PERSISTÊNCIA DE Metarhizium anisopliae FORMULADO EM ÓLEO E IMPREGNADO
EM PANOS PRETOS CONTRA Aedes aegypti EM CONDIÇÕES DE SEMICAMPO
Aline Teixeira Carolino, Adriano Rodrigues de Paula, Cátia Oliveira de Paula Morais,
Anderson Ribeiro, Richard Ian Samuels
Universidade Estadual do Norte Fluminense-RJ, Laboratório de Entomologia e Fitopatologia teixeira_a@yahoo.com.br; biodepaula@yahoo.com.br; catiadepaula@gmail.com;
anderson.ribeirorj@yahoo.com.br; richard@uenf.br
Resumo – Nesse teste foi observada a suscetibilidade de fêmeas de Aedes aegypti ao fungo Metarhizium
anisopliae em condições de semicampo. Panos pretos de algodão impregnado com o fungo (F) + óleo
vegetal (V) ou óleo vegetal + isoparafina (V+I) (50:50) foram fixados embaixo de cadeiras e mesas em duas salas (uma sala com cinco panos tratados fungos e outra com cinco panos sem o fungo). Cinqüenta mosquitos fêmeas foram liberadas em cada sala e depois de 5 dias os insetos sobreviventes foram capturados com uma armadilha BG-Sentinel®. Logo após, outros 50 insetos foram liberados em cada sala. Este procedimento foi repetido cinco vezes observando a eficiência do fungo para reduzir a sobrevivência dos mosquitos. Os insetos foram liberados nos seguintes períodos: 0-5, 6-11, 12-17, 18-23, 24-29 e 30-35 dias. Os ensaios feitos com F+V+I resultaram em significativa redução da sobrevivência de A. aegypti por até 29 dias (77%), comparado com o tratamento controle (87,3% de insetos vivos). A formulação F+V foi viável contra mosquitos por 11 dias. A utilização de panos pretos com F+V+I resultou em menores taxas de sobrevivência dos insetos. A formulação F+V+I apresenta potencial para ser utilizada no campo.
Palavras-chave: Formulação, Fungo entomopatogênico, mosquito, dengue. Área do Conhecimento: Ciências Biológicas.
Introdução
O mosquito Aedes aegypti se encontra amplamente distribuído em regiões tropicais e subtropicais do mundo, desempenhando um papel importante na transmissão de arboviroses tais como a dengue e a febre amarela (WHO, 2013). Atualmente, as medidas de controle do vetor consistem em utilização de inseticidas químicos. Contudo, casos de resistências já foram mostrados em formas imaturas do mosquito (HORTA et al., 2011). Frente a essas dificuldades, uma alternativa de controle que vem ganhando destaque é a utilização do controle biológico. As bactérias Bacillus thuringiensis var. israelensis (Bti) e Bacillus sphaericus foram amplamente utilizadas com eficiência na redução da sobrevivência de larvas de mosquitos (WIRTH et al., 2000). Os fungos entomopatogênicos também se mostram candidatos promissores, sendo constatada à eficiência desses entomopatógenos em ovos, larvas e adultos de mosquitos (LUZ et al., 2008; PEREIRA et al., 2009; PAULA et al., 2013ab). Entretanto, uma das maiores preocupações na utilização de fungos em condições de campo, é o quanto estes entomopatógenos podem ser capazes de tolerar os efeitos hostis em ambientes naturais, mantendo sua persistência e virulência. Fornecer aos
conídios do fungo proteção aos estresses ambientais tais como radiação UV, temperaturas extremas e dessecação são um dos principais objetivos dos recentes estudos de controle de insetos no campo (HOWARD et al., 2010; TSENG et al., 2011). Ensaios mostram que formulações do fungo a base de óleo oferecem grande vantagem em relação às formulações à base de Tween (WRIGHT et al., 2004). Até o presente momento, trabalhos de campo utilizando fungos entomopatogênicos foram feitos com mosquitos
Anopheles (SCHOLTE et al., 2005; LWETOIJERA
et al., 2010). E alguns estudos de semicampo mostraram a eficácia de fungos contra o mosquito
A. aegypti (PAULA et al., 2008, DARBRO et al.,
2012, PAULA et al., 2013ab), entretanto nenhum deles avaliou a persistência e viabilidade do fungo ao longo do tempo. O presente estudo teve como objetivo avaliar a persistência da combinação do fungo + óleo vegetal ou óleo isoparafina+vegetal impregnado em panos pretos contra o mosquito adulto de A. aegypti.
Metodologia
Criação do mosquito Aedes aegypti
A manutenção da colônia do mosquito A.
aegypti, linhagem Rockfeller foi realizada alimentando os mosquitos adultos com sangue de camundongo. Após o repasto sanguíneo, foi inserido na gaiola um copo plástico de 100 mL com água e com papel filtro forrado em seu interior para oviposição das fêmeas. A eclosão das larvas foi estimulada com a imersão do papel filtro em bandejas com água de torneira e como fonte de alimento foi fornecida ração de gato moída (0,05g) até atingirem a fase de pupa. As pupas foram retiradas das bandejas, adicionadas em copos plásticos de 100 mL com 50 mL de água e inseridas em gaiolas (30 x 20 x 20 cm) para a emergência dos adultos. Mosquitos fêmeas com idade entre 2 e 3 dias foram usadas nos ensaios.
Preparo da suspensão fúngica
O isolado ESALQ 818 de Metarhizium
anisopliae (isolado ESALQ 818) foi obtido da
coleção da ESALQ em Piracicaba- SP e cultivado em meio SDA (Dextrose, Peptona, Extrato de levedura, Ágar e água destilada) a 27 °C durante 14 dias. Para a produção em arroz, os conídios foram removidos das placas com o auxílio de uma espátula e adicionados a Erlenmeyers contendo 25g de arroz parboilizado com 10 mL de água destilada previamente autoclavados a 121°C por 20 min. Os frascos foram incubados em câmara de germinação do tipo BOD a 27°C por 14 dias e posteriormente os conídios foram separados do arroz utilizando uma máquina separadora de esporos (Mycoharvester – Inglaterra). Quatro gramas do fungo (F) foram adicionados a uma mistura de 50% de óleo Vegetal [(V) (óleo de girassol; Sadia Ltd. Brasil)] + 50% de óleo Isoparafina [(I) BroadLub Ltd. Brasil] ou somente ao óleo Vegetal (100%). A concentração do fungo utilizada nos ensaios foi de 1x108 conidios/mL-1.
Preparo dos panos pretos imersos no fungo entomopatogênico
Panos pretos de algodão (20 x 10 cm) foram autoclavados a 121°C por 20 min e posteriormente imersos na suspensão do fungo: F+V+I ou F+V e seus respectivos controles: V+I ou V (Figura 1-A). Os panos foram deixados durante 48 horas em uma sala com temperatura controlada (26 º C, 71 ± 7% de HR e 12h L: 12 D) e depois utilizados nos ensaios (Figura 1-B).
Experimentos de semicampo simulando um cômodo residencial
Duas salas idênticas de 6m2 com uma porta, janela, cadeira e duas mesas foram utilizadas nos ensaios. Primeiramente as salas foram limpas com Álcool 70 %. Como fonte alimentar para os mosquitos, três alimentadores artificiais com 30 ml de sacarose 10% foram colocados em cada sala. Cinco panos pretos impregnados com a formulação F+V+I ou F+V foram fixados embaixo dos móveis usando fita "silver tape" (3M Ltd, Brasil). Na sala do controle, cinco panos pretos impregnados com a V+I ou V foram fixados nos móveis. Cinquenta fêmeas de A. aegypti foram liberadas em cada sala e a porta e janela foi lacradas com fita adesiva. No final do quinto dia do experimento, uma armadilha (BG-Sentinel™ Biogents Ltd. Alemanha) foi colocada em cada sala e 24 horas depois, o número de mosquitos capturados foi contabilizado. A sala foi inspecionada para verificar possíveis mosquitos não capturados e outro grupo de mosquitos foi liberado em cada sala. Os mosquitos foram expostos a panos impregnados com o fungo cada vez mais antigo. A viabilidade do fungo foi avaliada durante os seguintes períodos: 0-5, 6-11, 12-17, 18-23, 24-29 e 30-35 dias. Todos os experimentos foram realizados três vezes. As taxas de sobrevivência foram comparadas através de análise de variância de uma via e teste de Tukey.
Figura 1- (A) Panos pretos imersos na formulação
do fungo M. anisopliae. (B) Panos secando em varal de chão.
Figura 2- (A) Panos pretos fixados em móveis em
condições de semicampo. (B) Armadilha de captura de insetos vivos.
Resultados
Esse experimento teve o objetivo de avaliar a persistência do isolado ESALQ 818 combinado com V+I ou V e impregnado em panos pretos contra A. aegypti em condições de semicampo. Primeiramente foram feitos testes controles nas duas salas. Os mosquitos foram expostos por 5 dias a cinco panos pretos impregnados com V+I fixados em móveis. Não houve diferença significativa na sobrevivência dos insetos liberados em ambas as salas (P>0,01). A partir desse teste foi estabelecida uma sala para serem feitos os tratamentos com fungo e outra controle. Nos testes feitos com panos impregnados com F+V foi observado que os insetos liberados imediatamente, ou seja, 0-5 dias pós-fixação dos panos nos móveis apresentaram menor taxa de sobrevivência (36,6%), comparado com os demais tratamentos (Tabela 1). A análise de variância (ANOVA) e o teste post-hoc de Duncan mostraram que as porcentagens de sobrevivência dos grupos de mosquitos liberados de 0 a 5 e 6 a 11 dias pós-fixação dos panos com F+V foram significativamente diferentes comparadas com os demais tratamentos e o controle [Tabela 1; F5,17 =
70,34 (P<0,01)]. A maior porcentagem de sobrevivência de A. aegypti exposto aos panos com F+V ocorreu quando os mosquitos foram liberados de 24 a 29 dias pós-fixação dos panos nos móveis (82,6% de sobrevivência). Esse grupo não apresentou taxas de sobrevivência significativamente diferente do controle (p>0,01). Nos testes realizados com F+V+I os mosquitos expostos imediatamente, ou seja, 0-5 dias pós-fixação dos panos nos móveis tiveram a menor taxa de sobrevivência (32,6%) comparada com os outros testes.
Tabela 1. Sobrevivência (%) e Desvio padrão (DP) de Aedes aegypti expostos a panos pretos impregnados com a formulação F+V ou F+V+I ou controles: V ou V+I em condições de semicampo.
Grupos de mosquitos expostos aos panos % Sobrevivência ± DP Tratamento F+V Tratamento F+V+I 0–5 dias 36,6 ± 1,5 c 32,6 ± 2,08 d 6-11dias 50 ± 2,64 b 40,6 ± 0,57 d 12 -17 dias 78,6 ± 2,80 a 60 ± 2,64 c 18-23 dias 81,3 ± 3,21 a 64,6 ± 2,51 c 24-29 dias 82,6 ± 1,52 a 77,3 ± 0,57 b 30-35 dias ND 83,3 ± 2,51 ab CONTROLE 84,6 ± 2,08 a 87,3 ± 4,16 a DP = Desvio padrão. ND = Dados não determinados. Valores seguidos de mesma letra não apresentam diferença estatística pelo teste
post-hoc de Duncan (5% probabilidade).
Discussão
O presente estudo mostra potencial do fungo
M. anisopliae formulado em óleo vegetal e óleo
isoparafina impregnados em panos pretos para controle do mosquito A. aegypti. Mesmo sendo observado certo declínio da viabilidade dos conídios ao longo do tempo. A formulação F+V+I reduziu significativamente a sobrevivência dos mosquitos A. aegypti comparado com a taxa de sobrevivência da formulação F+V (Tabela 1). Fatores bióticos e abióticos podem influenciar na longevidade dos conídios, afetando a germinação e crescimento de hifas fúngicas (ROY et al., 2006). Contudo, mesmo com a redução parcial da viabilidade dos conídios, houve redução da sobrevivência dos insetos. Estudos de infecções fúngicas de Anopheles têm mostrado que mesmo pequenas reduções na população de mosquitos adultos apresentam significativo impacto epidemiológico, sendo suficientes para reduzir a capacidade vetorial dos insetos (THOMAS & READ, 2007). O óleo vegetal e o óleo Isoparafina utilizados nesse trabalho já foram mostrados na literatura como adjuvantes promissores na proteção dos conídios aos estresses ambientais (ALVES et al., 1998; ALVES & FARIA, 2010; HOWARD et al., 2010). Em condições de campo, Scholte et al., (2005) observaram que fungo M.
anisopliae formulado com 5% de óleo vegetal
manteve-se persistente por até 3 semanas em ensaios de controle de Anopheles. O óleo Shelsol T, também se mostrou eficiente na formulação dos fungos M. anisopliae ou B. bassiana para controle de larvas de Coleoptera (Phaedon cochleariae) e também de larvas de Anopheles, mesmo as condições do campo tendo apresentado oscilações climáticas (INYANG et al., 2000; BUKHARI et al., 2011). Paula et al. (2013a) observaram, utilizando uma gaiola grande, significativa redução na sobrevivência de A.
aegypti expostas por 12 h a um pano preto
impregnado com o fungo. No presene estudo as fêmeas de A. aegypti ficaram expostas aos panos com fungo por 5 dias, o que pode ter aumentado o contato dos mosquitos com os conídios aderidos no pano preto. O atual estudo teve objetivo de se aproximar da realidade do campo onde panos pretos impregnados com fungo poderão ser fixados dentro ou fora de residências (testes em andamento). A atração de fêmeas de A. aegypti a panos pretos com e sem o fungo foi recentemente verificada (PAULA et al., 2013b). Darbro e colaboradores (2012) observaram, em testes de semicampo, que fêmeas de A. aegypti infectadas com o fungo B. bassiana tiveram redução na capacidade de buscar hospedeiros para realizar o repasto sanguíneo, entretanto, as infecções foram feitas em condições de laboratório. A Tabela 1
mostra significativa redução da sobrevivência dos mosquitos expostos de 6-11 dias (40,6%) aos panos pretos impregnados com F+V+I, comparado com os demais grupos, enquanto mosquitos expostos a panos com F+V apresentaram 50% de sobrevivência no mesmo período. Com isso sugerimos que no campo panos pretos com F+V+I devam ser substituídos por aproximadamente 10 dias quando utilizados dentro de residências. Além disso, a utilização do isoparafina no pano preto resultou em menores taxas de sobrevivência de insetos comparado com somente a utilização de óleo vegetal (Tabela 1). Foi verificado também que a formulação F+V+I reduziu significativamente (P<0,01) a sobrevivência do mosquito da dengue até o vigésimo nono dia do experimento, comparado com a sobrevivência dos mosquitos no grupo controle (V+I). Enquanto a formulação F+V reduziu significativamente (P<0,01) a sobrevivência dos mosquitos até o décimo primeiro dia do teste, comparado com controle (V). Mnyone et al. (2010), observaram que mesmo com a viabilidade reduzida, os fungos B. bassiana ou M. anisopliae se mantiveram persistentes por 28 dias e infectando 73-82% dos mosquitos
Anopheles, contudo o teste foi feito em condição
de laboratório (26°C - 27°C, 85-95% HR). Nossos estudos indicam que a formulação F+V+I tem potencial para ser utilizada em condições de campo. Panos pretos impregnados com F+V+I e fixados em móveis de residências provavelmente diminuirão a população do mosquito A. aegypti e portanto a transmissão de dengue.
Conclusão
Panos pretos impregnados com o fungo M.
anisopliae, apresentaram eficiência na redução da
sobrevivência de fêmeas de A. aegypti em condições de semicampo.
A formulação do fungo M. anisopliae (ESALQ 818) em óleo Vegetal + Isoparafina e impregnada em panos pretos reduziu a sobrevivência do mosquito da dengue, podendo seu utilizado em programas de controle de vetores.
Agradecimentos
À UENF e FAPERJ projetos: E-26/111.586 /2008, E-26/110.341/2010 e E-26/102.860/2011.
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