SÍNTESE E AVALIAÇÃO IN VITRO DO POLI ( L-ÁCIDO
LÁCTICO).
Vanusca D.Jahno1*, Jefferson B. da Silva1, Emanuelli Cabral2, Paula Kersche2, Rosane A. Ligabue2, Sandra Einloft2, Maidy Ferreira3, Karina Bombonato-Prado3.
1*Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Pós-Graduação em Medicina e Ciências da Saúde, Av.Ipiranga,6681 P12B sala 223, 90619-900 Porto Alegre/RS –vanuscadalosto@yahoo.com.br, jeffmao@terra.com.br;
2
Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul,Faculdade de Química –emanullis@hotmail.com, paulakersche@yahoo.com.br, rligabue@pucrs.br, einloft@pucrs.br; Universidade de São Paulo, Faculdade de
Odontologia de Ribeirão Preto – karina@forp.usp.br
Synthesis and in vitro evaluation of the poly(L-lactic acid).
Poly (L-lactic acid) (PLLA) is an aliphatic polyester which is being used, mainly in biomedical applications. PLLA is a biocompativel and bioabsorbable material. This work presents the synthesis and characterization of poly (L-lactic acid) and its cytotoxicity evaluation. The obtained polymers were characterized by FTIR and GPC. We observed that the cell viability was higher than 80% in the group in contact with PLLA and the cellular adhesion was similar for the controlled group and the group that received half conditional from PLLA, suggesting that the components of this material do not affect the cellular viability.
Introdução
Em 1960 começaram a serem produzidas as primeiras suturas bioabsorvíveis aprovadas na indústria médica, obtidas a partir de ácido láctico e ácido glicólico (1). Desde aquele tempo, outros dispositivos médicos, baseados em ácido láctico e ácido glicólico, como também outros materiais, inclusive copolímeros de poli (dioxanona) e poli (trimetileno carbonato), e homopolímeros e copolímeros da poli (ε-caprolactona), foram aceitos para o uso como dispositivos biomédicos (2). Além desses dispositivos aprovados, muitas pesquisas continuam em polianidridos (3), poliortoésteres (4), e outros materiais (5).
Para que um material seja aceito clinicamente como um material de implante, ele precisa atender a alguns requisitos fundamentais: (1) biocompatibilidade, ou seja, sua presença não deve causar efeitos nocivos no local do implante ou no sistema biológico; (2) os tecidos não devem causar a degradação do material; (3) o material deve ser biofuncional, ou seja, deve ter as características mecânicas adequadas para cumprir a função desejada e pelo tempo desejado; (4) o material deve ser esterilizável.
reduzindo a eficiência do implante. Os polímeros têm sido largamente utilizados como biomateriais por apresentarem vantagens em relação aos metais e às cerâmicas. Entre as vantagens estão à versatilidade de processamento e modelagem, possibilitando a síntese de polímeros em diferentes composições químicas e, conseqüentemente, a obtenção de materiais com diferentes propriedades mecânicas e graus variados de biocompatibilidade. A tendência atual pela busca de materiais absorvíveis e de baixo custo levou ao desenvolvimento, através de modificações químicas, do poli (L - ácido láctico) (PLLA). O PLLA pode ser extremamente interessante em aplicações clínicas em função de sua capacidade de degradação.
O mecanismo da degradação in vitro dos polímeros bioreabsorvíveis tem sido avaliado nos últimos anos e demonstra ser um processo heterogêneo na extensão do material. Dentre os produtos da hidrólise das ligações ésteres, a presença de terminais ácidos catalisa a reação de degradação. É o chamado efeito autocatalítico dos poli(α-hidróxi ácidos). O processo é homogêneo inicialmente, gerando oligômeros solúveis em água em toda a extensão do material. Os produtos presentes na superfície da matriz são difundidos para o meio, entretanto, a baixa taxa de difusão dos produtos da reação no interior do material gera um acúmulo de ácidos, fazendo com que estruturas densas tenham uma erosão inicial na superfície, mas apresentando uma degradação mais acentuada no centro (7).
A bioreabsorção pelo organismo ocorre quando a biodegradação geram produtos e subprodutos com as características dos metabólitos orgânicos, especificamente os ácidos do Ciclo de Krebs. Terminada a hidrólise do material a degradação segue o processo de oxidação a ácido láctico (para o PLA) e conversão das unidades de PGA em glicina, que por sua vez são convertidos em ácido pirúvico. Na presença da acetil coenzima A, ocorre à liberação de CO2 e, conseqüentemente, a decomposição em
citrato. O citrato será então incorporado no Ciclo de Krebs, resultando em CO2 e H2O, podendo sua
eliminação ser feita através da urina e da respiração, conforme mostra a figura 1. O material foi reabsorvido e metabolizado (7).
Figura 1. Rota metabólica de bioreabsorção dos poli(α-hidróxi ácidos) (PLA e PGA).
Em estudos in vivo, o processo de biodegradação e bioreabsorção é um mecanismo complexo de eventos celulares e bioquímicos. Com o implante do material sintético o organismo promove uma típica resposta a uma reação inflamatória de corpo estranho. A influência na degradação pela presença de peróxidos, enzimas e células fagocitárias representam ainda hoje um importante enfoque nas pesquisas dos polímeros bioreabsorvíveis (7).
A degradação in vitro mostra-se como uma boa alternativa quando comparados aos estudos in
vivo, sendo fundamentais e necessários. Os custos são menores, o processo pode ser acelerado e as
Experimental
Síntese do pré-polímero
A síntese do pré-polímero foi realizada através da retirada de água por policondensação com aquecimento de 160º por 4 horas, sob agitação mecânica e atmosfera inerte (gás nitrogênio).
Síntese por policondensação
Inicialmente foi sintetizado através do método de policondensação direta um pré-polímero L-ácido láctico de baixa massa molar. A partir dele foi sintetizado o poli (L-L-ácido láctico) conforme descrito na literatura (8), com o catalisador dibutildibutóxi-estanho.
Caracterização dos pré-polímeros e dos polímeros
Os espectros de IV foram obtidos em um espectrofotômetro Perkin Helmer-(célula de seleneto de zinco - acessório HATR) em valores de transmitância.
Através do GPC obteve-se a massa molar numérica média (Mn) e a massa molar ponderal
média (Mw) em um cromatógrafo equipado com uma bomba isocrática -1515 e detector de índice de
refração -2414 da Waters Instruments, utilizando tolueno como eluente. As amostras foram solubilizadas em clorofórmio.
Teste de citotoxicidade
Para o teste de citotoxicidade (ISO-9002) do material através de cultura de células osteoblásticas com o meio condicionado do material, adicionamos 10, 20 e 30% do eluente mais meio de cultura normal (MTS 10%) e a proliferação e viabilidade celular foram avaliadas após 24 horas, 4 dias, 7 dias e 11 dias
Resultados e Discussão
Análise dos Espectros de Infravermelho
Os espectros de IV do pré-polímero e do polímero PLLA sintetizados por policondensação com o catalisador dibutóxidibutil estanho são mostrados na Figura 2.
Figura 2: Espectros de IV do pré-polímero e do PLLA obtido por policondensação com o catalisador dibutóxidibutil estanho, em diferentes tempos de vácuo.
A banda larga em torno de 3500 cm-1 referente ao estiramento do grupo OH diminui no pré-polímero e praticamente desaparece no pré-polímero PLLA. Observa-se um deslocamento da banda referente ao estiramento do C=O no monômero em 1715 cm-1 para 1744 cm-1 no pré-polímero e 1753 cm-1 no polímero obtido com 350 horas de vácuo, assim como, um deslocamento da banda de C-O em 1160 cm-1 do pré-polímero para 1185 cm-1 no PLLA indicando que houve a formação do polímero.
Tanto o pré-polímero quanto o PLLA, apresentam as mesmas bandas de absorção, se diferenciando apenas na intensidade da banda em torno de 3500(O-H), que desaparece com o tempo de vácuo, devido à reação de poliesterificação direta que consome os grupamentos OH quando estes reagem com os grupamentos ácidos para formar a ligação éster. Essas atribuições são análogas às descritas na literatura (9,10,11).
Análise de Cromatografia por Permeação em Gel
A partir da análise de GPC foram obtidas a massa molar numérica média (Mn) e a massa
molar ponderal média (Mw) do pré-polímero e do PLLA obtidos em diversos tempos de reação,
como é mostrado na Tabela 1.
Tabela 1: Massas molares (Mw e Mn) do pré-polímero L-ácido láctico e do poli (L-ácido láctico)
Solvente: Clorofórmio, Catalisador dibutildibutóxi estanho.
Observa-se com estes dados que houve um aumento considerável da massa molar do polímero obtido PLLA quando comparado ao pré-polímero (entrada 1 e 2) e este aumento é observado também em função do tempo de reação (entrada 2 a 4). Como era esperado, a massa molar do PLLA sintetizado aumentou, passando de um valor de Mw de 1798 g/mol no pré-polímero, para um valor de Mw de 23902 g/mol no PLLA de 350 horas de tempo de reação.
Análise da Citotoxicidade
Pode ser observado no figura 3 que a partir do grupo de 4 dias, a proliferação celular diminuiu proporcionalmente com o aumento da concentração do meio condicionado nas culturas quando comparado ao controle. Apesar disso, figura 4 mostra que a viabilidade celular foi maior que 90% em todos os grupos estudados, sugerindo que os componentes deste material não afetam a viabilidade celular.
Entrada Polímeros Mn(g/mol) Mw(g/mol)
1 Pré-polímero 882 1798
2 PLLA (100 h) 6413 16032
3 PLLA (200 h) 11348 20669
Proliferação Celular 0 10 20 30 40 controle 10% 20% 30% grupos n º d e c é lu la s x 1 0 4/p o ç o 24 horas 4 dias 7 dias 11 dias
Figura 3. Proliferação celular após 24 horas, 4 , 7 e 11 dias de cultura em contato com 0, 10, 20 e 30% de meio condicionado com o PLA. Teste estatístico de Kruskall-Wallis.
Viabilidade Celular 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 controle 10% 20% 30% gr upos v ia b il id a d e c e lu la r (% ) 24 horas 4 dias 7 dias 11 dias
Figura 4. Proliferação celular após 24 horas, 4, 7 e 11 dias de cultura em contato com 0, 10, 20 e 30% de meio condicionado com o PLA. Teste estatístico de Kruskall-Wallis (ausência de significância entre os grupos).
Adesão e Proliferação Celular
A adesão celular estudada através de contagem de células em lamínulas de vidro e coradas com DAPI não mostrou diferenças estatisticamente significantes entre os dois grupos estudados
grupos 24 horas 4 dias 7 dias 11 dias
controle x 10% n.s. n.s. 5% 1%
controle x 20% n.s. 5% 0,1% 0,1%
Figura 5. Adesão celular após 24 horas de cultura dos osteoblastos controles e em contato com o meio condicionado com eluente de PLA. Diferença estatística não significante entre os dois grupos.
Figura 6. Proliferação celular após 7, 14 e 21 dias de osteoblastos humanos derivados do osso alveolar com e sem a adição de meio condicionado com PLA. Análise estatística de Mann-Whitney para p0.05. * Diferença estatística com p=0,004.
Viabilidade celular
Os dois grupos estudados de células na presença e na ausência de meio condicionado com eluente do PLA mostraram viabilidade celular acima dos 80% em todos os períodos estudados, com diferença estatística somente no período de 7 dias (Figura 7).
N ú m e ro d e c é lu la s /c a m p o Adesão celular 0 2 4 6 8 10 12 14 24 horas controle CM (PLA) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 7 14 21 período (dias) n ú m e ro d e c é lu la s x 1 0 4 / p o ç o control CM (PLA) * * *
0 20 40 60 80 100 7 14 21 período (dias) v ia b il id a d e c e lu la r (% ) control CM (PLA)
Figura 7. Viabilidade celular após 7, 14 e 21 dias de osteoblastos humanos derivados do osso alveolar com e sem a adição de meio condicionado com PLA. Análise estatística de Mann-Whitney para p0.05. *Diferença estatística com p=0,004.
Conclusões
O processo de policondensação utilizado mostrou-se uma rota sintética viável na obtenção do polímero PLLA, a partir de matérias primas nacionais.
A proliferação celular foi significativamente menor no grupo em contato com meio condicionado, e a quantidade de proteína total significativamente maior neste grupo em relação ao controle em todos os períodos estudados. Estes resultados sugerem que o material apresenta boa biocompatibilidade e não interfere com a adesão celular inicial de osteoblastos, apesar de não favorecer a proliferação celular.
Agradecimentos
Os autores agradecem à A.S.Technology, PROPESQ, UFRGS, PUCRS, USP e FAPESP. Agradece-se ao PUCRS pela bolsa de DT.
Referências Bibliográficas
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