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Química de Ácidos Nucleicos

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O termo Biologia Molecular

é usualmente aplicado à

Química de Ácidos Nucleicos

Ácido Deoxirribonucleico - DNA

Ácido Ribonucleico – RNA

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A informação genética de todos os animais é escrita na linguagem universal das seqüências de DNA.

A seqüência de DNA pode ser obtida por técnicas bioquímicas simples que hoje praticamente todos os laboratórios de

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Histórico:

Primeiras evidências de que o DNA é o material genético:

• F. Miescher, 1868- extraiu DNA do núcleo celular pela primeira vez (nuclein)

• O. Hertwing, 1884 - demonstrou que a fertilização de ovos dependia da união de dois núcleos - um do óvulo e outro do esperma

Hertwing suspeitou que “nuclein” fosse o material da

hereditariedade. Hipótese que caiu em esquecimento durante os próximos 60 anos.

• O. Avery, C. MacLeod e M. MacCarty, em 1944 - demonstraram em experimentos com Pneumococcus que o DNA é o material genético

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Nature - 25 de abril de 1953

“A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid”

J. Watson and W. Crick

“We wish to suggest a structure for the salt of deoxyribose nucleic acid (D.N.A.). This structure has novel features which are of considerable biological interest….”

A pedra fundamental da Biologia Contemporânea

Hoje, o fato de que o DNA é o material genético é um fato biológico tão óbvio e fundamental que torna-se difícil apreender a enormidade do vazio de

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1950: - Não se conhecia a seqüência de amino ácidos

de nenhuma proteína.

- Não se sabia que os amino ácidos numa proteína

permanecem arranjados numa seqüência exata.

1960: - Foi definida a primeira estrutura tridimensional

de uma proteína, definida por cristalografia.

Hoje conhecemos a seqüência primária de amino ácidos

de centenas de milhares de proteínas a partir dos genes

que as codifica.

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A identificação de moléculas de ácidos nucleicos tornou-se a maneira mais fácil de se

chegar a uma dada proteína

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Os ácidos nucleicos são moléculas muito mais

simples que as proteínas

Os ácidos nucleicos são formados de apenas

4 tipos de monômeros

(alfabeto de 4 letras)

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ESTRUTURA DO DNA

O DNA é uma molécula quase “unidimensional”

Largura: 20 Angstrons

Comprimento: 1,7 a 8,5 cm

•Uma Estrutura linear que dá origem a outra

estrutura linear (o RNA)

•O RNA, por sua vez, dá origem a outra estrutura

linear (sem ramificações):

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AS UNIDADES DO POLÍMERO - DNA

• Bases Purínicas (A ou G) e Pirimidínicas (C ou T)

• Um açúcar: desoxiribose

• Fosfato

• Nucleosídeo: purina ou pirimidina ligada ao açúcar

• Nucleotídeo: éster de fosfato de um nucleosídeo

• Exemplo: deoxiadenosina 5’ - trifosfato (dATP)

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O DNA é uma molécula com polaridade:

uma extremidade 5’- P

uma extremidade 3’-OH

• A SEQÜÊNCIA DE BASES É SEMPRE LIDA NA DIREÇÃO

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O DNA sempre tem duas fitas de ácidos nucléicos

enroladas em hélice

• As duas fitas de ácidos nucleicos se mantêm juntas por

PONTES DE HIDROGÊNIO

• Para que o pareamento ocorra, a DUAS FITAS têm que

ser ANTIPARALELAS

• O pareamento G-C tem 3 pontes de hidrogênio

• O pareamento A-T tem 2 pontes de hidrogênio

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Quanto maior o número de pontes de H mais

estável é a interação.

As fitas das moléculas de DNA no cromossomo

não se separam na célula íntegra sem ajuda de

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Desnaturação e Renaturação do DNA

(1961 - Marmur e Doty descobriram a RENATURAÇÃO do DNA)

• As duas fitas da dupla hélice podem ser reversivelmente

separadas quando as PONTES DE HIDROGÊNIO são rompidas:

Aumento de temperatura ou Extremos de pH (usamos pH alcalino para separar as fitas)

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Força de interação entre moléculas e entre átomos numa

mesma molécula

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Tm e % de GC

Quanto maior a

porcentagem de

pares GC, mais

difícil é a

desnaturação

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Separação das fitas é denominada

“FUSÃO”

da molécula de

DNA - “MELTING”

MELTING POINT:

TEMPERATURA NA QUAL É DESFEITA METADE DA ESTRUTURA EM HÉLICE DO DNA

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Ácidos Nucleicos absorvem máximamente a 260 nm.

A quantificação de ácidos nucleicos em laboratório é,

usualmente, feita por espectrofotometria - na

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A absorbância a 260 nm aumenta quando as fitas se separam. Temperatura de desnaturação, ou “melting point” (Tm), é a

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O DNA no núcleo:

• Um cromossoma : uma molécula de DNA

• Genoma: o conjunto de cromossomas de uma dada espécie • Genoma Humano: 46 cromossomas

• 22 CROMOSSOMAS AUTOSSÔMICOS (x2) • 2 CROMOSSOMAS SEXUAIS

• Total: 6 x 109 pares de nucleotídeos

Cada célula tem aproximadamente 2 metros de DNA, se esse fosse desenrolado. O núcleo tem apenas 6 mm.

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Primeiro nível de compactação: . nucleossomos

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Segundo nível de compactação: Histona H1

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As histonas são proteínas altamente conservadas. Histona H4 – 102 amino ácidos:

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H1, H2A, H2B, H3 e H4 em interação com o DNA

142 pontes de H são formadas entre DNA e o cerne das histonas, em cada nucleossomo.

A maioria entre o “backbone” de amino ácidos das histonas e o “backbone”

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DNA de procariotas tem cerca de 1mm.

Têm que ser compactados para se acomodarem na célula.

A associação com poliaminas carregadas positivamente reduz a repulsão entre moléculas de DNA, facilitando a compactação:

Proteínas interagem com o DNA, exercendo papel

semelhante aos das histonas. A mais abundante destas

proteínas é a H-NS.

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DNA POLIMERASES

POLIMERIZAÇÃO: 5’---> 3’

• Todas as DNA-POLIMERASES requerem para

seu funcionamento:

– Molécula de DNA - molde

– “Primer” de oligonucleotídeo

– Magnésio

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Incorporação de um nucleotídeo na cadeia

DNA-polimerase

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DNA polimerases têm dois sítios catalíticos: . Sítio de polimerização: Polimerase 5’3

. Sítio de remoção: Exonuclease 3’5'

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A necessidade de que a duplicação se faça com alta fidelidade requer uma

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Mecanismo hipotético: incompatível com o processo de correção

Mecanismo

real

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O SENTIDO DA VIDA É ....

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Origem de replicação em bactérias:

Uma seqüência específica de DNA, com algumas centenas de pares de bases, rica em AT.

Na origem forma-se o

complexo de replicação (RC) na fase G1.

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Duplicação de um DNA circular

Bactérias

Plasmídeos

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Duplicação do DNA Em eucariotos

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As origens de replicação são elementos do DNA aos quais se ligam ORCs (origin replication

complex)

Janela de oportunidade: fim em G1

proteínas específicas se ligam aos ORCs (pre-RC) [Leveduras: Cdc6p e RLFs (MCM)]

Proteínas cinases dependente de ciclinas (ciclinas B-CDK) agem no pré-RC

Ciclinas B acumulam-se na célula

imediatamente antes da fase S e fosforilam proteínas do pré-RC

pré-RC fosforilado  pós-RC Inicia-se a fase S

Pós-RCs não são capazes de reiniciar a replicação do DNA

O Processo de replicação só será possível quando as células filhas passarem novamente pelo mesmo processo.

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Cada cromossomo tem aproximadamente 150 milhões de pares de nucleotídeos. Numa velocidade de 50 nts/s, levaria cerca de 800 horas para replicar um

cromossomo.

Em cada cromossomo, 20 a 80 origens são ativadas para que o DNA seja replicado em tempo hábil.

O intervalo entre as origens de replicação varia entre 30.000 a 300.000 pares de nucleotídeos.

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No local de replicação forma-se uma bolha, que vai se abrindo em ambas as direções.

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A fita nova é iniciada pelo

complexo PRIMASE+DNA-pol a que sintetiza um primer de RNA

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A polimerização se faz obrigatoriamente na direção 5’3'

Fragmentos de Okazaki na fita de síntese

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Fazem parte do complexo de replicação além das polimerases:

Girase e Helicase (abrem as fitas)

 Proteínas que se ligam no DNA quando em fita única RPA (replication protein A)

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 RFC (replication factor C) – (Clamp Loader)

• Atua na substituição do complexo primase/DNA-pol a

pela polimerase que irá estender a fita por distâncias maiores (Pol e ou Pol d) • Carrega a PCNA para o local

 PCNA (proliferating cell nuclear antigen)

(Sliding clamp)

• PCNA funciona como um anel que circunda o DNA e prende a DNA-polimerase no local, aumentando sua processividade

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Figure 5-18b Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

PCNA

RFC

Estas proteínas são importantes para

manutenção da estabilidade cromossômica porque participam também do reparo do DNA e soluções dos problemas de quebra na

fita durante a replicação (stalled replication forks)

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Um “fork” de replicação de mamífero.

Primers: 7-9 RIBOnucleotídeos estendidos depois até ~30 nts pela DNA polimerase a Na “lagging-strand”, os “primers” são sintetizados a cada 100 a 200 nucleotídeos.

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Velocidade de polimerização: Procariota: 500 a 1000 nucleotídeos/segundo Eucariota: 50 nucleotídeos/segundo DNA helicase: à medida que se move ao longo do DNA, hidrolisa ATP e separa as fitas, numa velocidade de ~ 1000 nt/s

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Figure 5-23 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

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Maturação dos fragmentos de Okazaki

Cerca de 50 milhões de Fragmentos de Okazaki são gerados a cada duplicação do DNA em células de mamíferos

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Sempre auxiliadas por PCNA as seguintes enzimas participam da maturação dos fragmentos de Okazaki:

• Rnase H/FEN1: degrada os segmento RNA do segmento alfa

• FEN1: cliva o segmento que é deslocado pela DNA polimerase d (se pequeno)

• DNA2/RPA: cliva o segmento deslocado, se este é longo

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FEN1 – metilada: cliva o segmento

FEN1 – fosforilada: desprende-se do complexo Ligase I : fecha a interrupção na fita (nick)

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3’ 5’ 3’ 5’ Fitas parentais nova nova Primers de RNA 3’ 5’ +

Digestão dos primers por RNases 3’ 5’ 3’ 5’ + Falha na extremidade (primer gap)

Sequências repetidas dos telômeros (TTAGGG)

Telomerase velha

velha

velha

Preenchido pela DNA-polimerase

Primase DNA-polimerase Digestão do primer por RNases nova Falha na extremidade (primer gap)

* * * *

* * * *

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Estrutura da

telomerase

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Telomerase é uma transcriptase reversa: uma classe de DNA

polimerases que sintetiza DNA a partir de uma “template” de RNA.

Em humanos, a seqüência GGGTTA é adicionada pela telomerase, se estendendo por cerca de 10.000 nucleotídeos.

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A extremidade do telômero adquire uma estrutura especial (alça T)

Ausência de Rtel1 leva a

instabilidade genômica com fusões de cromossomos.

Os telômeros têm a cromatina altamente condensada.

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A maquinaria de replicação desloca o DNA das histonas. Ambas as fitas de DNA herdam histonas velhas. H2A e H2B velhas se juntam com H3 e H4 novas.

H3 e H4 velhas se juntam com H2A e H2B novas.

mRNAs de histonas aumentam cerca de 50 vezes durante a replicação, e em seguida são rapidamente degradados.

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Referências

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