Revista Eletrônica de Farmácia Eletronic Journal of Pharmacy
ISSN 1808-0804 doi 10.5216/ref.v16.47461
Artigo Original
Preparação e caracterização físico-química do extrato
hidroalcoó-lico de Genipa americana Linnaeus
Preparation and physical-chemical characterization of the
hy-droalcoholic extract of Genipa americana Linnaeus
Preparación
y
caracterización
físico-química
del
extrato
hidroalcohólico de Genipa americana Linnaeus
SILVA, Dayane Alves da1. COSTA, Rayssa Gomes1. BORGES, Leonardo Luiz1,2. ALVES, Suzana Ferreira1∗ 1Escola de Ciências Médicas, Farmacêuticas e Biomédicas, Pontifícia Universidade Católica de Goiás - PUC Goiás .2Unidade
Universitária de Ciências Exatas e Tecnológicas, Universidade Estadual de Goiás - UnUCET/UEG
∗suzanafal@gmail.com
Resumo. Introdução: O jenipapo, Genipa americana Linnaeus, possui importantes ações farmacológicas como a advinda dos
fitoesteróois presentes na fruta, cuja capacidade é abrandar os níveis de colesterol, bem como o iridoide genipina, o qual possui ação antioxidante, anti-inflamatória e antiangiogênica. Objetivo: O objetivo da pesquisa foi obter o extrato hidroalcoólico do jenipapo e posterior caracterização físico-química, de forma a contribuir com a identificação da fruta proveniente do cerrado brasileiro. Metodologia: A metodologia abrangeu a obtenção do extrato hidroalcoólico por percolação e concentração deste em rotaevaporador, seguida das determinações de pH, teor de sólidos, densidade, Cromatografia em Camada Delgada (CCD), prospecção fitoquímica e doseamento de fenóis. Resultados: Os resultados foram pH de 4,0, teor de sólidos de 0,48g/100 g, densidade do extrato de 0,9835 g/mL, e fenóis totais de 5,33%. O perfil cromatográfico por CDD indicou a presença de flavonoides e iridoides. A prospecção fitoquímica apontou a presença de alcaloides, taninos, flavonoides e triterpenoides, saponinas e cumarinas, sendo todos estes metabólitos já descritos na literatura para a espécie estudada. Conclusão: Conclui-se que a extração por percolação foi um método eficiente, logo, os resultados encontrados permitiram caracterizar o extrato hidroalcoólico obtido a partir das frutas de Genipa americana L.
Palavras-chave: Genipa americana. Cerrado. Extrato hidroalcoólico. Análise físico-química.
Abstract. Introduction: Jenipapo, Genipa americana Linnaeus, has important pharmacological actions due its
phytoste-rols, whose capacity is to lower cholesterol levels, as well as the iridipid genipine, which has antioxidant, anti-inflammatory and antiangiogenic action. Objective: The aim was to obtain the hydroalcoholic extract of the genipap and subsequent physical-chemical characterization, in order to contribute to the identification of the fruit coming from the Brazilian cerrado. Methodology: The methodology involved obtaining the hydroalcoholic extract by percolation and its concentration in a rotavaporator, followed by determinations of pH, solids content, density, thin layer chromatography (CCD), phytochemical prospecting and phenol assay. Results: The results were pH of 4.0, solids content of 0.48g/100 g, extract density of 0.9835 g/mL, and total phenols of 5.33%. The chromatographic profile by CDD indicated the presence of flavonoids and iridoids. Phytochemical prospecting indicated the presence of alkaloids, tannins, flavonoids and triterpenoids, saponins and coumarins, all these metabolites already described in the literature for the species studied. Conclusion: The extraction by percolation was an efficient method, so the results found allowed to characterize the hydroalcoholic extract obtained from the fruits of Genipa americana L.
Key-words: Genipa americana. Cerrado. Hydroalcoholic extract. hysicochemical analysis.
Resumen. Introducción: El jenipapo, Genipa americana Linnaeus, posee importantes acciones farmacológicas como la
llegada de los fitoesterois presentes en la fruta, cuya capacidad es disminuir los niveles de colesterol, así como el iridoide genipino, el cual posee acción antioxidante, anti-inflamatoria y antiangiogénica. Objetivo: El objetivo de la investigación fue obtener el extracto hidroalcoólico del jenipapo y posterior caracterización físico-química, de forma de contribuir con la identificación de la fruta proveniente del cerrado brasileño. Metodología: La metodología abarcó la obtención del extracto hidroalcohólico por percolación y concentración de éste en rotaevaporador, seguida de las determinaciones de pH, contenido de sólidos, densidad, Cromatografía en Capa Delgada (CCD), prospección fitoquímica y determinación de fenoles. Resultados: Los resultados obtenidos fueron pH de 4,0, contenido de sólidos de 0,48g/100 g, densidad del extracto de 0,9835 g/mL, y fenoles totales del 5,33%. El perfil cromatográfico por CCD indicó la presencia de flavonoides e iridoides. La prospección fitoquímica verificó la presencia de alcaloides, taninos, flavonoides y triterpenoides, saponinas y cumarinas, siendo todos estos metabolitos ya descritos en la literatura para la especie estudiada. Conclusión: Se concluye que la extracción por percolación fue un método eficiente, luego, los resultados encontrados permitieron caracterizar el extracto hidroalcohólico obtenido a partir de las frutas de Genipa americana L.
1 Introdução
Os vegetais são utilizados desde os primórdios da exis-tência humana para a manutenção da saúde e no tratamento de enfermidades, devido à extensa gama de seus princípios ativos existentes nas mais diversificadas vegetações.(1) Há uma valorização por parte da população mundial em relação ao tratamento com os vegetais, onde o Brasil ganha desta-que neste desta-quesito, visto desta-que a prática de automedicar-se com fitoterápicos e remédios à base de chás, por exemplo, é de-masiado elevada.(2) Essa prática é um tanto quanto perigosa à saúde se não houver uma orientação correta, levando-se em consideração que não existem apenas substâncias be-néficas ao organismo disponíveis nas plantas, mas também substâncias igualmente nocivas.(3)
Os metabólitos secundários são micromoléculas origi-nárias de sínteses que ocorrem nas plantas. Estas estruturas são de grande valor na indústria farmacêutica, alimentícia e agroquímica, bem como servem como modelo para a elabo-ração de substâncias sintéticas. Quantidades significativas de metabólitos advindos de plantas encontram-se descri-tos na literatura, todavia, ainda há muito para pesquisar no imenso reino vegetal.(4) Para tanto, a farmacognosia, uma ciência multidisciplinar, faz-se presente e de extrema rele-vância na busca de novos ativos ou adjuvantes, para que possam ser empregados na indústria farmacêutica a fim de aprimorar os tratamentos contra diversas enfermidades.(5) Neste contexto, a fruta da Genipa americana Linna-eus, pertencente à família Rubiaceae, mais conhecida popularmente como "jenipapo", possui importantes poten-ciais terapêuticos, como àquele proveniente da descoberta dos fitoesteróis, tais como campesterol, estigmasterol e -sitosterol, cujo potencial é abrandar os níveis de coles-terol no soro em relação a lipoproteínas de baixa densi-dade.(6,7,8)
O iridoide genipina, por sua vez, também presente na fruta, possui diversas propriedades farmacológicas como antioxidante, anti-inflamatória e antiangiogênica.(9,10,11) Em espécimes estudadas em outros países, foram isoladas substâncias pertencentes à mesma classe da genipina, cu-jas propriedades vão desde a inibição do crescimento in vitro de bactérias, a atividade antitumoral em testes in vi-tro.(12,13,14,15)
Não somente a polpa do jenipapo, mas igualmente outras estruturas do vegetal podem apresentar diferentes aplica-ções, como a casca do jenipapeiro, a qual possui taninos, que são metabólitos definidos como polifenólicos solú-veis em água e que precipitam proteínas.(15,16) Eles são utilizados no tratamento do couro, na produção de chás ins-tantâneos e na estabilização da cor dos vinhos.(15,17)
Os extratos vegetais, amplamente utilizados na indús-tria farmacêutica(18), são preparações líquidas obtidas por meio da extração com solvente apropriado ou por dissolu-ção de material vegetal e animal, sendo extraídas de várias
formas, tais como: maceração, infusão, decocção, destila-ção e percoladestila-ção, sendo esta última considerada o método em que se extrai uma quantidade maior de ativos.(19) Na literatura consta aplicações de extratos vegetais, como na absorção da radiação UVA/UVB em protetores solares, na substituição de agrotóxicos no combate a infecções fitopa-tológicas por fungos e como antimicrobiano no tratamento de certas micobactérias e bactérias.(20,21)
As frutas do jenipapo, que são comestíveis, são comer-cializadas em sua maior parte para consumo in natura, e também processadas nas formas de polpa, cristalizadas, li-cor ou vinho a partir da fermentação do suco, entre outros, em mercado local ou fabricados de maneira artesanal. A espécie pode ser utilizada na arborização urbana e, ainda, é um excelente negócio para os agricultores por meio da extração da madeira, muito útil e resistente na construção de móveis. A árvore do jenipapeiro ainda fornece uma ali-mentação rica em nutrientes para a fauna de áreas onde se deseja manter uma preservação ambiental.(22,23,24,25,26) Portanto, assim como em outros vegetais, a composição química e física das frutas do jenipapo variam muito, a de-pender das diferenças de altitude, época de frutificação e condições climatológicas, abrindo caminhos e perspectivas para novas pesquisas e descobertas.(25) Sua importância na farmacognosia é pouco estudada, o que abre preceden-tes às novas aplicações. Com isso, a obtenção do extrato hidroalcoólico da fruta do jenipapeiro e sua caracterização mostram-se de grande importância, já que este poderá servir como pilar para novos estudos, objetivando a utilização dos metabólitos ativos empregados em terapias farmacológicas diversas.
Dessa forma, o objetivo do presente estudo foi obter o ex-trato hidroalcoólico das frutas do jenipapo (G. americana) e determinar suas propriedades físico-químicas.
2 Metodologia
As frutas maduras foram coletadas de um espécime de G. americana na zona rural da cidade de Guapó, no mês de junho de 2016. Em seguida, as frutas foram higienizadas, tiveram suas cascas removidas e suas polpas congeladas. Com o auxílio de um liquidificador as polpas foram tri-turadas para posterior preparo do extrato hidroalcoólico e caracterização do mesmo.
2.1 Preparo do extrato hidroalcoólico concentrado A polpa foi submetida ao processo de extração por per-colação para obtenção do extrato hidroalcoólico, no qual foi utilizado cerca de 2 kg de polpa das frutas e 20 L de álcool 70% – solução extratora proposta por Alves(27), adaptada para esta pesquisa.
A partir da obtenção do extrato hidroalcoólico do jeni-papo, este foi posteriormente concentrado em evaporador rotativo, de modelo TE-211, acoplado à bomba de vácuo, de modelo TE-0581, da marca TECNAL, sob pressão baixa
e temperatura de 60ºC.
2.2 Caracterização do extrato hidroalcoólico concen-trado
2.2.1 pH
Determinou-se o pH em triplicada com fita indicadora de pH 0-14 Merck KGaA.
2.2.2 Teor de sólidos
Estipulou-se o teor de sólidos em triplicata com aproxi-madamente 1 g do extrato em balança de infravermelho de análise de umidade de marca GEHAKA, modelo IV3100.
2.2.3 Densidade
A densidade foi determinada em triplicata a partir da pe-sagem de picnômetro vazio com água e, em seguida, com amostra em balança semi-analítica da marca GEHAKA, modelo BK 400. A partir dos valores obtidos, calculou-se a densidade da amostra a partir da fórmula:
2.2.4 Cromatografia em Camada Delgada
A identificação dos componentes presentes no extrato hidroalcoólico do jenipapo foi realizada a partir de Croma-tografia em Camada Delgada (CCD), em duas fases móveis, proposta por Alves(27), adaptadas para esta análise, sendo os reagentes da fase 1 - acetato de etila : ácido acético : água : metanol (10:1,6:1,5:0,6 v/v), e fase 2 – hexano : acetato de etila : ácido fórmico (7:3:0,5 v/v), com os res-pectivos reveladores vanilina sulfúrica e reagente natural A 1% (N-difenilborato) + UV 365nm. Foi utilizado placas de CCD em alumínio e sílica gel 60 F254, 5x10cm, da marca MACHEEY-NAGEL GmgH Co, KG.
2.2.5 Triagem fitoquímica
Procedeu-se os testes fitoquímicos para possível de-tecção de alcaloides, taninos, flavonoides, esteroides e triterpenoides, saponinas, antraquinonas e cumarinas por meio da metodologia proposta por Costa(28), com adapta-ção por Paula e Bara.(29)
2.2.5.1 Detecção de alcaloides
Para o teste qualitativo de alcaloides, 2 mL do extrato fo-ram distribuídas em 3 tubos de ensaio, seguida pela adição de 4 gotas do reagente de Mayer no primeiro tubo, 4 gotas do reagente de Dragendorff no segundo e 4 gotas do reagente de Bertrand no terceiro tubo. Foi observado se haveria a formação de precipitado, o qual indica reação positiva para alcaloides.
2.2.5.2 Detecção de taninos
Para a detecção de taninos, 3 mL do extrato hidroalcoó-lico foram distribuídos em 3 tubos de ensaio, seguido pela adição de 5 gotas de FeCl SR 2% no primeiro tubo, 5 gotas de acetato de cobre no segundo tubo, 5 gotas de solução de gelatina a 2,5% em solução de NaCl a 5%. Foi observado se haveria a formação de precipitado, que indica reação po-sitiva para taninos.
2.2.5.3 Detecção de flavonoides
Realizou-se o teste para flavonoides, no qual 3 mL do extrato hidroalcoólico foram distribuídos em 2 tubos de en-saio e uma cápsula de porcelana, seguido pela adição de 1 cm de fita de Mg metálico + 5 gotas de HCl concentrado ao tubo 1 e 1 mL de NaOH 20% ao tubo 2. O conteúdo da cápsula de porcelana foi evaporado até se obter um resíduo semi-seco, posteriormente, foi adicionado 3 mL de solução de ácido bórico + 1 mL de solução de ácido oxálico, mistura essa levada à evaporação até secura. Por fim, foi adicionado 7 mL de éter etílico e levado a observação sob luz ultravi-oleta. Foi observado se haveria a formação de coloração vermelha no primeiro tubo, vermelha a amarela no segundo tubo e fluorescência verde/amarelado na cápsula de porce-lana, que indicam reações positivas para flavonoides.
2.2.5.4 Detecção de esteroides e triterpenoides
Foram adicionados 10 mL de clorofórmio a 2 mL do ex-trato hidroalcoólico e retirados 3 mL da fase clorofórmica e acrescentou-se 1 mL do reagente de Libermann Burchard. Posteriormente, foi observada se haveria desenvolvimento de cores. A coloração azul evanescente seguida de verde, indica a presença de esteroides e a coloração parda à ver-melha indica a presença de triterpenoides.
2.2.5.5 Detecção de saponinas
Para o teste de saponinas foram adicionados 5 mL do extrato hidroalcoólico a um tubo de ensaio, agitando-se vi-gorosamente por 20 segundos. Foi observado se haveria a formação de espuma, que se preservada por 15 minutos, indica reação positiva para saponinas.
2.2.5.6 Detecção de antraquinonas
Para a detecção de antraquinonas utilizou-se 10 mL de éter que foram adicionados a 2 mL do extrato hidroalcoó-lico, sendo esta mistura homogeneizada, e a 5 mL da fase etérea adicionou-se 3 mL de amônia SR (1:1). Foi obser-vado se haveria a formação de coloração vermelha, a qual indica reação positiva para antraquinonas.
2.2.5.7 Detecção de cumarinas
Para o teste qualitativo de cumarinas, 10 mL de éter e 2 mL do extrato hidroalcoólico foram transferidos para um funil de separação, seguido pela transferência da fração etí-lica para uma cápsula de porcelana e acrescentado 1 gota de NaOH 1N, posteriormente observado na luz UV. Foi ob-servado se haveria a formação de fluorescência verde, que indica reação positiva para cumarinas.
2.2.5.8 Detecção de resinas
Na detecção de resinas utilizou-se 2 mL do extrato hi-droalcoólico e 10 mL de água foram adicionadas a um tubo de ensaio e, após, homogeneizado. Foi observado se have-ria a formação de turvação, indicando reação positiva para resinas.
2.2.6 Doseamento de fenóis
O doseamento de fenóis foi realizado a partir do mé-todo de Hagerman e Butler, adaptada por Mole e Water-man(30,31), o qual se baseia na complexação de compostos fenólicos com solução de FeCl3, com a absorbância medida em espectrofotômetro da marca TECNAL no comprimento de onda de 510 nm.
A curva padrão foi preparada com solução de 1 mg/mL de ácido tânico a partir da adição de 100 mg deste a 40 mL de metanol a 50%, completando com água destilada até 100 mL. Desta solução, foram retiradas em triplicata alíquotas de 75 µL, 100 µL, 150 µL, 200 µL e 250 µL e transferidas para tubos de ensaio. Aos tubos foram adicio-nados 2 mL de solução de LSS/Trietanolamina e 1 mL de FeCl3, completando o volume final para 5 mL com água destilada, deixando esta mistura em repouso por 15 minu-tos. Prosseguiu-se para a leitura da absorbância em 510 nm, de modo que, a partir desta, construiu-se a curva padrão.
Para o doseamento de fenóis no extrato, foi adici-onado aos tubos de ensaio com 2 mL de solução de LSS/Trietanolamina, 1 mL de solução de FeCl3 e 2 mL da amostra, em triplicata, prosseguindo da mesma forma que a leitura da curva padrão.
3 Resultados e discussão
O pH encontrado a partir da fita indicadora em tempe-ratura ambiente foi de 4,0, estando em concordância com o valor encontrado por Figueiredo e colaboradores, o qual de-terminou o pH em potenciômetro Procyon, modelo pH N-4, aferido para uma temperatura ambiente de 28°C e calibrado com solução-tampão de pH 4. A densidade, considerando as triplicatas, foi de 0,9835 g/mL, valor também próximo ao encontrado por Figueiredo, sendo de 0,974 g/mL, o qual do mesmo modo utilizou a razão entre peso e volume.(22) O teor de sólidos obtido para 1 g de polpa foi de 48%. Comparando-se os resultados encontrados com a literatura, pode-se ressaltar o padrão de qualidade para a espécie em estudo, ou seja, há uma reprodutividade destes testes físico-químicos, indicando que a G. americana pode ser estudada com êxito na indústria farmacêutica.
A partir da realização da CCD com a fase 1, foi observada a formação de bandas nas colorações mar-rom (Rf=0,10), cinza (Rf=0,32), castanho (Rf=0,43), rosa (Rf=0,55), violeta (Rf=0,71), verde (Rf=0,85) e acinzen-tada (Rf=0,92)(Figura 1). De acordo com Wagner e Blandt, a formação da coloração marrom pode indicar a presença de flavonoides ou iridoides, enquanto que as colorações
acinzentada e violeta podem indicar a presença de iridoi-des. Já na CCD com a fase 2, foi observado a formação de duas bandas de coloração amarela e verde, Rf=0,26 e 0,47, respectivamente (Figura 2). Ainda de acordo com es-tes autores, a formação destas colorações pode indicar a presença de flavonoides, que formam um complexo com o revelador Natural A, emitindo essas colorações quando observados sob luz UV(32). Os iridoides são compostos que caracterizam quimicamente a espécie G. americana, sendo a genipina o primeiro desta classe isolado no Bra-sil. A genipina possui ações farmacológicas de alto valor: antioxidante, anti-inflamatória e antiangiogênica, como mencionado anteriormente. Além disso, este iridoide é de importante relevância econômica devido seu poder tintorial muito explorado no segmento industrial. O corante obtido a partir da genipina possui coloração azulada, devendo ser extraído da fruta em sua fase imatura(9,15).
Pode-se observar na Figura 1 a formação de bandas nas cores marrom, castanho, rosa, violeta e cinza, indicando a presença de flavonoides.
A Figura 2 apresenta a formação de bandas de coloração amarela e verde, indicando a presença de flavonoides.
Com o teste de Dragendorff, verificou-se a presença de alcaloides através da formação de precipitado, sendo sua presença indicada por Bessa e colaboradores em triagem fitoquímica com e extrato etanólico de G. americana.(33) Yang e colaboradores isolaram em 1999 o alcaloide cripto-lepina em pesquisa realizada com G. americana(27,34). Os alcalóides possuem ação farmacológica conhecida, consti-tuindo princípio ativo de anestésicos(33).
A partir dos reagentes para taninos, FeCl3 SR 2% e acetato de cobre SR 10%, verificou-se a formação de tur-vação e precipitação, respectivamente, indicando presença de taninos. Estes utilizados em certas enfermidades como no tratamento de inflamações e em diversas atividades industriais, tais como no tratamento do couro, havendo relatos da utilização da casca do jenipapeiro para esta fi-nalidade(15,33,35).
A formação de coloração avermelhada e fluorescên-cia verde nos testes para flavonoides, a partir de reação com NaOH 20% e oxalo-bórica, respectivamente, indica-ram a presença de flavonoides, bem como demonstrado na CCD. Os flavonoides possuem atividades farmacoló-gicas, tais como antioxidante, antiproliferativa e anti-inflamatória.(33,36) Omena e colaboradores(37), isoloram um flavonoide denominado quercetina da polpa, pericarpo e sementes de G. americana, que evidenciou, em outros estudos, atividade anti-inflamatória(27,38).
A formação de coloração vermelha na reação de Li-ebermann Burchard indica a presença de triterpenoi-des, que em linhas gerais, possuem atividade anti-inflamatória(15,39,40,41). Estes estão descritos na lite-ratura como um dos metabólitos encontrados entre as sub-famílias da família Rubiaceae, na qual o jenipapo está
inserida(15,42).
Apesar de alguns estudos indicarem a presença de es-teróis como os já citados campesterol, estigmasterol e -sitosterol, o resultado obtido difere da literatura, podendo ser justificado pelo método utilizado da triagem fitoquímica, que é, por sua vez, um teste qualitativo, logo, não sendo decisivo para a determinação de sua presença, ou, ainda, devido o fator da sazonalidade (6,7,8).
O teste de saponinas foi positivo com a formação de es-puma no extrato, a qual manteve-se permanente por mais de 15 minutos. As saponinas possuem diversas ações, dentre as quais: hemolítica, antimicrobiana e antialérgica(43,44). A presença de saponinas também foi indicada por Bessa em triagem fitoquímica com e extrato etanólico de G. ameri-cana(33).
A formação de coloração verde observada sob luz UV no teste para cumarinas indicou a presença da mesma. Estas possuem propriedades antioxidantes(15,45), muito utiliza-das para tratar diversas doenças da pele como dermatoses e psoríase, bem como possuem ação anticoagulante(33,46). Não foi encontrado na literatura relatos da identificação de antraquinonas e resinas no jenipapo, corroborando com os resultados obtidos nesta pesquisa.
Os resultados observados a partir da triagem fitoquímica estão descritos na Tabela 1.
Devido a positividade na triagem de compostos flavo-noides, taninos e cumarinas, foi realizado o doseamento de fenóis, cujo resultado baseou-se na curva de calibração do ácido tânico com concentrações de 0,018 mg/mL, 0,025 mg/mL, 0,037 mg/mL, 0,05 mg/mL e 0,062 mg/mL, (Fi-gura 3). O cálculo para doseamento levou em consideração o teor de sólidos de 48%, e, a partir deste, obteve-se 5,33% de fenóis totais presentes no extrato.
A curva padrão do ácido tânico encontra-se representada no gráfico da Figura 3.
O resultado de 5,33% de fenóis totais foi inferior ao per-centual 12,91% encontrado por Costa(47), o qual utilizou como líquido extrator uma solução tampão fosfato de sódio 50 mM pH = 7,0 e a técnica de Folin-Ciocalteu em junção as modificações propostas por Jayaprakasha e Singh, utili-zando a solução de carbonato de sódio para determinar os fenóis totais. Os resultados obtidos foram diferentes com-parando com a literatura, assim, evidenciando que existem amostras distintas, onde seu caráter físico-químico irá de-pender da sazonalidade, ou seja, da época de frutificação e fase de maturação, assim como dos diferentes métodos de extração e doseamento.
4 Conclusão
A extração e caracterização do extrato hidroalcoólico da fruta do jenipapo (G. americana) foram satisfatórias, in-dicando que o jenipapo merece ser mais estudado, visto a presença de substâncias de grande interesse para aplica-ções na farmacologia. A caracterização confirma a grande variabilidade das amostras que são influenciadas pela sa-zonalidade, a qual implica em alterações nas propriedades físico-químicas dos derivados vegetais.
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