MÉTODOS 3.4. Alterações da Sinalização Celular em Diferentes Modelos Celulares para DH Cultura Celular de Linfoblastos de Pacientes com DH

MÉTODOS

0,1 M) com 1 % de Albumina Bovina (BSA, Sigma, St. Louis, MO, USA) e testada em diversas concentrações (1:250, 1:400, 1:500 e 1:1000). O tempo de incubação testados foram de 1, 4 horas e overnight sempre à temperatura ambiente. Em decorrência dos testes, estabeleceu-se que a concentração ideal era a de 1:250, sendo o tempo de incubação de 4 horas à temperatura ambiente. Dessa forma, a fluorescência se manteve estável, com baixo background e ótima razão sinal/ ruído.

Após as padronizações, os cortes cerebrais foram realizados com os cérebros dos animais R6/1 de 9 meses de idade (n = 3 por grupo) para, então, serem incubados com o anticorpo anti-GFAP (1:250, 4 horas). Os cortes também foram incubados com DAPI (1:400 em PBS 0,1 M e 0,01 % Saponina), por 30 minutos a 4 ºC. Por fim, as lâminas foram passadas em H2O MiliQ e montadas com o auxílio de Fluoromont (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA) e lamínulas de 13 mm. Os cortes cerebrais foram visualizados no Microscópio Confocal LSM 510 com as objetivas de 10x e 40x e excitados com o laser de Argônio (488 nm). Os filtros usados foram HFT 488 e LP 505, de excitação e emissão, respectivamente. As análises foram realizadas por meio da ferramenta ROI levando-se em consideração as diferentes regiões cerebrais (E.; C.C.; C.). Os resultados da intensidade de fluorescência obtida de cada grupo foram locados em forma de histograma (média ± desvio padrão).

3.4. Alterações da Sinalização Celular em Diferentes Modelos Celulares para DH 3.4.1. Cultura Celular de Linfoblastos de Pacientes com DH

Visando o estudo da homeostase de Ca2+ e a da morte celular por autofagia em modelos celulares da DH, foi realizada, primeiramente, a cultura de linfoblastos imortalizados de pacientes com DH. Os tipos celulares usados foram: I) células da linhagem B, proveniente de indivíduos controle; II) células da linhagem A, proveniente de pacientes heterozigotos para a DH; III) células da linhagem E, proveniente de pacientes homozigotos para a DH. Para isso, as células foram mantidas em cultura, separadamente, em frascos de 75 cm² em suspensão, à 37 ºC e 5 % de CO2. O meio de cultura foi composto por RPMI 1640 (GIBCO, St. Louis, MO, USA), 10 % (linhagens B e A) ou 20 % (linhagem E) de soro fetal bovino (SFB), 1 % de L-Glutamina (GIBCO, St. Louis, MO, USA) e 1 % de Penicilina/ Streptomicina (GIBCO, St. Louis, MO, USA).

Após o descongelamento das células de linhagem, o concentrado celular (5 milhões de células) foi centrifugado por 2 minutos a 300 rpm na presença de 4 ml de

MÉTODOS

meio a 20 % de SFB. Em seguida, o sobrenadante foi descartado e o precipitado (1 ml) ressuspendido em 2 ml de meio a 20 %. Todo o conteúdo foi transferido para um frasco de cultura celular de 25 cm2, onde foram adicionados outros 2 ml de meio a 20 % após 24 horas. Depois desse período, a suspensão de células foi transferida e mantida em frascos de 75 cm2. A cada 3 dias 5 ml de meio a 10 ou 20 % de SFB eram adicionados até o total de 30 ml. A concentração de células nos frascos de 75 cm2 variou entre 50 e 70x104 células/ ml. Porém, para não haver um excesso de células, parte do homogenato (meio + células) era descartado e substituído por igual volume de volume de meio. Esse procedimento foi repetido por algumas vezes por 2 meses, quando as células eram descartadas e um novo lote celular era descongelado.

3.4.2. Construção dos plasmídeos e inserção da mhtt em células MEFs

Um outro modelo celular utilizado foi o de fibroblastos embrionários de camundongos (MEF, mice embrionic fibroblasts) infectados com a proteína mhtt. Esse modelo foi obtido por meio da inserção do fragmento gama 2 (γ2) da mhtt, que caracteriza-se por apresentar 82-85 repetições CAG e 372 pares de base na concentração inicial de 0,395 µg/ µl. Os MEFs contendo a mhtt eram de dois tipos: a) MEFs expressando regularmente a proteína transglutaminase 2 (TG2) e b) MEFs knock-out para a TG2. Para a inserção deste fragmento nas células MEFs, foi necessária a inserção do fragmento γ2 em um plasmídeo viral, o pLPCX (Figura 10). Para isso, foi realizada a digestão do próprio pLPCX (na concentração final de 5 µg) pelas enzimas ECO RI e a Bgl II, de acordo com o mapa de restrição.

MÉTODOS

Figura 10 - Figura representativa do vetor viral pLPCX utilizado em nossos experimentos para a expressão da huntintina mutante (mhtt). Estão representados os sítios de restrição das enzimas ECO RI e a Bgl II, assim como o gene de resistência a Puromicina (Puro), gene de seleção em células eucarióticas.

Pelo protocolo utilizado, metade da concentração do plasmídeo foi incubada separadamente com cada uma das enzimas por 2 horas a 37 °C e um gel de agarose a 1 % foi realizado para a confirmação da digestão. Em seguida, o plasmídeo foi purificado por meio de etapas envolvendo a adição de fenolclorofórmio, sódio acetato 3 M, glicogênio (10 µg/ µl), etanol 100 % e etanol 70 % juntamente como uma série de centrifugações. No final, o precipitado, contendo o DNA plasmideal, foi ressuspendido com T.E.. Após o processo de purificação, o pLPCX foi submetido a uma nova digestão. Contudo, desta vez, esta foi realizada utilizando-se os plasmídeos provenientes das duas digestões anteriores (ECO RI + Bgl II), com a finalidade de que o DNA não específico, contido no plasmídeo pLPCX fosse eliminado. Um gel de agarose a 1 % foi realizado e as bandas da digestão foram visualizadas por meio de um transiluminador. Posteriormente, elas foram cortadas com auxílio de lâminas e o pedaço retirado contendo o DNA plasmideal submetido à diálise. Com esse procedimento, o DNA que estava no gel migrou para a solução de diálise, sendo recuperado e ressuspendido em T.E. (MILLER & ROSMAN, 1989; COFFIN & VARMUS, 1996).

Paralelamente a digestão do pLPCX, foi realizada a digestão do plasmídeo contendo o fragmento γ2, na concentração de 1 µg e, posteriormente, 10 µg. As enzimas utilizadas foram ECO RI e Bam HI, conforme seus mapas de restrição. Um gel de agarose a 0,8 % foi realizado para a confirmação da reação. Em seguida, um outro gel (2 %) foi realizado para que a banda referente ao γ2 após digestão (DNA aberto) fosse visualizada pelo transiluminador e o DNA pudesse ser retirado para diálise.

A terceira etapa consistiu em unir o DNA do vetor viral plasmideal ao DNA do γ2. Para isso foram realizadas duas reações separadamente, pLPCX+γ2 e somente pLPCX (vetor vazio), por meio da utilização da enzima T4 DNA ligase. Após 1 hora, a temperatura ambiente, o DNA foi precipitado com sódio acetato 3M, glicogênio (10 µg/ µl), etanol 100 % e etanol 70 %, sendo o precipitado final ressuspendido com H20d. O plasmídeo contendo a mhtt foi então inserido em bactérias por meio da eletroporação e a suspensão transferida para placas de Petri com ágar. Cada colônia de bactéria

MÉTODOS

escolhida foi submetida à reação de mini-prep onde, cada amostra, foi transferida para um tubo contendo meio LB e Ampicilina (1 µl/ ml). A Ampicilina foi utilizada porque o pLPCX possui o gene de resistência a ela. Após o mini-prep, as amostras foram seqüenciadas (para verificar a inserção do γ2 no pLPCX) e, as amostras selecionadas, submetidas ao maxi-prep e posterior medição da concentração de DNA (0,374 µg/ µl). A seqüência da mhtt foI unida a uma seqüência de envelope viral e transferidas para células 293 para sua amplificação para, por fim, poderem infectar as células MEFs.

3.4.3. Cultura de Células MEFs

As culturas de células MEFs foram obtidas de camundongos normais (MEFs +/+) e de camundongos knock-out (MEFs -/-) para a proteína transglutaminase 2 (TG2) infectadas, ou não, com a mhtt. Assim, os grupos utilizados ficaram como se segue: I) MEFs +/+; II) MEFs -/-; III) MEFs +/+ γ2 (células MEFs com TG2 e γ2); IV) MEFs -/- γ2 (células MEFs sem TG2 e com γ2). Estas linhagens celulares, aderentes, foram cultivadas em frascos de 75 cm², separadamente, e mantidas em estufa à 37 ºC e 5 % de CO2. O meio utilizado foi composto por DMEN F12 com Glutamax (GIBCO, St. Louis, MO, USA), 10 % de soro fetal bovino (SFB) e 1 % de Penicilina/ Streptomicina (GIBCO, St. Louis, MO, USA). Após o descongelamento, o concentrado celular, equivalente a 1/3 de células de um frasco de 75 cm2 confluente, foi transferido para um frasco de cultura celular de 25 cm2, onde foram adicionados 4 ml de meio a 10 % de SFB. Quando as células se tornaram confluentes, elas foram transferidas para frascos de 75 cm2. Contudo, uma vez que as células MEFs +/+ possuem um ritmo de crescimento diferenciado em relação as MEFs -/-, durante as passagens consecutivas, as células foram plaqueadas em diferentes proporções: as positivas na razão 1:3, ou seja, 1/3 de célula provenientes do frasco de células “mãe”, enquanto que as células negativas na razão 1:6. A cada 2 dias, o meio foi trocado.

A retirada das células dos frascos de 25 ou 75 cm2 foi realizada pela tripsinização. Por esse processo, o meio foi retirado, o frasco lavado com D-PBS (GIBCO, St. Louis, MO, USA) para, em seguida ser adicionada à tripsina (EDTA 0,05 % 0,02 % PBS) (GIBCO, St. Louis, MO, USA). Após 2 minutos a 37 ºC, a enzima foi inativada com meio de cultura. O volume final (células, tripsina e meio) foi, então, dividido de acordo com a proporção de células a serem re-plaqueadas, 1:3 ou 1:6.

MÉTODOS

3.4.4. Medidas da Sinalização de Ca2+

Foram avaliadas as alterações da homeostase de Ca2+ nos linfoblastos e nos diferentes tipos de MEFs. Para os linfoblastos foi utilizado o equivalente a 106 células ressuspendidos em 2 ml de Tampão de Fluorescência contendo (mM): CaCl2 1,5, NaCl 130, KCl 5,6, MgSO4 0,8, Na2HPO4 1,0, Glicose 25, HEPES 2, NaHCO3 2,5 e pH 7,3. Foi adicionado, então, Fura-2-AM (2 µM) e 4 µl de Pluronic F127 20 %, com os quais as células permaneceram por 45 minutos a temperatura ambiente. Após a incubação com Fura-2-AM, a suspensão de células foi centrifugada por 5 minutos a 2700 rpm e o precipitado ressuspendido em Tampão de Fluorescência. As células foram transferidas para uma cubeta de quartzo e os registros da fluorescência realizados em um espectrofluorímetro Perkin Elmer (Luminescence Spectrometer LS50B, USA).

Para avaliar as alterações da homeostase de Ca2+ nos diferentes grupos de células MEFs, os frascos de 75 cm2, já confluentes, foram tripsinizados como citado anteriormente. O precipitado obtido após centrifugação foi ressuspendido em Tampão de Fluorescência acrescentado de Fura-2-AM (1,5 µM) e 3 µl de Pluronic F127 20 % e incubados por 45 minutos a temperatura ambiente. Depois da incubação, o conteúdo celular foi centrifugado com por 5 minutos a 2700 rpm e, o precipitado, ressuspendido em Tampão de Fluorescência. As células foram transferidas para uma cubeta de quartzo e os registros da fluorescência realizados em um espectrofluorímetro Perkin Elmer (Luminescence Spectrometer LS50B, USA).

A homeostase Ca2+ foi avaliada na presença e ausência do desacoplador mitocondrial FCCP (8 µM) e da Tapsigargina (2 µM). Ao final de cada experimento, foram adicionados Digitonina (5 mM) e Manganês (MnCl2, 0,2 M) para obtenção das razões máxima e mínima de Fluorescência, respectivamente. Após a obtenção dos dados, que são apresentados em forma de Fluorescência versus tempo, os valores foram normalizados com o programa Kaleida Graph. O resultado final foi locado em forma de histograma (média ± desvio padrão).

3.4.5. Citometria de Fluxo (FACS)

Para a marcação da autofagia nos modelos celulares da DH, foi feita a citometria de fluxo com o indicador fluorescente Acridine Orange (AO, Molecular Probes/ Invitrogen, Frederick, Marylan, USA). A AO é um fluoróforo que, uma vez no interior de

MÉTODOS

grânulos ácidos, se torna protonado e permanece retido em seu interior até que haja uma alcalinização do sistema.

Para a realização dos experimentos, os linfoblastos foram cultivados em frascos de 25 cm2, um ou dois dias antes do início dos tratamentos, na concentração de 6x104 células/ ml, enquanto que as células MEFs foram plaqueadas normalmente em frascos de 75 cm2. Os tratamentos para a indução do processo autofágico consistiram de Rapamicina (RAP, 1 µM, 96 horas), Starvation (STR, 24 horas) e um tratamento simultâneo de 3-metiladenina (3-MA, 10mM) com RAP ou STR. A RAP induz autofagia por meio da inibição da proteína mTOR, que por sua vez inibe a autofagia; a STR, por outro lado, consiste na indução da autofagia por ausência de substratos celulares que ativam vias de sinalização ainda não muito claras. Apesar disso, a STR é considerada como uma indutora clássica do processo autofágico. No processo de STR, as células devem ficar submetidas a uma restrição nutricional, que é conseguida por substituição do meio normal de cultura por um meio sem aminoácidos essenciais, como o EBSS (GIBCO, St. Louis, MO, USA). A 3-MA é uma inibidora da classe III da fosfatidiol-inositol quinase, uma das proteínas envolvidas na via de sinalização da autofagia e, também, inibidora da formação do autofagossomo.

No dia do experimento, após o término do tratamento, os linfoblastos foram homogeneizados com pipetas e apenas 1 ml do homogenato foi centrifugado por 5 minutos a 1300 rpm. O sobrenadante foi retirado, o precipitado ressuspendido com PBS e novamente centrifugado. Para os experimentos com as células MEFs, após a tripsinização, estas foram lavadas com D-PBS e, também, centrifugadas. Em ambos os casos, o precipitado final foi ressuspendido com o AO (100 µg/ ml), previamente diluído em PBS. Após 20 a 40 minutos as amostras puderam ser lidas no FACS.

Uma outra abordagem do estudo da morte celular em ambos os modelos para a DH foi a contagem de células apoptóticas por meio da coloração com o Iodeto de Propídeo (PI) e a identificação da fase do ciclo celular no qual essas células se encontravam. Assim, as células (linfoblastos ou MEFs) após serem retiradas de seus frascos (como citado anteriormente), foram centrifugadas por 8 minutos a 1400 rpm e ressuspendidas com PBS. O precipitado foi fixado com uma solução Metanol/ Acetona (4:1) na presença de igual volume de PBS. As células foram passadas em vortex por 30 segundos e conservadas a 4 °C. No dia do experimento, as células já fixadas foram lavadas com PBS e centrifugadas novamente. O precipitado foi incubado com PBS

MÉTODOS

RNAse (100 µg/ ml) por 20 minutos a temperatura ambiente onde, em seguida, foi adicionado PI (1 mg/ ml) por 20 minutos.

A detecção da fluorescência emitida pelo AO e pelo PI foi realizada pelo Citômetro de Fluxo (FACScalibur, BD, New Jersey, USA). Desta forma, foi possível identificar a fluorescência. O programa utilizado foi o Cell Quest e o resultado final de todos os experimentos foi apresentado em forma de histograma (média ± desvio padrão).

3.5. Análise Estatística

A análise estatística foi realizada com o Teste T de Student e o One-Way ANOVA, seguido do teste de Duncan. Foi utilizado, também, o ANOVA de duas vias. A probabilidade de p<0,05 foi considerada significantemente diferente para todas as comparações realizadas.

3.6. Materiais

Fura-2-AM, MitoTracker Red (MTR), MitoTracker Green (MTG) Pluronic F127 20 %, anti-GFAP, anti-NMDA 2B, Alexa Flúor 488, foram adquiridos da Molecular Probes (Eugene, OR, USA; Frederick, Marylan, USA). Da Sigma (St. Louis, MO, USA) foram utilizados: Carbonilcianeto-p-trifluorometoxifenilhidrazona (FCCP), Succinato desidrogenase (SDH), Gelatina/ Glicerina, Nitro blue tetrazolium, Diamino benzidina (DAB), Rapamicina, 3-metiladenina (3-MA), Acridine Orange e Iodeto de Propídeo (PI). Os reagentes relacionados com o cultivo de células como, Meio DMEN F12 com Glutamax, Meio RPMI 1640, soro fetal bovino (SFB), L-Glutamina e Penicilina/ Streptomicina, assim como, D-PBS, tripsina (EDTA 0,05 % 0,02 % PBS) e meio EBSS foram obtidos da GIBCO/ Invitrogen (St. Louis, MO, USA). Fluoromont e Paraformaldeído 20 % foram adquiridos da Electron Microscopy Sciences (Hatfield, PA, USA).

RESULTADOS

4. Resultados

4.1. Controle genético dos animais transgênicos por PCR

Em cada amostra retirada dos animais foi realizada a extração do DNA conforme descrito anteriormente (seção Métodos). Após o PCR, foi realizada uma eletroforese em gel de agarose 3 %, utilizando-se azul de bromofenol (Figura 11). As elipses brancas nas amostras 46.0, 46.1, 47.0, 47.1 e 47.3 correspondem aos DNAs que carregam o gene da DH (banda de ≅ 80 pb). As amostras C57 (obtidas de camundongos C57black), e p20 (obtidas de camundongo R6/1) foram utilizadas como controles negativos.

Figura 11 - Eletroforese em gel de agarose das amostras obtidas de camundongos C57 e R6/1. As elipses brancas correspondem aos DNAs que carregam o gene da DH (banda de ≅ 80 pb). As amostras C57 e p20 foram utilizadas como controles negativos.

4.2. Alterações da Sinalização Celular em fatias cerebrais de camundongos 4.2.1. Medidas da Sinalização de Ca2+

4.2.1.1. Medidas da Sinalização Ca2+ em B6CBA/F1 e R6/1 com diferentes idades A primeira etapa desse trabalho foi a investigação da homeostase do Ca2+ em fatias cerebrais de camundongos B6CBA/ F1 e R6/1 com diferentes idades. As fatias foram obtidas e incorporadas com indicador para medidas de Ca2+ conforme descrito anteriormente (seção Métodos). Na Figura 12 estão representadas fatias cerebrais de camundongos R6/1 de 9 meses, incorporadas com Fura-2 e visualizadas por meio de microscopia de fluorescência de alta resolução. A adição de Glu (1 mM) promove um aumento de Ca2+ em forma de onda, que inicia no estriado. A Figura 12A mostra o efeito do Glu em animais R6/1 controles enquanto que a Figura 12B representa o efeito do Glu em animais R6/1 transgênicos.

C57 p20 46.0 46.1 46.2 46.3 47.0 47.1 47.2 47.3 C57 p20 46.0 46.1 46.2 46.3 47.0 47.1 47.2 47.3 C57 p20 46.0 46.1 46.2 46.3 47.0 47.1 47.2 47.3 C57 p20 46.0 46.1 46.2 46.3 47.0 47.1 47.2 47.3

RESULTADOS

Figura 12 - Fatias cerebrais (200 µm) de camundongos R6/1 incubadas com Fura-2-AM (10 µM) por 2 horas (E.: estriado, C.C.: corpo caloso, C.: córtex). Fatias cerebrais de animais R6/1 controle (A) e transgênico (B), no momento 0 e após 5, 10 e 15 minutos da adição de Glu (1mM). Coloração obtida por meio do programa Spectralyzer, Overlay 340/380. A escala de

0 255 C.C. C.C. C. C. E. E. B) C.C. C.C. C. C. B) tempo 0 5 minutos E. E. C.C. C.C. C. C. E. E. B) C.C. C.C. C. C. B) tempo 0 5 minutos E. E. tempo 0 10 minutos 5 minutos 15 minutos C.C. C.C. C. C. E. E. A) tempo 0 10 minutos 5 minutos 15 minutos C.C. C.C. C. C. E. E. A) 10 minutos 15 minutos 10 minutos 15 minutos

RESULTADOS

pseudo-cores indica a intensidade da fluorescência (0-255). Imagens obtidas por meio do microscópio de alta resolução com câmera CCD. Objetiva de 10x.

A Figura 13 mostra o efeito do KCl e do Glu sobre as variações da fluorescência do Fura-2 que refletem as flutuações do Ca2+. A análise estatística por ANOVA de duas vias revelou que entre o grupo animal [F (2,27) = 15,37 ; p<0,05)] e a idade [F (2,27) = 2,65 ; p>0,05)] não houve interação [F (4,27) = 0,53 ; p>0,05)] após a adição de KCl (200mM) (Figura 13A). A análise post-hoc mostrou que houve uma diminuição do Ca2+ nos animais R6/1 em relação aos B6CBA/ F1, sendo que esta foi significante apenas nos animais de 9 meses (*p<0,05). A análise por ANOVA de duas vias também revelou que entre o grupo animal [F (2,36) = 9,59 ; p<0,05)] e a idade [F (2,36) = 2,60, p>0,05)] não houve interação [F (4,36) = 1,51 ; p>0,05)] na presença de Glu (1mM) (Figura 13B). A análise post-hoc revelou que houve uma diminuição do Ca2+ de forma significante nos animais R6/1 de 9 meses em relação aos B6CBA/ F1 (*p<0,05). No entanto, um outro dado importante é o aumento significante do Ca2+ nos transgênicos em relação aos controles na idade de 9 meses (@p<0,05).

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3

3 meses 6 meses 9 meses

R a z ã o d e F lu o re s c ê n c ia (3 4 0 / 3 8 0 n m ) B) 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3

3 meses 6 meses 9 meses

R a z ã o d e F lu o re s c ê n c ia (3 4 0 / 3 8 0 n m ) B)

*

*

3 meses 6 meses 9 meses

R a z ã o d e F lu o re s c ê n c ia ( 3 4 0 / 3 8 0 n m ) A) 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

3 meses 6 meses 9 meses

R a z ã o d e F lu o re s c ê n c ia ( 3 4 0 / 3 8 0 n m ) A)

* *

*

RESULTADOS

Figura 13 - Histograma representativo do aumento do Ca2+ _{(valores máximos da razão de}

fluorescência normalizada) em fatias cerebrais de camundongos B6CBA/ F1 e R6/1 (controles e transgênicos) com 3, 6 e 9 meses de idade, estimuladas com KCl (200 mM) (A) e Glu (1 mM) (B). Dados expressos como média ± desvio padrão de quatro (KCl) ou cinco (Glu) experimentos diferentes. ANOVA de duas vias seguido do teste de Duncan - *p<0,05 em relação aos animais B6CBA/ F1 de mesma idade; @p<0,05 em relação aos animais controle de mesma idade.

O t1/2 foi outro parâmetro investigado entre camundongos B6CBA/ F1 e R6/1 (Figura 14). A análise por ANOVA de duas vias revelou que entre o grupo animal [F (2, 27) = 4,19 ; p<0,05)] e a idade [F (2, 27) = 4,67 ; p<0,05)] na presença de KCl (200 mM) não houve interação [F (4, 27) = 4,75 ; p>0,05)] (Figura 14A). A análise post-hoc revelou que não houve diferença significante entre todos os grupos nas diferentes idades (p>0.05). Por outro lado, pelo ANOVA de duas vias revelou que entre o grupo animal [F (2, 36) = 4,51 ; p<0,05)] e a idade [F (2, 36) = 8,1 ; p<0,05)] não houve interação [F (4, 36) = 1,50 ; p>0,05)] na presença de Glu (1 mM) (Figura 14B). O post-hoc revelou que, com o Glu, os animais controle apresentaram um t1/2 menor que os transgênicos e que os camundongos B6CBA/ F1 (@p<0,05) aos 3 meses de idade.

T e m p o (s ) 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 B) T e m p o (s ) 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 B)

*

3 meses 6 meses 9 meses

T e m p o ( s ) A) 0 200 400 600 800 1000 1200 1400

3 meses 6 meses 9 meses

T e m p o ( s ) A)

B6CBA/ F1 R6/1 controles R6/1 transgênicos B6CBA/ F1 R6/1 controles R6/1 transgênicos

RESULTADOS

Figura 14 - Histograma representativo do t1/2 em fatias de cérebro de camundongos B6CBA/ F1 e R6/1 (controles e transgênicos) com 3, 6 e 9 meses de idade estimuladas com KCl (200 mM) (A) e Glu (1 mM) (B). Dados expressos como média ± desvio padrão de quatro (KCl) ou cinco (Glu) experimentos diferentes. ANOVA de duas vias seguido do teste de Duncan -

@

p<0,05 em relação aos controles de mesma idade.

4.2.1.2. Medidas da Sinalização Ca2+ em R6/1 com 9 meses

Devido aos animais B6CBA/ F1 apresentarem, sistematicamente, níveis de Ca2+ mais elevados que os animais R6/1 em todas as idades analisadas, as etapas seguintes da verificação das medidas de Ca2+ passaram a ser realizadas somente em animais R6/1. Com isso, buscou-se analisar as diferenças das respostas de Ca2+ devido à presença do transgene da DH. Os estudos ficaram restritos, ainda, a animais de 9 meses pelo fato de que somente com essa idade os animais transgênicos apresentaram uma diferença significante do Ca2+ em comparação com os controles.A análise por ANOVA de duas vias revelou que entre o grupo animal [F (1, 20) = 2,39 ; p>0,05)] e o estímulo (droga) [F (3,20) = 3,69 ; p<0,05)] não houve interação [F (3, 20) = 0,28 ; p>0,05)] (Figura 15). O teste post-hoc revelou que embora os transgênicos tenham apresentado um aumento significante do Ca2+ após Glu (1 mM) em meio normal (*p<0,05) em relação aos controles, não houvediferenças entre os grupos com os demais tratamentos. Por outro lado, entre os diferentes estímulos houve um aumento significante do Ca2+ nos camundongos controles estimulados com FCCP em relação aos estimulados com Glu, Glu em meio zero Ca2+ e Tapsigargina (#p<0,05).

B6CBA/ F1 R6/1 controles R6/1 transgênicos B6CBA/ F1 R6/1 controles R6/1 transgênicos

R a z ã o d e F lu o re s c ê n c ia (3 4 0 / 3 8 0 n m ) A) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 Glutamato Zero Ca2+ Glutamato FCCP Tapsigargina R a z ã o d e F lu o re s c ê n c ia (3 4 0 / 3 8 0 n m ) A) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 Glutamato Zero Ca2+ Glutamato FCCP Tapsigargina

*

RESULTADOS

Figura 15 - Histograma representativo do aumento do Ca2+ (valores máximos da razão de fluorescência normalizada) de camundongos R6/1 com 9 meses de idade estimulados com Glu (1 mM) em meio normal, Glu (1mM) em meio zero Ca2+, FCCP (50 µM) e Tapsigargina (10 µM). Dados expressos como média ± desvio padrão de cinco (Glu) ou três diferentes experimentos. ANOVA de duas vias seguido do Test T de Student ou Duncan - *p<0,05 em relação aos controles submetidos ao mesmo estímulo; #_{p<0,05 em relação aos demais tratamentos do}

mesmo grupo animal.

Na Figura 16 podemos observar o t1/2 dos efeitos do Glu em meio normal e zero Ca2+, do FCCP e da Tapsigargina. A estatística por ANOVA de duas vias revelou que entre o grupo animal [F (1, 20) = 0,11 ; p>0,05)] e o estímulo (droga) [F (3,20) = 8,7; p<0,05)] não houve interação [F (3, 20) = 2,32 ; p>0,05)]. A análise post-hoc mostrou que não houve diferença significante entre controles e transgênicos em nenhum dos tratamentos (p>0,05). Porém, quando o t1/2 foi comparado entre os diferentes estímulos, houve uma diminuição significante do t1/2 do Glu em meio normal em relação ao Glu em meio zero Ca2+ e à Tapsigargina (+p<0,05)> Houve uma diminuição significante do t1/2 do FCCP em relação a da Tapsigargina (#p<0,05).

Figura 16 - Histograma representativo do t1/2 em fatias cerebrais de camundongos R6/1 com 9 meses de idade estimuladas com Glu (1 mM) em meio normal e zero Ca2+, FCCP (50 µM) e Tapsigargina (10 µM). Dados expressos como média ± desvio padrão de cinco (Glu) ou três diferentes experimentos. ANOVA de duas vias seguido do Test T de Student ou Duncan -

+

p<0,05 em relação ao estímulo com Glu do mesmo grupo animal; #p<0,05 em relação ao tratamento com FCCP do mesmo grupo animal.

R6/1 controles R6/1 transgênicos R6/1 controles R6/1 transgênicos 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 T e m p o (s ) Glutamato Zero Ca2+ Glutamato FCCP Tapsigargina B) + + + # # #

RESULTADOS

O efeito do Glu foi também investigado na presença de FCCP e Tapsigargina (Figura 17). A análise por ANOVA de duas vias revelou que entre o grupo animal [F (1, 8) = 3,89 ; p>0,05)] e o estímulo (droga) [F (1,8) = 9,62 ; p<0,05)] não houve interação [F (1, 8) = 0,54 ; p>0,05)]. Pelo post-hoc mostrou que na presença do FCCP, o Glu foi capaz de aumentar a porcentagem de Ca2+ de forma significante (*p<0,05) nos animais transgênicos em comparação com os controles. Apesar do aumento do Ca2+ ter ocorrido também na presença de Tapsigargina, a diferença entre os grupos não foi significante (p>0,05). Entretanto, o efeito do Glu após Tapsigargina foi significantemente maior do que o efeito após o FCCP (#p<0,05) nos animais controles.

Figura 17 - Histograma representativo da porcentagem de aumento do Ca2+ induzido pelo Glu (1 mM) na presença de FCCP (50 µM) ou Tapsigargina (10 µM) em fatias cerebrais de camundongos R6/1 com 9 meses de idade. Dados expressos como média ± desvio padrão de três diferentes experimentos. ANOVA de duas vias seguido do Test T de Student - *p<0,05 em relação ao controle submetido ao mesmo estímulo; #p<0,05 em relação ao R6/1 controle na presença de FCCP.

4.2.2. Análise do Receptor Ionotrópico Glutamatérgico NMDA (2B)

A Figura 18 mostra o padrão de marcação do anticorpo anti-NMDA 2B nas fatias cerebrais de animais R6/1. Na Figura 18A estão representados vários planos focais em eixo ‘z’. Para a análise quantitativa da imunofluorescência, foi escolhida uma fatia (um plano focal z) central. Por meio da ferramenta ROI, a fluorescência do plano focal selecionado foi extraída, normalizada e locada em forma de histograma. As Figuras

R6/1 controles R6/1 transgênicos R6/1 controles R6/1 transgênicos FCCP + Glutamato Tapsigargina + Glutamato 0 5 10 15 20 25 30 A u m e n to d a F lu o re s c ê n c ia ( % ) FCCP + Glutamato Tapsigargina + Glutamato 0 5 10 15 20 25 30 A u m e n to d a F lu o re s c ê n c ia ( % )

*

RESULTADOS

18B e C mostram todas as imagens da Figura 18A em sobreposição (objetiva de 10x e 40x, respectivamente). A Figura 18D é uma sobreposição de imagens de diferentes planos ‘z ‘ do hipocampo (objetiva 10x), para mostrar o padrão de marcação em outra região cerebral.

Figura 18 – Padrão de marcação das fatias cerebrais (20 µm) de camundongos R6/1 incubadas com anticorpo primário anti-NMDA 2B (1:250) por 1 hora (E.: estriado, C.C.: corpo caloso, C.: córtex; Hip.: hipocampo). (A) Imagens visualizadas e obtidas de uma fatia cerebral em vários planos ‘z’ (objetiva 10x) por meio no Microscópio Confocal LSM 510. Em cada uma das imagens está representado um plano focal (µm) a partir da superfície inferior do corte. O círculo vermelho representa a imagem central; (B) e (C) Imagens da sobreposição das imagens da Figura A com a objetiva de 10x e 40x, respectivamente; (D) Imagem da sobreposição obtida de diversos planos focais do hipocampo com a objetiva de 10x. As sobreposições foram obtidas por meio de uma ferramenta do programa do LSM 510.

Após a análise da fluorescência do NMDA (Figura 19A) em um determinado plano focal, verificou-se que os animais transgênicos apresentaram uma intensidade de fluorescência significantemente menor do que a dos animais controles (*p<0,05). Após

A) C. C.C. E. C. C.C. E. C. C.C. E. A) A) C. C.C. E. C. C.C. E. C. C.C. E. B) C. C.C. E. C . C.C. E . B) C) D) Hip.

RESULTADOS

estatística por ANOVA de duas vias revelou que entre o grupo animal [F (1, 12) = 52,24 ; p<0,05)] e a área cerebral [F (2,12) = 1,56 ; p>0,05)] não houve interação [F (2,12) = 0,42 ; p>0,05)]. O post-hoc revelou que mesmo quando a análise foi realizada em regiões cerebrais específicas, os animais transgênicos apresentaram uma intensidade de fluorescência significantemente menor do que a dos animais controles (*p<0,05). Entretanto, não houve diferença significante entre as diferentes áreas cerebrais analisadas tanto nos animais controles quanto nos transgênicos (p>0,05).

Figura 19 - (A) Histograma representativo da intensidade de fluorescência em fatias cerebrais de camundongos R6/1 com 9 meses de idade incubados com anticorpo primário anti-NMDA 2B; (B) Histograma representativo da intensidade de fluorescência em diferentes regiões cerebrais de fatias de cérebro de camundongos R6/1 com 9 meses de idade, incubadas com anticorpo primário anti-NMDA 2B. Dados expressos como média ± desvio padrão de três diferentes experimentos. Teste T de Student and ANOVA de duas vias seguido do Teste T de Student e Duncan - *p<0,05 em relação a animais controles.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 In te n s id a d e d e F lu o re s c ê n c ia A) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 In te n s id a d e d e F lu o re s c ê n c ia A)

*

córtex corpo caloso estriado

B) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 R6/1 controles R6/1 transgênicos R6/1 controles R6/1 transgênicos In te n s id a d e d e F lu o re s c ê n c ia

córtex corpo caloso estriado

B) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130

*

*

*

RESULTADOS

4.2.3. Avaliação da Sinalização Intracelular 4.2.3.1. Medida da viabilidade celular

Cortes cerebrais de camundongos R6/1 foram investigados, ainda, quanto a viabilidade celular. As Figuras 20A e B mostram fatias cerebrais de animais controles e transgênicos, respectivamente, de 9 meses de idade, incubadas com Calceína-AM. A análise da intensidade da fluorescência emitida pode ser observada na Figura 20C, que mostra que, apesar dos animais controle apresentarem uma maior intensidade de fluorescência em relação aos transgênicos, essa não foi significante (p>0,05).

0 5 10 15 20 25 30 In te n s id a d e d e F lu o re s c ê n c ia C) 0 5 10 15 20 25 30 In te n s id a d e d e F lu o re s c ê n c ia 0 5 10 15 20 25 30 In te n s id a d e d e F lu o re s c ê n c ia C) C.C. E. 255 0 A) C.C. E. C. B) C.C. E. C.

RESULTADOS

Figura 20 - Fatias cerebrais (200 µm) de camundongos R6/1 controles (A) e transgênicos (B) de 9 meses de idade incubadas com Calceína-AM (500 nM) por 27 minutos e lavadas, posteriormente, por 40 minutos (E.: estriado, C.C.: corpo caloso, C.: córtex). As amostras foram excitadas com o laser de Argônio (488 nm) e a objetiva utilizada foi de 40x. O intervalo entre as imagens foi de 60 segundos. A escala de pseudo-cores indica a intensidade da fluorescência (0-255) e as cores foram atribuídas; (C) Histograma representativo da Intensidade de Fluorescência de fatias cerebrais de animais R6/1. Dados expressos como média ± desvio padrão de quatro diferentes experimentos. Teste T de Student – p>0,05.

A viabilidade celular foi verificada também por meio da utilização do PI. As Figuras 21A e 21B mostram fatias cerebrais de animais controles e transgênicos, respectivamente, de 9 meses de idade. A Figura 21C mostra que os animais transgênicos apresentam um aumento da fluorescência do PI em comparação com a dos animais controles, embora esta não tenha sido significante (p>0.05).

255 0 A) C.C. E. C. A)A) C.C. E. C. A) B) C.C. E. C. B) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 In te n s id a d e d e F lu o re s c ê n c ia 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 In te n s id a d e d e F lu o re s c ê n c ia 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 In te n s id a d e d e F lu o re s c ê n c ia C)

RESULTADOS

Figura 21 - Fatias cerebrais (200 µm) de camundongos R6/1 controles (A) e transgênicos (B) de 9 meses de idade na presença de PI (5 µg/ ml) (E.: estriado, C.C.: corpo caloso, C.: córtex). As amostras foram excitadas com o laser HeNe 1(543 nm) e a objetiva utilizada foi de 40x. O intervalo entre as imagens foi de 60 segundos. A escala de pseudo-cores indica a intensidade da fluorescência (0-255) e as cores foram atribuídas; (C) Histograma representativo da Intensidade de Fluorescência de fatias cerebrais de animais R6/1. Dados expressos como média ± desvio padrão de quatro diferentes experimentos. Teste T de Student - p>0,05.

4.2.3.2. Medida de Espécies Reativas de Oxigênio (EROs)

Após verificarmos as alterações da homeostase de Ca2+, a presença de receptores NMDA e a viabilidade celular em fatias cerebrais de camundongos R6/1, foi investigado o nível do estresse oxidativo nesses animais. A Figura 22 mostra fatias cerebrais de animais controles (A) e transgênicos (B) ao longo do tempo, após incubação com DCF e estímulo com Glu (1 mM). Pode-se notar que com o decorrer do tempo, há um aumento da fluorescência nos animais controles, enquanto que nos animais transgênicos há uma diminuição, embora a fluorescência basal destes seja maior. Os cortes foram analisados com a ferramenta ROI e os dados normalizados e locados em histograma (Figuras 22C e D). O Teste T revelou que na situação basal, os camundongos transgênicos não apresentaram um aumento significante das espécies reativas de oxigênio (p>0,05). Entretanto, após a adição de Glu, os transgênicos apresentaram uma diminuição significante da fluorescência em relação aos controles (*p<0,05). tempo o tempo o C.C. C.C. E. E. C. C. 7 minutos 7 minutos A) A)

RESULTADOS

Figura 22 - Fatias cerebrais (200 µm) de camundongos R6/1 controles (A) e transgênicos (B) incubadas com DCF (2,5 µM, 1 hora a 37ºC) (E.: estriado, C.C.: corpo caloso, C.: córtex). As amostras foram excitadas com o laser Argon (488 nm), o intervalo entre as imagens foi de 30 segundos e a objetiva utilizada foi a de 40x. A escala de pseudo-cores indica a intensidade da fluorescência (0-255) e as cores foram atribuídas; (C) e (D) Histogramas representativos, respectivamente, da Intensidade de Fluorescência basal (unidades arbitrárias) e da alteração da Intensidade de Fluorescência em relação ao valor basal (%) após a adição de Glu (1 mM), de animais controles e transgênicos. Dados expressos como média ± desvio padrão de quatro diferentes experimentos. Teste T de Student - *p<0,05 em relação aos animais controles submetidos ao mesmo estímulo.

tempo o tempo o C.C. C.C. E. E. C. C. 7 minutos 7 minutos B) B) 20 minutos

20 minutos 32 minutos32 minutos

R6/1 controles R6/1 transgênicos R6/1 controles R6/1 transgênicos 0 20 40 60 80 100 120 140 160 In te n s id a d e d e F lu o re s c ê n c ia (u n id a d e s a rb it rá ri a s ) 0 20 40 60 80 100 120 140 ∆∆∆∆ In te n s id a d e d e F lu o re s c ê n c ia ( % ) C) Glutamato Basal D)

*

RESULTADOS

Foram avaliadas, também, a produção de espécies reativas de oxigênio e a atividade da cadeia respiratória de forma indireta por meio da auto-fluorescência do NAD(P)H. A Figura 23 mostra que tanto os animais controles (A) como os transgênicos (B) têm a sua auto-fluorescência diminuída ao longo do tempo após estímulo com Glu (1 mM). Entretanto, a auto-fluorescência basal dos animais transgênicos é maior do que a dos controles. Após a adição de FCCP (50 µM, 32 minutos), houve um aumento da auto-fluorescência de ambos os grupos. As Figuras 23C e 23D representam os valores da auto-fluorescência após sua extração pelo programa Spectralyzer em forma de histograma. O Teste T revelou que na situação basal, os camundongos transgênicos apresentaram um aumento, embora não significante (p>0,05), das espécies reativas de oxigênio. Após a adição de Glu, no entanto, os transgênicos apresentaram uma diminuição significante da fluorescência em comparação aos controles (*p<0,05).

tempo 0

tempo 0 17 minutos17 minutos 30 minutos30 minutos

C.C. C.C. C. C. E. E. A) 35 minutos

RESULTADOS

Figura 23 - Fatias cerebrais (200 µm) de camundongos R6/1 controles (A) e transgênicos (B) (E.: estriado, C.C.: corpo caloso, C.: córtex) excitadas com o laser Titânio-Safira (750 nm) para a análise do NAD(P)H, o intervalo entre as imagens foi de 30 segundos e a objetiva utilizada foi a de 40x. A escala de pseudo-cores indica a intensidade da fluorescência (0-255) e as cores foram atribuídas; (C) e (D) Histogramas representativos, respectivamente, da Intensidade de

C) Glutamato In te n s id a d e d e A u to -F lu o re s c ê n c ia (u n id a d e s a rb it rá ri a s ) 0 10 20 30 40 50 60 -20 -10 0 10 20 30 ∆∆∆∆ In te n s id a d e A u to -F lu o ro e s c ê n c ia (% ) Basal D)

*

tempo 0 17 minutos17 minutos 30 minutos30 minutos C.C. C.C. C. C. E. E. B) 35 minutos

35 minutos 45 minutos45 minutos

R6/1 controles R6/1 transgênicos R6/1 controles R6/1 transgênicos

255

0 255

RESULTADOS

Fluorescência basal (unidades arbitrárias) e da alteração da Intensidade da Auto-Fluorescência em relação ao valor basal (%) após a adição de Glu (1 mM) de animais controles e transgênicos. Dados expressos como média ± desvio padrão de quatro diferentes experimentos. Teste T de Student - *p<0,05 em relação aos animais controles submetidos ao mesmo estímulo.

4.2.3.3. Identificação mitocondrial por meio de microscopia de fluorescência A co-marcação do DCF com MTR em fatias cerebrais de animais R6/1 pode ser observada nas Figuras 24A (canal verde: DCF; canal vermelho: MMTR) e 24B (sobreposição das duas fluorescências). O gráfico de análise da co-localização dos dois fluoróforo (Figura 24C) mostra que esta ocorreu parcialmente, o que decorre da pouca sobreposição dos mesmos. A escala de cores indica a freqüência de co-localização entre os dois fluoróforos, sendo que as cores azul e verde baixa freqüência e as cores laranja e vermelha alta freqüência.

Figura 24 - (A) Fatias cerebrais (200 µm) de camundongos R6/1 incubadas com DCF (2,5 µM, verde) e MTR (10 nM, vermelho) (E.: estriado, C.C.: corpo caloso, C.: córtex) excitadas com o laser de Argônio (488 nm) e HeNe 1 (543 nm) e objetiva de 40x; (B) Sobreposição das imagens da Figura A; (C) Gráfico representativo da co-localização da fluorescência do DCF e MTR sendo que cada fluoróforo é representado em um canal (1 e 2). A tabela abaixo indica a escala de freqüência entre os dois canais (0-255).

A) C.C. C. E. B) C) In te n s id a d e d e F lu o re s c ê n c ia (c a n a l 1 )

Intensidade de Fluorescência (canal 2)

F re q ü ê n c ia A b s o lu ta 0 50 100 150 200 250 F re q ü ê n c ia A b s o lu ta 0 50 100 150 200 250