rotavírus atenuado de um sorotipo de rotavírus na prevenção de doença associada com infecção por rotavírus de outro sorotipo de rotavírus. Em particular a invenção refere-se ao 10 uso de uma população de rotavírus atenuado de sorotipo G1 na prevenção de

doença associada com infecção por rotavírus de sorotipos não-G1. FUNDAMENTOS

Diarréia infecciosa, aguda é uma causa líder de doença e de morte em muitos países do mundo. Em países em desenvolvimento, o impacto 15 de doença diarréica é incrível, Para Ásia, África e América Latina, tem sido estimado que há entre 3 e 4 bilhões de casos de diarréia cada ano e daqueles casos cerca de 5-10 milhões resultam em morte (Walsh, J. A . et al.: N. Engl. J. Med., 301:967-974 (1979)).

Rotavírus tem sido reconhecido como uma das causas mais 20 importantes de diarréia severa em bebês e crianças jovens (Estes, M. K., "Rotaviruses and Their Replication" em Fields Virology, Terceira Edição, editado por Fields et al., Raven Publishers, Philadelphia, 1996). É estimado que a doença por rotavírus é responsável por mais de um milhão de mortes anualmente. Doença induzida por rotavírus mais comumente afeta crianças 25 entre 6 e 24 meses de idade, e a prevalência de pico da doença em geral ocorre durante os meses mais frios em climas temperados, e ao redor de um ano em áreas tropicais. Rotavírus são tipicamente transmitidos de pessoa para pessoa pela rota fecal-oral com um período de incubação de cerca de 1 dia a cerca de 3 dias. Diferente da infecção no grupo de 6 meses a 24 meses de

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8(8):21-26, 1982).

Rotavírus são em geral esféricos, e seu nome é derivado de sua estrutura de capsídeo de capa dupla ou interna e externa distintas. Tipicamente, a estrutura de capsídeo de capa dupla de um rotavírus circunda 10 uma casca ou núcleo de proteína interna que contém o genoma. 0 genoma de um rotavírus é composto de 11 segmentos de RNA de fita dupla que codificam pelo menos 11 proteínas virais distintas. Duas destas proteínas virais chamadas de VO4 e VP7 estão arranjadas sobre o exterior da estrutura de capsídeo de casca dupla. 0 capsídeo interno do rotavírus apresenta uma 15 proteína, que é a proteína do rotavírus designada VP6. A importância relativa destas três proteínas virais específicas na geração de resposta imune que segue à infecção por rotavírus ainda não está clara. Contudo, a proteína VP6 determina o antígeno de grupo e subgrupo, e as proteínas VP4 e VP7 são os determinantes de especificidade de sorotipo.

20 Até o presente, pelo menos 14 sorotipos G de rotavírus e 11 sorotipos P de rotavírus têm sido identificados (Linhares A. C. & Bresse J. S., Pan Am. J. Publ. Health 2000, 9, 305-330). Dentre estes, 10 sorotipos G e 6 sorotipos P têm sido identificados dentre os rotavírus de humano.

A proteína VP7 é uma glicoproteína de PM de 38.000 (PM de 25 38.000 quando não-glicosilada) que é o produto de tradução do segmento genômico 7, 8 ou 9, dependendo da cepa. Esta proteína estimula a formação do anticorpo neutralizador após infecção por rotavírus. A proteína VP4 é uma proteína não-glicosilada de PM aproximadamente de 88.000 que é o produto de tradução do segmento genômico 4. Esta proteína também estimula o

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anticorpo neutralizador após infecção por rotavírus.

Visto que as proteínas VP4 e VP7 são as proteínas virais contra as quais os anticorpos neutralizadores são direcionados, acredita-se que são as primeiras candidatas para o desenvolvimento de vacinas de rotavírus, 5 proporcionando proteção contra doença por rotavírus.

É sabido que a infecção por rotavírus natural durante a infância inicial gera imunidade protetora. Uma vacina de rotavírus atenuada viva é portanto elevadamente desejável. Preferivelmente esta deve ser uma vacina oral, porque esta é a rota natural de infecção do vírus.

10 0 desenvolvimento inicial de vacina para prevenir infecção por rotavírus começou nos anos 1970 após a descoberta do vírus. Inicialmente, cepas atenuadas de animais e de humanos eram estudadas e tiveram resultados mistos ou decepcionantes. Esforços mais recentes têm focalizado sobre reclassificadores humano-animal que têm sido mais bem 15 sucedidos.

Tem sido descrita uma cepa de rotavírus conhecida como 89-12 por Ward; veja a Patente U.S. 5.474.773 e Bemstein, D. L. et al., Vaccine, 16 (4), 381-387, 1988. A cepa 89-12 foi isolada de um espécime de fezes coletado de uma criança de 14 meses de idade com doença por rotavírus 20 natural em 1988. De acordo com a Patente U.S. 5.474.773 o rotavírus de humano HRV 89-12 foi então adaptado para cultura por 2 passagens em células de Rim de Macaco Verde Africano (AGMK) e por 4 passagens em células MA-104 como descrito por Ward em J. Clin. Microbiol., 19, 748-753, 1984. Foi então purificado de placa 3 vezes em células MA-104 (para a 25 passagem 9) e crescido após 2 passagens adicionais nestas células. Uma passagem adicional foi preparada (passagem 12) para depósito com o ATCC sob o número de acesso ATCC VR 2272. A cepa depositada é conhecida como 89-12C2.

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abaixo como o ensaio em Vaccine (1998). 0 ensaio descreve a segurança e a imunogenicidade de uma candidata à vacina de rotavírus de humano vivo oralmente administrada. Esta vacina foi obtida da cepa 89-12, atenuada pela passagem sem purificação de placa 26 vezes em células AGMK primárias e 5 então outras 7 vezes em uma linhagem de células AGMK estabelecida (33

passagens no total).

Daqui em diante o material acima mencionado que tem sido serialmente passado 26 vezes será referido a P26 e o material que tem sido serialmente passado 33 vezes será referido a P33. Em geral, rotavírus 10 derivado pela passagem de 89-12 n vezes será referido a Pn.

Nos exemplos que seguem o material P33 foi passado mais 5 vezes em células Vero. Este é referido a P38.

Os isolados P26 e P33 descritos no ensaio em Vaccine (1998) não foram depositados em uma coleção de culturas, nem foram analisados 15 para estabelecer sua caracterização genética.

Agora tem sido verificado que a população P26 descrita na literatura compreende uma mistura de variantes. Isto tem sido estabelecido por caracterização genética como descrito aqui abaixo (veja os exemplos). P26 não é portanto uma população confiavelmente consistente para passagens 20 adicionais, em particular para a produção de lotes de vacina. Semelhantemente, P33 compreende uma mistura de variantes e não é confiavelmente consistente para a produção de lotes de vacina.

Tem sido verificado que o material P26 é uma mistura de pelo menos três variantes de gene VP4. P33 e P38 são semelhantemente uma 25 mistura de duas variantes. Estas variantes parecem ser antigeneticamente diferentes, em termos de epitopos neutralizadores, em relação à cepa 89-12C2 depositada na ATCC quando se avaliam os títulos de anticorpo neutralizador de soros de bebês vacinados com P33 contra estas variantes.

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administrado a bebês, duas variantes identificadas são replicadas e excretadas. De 100 bebês vacinados, apenas 2 mostraram sinais de gastroenterite devido à infecção por rotavírus, enquanto que 20% de um grupo de placebo foi infectado. Estas descobertas sugerem que as variantes identificadas estão • 5 associadas com a proteção contra a doença por rotavírus.

WO 0112797 descreve um método de separar variantes de rotavírus e uma vacina de rotavírus atenuado vivo melhorado derivado de uma cepa de rotavírus de humano (homogêneo) clonado. Também é descrita uma população (isolado) de rotavírus atenuado, caracterizada pelo fato de que 10 compreende uma variante única ou substancialmente uma variante única, a citada variante definida pela seqüência de nucleotídeos codificadora de pelo menos uma das proteínas virais maiores designadas como VP4 e VP7. Eficácia protetora de uma tal vacina de rotavírus de humano atenuado oral contra cepa heteróloga G9 tem sido relatada em bebês na América Latina 15 (Perez et al., 42nd Interscience Conference on Antimicrobial Agentes and Chemotherapy (ICAAC 2002) 27-30 de Setembro de 2002, San Diego). 0 conteúdo inteiro de WO0112797 é aqui incorporado como referência.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1 é a seqüência de nucleotídeos codificadora da 20 proteína VP4 de P43.

Figura 2 é a seqüência de nucleotídeos codificadora da proteína VP7 de P43.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Na presente invenção temos determinado que uma população 25 de rotavírus atenuado, caracterizada pelo fato de que ela compreende uma única variante ou substancialmente uma única variante, a citada variante definida por uma seqüência de nucleotídeos codificadora de pelo menos uma das proteínas virais maiores designadas como VP4 e VP7, pode ser usada como uma vacina para proporcionar proteção cruzada contra infecção por

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rotavírus de um sorotipo diferente daquele utilizado na vacina.

Em particular o uso de uma população de rotavírus G1, [por exemplo como depositada na European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Vaccine Research and Production Laboratory, Public Health 5 Laboratory Service, Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG, Reino Unido aos 13 de agosto de 1999 sob o número de depósito 99081301, sob os termos do Tratado de Budapeste], pode ser utilizado para prevenir doença causada por ambos sorotipos de rotavírus G1 e pelo menos um não-G1, tais como os sorotipos de rotavírus 10 G2, G3, G4 e G9.

Conseqüentemente a presente invenção refere-se ao uso de uma população de rotavírus atenuado de um sorotipo de rotavírus na prevenção de doença associada com infecção por rotavírus de outro sorotipo de rotavírus, na qual o sorotipo é preferivelmente definido por referência à 15 seqüência da proteína G de rotavírus.

Preferivelmente a população de rotavírus é caracterizada pelo fato de que ela compreende uma única variante ou substancialmente uma única variante, a citada variante definida por uma seqüência de nucleotídeos codificadora de pelo menos uma das proteínas virais maiores designadas 20 como VP4 e VP7.

Preferivelmente a população de rotavírus compreende proteínas virais VP4 e VP7 do depósito 99081301 em ECACC adequadas para proporcionarem um efeito protetor cruzado.

Preferivelmente o sorotipo de rotavírus atenuado é G1 e é 25 capaz de proporcionar proteção cruzada contra doença causada por sorotipos de rotavírus G1 e não-G1 tais como os sorotipos selecionados do grupo consistindo de: G2, G3, G4, G5, G6, G7, G8, G9, G10, G11, G12, G13 e G14. Em particular o uso de uma população de rotavírus atenuado G1 [por exemplo como depositada na European Collection of Animal Cell

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Cultures (ECACC), Vaccine Research and Production Laboratory, Public Health Laboratory Service, Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG, Reino Unido aos 13 de agosto de 1999 sob o número de depósito 99081301, sob os termos do Tratado de 5 Budapeste], pode ser utilizado para prevenir doença causada por pelo menos um, preferivelmente pelo menos dois, com maior preferência pelo menos três, mais preferivelmente pelo menos quatro sorotipos de rotavírus não-G1 selecionados do grupo consistindo de: G2, G3, G4, G5, G6, G7, G8, G9, G10, G11, G12, G13 e G14. Em um aspecto particularmente preferido, uma 10 resposta imune é induzida contra dois ou mais sorotipos não-G1 de rotavírus, tipicamente contra qualquer sorotipo selecionado do grupo consistindo de: G2, G3, G4, G5, G6, G7, G8, G9, G10, G11, G12, G13 e G14. É preferido que se tenha proteção heterotípica contra pelo menos dois, com maior preferência pelo menos três, mais preferivelmente pelo menos quatro dos 15 seguintes sorotipos não-G1: G2, G3, G4 e G9, em adição à proteção

homotípica (G1).

Em particular de acordo com a presente invenção, é proporcionado o uso de uma cepa de rotavírus atenuado de um sorotipo G1 na manufatura de uma composição de vacina para a indução de uma resposta 20 imune contra um rotavírus que é não G1 ou G9. Em um aspecto preferido uma resposta imune é adicionalmente induzida contra infecção por rotavírus por um sorotipo G9 e/ou sorotipo Gl. Em um aspecto preferido particular, uma resposta imune é induzida contra dois ou mais sorotipos de rotavírus, estes sorotipos não sendo G1 ou G9. Tipicamente qualquer sorotipo diferente 25 de G1 ou G9 é selecionado da lista consistindo de: G2, G3, G4, G5, G6, G7, G8, G10, G11, G12, G13 e G14. É preferido que se tenha proteção heterotípica contra pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, com maior preferência pelo menos cinco ou mais destes sorotipos diferentes daquele da composição de vacina. Mais preferivelmente uma resposta imune

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é induzida contra todos os seguintes sorotipos não-G1: G2, G3, G4 e G9. A invenção também se refere a um método para induzir uma resposta imune contra infecção por rotavírus de um sorotipo de rotavírus, o método compreendendo administrar a um indivíduo uma composição 5 compreendendo uma vacina de rotavírus atenuado de um sorotipo diferente.

Preferivelmente o método é um método para induzir uma resposta imune contra sorotipo não-G9 de rotavírus, o método compreendendo administrar a um indivíduo uma composição compreendendo uma vacina de sorotipo G1 de rotavírus compreendendo uma única variante 10 ou substancialmente uma única variante como aqui definida.

Preferivelmente a população de rotavírus dentro da composição de vacina é de especificidade G1P1A P[8]. Mais preferivelmente a população de rotavírus compreende as proteínas virais VP4 e VP7 do depósito 99081301 em ECACC adequadas para gerar uma resposta imune e, 15 tipicamente, proporciona um efeito protetor cruzado. Preferivelmente a vacina de rotavírus usada é depósito 99081301 em ECACC , ou é derivada daquele depósito.

Em uma modalidade a invenção exclui o uso da cepa de rotavírus correspondendo a 99081301 em ECACC, em um método ou uso 20 como indicado acima para induzir uma resposta imune apenas ao sorotipo G9, embora o emprego de uma tal cepa G1 para a indução de respostas imunes para G9 em combinação com indução de respostas imunes para outros sorotipos G não seja em geral excluído.

Adequadamente a invenção refere-se às cepas de rotavírus 25 G1P8 em métodos e usos como descritos acima.

Preferivelmente a vacina é usada em um regime de 2 doses. Preferivelmente a vacina proporciona proteção cruzada contra gastroenterite. Conseqüentemente, em outro aspecto é proporcionado um método de acordo com a invenção no qual a composição é até 60% protetora,

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em uma população de indivíduos vacinados, contra diarréia causada pela infecção de um rotavírus de um tipo diferente daquele do rotavírus atenuado presente na composição. Em outro aspecto, é proporcionado um método de acordo com a invenção no qual a composição é até 81% protetora, em uma 5 população de indivíduos vacinados, contra gastroenterite causada pela infecção de um rotavírus de um tipo diferente daquele do rotavírus atenuado presente na composição. Em ainda um outro aspecto, é proporcionado um método de acordo com a invenção no qual a composição compreende uma cepa de rotavírus G1 que é até 83% protetora em uma população de 10 indivíduos vacinados contra gastroenterite severa causada por infecção de

rotavírus de pelo menos dois sorotipos não-G1.

Preferivelmente a taxa de proteção contra diarréia e/ou gastroenterite e/ou gastroenterite severa alcançada em uma população de indivíduos vacinados infectados por um rotavírus de um tipo diferente 15 daquele do rotavírus atenuado presente na composição, está entre 10% e 90%, com maior preferência entre 20% e 80%, mais preferivelmente é de pelo menos 50%.

A vacina de rotavírus usada para dar proteção cruzada possui as seguintes características preferidas:

20 Preferivelmente a população de rotavírus de acordo com a invenção é uma variante clonada.

Uma população compreendendo uma única variante, ou substancialmente uma única variante, significa uma população de rotavírus que não contém mais do que 10%, e preferivelmente menos do que 5% e mais 25 preferivelmente menos do que 1% de uma variante ou variantes diferentes. Populações de vírus podem ser purificadas para homogeneidade ou homogeneidade substancial pela passagem em tipos celulares adequados ou pela realização de uma série de uma ou mais etapas de clonagem.

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compreendendo uma única variante é mais apropriada para a formulação de um lote de vacina consistente. Variantes específicas definidas pelas seqüências de nucleotídeos codificadoras das proteínas virais maiores também podem estar associadas com a eficácia aumentada na prevenção da infecção ° 5 por rotavírus.

Em um aspecto preferido, a única ou substancialmente única variante na população de rotavírus da invenção é uma variante na qual o gene VP4 compreende uma seqüência de nucleotídeos compreendendo pelo menos uma das seguintes: uma base adenina (A) na posição 788, uma base adenina 10 (A) na posição 802 e uma base timina (T) na posição 501 a partir do códon de

iniciação.

Em um outro aspecto preferido, a única ou substancialmente única variante na população de rotavírus da invenção é uma variante na qual o gene VP7 compreende uma seqüência de nucleotídeos compreendendo pelo 15 menos uma das seguintes: uma timina (T) na posição 605, uma adenina (A) na posição 897 ou uma guanina (G) na posição 897 a partir do códon de iniciação. Preferivelmente na posição 897 há uma adenina (A).

Em um aspecto preferido a única variante na população de acordo com a invenção possui uma adenina (A) nas posições 788 e 802 e uma 20 timina (T) na posição 501 a partir do códon de iniciação na seqüência de gene

VP4.

Em outro aspecto preferido a única variante na população de acordo com a invenção possui uma timina (T) na posição 605 e uma adenina/guanina (A/G) na posição 897 a partir do códon de iniciação na 25 seqüência de gene VP7. Mais preferivelmente na seqüência VP7 há uma

adenina (A) na posição 897.

Em um aspecto particularmente preferido a única variante na população de acordo com a invenção possui uma adenina (A) nas posições 788 e 802 e uma timina (T) na posição 501 a partir do códon de iniciação na

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5 Em outro aspecto a única variante compreende uma seqüência de nucleotídeos codificadora de uma proteína VP4 na qual a seqüência de nucleotídeos é como a mostrada na Figura 1, e/ou uma seqüência de nucleotídeos codificadora de uma proteína VP7 na qual a seqüência de nucleotídeos é como a mostrada na Figura 2.

10 Populações de rotavírus preferidas para uso na presente invenção podem ser obtidas por um método compreendendo:

a) diluição limitada; ou

b) isolamento de placa individual; e

checagem para a presença de uma variante substancialmente única pela 15 realização de uma determinação de seqüência de uma região apropriada da

seqüência de gene VP4 e/ou VP7.

Preferivelmente a população é derivada das cepas P33 ou P26 como descritas acima.

A determinação de seqüência pode ser adicionalmente 20 realizada por uma técnica de hibridização semi-quantitativa ou quantitativa tal

como uma hibridização em slot blot ou hibridização em placa.

Preferivelmente a variante selecionada é uma variante que é replicada e excretada quando a preparação de rotavírus inicial é administrada a um indivíduo humano, em particular a uma criança.

25 Tipos de célula adequados para passagem da população de rotavírus no método acima incluem as células de rim de macaco verde africano (AGMK), que podem ser linhagens celulares estabelecidas ou células AGMK primárias. Linhagens de célula AGMK apropriadas incluem por exemplo Vero (ATCC CCL81), DBS-FRhL-2 (ATCC CL-160), BSC-1

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(ECACC 85011422) e CV-1 (ATCC CCL70). Também são adequadas as linhagens celulares MA-104 (macaco rhesus ) e MRC-5 (de humano — ATCC CCL-171). Células Vero são particularmente preferidas para propósitos de amplificação. Passagem em células Vero dá um rendimento de vírus elevado. 5 Técnicas para a checagem se há uma única variante em uma

população de vírus resultante do método, e para determinar a natureza daquela única variante envolvem procedimentos de hibridização ou de seqüenciamento padrão conhecidos na técnica e que estão descritos aqui abaixo.

10 Em um aspecto preferido o método da invenção é realizado usando rotavírus apropriado, particularmente rotavírus possuindo as características da cepa 89-12 ou de um seu derivado de passagem.

Uma população de variante única particularmente preferida é P43, que foi obtida de P33 (por passagem 33 vezes de um rotavírus de 15 humano isolado em cultura de tipos de célula apropriados) por uma série de etapas de clonagem de diluição final seguida pela passagem do material clonado em células Vero para amplificação.

A população P43 foi depositada na European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Vaccine Research and Production 20 Laboratory, Public Health Laboratory Service, Centre for Applied Microbiology and Research, Potion Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG, Reino Unido aos 13 de agosto de 1999 sob o número de depósito 99081301, sob os termos do Tratado de Budapeste.

Embora esta disponibilidade pública indicada seja o método 25 mais simples de obtenção de rotavírus de humano P43, rotavírus semelhantes e funcionalmente idênticos podem ser produzidos por estes ou outros métodos em vista dos ensinamentos desta invenção. Tais rotavírus funcionalmente substancialmente idênticos são considerados biologicamente equivalentes ao rotavírus de humano P43 desta invenção e portanto estão dentro do escopo

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geral da presente invenção. Portanto será entendido que a invenção inclui populações de rotavírus possuindo as características da variante P43 corno aqui descritas.

Também será entendido que a invenção inclui materiais • 5 derivados de P43 ECACC 99081301 depositado ao submetê-lo a processamento adicional por passagem, clonagem ou outros procedimentos adicionais usando o vírus vivo ou por modificação de P43 em qualquer maneira incluindo por técnicas de engenharia genética ou técnicas reclassificadores. Tais etapas e técnicas são bem conhecidas na técnica.

10 Materiais derivados de P43 depositado que são cobertos pela invenção incluem material de proteína e genético. De interesse particular são os rotavírus reclassificadores que compreendem pelo menos um antígeno ou pelo menos um segmento de P43, por exemplos os reclassificadores que compreendem urna cepa de rotavírus virulenta na qual um ou parte de um dos 15 11 segmentos de genoma tem sido substituída pelo segmento de genoma ou sua parte de P43. Especificamente, um reclassificador de rotavírus no qual o segmento ou segmento parcial codificador de NSP4 é um segmento ou segmento parcial de P43, pode ter propriedades úteis. Rotavírus reclassificadores e técnicas para a preparação deles são bem conhecidos 20 (Foster, R. H. e Wagstaff, A. J. "Tetravalent Rotavirus Vaccine, a-review".

ADIS drug evaluation, BioDrugs, Gev, 9 (2), 155-178, 1998).

Materiais de interesse específicos são progênie de P43 e os derivados de P43 imunologicamente ativos. Derivados imunologicamente ativos significam materiais obtidos de ou com o vírus P43, particularmente 25 antígenos do vírus, que são capazes de gerar uma resposta imune que é reativa

contra Rotavírus quando injetados em um animal hospedeiro.

Na adaptação do rotavírus a uma linhagem celular apropriada, por exemplo células Vero, pode ser necessário tratar o vírus de modo a se livrar de um contaminante potencial tal como quaisquer agentes imprevistos

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que possam estar presentes e que de outro modo causariam contaminação. No caso de vírus imprevistos sensíveis ao éter, isto pode ser feito pelo tratamento com éter como descrito aqui abaixo. A presente invenção também se refere à inclusão de tal tratamento de éter como uma etapa opcional no procedimento 5 total para a obtenção de um rotavírus vivo atenuado ou de uma vacina

formulada com o mesmo.

Vacina compreendendo variantes de rotavírus únicas ou substancialmente únicas são preferidas, contudo, o uso de variantes únicas ou de variantes substancialmente únicas não é essencial. A cepa de rotavírus 10 protetora cruzada da presente invenção pode ser combinada com outras cepas de rotavírus para proporcionar proteção ou proteção cruzada adicional contra doença ou infecção por rotavírus.

Portanto, também estão dentro do escopo da invenção as misturas de P43 com outras variantes de rotavírus, por exemplo outras 15 variantes clonadas, ou com outros vírus em particular com outros vírus atenuados. Tais misturas são úteis nas vacinas da invenção que são descritas aqui abaixo.

A presente invenção também proporciona uma vacina de rotavírus atenuado vivo capaz de proporcionar proteção cruzada, 20 preferivelmente que compreende uma população de uma variante substancialmente única, misturada com um adjuvante ou um veículo farmacêutico adequado.

Preferivelmente, a vacina de rotavírus de acordo com a invenção é uma vacina de rotavírus monovalente contendo uma única cepa de 25 rotavírus.

A presente invenção é particularmente vantajosa na provisão de uma vacina de rotavírus vivo na qual o rotavírus atenuado vivo é um rotavírus de humano e não causa intussuscepção.

15 • •e• • • • • • ••• ••e i • • • • •• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • ••w • ••• • c • • • • • • • • • • • e • ••• • • ••• • • • • rotavírus atenuado de acordo com a invenção incluem aqueles conhecidos na técnica como sendo apropriados para administração oral, especialmente a bebês. Tais veículos incluem e não são limitados a carboidratos, polialcoóis, aminoácidos, hidróxido de alumínio, hidróxido de magnésio, hidróxi-apatita, 5 talco, dióxido de titânio, estearato de magnésio, carbóxi-metil-celulose, hidróxi-propil-metil-celulose, celulose microcristalina, gelatina, peptona vegetal, xantana, carragenano, goma arábica, (3-ciclo-dextrina.

A invenção também proporciona um processo para preparar uma vacina de rotavírus, por exemplo por secagem por congelamento do vírus 10 na presença de estabilizadores adequados ou misturação do vírus de acordo

com a invenção com um veículo farmacêutico ou adjuvante adequado.

Também pode ser vantajoso formular o vírus da invenção em veículos baseados em lipídeo tais como virossomos ou lipossomos, em emulsões de óleo em água ou com partículas veículo. Alternativamente ou em 15 adição imunoestimulantes tais como aqueles conhecidos na técnica para vacinas orais podem estar incluídos na formulação. Tais imunoestimulantes incluem toxinas bacterianas, particularmente toxina da cólera (CT) na forma da holotoxina (molécula inteira) ou apenas a cadeia B (CTB) e a enterotoxina de E. coli lábil ao calor (LT). LTs mutadas (mLTs) que são menos propensas 20 à conversão em sua forma ativa do que a LT nativa são descritas em WO

96/06627, WO 93/13202 e US 5.182.109.

Outros imunoestimulantes que podem ser vantajosamente incluídos são derivados de saponina tais como QS21 e monofosforil-lipídeo A, em particular monofosforil-lipídeo A 3-de-O-acilado (3D-MPL). 25 Saponinas purificadas como adjuvantes orais estão descritas em WO 98/56415. Saponinas e monofosforil-lipídeo A podem ser empregadas separadamente ou em combinação (por exemplo WO 94/00153) e podem ser formuladas em sistemas adjuvantes juntamente com outros agentes. 3D-MPL é um adjuvante bem conhecido fabricado por Ribi Immunochem, Montana e é

16 7• ••• • • • • • ••• ••• • 0 Y • • • •• • • • • • o • 'I • • • • • • • • • • • •• • • • ••0 • ••• • O • • • • • • • • • • • • • • • ••• • • •11 • • • • fabricado como descrito em GB 2122204.

Uma discussão geral de veículos e adjuvantes para imunização oral pode ser encontrada em Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach, editado por Powell e Newman, Plenum Press, New York, 1995. 5 A invenção também proporciona um método para vacinar indivíduos humanos, especialmente bebês, pela administração a um indivíduo em necessidade da mesma de uma quantidade efetiva de uma composição de vacina de acordo com a invenção. Preferivelmente a vacina atenuada viva é administrada por administração oral.

10 Em um aspecto preferido a cepa de rotavírus atenuado de acordo com a invenção é formulada com um antiácido para minimizar a inativação da vacina pelo ácido no estômago. Componentes antiácidos adequados incluem antiácidos inorgânicos por exemplo hidróxido de alumínio Al(OH)3 e hidróxido de magnésio Mg(OH)2. Antiácidos comercialmente 15 disponíveis que são adequados para uso na invenção incluem Mylanta (marca comercial) que contém hidróxido de alumínio e hidróxido de magnésio. Estes são insolúveis em água e são dados em suspensão.

Hidróxido de alumínio é um componente particularmente preferido de uma composição de vacina de acordo com a invenção porque 20 pode proporcionar não apenas um efeito antiácido mas também um efeito

adjuvante.

Também são adequados para uso como antiácidos na vacina da invenção antiácidos orgânicos tais como sais de carboxilato de ácido orgânico. Um antiácido preferido na composição de vacina da invenção 25 contém um sal de carboxilato de ácido orgânico, preferivelmente um sal de

ácido cítrico tal como citrato de sódio ou citrato de potássio.

Um antiácido particularmente preferido que pode ser utilizado na composição de vacina da presente invenção é o sal inorgânico insolúvel, carbonato de cálcio (CaCO3). 0 carbonato de cálcio é capaz de se associar

17 . . .. ... • • • • • • ..•. . •• . . • ... • ••• • . . • • •• •• • • . . . . • . .. • . . ... • ••• •• •• • . • • . . . . • •• • • • • • • • ••• • . ... • • • •

com o rotavírus e a atividade do rotavírus é mantida durante a associação com o carbonato de cálcio.

Para prevenir a sedimentação do carbonato de cálcio durante a etapa de enchimento, agentes viscosos • estão preferivelmente presentes na 5 formulação.

Agentes viscosos possíveis que podem ser usados incluem excipientes pseudoplásicos. Uma solução pseudoplásica é definida como uma solução possuindo viscosidade maior em repouso comparada com a sua viscosidade sob agitação. Excipientes deste tipo são polímeros naturais tais 10 como goma arábica, goma adraganto, ágar-ágar, alginatos, pectinas ou polímeros semi-sintéticos por exemplo: carbóxi-metil-celulose (Tyloses C®), metil-celulose (Methocels A®, Viscotrans MC®, Tylose MH® e MB®), hidróxi-propil-celulose (Klucels®), e hidróxi-propil-metil-celulose (Methocels E®, e K®, Viscontrans MPH®). Em geral aqueles excipientes 15 pseudoplásicos são usados juntamente com agentes tixotrópicos. Agentes viscosos alternativos que podem ser usados são excipientes pseudoplásicos com capacidade de escoamento baixa. Estes polímeros, em uma concentração suficiente, produzem um arranjo de fluido estrutural resultando em uma solução de viscosidade alta possuindo capacidade de escoamento baixa em 20 repouso. Uma certa quantidade de energia necessita ser fornecida ao sistema para permitir escoamento e transferência. Energias externas (agitação) são necessárias para destruir temporariamente o arranjo de fluido estrutural com o propósito de obter uma solução fluida. Exemplos de tais polímeros são Carbopols® e goma xantana.

25 Excipientes tixotrópicos se tornam uma estrutura de gel em repouso enquanto que sob agitação formam uma solução fluida. Exemplos de excipientes tixotrópicos são: Veegum® (silicato de alumínio e magnésio) e Avicel RC® (cerca de 89% de celulose microcristalina e 11% de Na-carbóxi-metil-celulose).

18 . . .. ... • . . . . • .. • • • . . • ... ... • •

. . • . . . . • . . . . . .

.. • . . ... • ... . . . .

• . . . . • . . . . . .

• ... • . ... • . • •

A composição de vacina da presente invenção preferivelmente compreende um agente viscoso selecionado de goma xantana ou amido.

Assim a composição de vacina da presente invenção é preferivelmente formulada com uma combinação de carbonato de cálcio e 5 goma xantana.

Outros componentes de uma composição usada na invenção adequadamente incluem açúcares por exemplo sacarose e/ou lactose.

A composição de vacina de acordo com a invenção pode conter componentes adicionais incluindo por exemplo agentes aromatizantes 10 (particularmente para uma vacina oral) e agentes bacteriostáticos.

Preparações diferentes da composição de vacina de acordo com a invenção são contempladas.

Em uma modalidade preferida, a vacina é administrada como uma formulação líquida. Preferivelmente a formulação líquida é reconstituída 15 antes da administração a partir de pelo menos os seguintes dois componentes:

i) componente vírus ii) componente líquido.

Nesta modalidade, o componente vírus e o componente líquido estão normalmente presentes em recipientes separados, que podem ser 20 compartimentos convenientemente separados de um único vaso, ou vasos separados que podem ser conectados em uma tal maneira que a composição de vacina final é reconstituída sem expô-la ao ar.

Antes da reconstituição, o vírus pode estar em uma forma seca ou em uma forma líquida. Preferivelmente o componente vírus é liofilizado. 25 0 vírus liofilizado é mais estável do que o vírus em uma solução aquosa . 0 vírus liofilizado pode ser adequadamente reconstituído usando uma composição antiácida líquida para produzi uma formulação de vacina líquida. Alternativamente o vírus liofilizado pode ser reconstituído com água ou uma solução aquosa, em cujo caso a composição de vírus liofilizado

19 .. • • .• • . .. . . • • • . • • • • •• •• •• . • • • •• • • •• • • •• • . • •• • .• • • • ... • ••• • • • • • • •• • • •. • • • • . • • ... • • ... • • • • preferivelmente contém um componente antiácido.

Preferivelmente, a formulação de vacina compreende um componente vírus formulado com carbonato de cálcio e goma xantana em um compartimento ou vaso e este é reconstituído com água ou solução aquosa 5 presente no segundo compartimento ou vaso.

Em outra modalidade preferida, a composição de vacina é uma formulação sólida, preferivelmente um bolo liofilizado que é adequado para dissolução imediata quando posicionado dentro da boca. Formulações liofilizadas podem ser convenientemente proporcionadas na forma de tabletes 10 em uma embalagem farmacêutica de bolhas.

Em outro aspecto a invenção proporciona uma vacina de rotavírus na forma de um tablete de dissolução rápida para administração oral. Em outro aspecto a invenção proporciona uma composição compreendendo uma cepa de rotavírus atenuado vivo, em particular uma cepa 15 de rotavírus de humano, na qual a composição é um sólido liofilizado de

dissolução imediata quando posicionado dentro da boca.

Preferivelmente o tablete de dissolução rápida de acordo com a invenção se dissolve na boca do indivíduo suficientemente rapidamente para prevenir a ingestão de tablete não dissolvido. Esta abordagem é 20 particularmente vantajosa para vacinas de rotavírus pediátricas.

Preferivelmente o vírus é um rotavírus de humano atenuado vivo que está formulado com um antiácido inorgânico tal como carbonato de cálcio e um agente viscoso tal como goma xantana.

Um outro aspecto da presente invenção é proporcionar uma 25 formulação liofilizada na qual o componente vírus é qualquer cepa de

rotavírus que está formulada com carbonato de cálcio e goma xantana.

Vacinas da invenção podem ser formuladas e administradas por técnicas conhecidas, usando uma quantidade adequada de vírus vivo para proporcionar proteção efetiva contra infecção por rotavírus sem os efeitos

20 .. • • . .. • • • • • • • • • ••• ••• • • • .. • • • • • • • . . . • • • • • • ••• •• • • • • 10 . • • • • • • • • • • • • • • • • • ••• • • • .

colaterais adversos •significativos em vacinas típicas. Uma quantidade adequada de vírus vivo normalmente estará entre 104 e 107 unidades formadoras de foco (ffu) por dose. Uma dose de vacina típica pode compreender 105-106 ffu por dose e pode ser dada em várias doses em um • 5 período de tempo, por exemplo em duas doses dadas com um intervalo de dois meses. Benefícios podem contudo ser obtidos ao se ter mais de 2 doses, por exemplo um regime de 3 ou 4 doses, particularmente em países em desenvolvimento. 0 intervalo entre as doses pode ser maior ou menor do que dois meses. Uma quantidade ótima de vírus vivo para um dose única ou para 10 um regime de doses múltiplas, e tempo opcional para as doses, pode ser verificada por estudos padrão envolvendo a observação de títulos de anticorpo e de outras respostas em indivíduos.

A vacina da invenção também pode compreender outros vírus vivos adequados para proteção contra outras doenças, por exemplo poliovírus. 15 Alternativamente outras vacinas de vírus vivo adequadas para administração oral podem ser dadas em uma dose separada mas na mesma ocasião da composição de vacina de rotavírus de acordo com a invenção.

Soros de doze bebês de 4 a 6 meses de idade vacinados com material P43 como descrito no ensaio em Vaccine (1998) foram testados para 20 neutralização de P33, P38, P43 e 89-12C2.

A faixa de títulos de neutralização de todos os soros testados é semelhante para P33, P38 e P43. A análise estatística não mostra diferença nos títulos de neutralização total contra todos os três vírus. Isto sugere que os epitopos de neutralização conformacionais e não-conformacionais de P33, 25 P38 e P43 são igualmente bem reconhecidos pelos soros anti-P33 de bebês vacinados. Esta observação indiretamente sugere que os epitopos de neutralização revelados neste ensaio in vitro não foram alterados entre P33, P38 e P43.

21 • .. • • • •• • • ..• . . •••. •• . ••. • .. • . • . .. • • • • • •• •• •• • • •• • • •• • • • •• • •• • ••• •• • ••• • • • • • • • •• • •• • •• •• •• • • . • ••• ♦ • ••• • • • • significativamente de P33, P38 e P43. Esta observação sugere que os epitopos de neutralização conformacionais e não-conformacionais de P33, P38 e P43 não são igualmente bem reconhecidos pelos soros anti-P33 dos bebês vacinados contra P33. Esta observação indiretamente sugere que os epitopos • 5 de neutralização revelados neste ensaio in vitro foram alterados entre 89-12C2

e P33, P38 e P43.

Modalidades elevadamente preferidas da presente invenção incluem:

1. 0 uso de uma cepa de rotavírus atenuado de um sorotipo Gl na 10 manufatura de uma composição de vacina para a indução de urna resposta

imune contra um rotavírus que é não G1 ou G9.

2. 0 uso de acordo com 1 no qual uma resposta imune é adicionalmente induzida contra infecção por rotavírus por um sorotipo G9 e/ou sorotipo G1. 3. 0 uso de acordo com 1 ou 2 no qual a resposta imune é induzida contra 15 dois ou mais sorotipos de rotavírus, estes sorotipos não sendo G1 ou G9.

4. 0 uso de acordo como reivindicado em qualquer um de 1 a 3 no qual o sorotipo diferente de sorotipo G1 ou G9 é selecionado da lista consistindo de: G2, G3, G4, G5, G6, G7, G8, G10, G11, G12, G13 e G14.

5. 0 uso de acordo com qualquer um de 1 a 4 no qual urna resposta imune 20 é induzida contra todos os seguintes sorotipos não-G1: G2, G3, G4 e G9.

6. 0 uso de acordo com qualquer um de 1 a 5, no qual a composição de vacina de rotavírus G1 compreende uma única variante de rotavírus ou substancialmente uma única variante de rotavírus, a citada variante definida por uma seqüência de nucleotídeos codificadora de pelo menos uma das 25 proteínas virais maiores designadas como VP4 e VP7.

7. 0 uso de acordo com 6 no qual a composição compreende um rotavírus possuindo um gene VP4 compreendendo, em urna seqüência de nucleotídeos, pelo menos uma das seguintes: uma base adenina (A) na posição 788, uma base adenina (A) na posição 802 e urna base timina (T) na posição 501 a

22 .. • • ..• . . . ... ... • • • • • • •• • •• • • • • •• • •• • • • • • • • • •• • • •• • •• •• •• • • •• •••• •• •. • • • •• • • • • • • •• •• • •• . • ••• • • • ••• •• • •

partir do códon de iniciação.

8. 0 uso de acordo com 7, no qual o gene VP4 compreende uma seqüência de nucleotídeos compreendendo uma base adenina (A) nas posições 788 e 802 e uma base timina (T) na posição 501 a partir do códon de 5 iniciação.

9. 0 uso de acordo com 6 no qual a composição compreende um rotavírus possuindo um gene VP7 compreendendo, na seqüência de nucleotídeos, pelo menos uma das seguintes: uma timina (T) na posição 605, uma adenina (A) na posição 897 ou uma guanina (G) na posição 897 a partir do códon de 10 iniciação.

10. 0 uso de acordo com 7 no qual o gene VP7 compreende uma seqüência de nucleotídeos compreendendo uma timina (T) na posição 605 e uma adenina (A) ou uma guanina (G) na posição 897 a partir do códon de iniciação.

15 11. 0 uso de acordo com qualquer um de 1 a 10, no qual a composição compreende um rotavírus possuindo um gene VP4 compreendendo, na seqüência de nucleotídeos, uma base adenina (A) nas posições 788 e 802 e uma base timina (T) na posição 501 a partir do códon de iniciação; e no qual o gene VP7 compreende, na seqüência de nucleotídeos, uma timina (T) na 20 posição 605 e uma adenina (A) na posição 897 a partir do códon de iniciação.

12. 0 uso de acordo com qualquer um de 1 a 11 no qual a composição é capaz de proteger contra gastroenterite e/ou diarréia causada por infecção por um rotavírus de um tipo diferente do sorotipo G1 do rotavírus atenuado presente na composição.

25 13. 0 uso de acordo com 12 no qual a composição é até 83% protetora em uma população de indivíduos vacinados contra gastroenterite severa causada por infecção de rotavírus de pelo menos dois sorotipos, estes sorotipos sendo diferentes do sorotipo G1 do rotavírus atenuado presente na composição. 14. 0 uso de acordo com 13 no qual a gastroenterite severa é causada por

23 • • • • • • ••• ••• • • • • •• . . . • . . . . • . . . . • • . • • • • •• • •• •. • •

infecção de um rotavírus de pelo menos quatro sorotipos não-G1.

15. 0 uso de acordo com 14 no qual os sorotipos não-G1 são sorotipos G2, G3, G4, e G9.

16. 0 uso de acordo com qualquer um de 1 a 15 no qual a cepa de rotavírus 5 é o depósito 99081301 em ECACC, ou é obtenível ou derivável do depósito

99081301 em ECACC.

17. 0 uso de acordo com qualquer um de 1 a 16 no qual a vacina é utilizada em um regime de 2 doses.

Os seguintes exemplos não limitantes ilustram a invenção.

10 EXEMPLOS

Exemplo 1: Demonstração de que a cepa 89-12 na passagem 26 (P26) é uma mistura de variantes

Seqüenciamento de genes VP4 e VP7 de diferentes lotes de passagem

Foram realizados os seqüenciamentos dos genes VP4 e VP7 da 15 passagem P26 (células AGMK primárias), passagem P33 (linhagem de células AGMK estabelecidas (em oposição às primárias)), passagem P41 e passagem P43. A extração de RNA total foi reversamente transcrita e amplificada por meio de PCR em uma etapa/um tubo.

Iniciadores Rota 5bis e Rota 29bis amplificaram o gene VP4 20 inteiro e os iniciadores Rota 1 e Rota 2bis amplificaram o gene VP7 inteiro. 0 material de PCR tem sido seqüenciado usando iniciadores diferentes (veja a Tabela 1).

A seqüência de passagem P26 diferiu da seqüência de passagem P33 por 3 posições de base 501, 788 e 802 pb a partir do códon de 25 iniciação) em VP4 e por três bases em VP7 (108, 605 e 897 pb a partir do

códon de iniciação).

As varreduras de seqüência de passagem P26 de VP4 e VP7 mostram nas posições mutadas a presença da seqüência de passagem P33 como um fundo. Assim pode ser visto que a passagem P26 é uma mistura de

24 • . . . ... • . . . • . . . • . . . . •.. • . . . . . • • . • . •.• • ••• • • . . . •. . . •. . . ... . • •.. • • • .

pelo menos 2 variantes.

As varreduras de seqüência de passagem P33 parecem homogêneas em VP4 e heretogêneas para VP7 (veja a Tabela 2).

Passagem 38 (derivada da passagem 33) foi passada 5 vezes 5 em células Vero e mostrou o mesmo conjunto de seqüências de VP4 e VP7 que o da passagem P33 (linhagem de célula AGMK). Assim não houve mudança maior nas populações entre P33 e P38.

Tabela 1: Oligonucleotídeos usados para a RT-PCR e o seqüenciamento

nome seqüência VP7 Rota 1 Rota 1 bis Rota 2bis Rota 7 Rota 12 Rota 46 Rata 18

GGC TTT AAA AGA GAG AAT TTC CGT CTG :G GGT TAG CTC CTT TTA ATG TAT GGT A GGT CAC ATC GAA CM TTC TAA, TCT MG CAA GTA CTC AAA TCA ATG ATG G

TGT TGA TTT TTC TGT CGA TCC AC

GGT TGC TGA GAA TGA GAA ATT AGC TAT AGT GO

CCA CTA,TAG CTA ATT TCT CAT TCT CAG CAA CC posição -49 ta 22 16to10 1014-988 266-.287 372-394 651-682 682-651 VP4 Rota 5 Rota 6 Rota 5bis Rota 6bis Rata 25 Rota 26 • Rata 27bis Rota 28 Rota 31 Rota 32 Rota 45 Rota 53 Rota 54 Rota 55 Rota 40 Rota 39 Rota 33 Rota 34 Rota 29bis TGG CTTCdC CAT TTT ATA GXC ATT TCG GAC CAT TTA TAA CC TGG CTT CAC TCA TTT ATA GAC A ATT TCA GAC CAT TTA TAA CCT AG

CGA GTA GTA TAT GAA AGT ACA AAT MT AG

CTA TTA TTT GTA CTT TCA TAT ACT ACT CC ..

TCG ATA CAG TAT AAG AGA GCA CAA •G TTC ATT AAC TTG TGC TCT CTT ATA CTG GTA TAT GTA GAC TAT TGG GAT G

CAT CCC AAT AGT CTA CAT ATA C TGT AAC TCC GGC AAA ATG CAA CG CGT TGC ATT TTG CCG GAG TTA CA GTA AGA CAA GAT TTA GAG CGC CA TGG CGC TCT AAA TCT TGT CU AC CTT GAT GCT GAT GAA GCA GCA TCT G CAG ATG CTG GTT CAT CAG CAT CAA G CGA TCA TAT CGA ATA TTA MG GAT G CAT CCT TTA ATA TTC GAT ATG ATC G AGC GTT CAC ACA ATT TAC ATT GTA G

2-23 878-859 2-23 878.856 268-296 296-268 721-745 753-727 1048-1070 1070-1048 1205-1227 1227-1205 1465-1487 1487-1465 1703-1727 1727-1703 2008-2032 2032-2008 2335-2311

25 •. ..• • • 1 • • ••• ••• 1 • • • • • •• • • • • J • • • • • • • • • • • • • • •• • • • ••• • ••• • • • • • • • • • • • • • • • • • •.• • • ••• • • • •

Tabela 2: Oligonucleotídeos usados em hibndização

nome seqüência posição

VP7 Rota 41 AGT ATT TTA TAC TAT AGT AGA TTA TAT 882-913 TAA TC

Rota 42 AGT ATT TTA TAC TAT GGT AGA TTA TAT 882-913 TAA TC

VP4 Rota 15 ATC CCC ATT ATA CTG CAT TCC TTT C 807-783 Rota 16 ATC CCT ATT ATA CTG CAT TTC 'M C 807-783 Rota 35 ATC CCC ATT ATA CTG CAT TTC TTT C 807-783 Rota 36 ATC

CCT

As bases mostradas em negrito na Tabela 2 são os sítios de variação de seqüência específica em VP4 e VP7.

Tabela 3: Variação de seqüência de genes VP4 e VP7

VP4 VP7 501 bp 167aa -" •788 bp 263aa 802 bp.. 268aa ! 108 bp 36aa 605 bp 202aa 897 bp 299 a P26 (AGMK) A GIA G A. C/T A P33 AGMK), T A A G IA TIC AIG P38 (VERO) T A A A/G T GIA P43 (VERO) T A A A T A

5 N.B. Em um segundo clone dos 3 clones que foram desenvolvidos até o nível de produção de lote, o nucleotídeo de posição de 897 pb de VP7 é G, em vez de A como no clone selecionado de P43. Isto resulta em uma metionina no lugar de uma isoleucina na seqüência de aminoácidos. Variantes correspondendo a ambos o clone P43 selecionado e o 10 clone no qual há uma G em VP7 em 897 pb a partir do códon de iniciação, foram excretados nas fezes de bebês que haviam sido vacinados com o material P33.

Na Tabela 3.1, na qual há duas bases alternativas em uma posição bases alternativas em uma posição específica, a primeira das duas 15 representa a base que aparece em uma população maior e a segunda é a base que aparece em uma população menor. Populações variantes menores e maiores são julgadas pela força do sinal no seqüenciamento.

26 3.2 •• ••• • • • • • ••• 1•a • V • • • • •• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •• • • • ••• • ••• • • • • • • • • • • • • • • 1 • • ••• 4 • ••• • • • • VP4 VP7 501 bp 167aa 788 bp 263aa 802 bp 268aa 108 bp 36aa 605 bp 202aa 897 bp 299aa P26 (AGMK)

Leu GIy/GIu GlyIArg Arg Thr/Met lie P33

(AGMK)

Phe Giu Arg Arg/Arg Met/ Thr Ile/Met P38

(VERO)

Phe GIu Arg Arg/Arg Met Met/lle P43

(VERO)

Phe Giu Arg Arg Met ile

Tabela 3.2 mostra as mudanças de aminoácido resultantes das diferenças de nucleotídeos entre as variantes.

Tabela 4

VP4 (posições 788-802) VP7 (posição 897)

G-G A-A A-G G-A A . G

Sondas _{Rota 15} Rota 16 Rota 35 Rota 36 Rota 41 Rota 42 Passagens

' P26 - + + + _{' nd nd}

p33 - + - ++ +

P38 - + - + ++

P43 - + - * -

5 Hibridização em slot blot

A mudança em populações entre as passagens P26 e P33 em células AGMK tem sido adicionalmente confirmada por hibridização em slot blot. Os fragmentos de genes VP4 e VP7 gerados pela RT/PCR foram hibridizados com sondas de oligonucleotídeo específicas para cada variante 10 (veja as Tabelas 3.1 e 3.2). Em contraste a P26 que hibridizou com Rota 16, Rota 35 e Rota 36 e não com Rota 15, o fragmento de PCR de VP4 do material P33, nas posições 788 e 802 hibridizou apenas com Rota 16 e não com qualquer um de Rota 15 ou Rota 35 ou Rota 36. Estes resultados estabeleceram a presença de pelo menos 3 variantes em P26 (veja a Tabela 4). 15 Para os fragmentos de PCR de VP7 do material P33, a posição 897 hibridizou com Rota 41 e Rota 42. Estes resultados estabeleceram a presença de pelo menos duas variantes no material P33.

Exemplo 2: Isolamento e caracterização do clone P43

27 • •• • ••() • • • • • • CO • • • • • • ••• • 011 • • r • A • • • • • • • • • • V,• • • • ••• • ••• • Q • • • • • • • • • • • • ••• • ••• • • ••• • •

vírus homogênea, três diluições de ponto final de P33/AGMK em células Vero foram realizadas e o vírus resultante foi usado para infectar células Vero.

Cavidades positivas foram selecionadas usando dois critérios: 5 crescimento demonstrado pelo número mais alto de focos detectados nas cavidades e as cavidades isoladas mais positivas nas placas, como é classicamente realizado. Após 3 passagens de diluição final em placas de microtítulo de 96 cavidades, 10 cavidades possíveis foram amplificadas sucessivamente em células Vero e avaliadas para seu rendimento.

10 Baseando-se no rendimento, três clones foram desenvolvidos para o nível de passagem de lote de produção. Imunorreconhecimento por anticorpos policlonais foi mostrado semelhante em ambos entre os três clones e entre os clones e P33. Homogeneidade dos clones foi avaliada por hibridização em slot blot. A seleção final de um único clone foi baseada na 15 seqüência e no rendimento.

O clone selecionado foi amplificado por passagens sucessivas em células Vero para gerar uma semente Padrão, uma semente de Trabalho e finalmente lotes de produção.

O clone selecionado foi geneticamente caracterizado em níveis 20 de passagem diferentes por seqüenciamento de VP4 e VP7 (identidade) e por hibridização específica em slot blot de VP4 e VP7 (homogeneidade) dos materiais amplificados por PCR. A seqüência dos genes VP4 e VP7 do material P43 são dadas nas Figuras 1 e 2 respectivamente e são idênticas a de P41.

25 Homogeneidade do clone selecionado foi avaliada por uma hibridização seletiva usando sondas de oligonucleotídeo discriminantes de mudanças de nucleotídeo em regiões de VP4 e/ou VP7 para cada variante identificada durante o seqüenciamento de P26/AGMK primária (veja a Tabela 4).

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0 fragmento de VP4 hibridizou com Rota 16 e não com Rota 15, Rota 35 ou Rota 36. 0 fragmento de VP7 hibridizou com Rota 41 e não com Rota 42.

Estes resultados confirmaram que P43 é uma população 5 homogênea.

Exemplo 3: Remoção de vírus imprevisto potencial

Os lotes de produção descritos acima são formulados para administração oral a bebês pelo seguinte método.

1. Vírus liofilizado

10 Técnicas padrão são usadas para preparar doses de vírus. Massa viral purificada congelada é descongelada e diluída com composição de meio apropriada, neste caso meio de Eagle modificado por Dulbecco, até uma concentração viral padrão desejada, neste caso de 106,2 ffu/mL. 0 vírus diluído é então diluído com estabilizador de liofilização (sacarose 4%, 15 dextrano 8%, sorbitol 6%, aminoácido 4%) até o título viral alvo, neste caso 105,6 ffu/dose. Alíquotas de 0,5 mL de composição viral estabilizada são assepticamente transferidas para frascos de 3 mL. Cada frasco é então parcialmente fechado com uma tampa de borracha, a amostra é seca por congelamento sob um vácuo, o frasco é então totalmente fechado e uma 20 tampa de alumínio é prensada no lugar ao redor da boca do frasco para manter

a tampa no lugar.

Para uso, o vírus é reconstituído usando um dos seguintes reconstituintes antiácidos:

(a) Reconstituinte de citrato

25 Citrato de sódio é dissolvido em água, esterilizado por filtração e assepticamente transferido para dentro de recipientes reconstituintes em quantidades de 1,5 mL em uma concentração de 544 mg de CitratoNa3.2H2O por dose de 1,5 mL. Os recipientes reconstituintes podem ser por exemplo frascos de 3 mL, ou frascos de 4 mL, ou seringas de 2 mL, ou

29 .. ... . . . ... ... • • • • • • • •• •. • . • • • • • • • •.. •• • • • • • • • ••• • • • • • • cápsulas compressíveis de plástico mole para administração oral. Como uma alternativa à manutenção dos componentes estéreis sob condições estéreis, o recipiente final pode ser autoclavado.

(b) Reconstituinte de Al(OH)3

5 Uma suspensão de hidróxido de alumínio asséptica (Mylanta - marca comercial) é assepticamente diluída em água estéril, assepticamente transferida para recipientes reconstituintes (por exemplo seringas de 2 mL, ou cápsulas compressíveis de plástico mole) em quantidades de 2 mL contendo cada 48 mg de Al(OH)3. Uma alternativa ao uso de componentes estéreis sob 10 condições estéreis é a irradiação y da suspensão de hidróxido de alumínio

(preferivelmente em um estágio diluído).

Ingredientes padrão são incluídos para evitar a sedimentação da suspensão. Tais ingredientes padrão incluem por exemplo estearato de magnésio, carbóxi-metil-celulose, hidróxi-propil-metil-celulose, celulose 15 microcristalina, e polímeros de silicone. Agentes bacteriostáticos por exemplo butil-parabeno, propil-parabeno ou outros agentes bacteriostáticos padrão usados em alimento, e aromatizantes, também podem estar incluídos.

2. Vírus liofilizado com Al(OH)3 em formulação líquida

Técnicas padrão são usadas para preparar doses de vírus. 20 Massa viral purificada congelada é descongelada e diluída com composição de meio apropriada, neste caso meio de Eagle modificado por Dulbecco, até uma concentração viral padrão desejada, neste caso de 106,2 ffu/mL. A suspensão de hidróxido de alumínio é adicionada para alcançar uma quantidade final de 48 mg/dose e a composição de vírus é diluída com 25 estabilizador de liofilização (sacarose 4%, dextrano 8%, sorbitol 6%, aminoácido 4%) até o título viral alvo, neste caso 105,6 ffu/dose. Alíquotas de 0,5 mL de composição viral estabilizada são assepticamente transferidas para frascos de 3 mL. Liofilização e fechamento dos frascos são então realizados como descritos na parte 1.

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3. Vírus liofilizado com Al(OH)3 para apresentação em bolhas

Técnicas padrão são usadas para preparar doses de vírus. Massa viral purificada congelada é descongelada e diluída com composição de meio apropriada, neste caso meio de Eagle modificado por Dulbecco, até 5 uma concentração viral padrão desejada, neste caso de 106,2 ffu/mL. A suspensão de hidróxido de alumínio é adicionada para alcançar uma quantidade final de 48 mg/dose e a composição de vírus é diluída com estabilizador de liofilização que pode ser sacarose, dextrano ou aminoácido 4%, ou gelatina, ou peptona vegetal, ou xantana até o título viral alvo, neste 10 caso 105,6 ffu/dose. Uma operação de enchimento asséptico é empregada para transferir doses de 0,5 mL ou preferivelmente menores para cavidades de bolhas. A composição é liofilizada, e as cavidades de bolhas são vedadas por vedação térmica.

Ingredientes padrão opcionais são incluídos para evitar a 15 sedimentação da suspensão de hidróxido de alumínio. Tais ingredientes padrão incluem por exemplo estearato de magnésio, carbóxi-metil-celulose, hidróxi-propil-metil-celulose, celulose microcristalina, e polímeros de silicone. Agentes aromatizantes, também podem estar incluídos.

Exemplo 5: Titulação viral de Rotavírus e formulações baseadas em 20 sacarose

5.1 Comparação entre formulações baseadas em lactose e em sacarose: Tabela 5

Batelada No.

Composição da formulação

Título viral antes da liofilização

Título virai após a liofilização e 1 semana a 37oC 98G06/01 Lactose: 2% Dextrano: 4% Sorbitol: 3% Aminoácidos: 2% 105,22 104,67 98G06/03 Lactose: 2% Dextrano: 4% Sorbitol: 3% Aminoácidos: 2% 105,28 104,92

Rotavírus P43 foi formulado quer com sacarose quer com lactose como mostrado na tabela acima. Titulação viral antes da liofilização é