O termo Biologia Molecular
é usualmente aplicado à
Química de Ácidos Nucleicos
Ácido Deoxirribonucleico - DNA
Ácido Ribonucleico – RNA
A informação genética de todos os animais é escrita na linguagem universal das seqüências de DNA.
A seqüência de DNA pode ser obtida por técnicas bioquímicas simples que hoje praticamente todos os laboratórios de
Histórico:
Primeiras evidências de que o DNA é o material genético:
• F. Miescher, 1868- extraiu DNA do núcleo celular pela primeira vez (nuclein)
• O. Hertwing, 1884 - demonstrou que a fertilização de ovos dependia da união de dois núcleos - um do óvulo e outro do esperma
Hertwing suspeitou que “nuclein” fosse o material da
hereditariedade. Hipótese que caiu em esquecimento durante os próximos 60 anos.
• O. Avery, C. MacLeod e M. MacCarty, em 1944 - demonstraram em experimentos com Pneumococcus que o DNA é o material genético
Nature - 25 de abril de 1953
“A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid”
J. Watson and W. Crick
• “We wish to suggest a structure for the salt of deoxyribose nucleic acid (D.N.A.). This structure has novel features which are of considerable biological interest….”
A pedra fundamental da Biologia Contemporânea
Hoje, o fato de que o DNA é o material genético é um fato biológico tão óbvio e fundamental que torna-se difícil apreender a enormidade do vazio de
1950: - Não se conhecia a seqüência de amino ácidos
de nenhuma proteína.
- Não se sabia que os amino ácidos numa proteína
permanecem arranjados numa seqüência exata.
1960: - Foi definida a primeira estrutura tridimensional
de uma proteína, definida por cristalografia.
Hoje conhecemos a seqüência primária de amino ácidos
de centenas de milhares de proteínas a partir dos genes
que as codifica.
A identificação de moléculas de ácidos nucleicos tornou-se a maneira mais fácil de se
chegar a uma dada proteína
Os ácidos nucleicos são moléculas muito mais
simples que as proteínas
Os ácidos nucleicos são formados de apenas
4 tipos de monômeros
(alfabeto de 4 letras)
ESTRUTURA DO DNA
O DNA é uma molécula quase “unidimensional”
Largura: 20 Angstrons
Comprimento: 1,7 a 8,5 cm
•Uma Estrutura linear que dá origem a outra
estrutura linear (o RNA)
•O RNA, por sua vez, dá origem a outra estrutura
linear (sem ramificações):
AS UNIDADES DO POLÍMERO - DNA
• Bases Purínicas (A ou G) e Pirimidínicas (C ou T)
• Um açúcar: desoxiribose
• Fosfato
• Nucleosídeo: purina ou pirimidina ligada ao açúcar
• Nucleotídeo: éster de fosfato de um nucleosídeo
• Exemplo: deoxiadenosina 5’ - trifosfato (dATP)
O DNA é uma molécula com polaridade:
uma extremidade 5’- P
uma extremidade 3’-OH
• A SEQÜÊNCIA DE BASES É SEMPRE LIDA NA DIREÇÃO
O DNA sempre tem duas fitas de ácidos nucléicos
enroladas em hélice
• As duas fitas de ácidos nucleicos se mantêm juntas por
PONTES DE HIDROGÊNIO
• Para que o pareamento ocorra, a DUAS FITAS têm que
ser ANTIPARALELAS
• O pareamento G-C tem 3 pontes de hidrogênio
• O pareamento A-T tem 2 pontes de hidrogênio
Quanto maior o número de pontes de H mais
estável é a interação.
As fitas das moléculas de DNA no cromossomo
não se separam na célula íntegra sem ajuda de
Desnaturação e Renaturação do DNA
(1961 - Marmur e Doty descobriram a RENATURAÇÃO do DNA)
• As duas fitas da dupla hélice podem ser reversivelmente
separadas quando as PONTES DE HIDROGÊNIO são rompidas:
Aumento de temperatura ou Extremos de pH (usamos pH alcalino para separar as fitas)
Força de interação entre moléculas e entre átomos numa
mesma molécula
Tm e % de GC
Quanto maior a
porcentagem de
pares GC, mais
difícil é a
desnaturação
Separação das fitas é denominada
“FUSÃO”
da molécula de
DNA - “MELTING”
MELTING POINT:
TEMPERATURA NA QUAL É DESFEITA METADE DA ESTRUTURA EM HÉLICE DO DNA
Ácidos Nucleicos absorvem máximamente a 260 nm.
A quantificação de ácidos nucleicos em laboratório é,
usualmente, feita por espectrofotometria - na
A absorbância a 260 nm aumenta quando as fitas se separam. Temperatura de desnaturação, ou “melting point” (Tm), é a
O DNA no núcleo:
• Um cromossoma : uma molécula de DNA
• Genoma: o conjunto de cromossomas de uma dada espécie • Genoma Humano: 46 cromossomas
• 22 CROMOSSOMAS AUTOSSÔMICOS (x2) • 2 CROMOSSOMAS SEXUAIS
• Total: 6 x 109 pares de nucleotídeos
Cada célula tem aproximadamente 2 metros de DNA, se esse fosse desenrolado. O núcleo tem apenas 6 mm.
Primeiro nível de compactação: . nucleossomos
Segundo nível de compactação: Histona H1
As histonas são proteínas altamente conservadas. Histona H4 – 102 amino ácidos:
H1, H2A, H2B, H3 e H4 em interação com o DNA
142 pontes de H são formadas entre DNA e o cerne das histonas, em cada nucleossomo.
A maioria entre o “backbone” de amino ácidos das histonas e o “backbone”
DNA de procariotas tem cerca de 1mm.
Têm que ser compactados para se acomodarem na célula.
A associação com poliaminas carregadas positivamente reduz a repulsão entre moléculas de DNA, facilitando a compactação:
Proteínas interagem com o DNA, exercendo papel
semelhante aos das histonas. A mais abundante destas
proteínas é a H-NS.
DNA POLIMERASES
POLIMERIZAÇÃO: 5’---> 3’
• Todas as DNA-POLIMERASES requerem para
seu funcionamento:
– Molécula de DNA - molde
– “Primer” de oligonucleotídeo
– Magnésio
Incorporação de um nucleotídeo na cadeia
DNA-polimerase
DNA polimerases têm dois sítios catalíticos: . Sítio de polimerização: Polimerase 5’3
. Sítio de remoção: Exonuclease 3’5'
A necessidade de que a duplicação se faça com alta fidelidade requer uma
Mecanismo hipotético: incompatível com o processo de correção
Mecanismo
real
O SENTIDO DA VIDA É ....
Origem de replicação em bactérias:
Uma seqüência específica de DNA, com algumas centenas de pares de bases, rica em AT.
Na origem forma-se o
complexo de replicação (RC) na fase G1.
Duplicação de um DNA circular
Bactérias
Plasmídeos
Duplicação do DNA Em eucariotos
As origens de replicação são elementos do DNA aos quais se ligam ORCs (origin replication
complex)
Janela de oportunidade: fim em G1
proteínas específicas se ligam aos ORCs (pre-RC) [Leveduras: Cdc6p e RLFs (MCM)]
Proteínas cinases dependente de ciclinas (ciclinas B-CDK) agem no pré-RC
Ciclinas B acumulam-se na célula
imediatamente antes da fase S e fosforilam proteínas do pré-RC
pré-RC fosforilado pós-RC Inicia-se a fase S
Pós-RCs não são capazes de reiniciar a replicação do DNA
O Processo de replicação só será possível quando as células filhas passarem novamente pelo mesmo processo.
Cada cromossomo tem aproximadamente 150 milhões de pares de nucleotídeos. Numa velocidade de 50 nts/s, levaria cerca de 800 horas para replicar um
cromossomo.
Em cada cromossomo, 20 a 80 origens são ativadas para que o DNA seja replicado em tempo hábil.
O intervalo entre as origens de replicação varia entre 30.000 a 300.000 pares de nucleotídeos.
No local de replicação forma-se uma bolha, que vai se abrindo em ambas as direções.
A fita nova é iniciada pelo
complexo PRIMASE+DNA-pol a que sintetiza um primer de RNA
A polimerização se faz obrigatoriamente na direção 5’3'
Fragmentos de Okazaki na fita de síntese
Fazem parte do complexo de replicação além das polimerases:
Girase e Helicase (abrem as fitas)
Proteínas que se ligam no DNA quando em fita única RPA (replication protein A)
RFC (replication factor C) – (Clamp Loader)
• Atua na substituição do complexo primase/DNA-pol a
pela polimerase que irá estender a fita por distâncias maiores (Pol e ou Pol d) • Carrega a PCNA para o local
PCNA (proliferating cell nuclear antigen)
(Sliding clamp)
• PCNA funciona como um anel que circunda o DNA e prende a DNA-polimerase no local, aumentando sua processividade
Figure 5-18b Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
PCNA
RFC
Estas proteínas são importantes para
manutenção da estabilidade cromossômica porque participam também do reparo do DNA e soluções dos problemas de quebra na
fita durante a replicação (stalled replication forks)
Um “fork” de replicação de mamífero.
Primers: 7-9 RIBOnucleotídeos estendidos depois até ~30 nts pela DNA polimerase a Na “lagging-strand”, os “primers” são sintetizados a cada 100 a 200 nucleotídeos.
Velocidade de polimerização: Procariota: 500 a 1000 nucleotídeos/segundo Eucariota: 50 nucleotídeos/segundo DNA helicase: à medida que se move ao longo do DNA, hidrolisa ATP e separa as fitas, numa velocidade de ~ 1000 nt/s
Figure 5-23 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Maturação dos fragmentos de Okazaki
Cerca de 50 milhões de Fragmentos de Okazaki são gerados a cada duplicação do DNA em células de mamíferos
Sempre auxiliadas por PCNA as seguintes enzimas participam da maturação dos fragmentos de Okazaki:
• Rnase H/FEN1: degrada os segmento RNA do segmento alfa
• FEN1: cliva o segmento que é deslocado pela DNA polimerase d (se pequeno)
• DNA2/RPA: cliva o segmento deslocado, se este é longo
FEN1 – metilada: cliva o segmento
FEN1 – fosforilada: desprende-se do complexo Ligase I : fecha a interrupção na fita (nick)
3’ 5’ 3’ 5’ Fitas parentais nova nova Primers de RNA 3’ 5’ +
Digestão dos primers por RNases 3’ 5’ 3’ 5’ + Falha na extremidade (primer gap)
Sequências repetidas dos telômeros (TTAGGG)
Telomerase velha
velha
velha
Preenchido pela DNA-polimerase
Primase DNA-polimerase Digestão do primer por RNases nova Falha na extremidade (primer gap)
* * * *
* * * *
Estrutura da
telomerase
Telomerase é uma transcriptase reversa: uma classe de DNA
polimerases que sintetiza DNA a partir de uma “template” de RNA.
Em humanos, a seqüência GGGTTA é adicionada pela telomerase, se estendendo por cerca de 10.000 nucleotídeos.
A extremidade do telômero adquire uma estrutura especial (alça T)
Ausência de Rtel1 leva a
instabilidade genômica com fusões de cromossomos.
Os telômeros têm a cromatina altamente condensada.
A maquinaria de replicação desloca o DNA das histonas. Ambas as fitas de DNA herdam histonas velhas. H2A e H2B velhas se juntam com H3 e H4 novas.
H3 e H4 velhas se juntam com H2A e H2B novas.
mRNAs de histonas aumentam cerca de 50 vezes durante a replicação, e em seguida são rapidamente degradados.