Estudo da variação nos teores de capsaicinoides, capsinoides, carotenoides, fenólicos totais e capacidade antioxidante de pimentas capsicum chinense em diferentes estádios de maturação e períodos de colheita

(1)

i

JANCLEIPEREIRACOUTINHO

ESTUDO DA VARIAÇÃO NOS TEORES DE CAPSAICINOIDES, CAPSINOIDES, CAROTENOIDES, FENÓLICOS TOTAIS E CAPACIDADE

ANTIOXIDANTE DE PIMENTAS Capsicum chinense EM DIFERENTES

ESTÁDIOS DE MATURAÇÃO E PERÍODOS DE COLHEITA

.

CAMPINAS – SP 2015

(2)

(3)

iii

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS

JANCLEIPEREIRACOUTINHO

ESTUDO DA VARIAÇÃO NOS TEORES DE CAPSAICINOIDES, CAPSINOIDES, CAROTENOIDES, FENÓLICOS TOTAIS E CAPACIDADE ANTIOXIDANTE DE PIMENTAS Capsicum chinense EM DIFERENTES ESTÁDIOS DE MATURAÇÃO

E PERÍODOS DE COLHEITA

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos da Faculdade de Engenharia de Alimentos para Obtenção do Título de Doutor em Ciência de Alimentos.

Orientadora: Profa. Dra. Helena Teixeira Godoy

Este exemplar corresponde a versão final.

Tese defendida pelo aluno Janclei Pereira Coutinho, E orientada pela Profa. Dra. Helena Teixeira Godoy. _________________________________________

CAMPINAS – SP 2015

(4)

(5)

v

BANCA EXAMINADORA

__________________________________________________________ Profa. Dra. Helena Teixeira Godoy (Orientadora)

Faculdade de Engenharia de Alimentos – Unicamp

_____________________________________________________________ Profa. Dra. Lígia Bicudo de Almeida Muradian

Faculdade de Ciências Farmacêuticas - USP

___________________________________________________________ Prof. Dr. Marcelo Alexandre Prado

___________________________________________________________ Prof. Dr. Maurício Ariel Rostagno

Faculdade de Engenharia de Alimentos - Unicamp

____________________________________________________________ Profa. Dra. Milene Teixeira Barcia

Universidade Federal do Rio Grande – FURG

____________________________________________________________ Prof. Dr. Julian Martinez (suplente)

____________________________________________________________ Prof. Dr. Severino Matias de Alencar (suplente)

Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz –USP

____________________________________________________________ Prof. Dr. Stanislau Bogusz Júnior (suplente)

(6)

(7)

vii RESUMO

A pimenta é mundialmente utilizada para conferir cor e sabor aos alimentos, podendo ser adicionada na culinária diretamente no alimento, como na indústria em produtos como carnes, sopas, mistura de condimentos, entre outros. O mercado mundial de pimenta está em constante crescimento, onde o mercado asiático aponta como maior produtor e consumidor desse fruto. O Brasil é um produtor/consumidor relativamente pequeno, mas se beneficia no mercado de pimenta, pois exporta essa hortaliça a um bom preço, sendo uma das hortaliças mais lucrativas para o país, mesmo não sendo uma das mais exportadas em termos de volume. A pimenta vem atraindo o interesse não só da indústria de alimentos, mas também da indústria farmacêutica devido a presença de compostos bioativos, dentre os quais destacan-se os capsaicinoides, capsinoides, carotenoides e compostos fenólicos, conferindo a pimenta atividades biológicas interessantes como antioxidante, anti-inlamatória, analgésica, antitumoral, termogênica entre outras. O conhecimento da composição química de pimentas brasileiras ainda é pequeno existindo uma grande quantidade de espécies ainda não caracterizadas. Também são escassos os trabalhos mostrando a variação desses compostos bioativos com diferentes formas de cultivo, bem como com a maturação dos frutos e isso é muito importante quando se visa aumentar ou diminuir a produção de um dado metabólito. Nesse sentido, esse trabalho visa aumentar o conhecimento da composição química de duas variedades de pimentas brasileiras (Cumarí do Pará e Murupí Amarela), bem como o comportamento das classes de compostos acima citadas, com a maturação e período de colheita. Durante o trabalho, foram realizadas etapas de síntese de padrões de capsaicinoides e capsinoides, e isolamento de carotenoides. Para a realização das etapas de otimização da separação destes por cromatografia líquida de ultra alta eficiência (UHPLC) e também uma etapa de otimização da extração de capsinoides pelas técnicas de ultrassom, micro-ondas e flúido pressurizado. Com todos os métodos de separação e extração otimizados, foi realizado o estudo da variação dos capsaicinoides, capsinoides, carotenoides, compostos fenólicos totais e capacidade antioxidante em dois estádios de maturação (comercial e tecnológico) e em dois períodos de colheita (inverno e verão), contribuindo assim para um melhor conhecimento da composição de pimentas Capsicum chinense variedades Cumarí-do-Pará e Murupí Amarela.

(8)

(9)

ix ABSTRACT

The pepper is widely used to add color and flavor to foods such as directly in cook food as in the industry products such as meats, soups, condiments mix, among others. The world market for pepper is constantly increasing, where the Asian market stands as largest producer and consumer of this fruit, Brazil is a relatively small producer / consumer but benefits the pepper market, as exports pepper at a good price, is one of the most profitable vegetables to Brazil. Pepper have attract the interest not only of the food industry but also the pharmaceutical industry due to the presence of bioactive compounds such as capsaicinoids, capsinoids, carotenoids, phenolic compounds among others, giving pepper biological activities such as antioxidant, anti-inlamatory, analgesic, antitumor and other thermogenic. Knowledge of the chemical composition of Brazilian peppers is still small and there is a lot of not characterized species and are also few studies showing the variation of these bioactive compounds with different forms of cultivation, as well as the maturation and this is very important to increase or decreasing the production of a interesting metabolite. In this sense this paper aims to increase the knowledge of the chemical composition of two varieties of Brazilian peppers, as well as the behavior of these classes of compounds with the maturation and harvest period. Synthesis of standards were performed capsaicinoids and capsinoids, and isolation of carotenoids. With standards produced/isolated, steps of optimization of separation of these compounds were carried out by ultra high performance liquid chromatography (UHPLC), as well as an optimization of capsinoid extraction by techiniques such as ultrasound, microwave and pressurized fluid. With all methods of separation and extraction, was carried out to study the variation of capsaicinoids, capsinoid, carotenoids, phenolic compounds and antioxidant capacity in two ripening stages (mature and immature) and two harvest periods (winter and summer), contributing to a better knowledge of the composition of Capsicum chinense peppers variety “Cumari-do-Pará” and “Murupí Amarela”.

(10)

(11)

xi SUMÁRIO

AGRADECIMENTOS ... XXI

INTRODUÇÃO GERAL ...XXV

OBJETIVOS ... XXVII

Objetivos Gerais ... xxvii

Objetivos Específicos ... xxvii

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 1

As Pimentas do gênero Capsicum ... 3

Metabólitos Secundários em Pimentas do gênero Capsicum ... 6

Capsaicinoides ... 6

Capsinoides ... 9

Carotenoides... 11

Outros Metabólitos Secundários Presente em Pimentas Capsicum ... 14

Atividades Biológicas Relacionadas as Pimentas Capsicum ... 15

CONCLUSÃO ... 17

REFERÊNCIAS ... 17

ARTIGO 1 ... 27

SÍNTESE, IDENTIFICAÇÃO E METODOLOGIA ANALÍTICA PARA SEPARAÇÃO DE 17 CAPSAICINOIDES POR UHPLC-DAD ... 27 1 ... 30 1.1 RESUMO ... 30 1.2 ABSTRACT ... 31 1.3 INTRODUÇÃO ... 32 1.4 MATERIAIS E MÉTODOS ... 35 1.4.1 Reagentes ... 35 1.4.2 Equipamentos ... 36

1.4.3 Síntese dos Capsaicinoides Minoritários ... 36

1.4.4 Planejamento Experimental para Otimização e Tratamento Estatístico dos Dados .. 39

1.5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 41

1.5.1 Síntese e Identificação dos Capsaicinoides ... 41

1.5.2 Análises dos dados e determinação da melhor condição de separação ... 41

1.5.2.1 Determinação das condições desejáveis na coluna de 50 mm ... 47

(12)

xii

1.5.2.3 Obtenção do ponto ótimo e desejabilidade. ... 48

1.5.3 Validação ... 51

1.6 CONCLUSÕES ... 53

1.7 REFERÊNCIAS ... 54

ANEXO ... 59

ARTIGO 2 – ... 69

ISOLAMENTO, IDENTIFICAÇÃO E METODOLOGIA ANALÍTICA PARA SEPARAÇÃO DE CAROTENOIDES MAJORITÁRIOS DE PIMENTAS POR UHPLC-DAD-MS/MS ... 69

2 ... 72 2.1 RESUMO ... 72 2.2 ABSTRACT ... 73 2.3 INTRODUÇÃO ... 74 2.4 MATERIAIS E MÉTODOS ... 76 2.4.1 Reagentes ... 76 2.4.2 Material Vegetal... 76 2.4.3 Equipamentos ... 77

2.4.4 Otimização da Saponificação dos Extratos ... 78

2.4.5 Isolamento e Identificação de Padrões de Carotenoides ... 79

2.4.6 Otimização da Separação ... 81

2.4.7 Validação ... 83

2.5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 84

2.5.1 Otimização da Saponificação dos extratos... 84

2.5.2 Identificação e Quantificação dos Padrões de Carotenoides ... 85

2.5.3 Otimização da Separação ... 87

2.5.3.1 Determinação das condições Desejáveis ... 91

2.5.4 Validação ... 96

2.6 CONCLUSÕES ... 97

2.7 REFERÊNCIAS ... 99

ARTIGO 3 ... 103

SÍNTESE, IDENTIFICAÇÃO E METODOLOGIA ANALÍTICA PARA SEPARAÇÃO DE 17 CAPSINOIDES POR UHPLC-DAD ... 103

3.1RESUMO ... 106

(13)

xiii 3.3INTRODUÇÃO ... 108 3.4MATERIAIS E MÉTODOS ... 110 3.4.1 Reagentes ... 110 3.4.2 Equipamentos ... 111 3.4.3 Síntese de capsiatos ... 111

3.4.4 Condições experimentais para separação de 17 capsinoides. ... 118

3.4.5 Validação ... 120

3.5RESULTADOS E DISCUSSÃO... 120

3.5.1Síntese dos capsinoides ... 120

3.5.2 Otimização da melhor condição de separação ... 121

3.5.2.1 Determinação da condição ótima em coluna de 100 mm ... 127

3.5.2.2 Determinação da condição ótima em coluna de 50 mm. ... 127

3.5.2.3 Determinação da condição ótima de análise e desejabilidade ... 130

3.5.3 Validação ... 133

3.6CONCLUSÕES ... 135

3.7REFERÊNCIAS ... 135

ANEXO ... 139

ARTIGO 4 ... 161

OTIMIZAÇÃO DA EXTRAÇÃO DE CAPSINOIDES PELAS TÉCNICAS DE ULTRASSOM, FLÚIDO PRESSURIZADO E MICRO-ONDAS ... 161 4.1RESUMO ... 164 4.2ABSTRACT ... 165 4.3INTRODUÇÃO ... 166 4.4MATERIAIS E MÉTODOS ... 168 4.4.1 Reagentes ... 168 4.4.2 Material Vegetal ... 168 4.4.3 Equipamentos ... 168

4.4.4 Otimização da Extração Assistida por ultrassom ... 169

4.4.5 Otimização da Extração Assistida por Fluído Pressurizado ... 170

4.4.6 Otimização da Extração Assistida por Micro-ondas ... 171

4.4.7Validação ... 172

4.5RESULTADOS E DISCUSSÃO... 173

4.5.1 Otimização da Extração Assistida por Ultrassom ... 173

4.5.2 Otimização da Extração Assistida por Fluído Pressurizado ... 181

(14)

xiv

4.5.4 Comparação entre os métodos de extração ... 199

4.5.5 Validação ... 201

ARTIGO 5 ... 207

AVALIAÇÃO DA INFLUÊNCIA DO GRAU DE MATURAÇÃO E PERÍODO DE COLHEITA NOS TEORES DE CAPSAICINOIDES, CAROTENOIDES, CAPSINOIDES, FENÓLICOS TOTAIS E CAPACIDADE ANTIOXIDANTE EM PIMENTAS CAPSICUM CHINENSE VARIEDADE CUMARÍ-DO-PARÁ E MURUPÍ. ... 207

5.1RESUMO ... 210 5.2ABSTRACT ... 211 5.3INTRODUÇÃO ... 212 5.4MATERIAL E MÉTODOS ... 214 5.4.1 Material Vegetal ... 214 5.4.2 Reagentes ... 215 5.4.3 Equipamentos ... 215 5.4.4 Análise de Capsaicinoides ... 216 5.4.5 Análise de Carotenoides ... 217 5.4.6 Análise de Capsinoides ... 218

5.4.7 Quantificação de compostos Fenólicos totais ... 218

5.4.8 Avaliação da capacidade antioxidante pelo método DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazila). ... 219

5.4.9 Avaliação da capacidade antioxidante pelo método FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power) ... 220

5.4.10 Avaliação da capacidade antioxidante pelo método ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity). ... 220

5.5RESULTADOS E DISCUSSÕES ... 221

5.5.1 Análise de Capsaicinoides ... 221

5.5.2 Análise de Carotenoides ... 226

5.5.3 Análise de Capsinoides ... 229

5.5.4 Análise de Comostos Fenólicos Totais ... 231

5.5.5 Análise da capacidade antioxidante pelo método DPPH ... 232

5.5.6 Análise antioxidante pelo método FRAP ... 234

(15)

xv

5.5.8 Correlação entre os métodos de atividade antioxidante, fenólicos totais, capsaicinoides,

capsiato e carotenoides. ... 237

(16)

(17)

xvii

Painho e Mainha, à vocês dedico esse trabalho.

(18)

(19)

xix

“Há uma força motriz mais poderosa que o vapor, a eletricidade e a energia atômica: a vontade” Albert Einstein

“Não troco o meu oxente pelo ok de ninguém” Ariano Suassuna

(20)

(21)

xxi

AGRADECIMENTOS

À Deus pelo dom da vida, pela força para realizar esse duro trabalho e por se mostrar presente em minha vida em muitos momentos, alguns deles desde a minha seleção até conclusão dessa tese.

À Painho e Mainha, Clemente e Ana, seu Quelé e Naninha. A vocês meu agradecimento e reconhecimento, que pela dificuldade que enfrentaram em toda vida e impossibilidade de concluir seu estudos, apostaram e mim e meus irmão de forma incrível. Sempre nos ensinaram a estudar e trabalhar. Mainha, a senhora que sempre sonhou em ser professora, posso te dizer que é a melhor de todas, tem três de seus filhos com diploma de nível superios (e Erlan está trazendo o 4° diploma), dois mestres e agora um doutor. Então o fato de não ter concluído seus estudos não diz nada, a senhora é uma grande professora!!! E Painho, sempre duro, nos mostrou que nada vem de graça, que a vida não é fácil e que temos que ser mais duros que ela. A vocês muito obrigado pelo exemplo de força e superação, pelo amor, carinho, atenção. Amo vocês!!!!

A Professora Helena pela maestria em sua orientação, dosando muito bem os momentos em que tomou as rédeas de determinadas ações como também momentos em que eu tinha autonomia para fazer determinadas ações da minha maneira. Sua orientação proporcionou não só uma grande aquisição de conhecimento, visto que cada pequena conversa sobre o trabalho era como se conseguisse colocar em minha cabeça todo o conhecimento de um grande livro, como também a autonomia para seguir a carreira de professor e pesquisador daqui por diante. Muito obrigado pela orientação, amizade, pela “mãezona” que sempre é, pelas farras... rs e tantas outras coisas.

Aos meus Irmãos Jean, Erlan e Elaine, minhas cunhadas Leila e Érica e meus sobrinhos Gabriel, Maria Raquel e Clara, muito obrigado pelo incentivo, apoio e torcida por cada vitória em todas as etapas de minha vida.

(22)

xxii

À minha linda Rândilla muito obrigado pelo seu amor, companherismo, amizade e por tornar os meus dias tão mais felizes. Te amo!!

Aos meus familiares, em especial minhas primas Norma, Dinha e suas respectivas famílias pelo apoio incondicional em todos os momentos, pelos encontros sempre alegres, por abrirem as portas de suas casas no momento de minha chegada e em qualquer momento que eu precise e ao meu tio Manoel (em memória) que viu tão de perto esse o início desse sonho, mas que partiu antes de sua conclusão, muito obrigado.

Aos colegas do Lab Análise obrigado por serem por muitas vezes minha família em Campinas, pessoas com quem passei a maior parte do meu tempo, pelas muitas risadas, festas, apoio nos momentos de angustia, também muito obrigado aos amigos Danilo e Jane e Maria Rosa e Leandro, pelos sobrinhos Levi, Matheus e Sophia (Fofia).

À Galera louca da Capela (mais que república!!) pelo bom convívio, amizade, muitos momentos de alegria, descontração, festas, viagens e muito mais.

Aos colegas do Laboratório de Alta Pressão em Engenharia de Alimentos – LAPEA, muito obrigado por se mostrarem execentes colegas de trabalho, o que já resultou em muitos trabalhos em parceria (e muitos ainda por vir), e também pela amizade dentro e fora do ambiente acadêmico.

Aos Colegas do laboratório de Cereais pela amizade e sempre manterem asportas abertas e com um sorriso no rosto para o que eu precisasse, obrigado em especial à Márcio pela ajuda direta com os trabalhos envolvendo a técnica de extrusão.

Aos Colegas do Laboratório de Neuroimunologia, em especial a Guilherme, Fernando, Alliny, as Íngrids, Adriel e Rose muito obrigado pela ajuda direta nos ensaios in vivo e pela paciência em ensinar uma pessoa de uma área totalmente diferente como se trabalha com animais, órgão, células entre tantas outas coisas..

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xxiii

Ao Prof. Gerardo Barbeiro, obrigado pelo convite para realização de estágio na Universidad de Cadiz, Espanha, além de amizade e excelente receptividade e convívio no ambiente de trabalho.

Aos Professores Miguel Palma e Carmelo Barroso do “Instituto Andaluz de Investigación em Vitivinicultura y Agroalimentación” e aos Professores Francisco Antônio Macias, José Maria Molinillo y Rosa Varela do “Grupo de Investigación en Alelopatia”, da Universedad de Cadiz, Espanha, muito obrigado pela receptividade em seus laboratórios e pelo valoroso conhecimento nas áreas de química analítica, orgânica e síntese.

Á Professora Leonilda, do laboratório de neuroimunologia do Instituto de Biologia da Unicamp, obrigado por gentilmente permitir o uso das instalações de seu laboratório para realização dos ensaios de atividades biológicas in vivo.

À Professora Elaine Conceição Oliveira obrigado pela orientação nos ensaios de resposta imunológica e atividade anti-inflamatória, pela ajuda direta na execução dos experimentos e pela valorosa oportunidade de realização de ensaios in vivo.

Aos proressores membros da banca examinadora obrigado pela avaliação e valorosa contribuição para o melhoramento dessa tese.

Aos amigos brasileiros e espanhois que fiz na em Cadiz e Puerto Real, Espanha, muito obrigado pela amizade e companherisdo, viver em outro país é uma ótima experiência, mas trás consigo momentos de angustia e solidão pela ausência da família, e vocês em especial Sílvia foram um apoio muito importante em diversos momentos.

Aos novos tios de coração, Mauro e Sílvia e Rubens e Adriana pelo acolhimento em suas famílias pela atenção, sempre se preocupando com minha estadia em Campinas e sempre fazendo questão de minha presença em suas reuniões. E a minha amiga Silvinha pela constante presença, amizade e pelos valorosos conselhos e puxões de orelha rsrsrs.

(24)

xxiv

À todos os professores que já me transmitem conhecimento desde minha educação primária até o a conclusão desse trabalho, muito obrigado. Esse doutorado em um pouco de cada um de vocês.

Aos Amigos de fora do meio acadêmico, que de forma indireta contribuem muito para a execução desse trabalho.

Aos secretários, Cosme, Marcos e Camila obrigado pelo excelente trabalho e ajuda com a solução de problemas e burocracias.

Aos técnicos de laboratório Marcela, Renata e Dirceu, muito obrigado pelo seu trabalho de manutenção das boas condições de trabalho e organização do laboratório.

Ao CNPq pela bolsa de estudos no início do trabalho e a FAPESP pela conseção da bolsa de estudos da metade ao fim do doutorado (processo n° 2011/15431-1), pela bolsa sanduíche para estudos na Espanha (processo n° 2012/22053-6) e pelo auxílio pesquisa para financiamento da pesquisa (processo n° 2010/19863-0).

A todos que direta ou indiretamente participaram desse trabalho, deixo o meu muito obrigado.

(25)

xxv

INTRODUÇÃO GERAL

As pimentas do gênero Capsicum foram descobertas no continente americano por volta do século XV pelos navegadores espanhóis e portugueses, e a partir desse momento foram espalhadas por todo o mundo. Atualmente a pimenta é utilizada para o consumo in natura, diretamente em alimentos cozidos, como também na forma de molhos, tempeiros e ingredientes para o processamento de outros produtos como carnes e seus imbutidos, sopas entre outros.

A Ásia se tornou a regial que apresenta o maior consumo do mundo, chegando a superar todos os demais continentes juntos, e mantém crescente o seu consumo. Os demais continentes também apresentam uma taxa de crescimento no consumo de pimenta, entretanto bem inferior ao crescimento apresentado pelo continente asiático. O Brasil é considerado um pequeno produtor e consumidor de pimenta, se comparado com países como Tailândia, China, México entre outros. Entretanto o Brasil participa de um mercado muito lucrativo, visto que sua produção de pimenta supera o consumo, e esse excedente de produção é exportado para países onde a produção é inferior ao consumo como a Malásia.

O uso da pimenta se deve principalmente ao seu sabor pungente característico e pela sua coloração, onde essas características são transferidas para o alimento onde a mesma é adicionada. Os capsaicinoides e carotenoides são as duas classes de compostos responsáveis pelo sabor e cor, respectivamente. Além das suas características sensoriais, essas classes de compostos têm demostrado uma série de atividades biológicas tais como antioxidante, anti-inflamatória, anticarcinogênica, analgésica, antimicrobiana entre outras, o que atrai o interesse também da indústria farmacêutica.

(26)

xxvi

Recentemente foi descoberta uma nova classe de compostos químicos em algumas variedades de pimentas, os capsinoides. Esses compostos possem uma estrutura química semelhante aos capsaicinoides, mantendo suas atividades biológicas, porém, sem apresentar o sabor pungente, de forma que pimentas contendo capsinoides e não contendo capsaicinoides podem representar uma alternativa para consumidores que desejam fazer uso da pimenta mas que possuem uma limitação causada pelo sabor pungente.

As condições edafoclimáticas bom como o grau de maturação de produtos de origem veretal são fatores que causam grande influência na qualidade do alimento e de sua composição físico-química. Com uma grande diversidade genética, o Brasil apresenta uma grande quantidade de pimentas ainda pouco estudadas, como é o caso das pimentas Capsicum chinense variedade Murupí amarela e Cumarí-do-Pará, o que motiva a realização desse estudo.

(27)

xxvii

OBJETIVOS

OBJETIVOS GERAIS

Essa tese teve por objetivo o estudo do efeito da maturação e período de colheita sobre os teores de capsaicinoides, capsinoides, carotenoides, fenólicos totais e atividade antioxidante em duas variedades de pimentas Capsicum chinense, Cumarí-do-Pará e Murupí.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Síntese dos padrões de 15 capsaicinoides de cadeia linar e desenvolvimento e validação de metodologia analítica para separação de capsaicina, duhidrocapsaicina e mais 15 capsaicinoides de cadeia linear em UHPLC.  Isolamento, identificação e quantificação de padrões de Luteína, violaxantina,

anteraxantina e neoxantina bem como o desenvolvimento e validação de metodologia analíca para separação destes carotenoides em UHPLC.

 Síntese dos padrões de 17 capsinoides e desenvolvimento e validação de metodologia analítica para separação destes 17 capsinoides em UHPLC.  Otimização da extração de capsiato pelas técnicas de ultrassom, fluido

pressurizado e micro-ondas, assim como a comparação destas.

 Estudo da variação nos teores de capsaicinoides, carotenoides, capsinoides, fenólicos totais e atividade antioxidante em função do estádio de maturação e período de colheita em amostras de pimenta Cumari-do-Pará e Murupí.

(28)

(29)

Janclei Pereira Coutinho Revisão Bibliográfica

1

R

EVISÃO

B

IBLIOGRÁFICA

(30)

(31)

3

Revisão Bibliográfica

Janclei Pereira Coutinho e Helena Teixeira Godoy

AS PIMENTAS DO GÊNERO CAPSICUM

O início da história das pimentas do gênero Capsicum, se dá no período das grandes navegações, quando navegadores de países europeus, principalmente Portugal e Espanha viajavam de navio contornando o continente africano até chegar ao oriente, para comercialização de diversos produtos, entre eles condimentos onde se incluía a pimenta. Nesse período a pimenta mais utilizada era a pimenta-do-reino (Piper nigrum), pertencente à família Piperaceae e gênero Piper, nessa variedade de pimenta o composto responsável pelo sabor pungente é a peperina (CARDOSO et al., 2012). Com a proposta de viajar até ao oriente por um novo caminho, navegadores espanhóis, no fim do século XV chegaram ao continente americano e encontraram novas civilizações. O contato com essas civilizações revelou muitas novidades nos mais diferentes aspectos e na alimentação observaram que os nativos possuíam um fruto de sabor picante, que também era utilizado como corante e medicamento. Estes frutos tratavam-se das pimentas conhecidas atualmente como as pimentas do gênero Capsicum, pertencentes à família Solanaceae, que a partir desse momento foram disseminada por todo o mundo sendo muito apreciada por apresentar uma grande variedade de cores e sabores, sendo usada também para conservar os alimentos da contaminação por fungos e bactérias (VALVERDE, 2011) (HEIDEM et al., 2007). Hoje, é confirmado não só por dados históricos, mas também por informações geográficas e dados de eletroforese que apontam que a origem do gênero Capsicum se deu na Bolívia e o gênero

(32)

4

foi disseminado por pássaros na América Central e do Sul levando esse gênero a ser encontrado desde a região tropical da América do Sul até a região que hoje compreende o México, como pode ser observado na Figura 1 (SANTOS 2009) (NUEZ et al., 1996) (MCLEOD et al., 1982).

Figura 1: Local de origem de 4 famílias de Pimentas Capsicum na América Central e do Sul. NUEZ et a., 1996.

Dentre as espécies que compõem o gênero Capsicum, a espécie Capsicum chinense foi alvo de um erro de identificação taxonômica. Devido o seu epitélio sugerir se tratar de uma planta originária da China, assim recebeu erroneamente a classificação de “chinense” o que mostraria a China como local de origem dessa espécie. Atualmente esse erro foi corrigido e sabe-se que a espécie C. chinense é originária do continente americano (BOSLAND et al., 1988)

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5

Atualmente a pimenta é utilizada in natura para conferir o seu sabor característico aos alimentos no momento do consumo e utilizada como ingrediente para conferir cor e sabor para alimentos processados como embutidos cárneos, sopas, molhos e misturas de temperos, conservas, geléias, conservas ornamentais, e também na indústria farmacêutica devido a uma série de atividades biológicas (SANTOS, et al., 2008) (GAIOTTO et al., 1999). O mercado de pimentas vem crescendo a cada ano (SEGATTO et al., 2006) como pode ser observado no gráfico apresentado na Figura 2.

Figura 2: Produção de pimenta nos continentes entre os anos de 1990 a 2006. Mt- mil toneladas. FAOSTAT 2008.

O mercado consumidor asiático é muito maior que nos demais continentes, e a sua tendência de aumento do consumo é superior à de produção, onde no ano de 1990 a produção mundial de pimenta era superior ao consumo em 84 mil toneladas, já no ano de 2004 essa diferença caiu para 54 mil toneladas, isso porque grandes consumidores como Estados Unidos, Malásia, México, Tailândia e Bangladesh não conseguem aumentar sua produção na mesma proporção que aumenta o consumo, e juntos apresentam um déficit de 205 mil toneladas no ano de 2004. Países como Índia e China, que são grandes consumidores e produtores, já se prepararam para essa tendência de mercado e conseguiram aumentar sua produção de pimenta muito acima das necessidades de consumo, e juntas

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6

apresentaram um superávit de 286 mil toneladas no ano de 2004, exportando assim o excesso de produção (SANTOS, 2009).

O Brasil se beneficia desse comportamento de mercado, pois apesar de não ser um grande produtor/consumidor possui uma produção maior que o consumo e exporta esse excesso de produção com grande valor agregado o que faz com que a pimenta seja uma das hortaliças mais lucrativas para o Brasil. Os estados de Minas Gerais, Goiás, São Paulo, Ceará e Rio Grande do Sul se destacam como os maiores produtores de pimenta. Segundo dados da EMBRAPA no ano de 2004 a exportação de pimentas cultivadas no Brasil foi de 8,5 mil toneladas, subindo para 9,2 mil toneladas no ano de 2005, sendo responsável por 13,5 % do valor total das exportações de hortaliças no Brasil (BOGUSZ JUNIOR, 2010) (WAGNER, 2003) (REISHNEIDER, 2000), entretanto os dados de comercialização e consumo de pimentas no Brasil, são escassos e os poucos dados encontrados são sempre subestimados uma vez que a maior parte da produção se dá por pequenos produtores, que a comercializam em pequenas feiras, não sendo contabilizados.

METABÓLITOS SECUNDÁRIOS EM PIMENTAS DO GÊNERO Capsicum

CAPSAICINOIDES

Os capsaicinoides são compostos classificados como alcaloides, sendo que os capsaicinoides mais comumente encontrados nas pimentas são a capsaicina, dihidrocapsaicina e nordihidrocapsaicina, que coorespondem por cerca de 90% dos capsaicinoides totais e pungência da maior parte das variedades de pimentas (PEÑA-ALVAREZ et al., 2009), mas também são encontrados capsaicinoides minoritários como a

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7

homocapsaicina, homodihidrocapsaicina, norcapsaicina, nornorcapsaicina, nonivamida (BARBERO et al., 2008) entre outros (Figura 3).

Figura 3: Principais Capsaicinoides majoritários e minoritários já encontrados em pimentas do gênero Capsicum. Adaptado de Barbero (2008) e Schweiggert (2006).

Os capsaicinoides são derivados do metabolismo secundário do grupo dos alcaloides e são formados pela vanililamina ligada a um ácido graxo, onde a diferença nas ramificações da cadeia do ácido graxo que entra na via metabólica determina a diferença entre os capsaicinoides (Figura 3). A síntese dos capsaicinoides, conforme pode ser observado na Figura 4, é originário da via dos fenilpropanoides e da via dos ácidos graxos, partindo de 2 aminoácidos, fenilalanina e valina, onde a fenilalanina passa por uma série de

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modificações estruturais até ser convertida na vanililamina, enquanto que a valina sofre algumas transformações até entrar na via dos ácidos graxos, ligados à coenzima A (CoA), como pode ser observado na biosíntese da capsaicina realizada pelas pimentas Capsicum, na Figura 4 (STEWART JR et al., 2007)

Os capsaicinoides são os responsáveis pelo sabor pungente (queimação), característico nas pimentas, que é a principal causa de sua aceitação ou rejeição, sendo que apresentam diferentes sensações de pungência. A capsaicina e dihidrocapsaicina são as mais irritantes (maior pungência), causando ardor no meio da boca, palato, garganta e na parte posterior da língua. A nordihidrocapsaicina tem uma pungência menor, sendo percebida imediatamente após a ingestão na frente da boca e no palato, e é rapidamente dissipada. Assim, diferentes combinações dessas substâncias podem conferir à pimenta diferentes características de pungência o que explica a variação no ardor das pimentas (BOGUSZ JUNIOR, 2010) (LIU et al., 2010) (SCHWEIGGERT, et al., 2006).

Uma curiosidade a respeito é que essa classe de compostos, entre outras funções, é responsável por uma seleção nos disseminadores de semente. É um pensamento controverso imaginar que uma espécie que necessita de disseminadores de semente produza uma classe de compostos que cause uma sensação de queimação, logo, repelindo animais que comeriam a pimenta e espalhariam suas sementes através das fezes. Esse raciocínio é válido para os mamíferos, principalmente os ruminantes, que em seu processo digestivo contendo a enzima celulase destroem toda a estrutura das paredes das sementes, e consequente digestão do interior destas, fazendo com que não ocorra a germinação das sementes quando expelidas. Entretanto a sensação de pungência não é percebida pelas aves, e estas representam os maiores disseminadores de sementes de pimenta, pois possuem um

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sistema digestivo curto e menos agressivo que os ruminantes, o que leva a semente a manter condições de germinar após a excreção (BOGUSZ JUNIOR, 2010)

CAPSINOIDES

Os Capsinoides são uma classe de compostos, análogos aos capsaicinoides, descobertos recentemente em uma variedade de pimenta não pungente denominada “CH-19 Sweet” (Capsicum annuum L.), que apresenta uma grande concentração dessas substâncias, sendo descritos como majoritários o capsiato, dihidrocapsiato e nordihidrocapsiato (IWAI et al., 2003). Tratam-se de compostos muito semelhantes aos capsaicinoides, como pode ser observado na Figura 5. A única diferença entre as duas classes se dá no átomo no centro da molécula, enquanto os capsaicinoides apresentam uma ligação amida, os capsinoides apresentam uma ligação éster (LUDY et al., 2012). Essa diferença estrutural causa algumas mudanças nas características das duas moléculas, a mais notável delas é que os capsinoides não apresentam pungência, com a manutenção de algumas atividades biológicas (LOU et al., 2011).

Figura 5: Estruturas da Capsaicina (A) e Capsiato (B). Evidenciadas com uma marcação a diferença entre as moléculas. Adaptado de Barbero 2010.

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Figura 4: Proposta de Síntese da Capsaicina. (1)Fenilalanina, (2)Ác. Cinâmico,(3)Ác. p-Cumárico, (4)Cumaroil-CoA, (5)p-cumaroil-shikimato,(6) Cafeoil-shikimato, (7)Cafeoil-CoA, (8)Ferruloil-CoA, (9)Vanilina, (10)Vanililamina, (11)Valina, (12)α-Cetoisovalerato, (13)Isobutiril-CoA, (14)Ácido-8-metil-nonanoico, (15)Ácido-8-metil-6-nonenoico, (16)8-metil-6-nonenoil-CoA. (A)Fenilalanina Amonialiase, (B)Acido-cinâmico-4-hidroxilase, (C)4-Coumarato-CoALigase, (D)Hidroxicinamoiltransferase, (E/F)Coumaroil-shikimato/quinato-3-hidroxilase, (G)Coenzima A, (H)Hidroxicinamoiltransferase, (I)Ácido cafeico O-metiltransferase, (J)Não descrita, (L)Aminotrasferase, (M)Aminoácido de cadeia ramificada transferase, (N)Isovalerato-Desidrogenase, (O/P)Entram na via seguinte sem modificação enzimática, (Q)3-ceto-acil ACP sintetase/Proteína Transportadora de Acilo, (R)Acilo-ACP-tioesterase, (S)Desnaturase, (T)Acil-CoA-Sintetase, (U) Capsaicina sintetase. Adaptado de STEWART JR (2007).

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Dados a respeito da presença dos capsinoides em pimentas são muito escassos, o que se deve ao pouco tempo de conhecimento dessa classe de compostos aliado à inexistência de métodos de extração e poucos métodos de separação. Somente foi encontrado um trabalho que analisou 49 espécies, com uma amostra brasileira entre elas, o que é pouco representativo frente à grande quantidade de espécies existentes, e menos ainda quando se trata de amostras brasileiras (SINGH et al., 2009). A grande parte dos trabalhos encontrados na literaturase destina à síntese dos capsiatos e avaliação de atividades biológicas dos mesmos, sendo relatada em termos da contribuição desses compostos para a saúde (REDDY et al., 2011) (GALGANI, et al., 2009) (MACHO et al., 2003) (IWAI et al., 2003), mas por outro lado pouco se conhece a respeito das variedades que possuem tais compostos. Um trabalho bastante relevante é o realizado por Aguiar (2014), que apresenta um estudo detalhado de técnicas e solventes de extração capsinoides na pimenta “biquinho” (C. chinense), uma variedade brasileira.

CAROTENOIDES

Os carotenoides são compostos formados basicamente por oito unidades isoprênicas totalizando 40 carbonos, havendo exceções. Possuem estrutura que caracteriza uma polaridade relativamente baixa e hidrofobicidade, e para os organismos vegetais possui uma função similar a clorofila, absorvendo energia para realização de fotossíntese. Podem ser divididos em dois grandes grupos, os carotenos, quando compostos somente por carbono e hidrogênio, ou xantofilas, quando possuem também oxigênio em sua estrutura. Os carotenoides possuem um sistema de ligações duplas conjugadas que lhes confere uma

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coloração típica, variando do amarelo até o vermelho. Essas ligações duplas ocorrem em maior proporção na forma trans (também existindo a forma cis). De maneira geral a isomerização trans-cis é a primeira reação que ocorre para a degradação dos carotenoides. Animais são incapazes de sintetizar carotenoides, entretanto alguns animais como crustáceos possuem uma coloração típica causada pela ingestão de carotenoides através de sua alimentação (RODRIGUEZ-AMAYA, 2001).

Os alimentos são uma importante fonte de carotenoides, os quais são essenciais para alimentação devido a suas atividades biológicas, e também para a indústria devido ao seu poder de conferir cor aos alimentos e produtos industrializados. No grupo dos carotenoides, a bixina, presente no urucum (Bixa orellana), é um dos exemplos mais conhecidos de uso de carotenoides para conferir cor a outros produtos (CHISTÉ et al., 2011). Existem muitos alimentos ricos em determinados carotenoides, como é o caso da cenoura que é fonte em alfa e beta caroteno, o mamão, fonte de beta criptoxantina, vegetais folhosos de coloração verde escuro que são fontes de luteína, a manga, fonte de violaxantina, tomate, fonte de licopeno entre outros (RODRIGUEZ-AMAYA et al., 2008). No que diz respeito à pimenta Azevedo-Meleiro (2009) mostrou que as pimentas amarelas apresentam em maior concentração a luteína e violaxantina, já se tratando de pimentas vermelhas, a capsantina e capsorubina são os carotenoides majoritários. Os carotenoides majoritários em pimentas podem ser observados na Figura 6.

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Figura 6: Carotenoides majoritários em pimentas amarelas e vermelhas (RODRIGUEZ-AMAYA, 2001).

Em termos tecnológicos a capsantina e capsorubina, apresentam uma coloração vermelha muito intensa, e que se mantém mesmo com a secagem da pimenta, assim a páprica (pimenta seca em pó) ganha um uso expressivo como corante natural, tanto para conferir cor, no caso da páprica doce, quanto cor e sabor no caso da páprica picante (DELI et al., 2001).

Os carotenoides já são estudados desde muito tempo, e sua presença e comportamento nas mais variadas matrizes é muito bem conhecido, entretanto, essa afirmação é válida apenas para a pimenta vermelha. Quando se trata de pimentas amarelas são escassos os trabalho de composição em diferentes variedades e sobretudo como esses carotenoides se comportam com diferentes variações de cultivo ou maturação. Poucos trabalhos encontrados descrevem o metabolismo de carotenoides para pimentas vermelhas e

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como ocorre a variação destes com o amadurecimento parcial e total, para a pimenta amarela não foram encontradas informações similares, sendo essa a justificativas para uma das etapas dessa tese (CERVANTES-PAZ et al., 2014) (DELI et al., 2001).

OUTROS METABÓLITOS SECUNDÁRIOS PRESENTE EM PIMENTAS Capsicum

Além dos capsaicinoides, capsinoides e carotenoides, também são descritos para a pimenta do gênero Capsicum outros metabólitos secundários como o ácido ascórbico, ácido proteocatecuico, ácido Clorogênico, ácido p-cumárico, quercetina, luteolina e compostos voláteis das mais variadas classes, como alcoóis, aldeídos, cetonas e ésteres (BOGUZ JUNIOR, 2010). Todas essas classes de compostos são importantes para a pimenta em vários aspectos, os compostos não voláteis citados apresentam uma série de atividades biológicas, como antioxidante, o que confere valor agregado pelo consumo visando a ingestão de tais compostos e pela exploração da indústria farmacêutica que produz fórmulas utilizando a pimenta baseado na presença desses compostos. Os compostos voláteis se tornam importante por apresentarem na planta funções como atração/seleção de polinizadores, defesa contra micro-organismos e espécies vegetais, tecnologicamente os compostos voláteis participam da formação do flavor do alimento, combinação de sabor e aroma, determinante para a aceitação de um alimento (DUDAREVA et al., 2004) (THOMSON , 1987).

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ATIVIDADES BIOLÓGICAS RELACIONADAS AS PIMENTAS Capsicum

Devido à diversidade de metabólitos secundários das pimentas Capsicum, estas apresentam uma série de atividades biológicas como demonstrado por uma grande variedade de trabalhos na literatura.

A capacidade antioxidante é classificada como a capacidade de compostos, mesmo em concentrações baixas, de atrasar, inibir ou neutralizar radicais livres no organismo (GUTTERIDGE, 1994). O estudo da capacidade antioxidante é muito importante porque a neutralização de radicais livres está relacionada com a prevenção a uma série de doenças como câncer (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1989), aterosclerose e outras doenças cardiovasculares (LICHTENSTEIN, 2009), mal de Parkinson, Alzheimer e Esclerose Lateral Amiotrófica (ALI et al., 2008) (DI MATTEO & ESPOSITO, 2003), problemas decorrentes do envelhecimento (JOSEPH et al., 1999) entre outras, além de estar correlacionada com as atividades anti-inflamatória (BICAS et al., 2011) e antimutagênica (VAYALIL, 2002). Devido à associação da capacidade antioxidante com a prevenção de muitas doenças, o consumo de alimentos com compostos antioxidantes vem crescendo visando esses benefícios, já existindo estudos epidemiológicos mostrando que o consumo de alimentos com alto teor de antioxidantes está relacionado à redução de doenças cardiovasculares e câncer (RECORD et al., 2001). Nesse sentido a pimenta se mostra como uma importante fonte de antioxidantes, pois já é descrita a atividade antioxidante de vários de seus metabólitos secundários presentes na pimenta como os capsaicinoides (HENDERSON & SLICKMAN, 1999), capsinoides (ROSA et al., 2002), demais compostos fenólicos e ácido ascórbico (DEEPA et al., 2007), carotenoides (STAHL & SIES, 2003).

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Além da capacidade antioxidante (e atividades correlacionadas) aos capsaicinoides são atribuídas as atividades analgésica (WINTER et al., 1995), estimulante do sistema cardio-respiratório (MORRIS et al., 1995) e termogênica (YOSHIKA et al., 1995) (YOSHIKA et al., 1998). Os capsinoides, fora a atividade antioxidante, são associados à proteção contra lesões gástricas causadas pelo etanol (LI et al., 2012) e também estão associados a atividade termogênica e redução de gordura corporal (ONUKI et al., 2001)(ONUKI et al., 2001 II). Existe, entretanto, contradições a respeito das atividades biológicas da pimenta, onde a pimenta seria maléfica, como por exemplo, para a atividade anticancerígena, e toda essa discussão gira em torno das concentrações de pimenta ingerida, o que sugere que mais estudos sejam realizados visando estabelecer a dosagem ideal de pimenta para a obtenção da atividade desejada (SURH & LEE, 1996).

Dentre os carotenoides encontrados em pimentas, a luteína, já descrita como majoritária, apresentam atividade antioxidante e está relacionada com benefícios para a visão. A mácula, região localizada na parte inferior do olho humano, e a retina possuem uma concentração relativamente grande de carotenoides, mais especificamente a luteína e zeaxantina. Estes carotenoides atuam como filtros, removendo a “luz azul de alta energia”, devido a absorbância na região do espectro de 400 a 500 nm ser justamente a região do espectro onde se encontra a luz azul. No olho humano a mácula tem a função de garantir a nitidez da visão, enquanto que a energia na região da “luz azul” acaba por degenerar a mácula causando a perda da nitidez visual, muito comum com o envelhecimento, assim a luteína (juntamente com a zeaxantina) tem um papel muito importante para a visão, que é proteger a mácula da degeneração, já sendo descrita uma relação direta entre os carotenoides e a prevenção de doenças da visão como a catarata (SCHALCH et al., 2009) (BRITTON, 2008).

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CONCLUSÃO

Pelas informações apresentadas, é clara a importância da pimenta para a indústria de alimentos e farmacêutica devido suas características de odor e sabor, e também pela presença de vários metabólitos secundários com atividades biológicas. Entretanto o estudo de variedades brasileiras ainda é relativamente pequeno, bem como o estudo das influências climáticas e dos graus de maturação nos teores de tais metabólitos. Assim, é importante conhecer melhor as formas de cultivo para atender às necessidades de maior ou menor teor de um dado composto, como por exemplo os capsaicinoides que nem sempre são desejáveis em grande quantidade, como no caso do preparo de molhos de pungência baixa a mediana. Além da escolha da variedade de pimenta temos também a escolha de características de cultivo e maturação para atingir uma determinada característica desejável. Nesse sentido esse trabalho contribui para aumentar o conhecimento sobre a composição química de variedades brasileiras de pimentas Capsicum chinense.

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27 ARTIGO 1

SÍNTESE,IDENTIFICAÇÃO E METODOLOGIA ANALÍTICA PARA SEPARAÇÃO DE 17

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Janclei Pereira Coutinho Artigo 1

29

Síntese, Identificação e Metodologia Analítica Para Separação de 17 Capsaicinoides por UHPLC-DAD

Janclei Pereira Coutinhoa*, Gerardo Fernandez Barberob e Helena Teixeira Godoya.

a

Departamento de Ciência de Alimentos, Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, São Paulo, Brasil.

b

Centro de Investigación en Vitivinicultura y Agroalimentación – CAIV, Facultad de Ciencias, Universidad de Cadiz, Cadiz, Espanha.

* janclei_coutinho@yahoo.com.br

Manuscrito em fase final de formatação para envio para publicação no Journal of Separation Science.

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1.1 RESUMO

Os capsaicinoides, compostos responsáveis pelo sabor pungente em pimentas Capsicum, possuem importância elevada não só por suas características sensoriais, mas também por suas atividades biológicas como antioxidante, anti-inflamatória, antitumoral, termogênica, entre outras. Foi realizada a síntese de 15 capsaicinoides de cadeia lateral linear e juntamente com a capsaicina e dihidrocapsaicina comerciais, foi proposto um estudo de otimização para separação desses 17 capsaicinoides no menor tempo possível. Ao final da otimização a melhor condição de separação foi aquela iniciada com 0% de solvente B (acetonitrila com 0,1% de ácido acético), com gradiente linear mudando a fase móvel para 21,42% de B em 0,5 min, e novo gradiente linear mudando a fase móvel para 100% de B em 7,89 min e vazão de 0,7mL.min-1 em coluna C18 (2,1 x 100mm, 1,7 µm), sempre completando 100% com o solvente A (água com 0,1% de ácido acético).

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1.2 ABSTRACT

The capsaicinoids, responsible to pungent flavor in Capsicum peppers, have high importance because of their sensory chacarteristics, and also because of their biological activities such as antioxidant, anti-inflamatory, antitumor, thermogenic among others. The synthesis of 15 linear chain capsaicinoids was achieved done and theses compouds were added to commercial capsaicin and dihydrocapsaicin, and a study of optimization to separate this 17 capsaicinoids in a short time was proposed. Finally, the optimal chromatographyc conditions to separation were a run starting with 0% of solvent B (acetonitrile with 0.1% of acetic acid), with a linear gradient change of the mobile phase to 21.42% of B in 0.5 min, and linear gradient change the mobile phase to 100% of B in 7.89 min, and flow rate of 0.7 mL.min-1 in a C18 (2.1 x 100 mm, 1.7 µm) column, always completing 100% of mobile phase with the solvent A (water with 0.1% of acetic acid).

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1.3 INTRODUÇÃO

As pimentas, frutos de diversas espécies do gênero Capsicum (Solanaceae), são utilizadas na culinária em muitos países, e em diversos segmentos de indústrias alimentícias com o intuito de conferir cor e sabor aos alimentos. Dentre as características sensoriais da pimenta, o seu sabor pungente, é o principal motivo de sua aceitação ou rejeição (SCHWEIGGERT et al., 2006) (STEINHAUS & SCHIEBERLE, 2005) (MANGELS et al., 1993).

Essa característica de pungência das pimentas é causada por um grupo de alcaloides conhecidos como capsaicinoides, sendo predominante nesse grupo a capsaicina e a dihidrocapsaicina. Estes dois compostos são responsáveis por cerca de 90% de toda a pungência da pimenta, mas outros capsaicinoides minoritários também são encontrados em algumas variedades de pimenta, incluindo a norcapsaicina, nordihidrocapsaicina, homocapsaicina I e II, homodihidrocapsaicina I e II, nornorcapsaicina, nonivamida e outros (BARBERO, et al., 2008) (GARCÉS-CLAVER, et al., 2006) (ZEWDIE & BOSLAND, 2001) (CONSTANT et al., 1995).

Além das características sensoriais, aos capsaicinoides também são atribuídas uma série de atividades biológicas como antioxidante (HENDERSON & SLICKMAN, 1999), anti mutagênica e anti tumoral (SURH, et al., 1995) (TOTH & GANNETT, 1992), anti-inflamatória (SANCHO et al., 2002), e estimulante do sistema cardiovascular (MORRIS et al., 1995) (GOVINDARAJAN, & SATHYANARAYANA, 1991), o que tem atraído o interesse da indústria farmacêutica. Além dessas atividades também é relatado que a pimenta auxilia no combate a obesidade, induzindo a termogênese (KANG, et al., 2007)

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(KOVACS & MELA, 2006), (YOSHIOCA, 2001) (YOSHIOCA, 1999) (YOSHIOCA, 1998) (YOSHIOCA, 1995)

No início do século XX a pungência em pimentas era determinada por meio de testes sensoriais como o SHU (Scoville Heat Unit) (SCOVILLE, 1912). Entretanto esse método apresentava algumas limitações sensoriais, como o fato de cada provador sentir a pungência de maneira diferente, ocasionando erros. Com o passar dos anos a pungência em pimentas foi mensurada pela relação direta com os capsaicinoides, compostos responsáveis por tal característica, e a quantificação de capsaicinoides passou a ser realizada por métodos instrumentais como, espectrofotometria (DAVES et al., 2007), espectroscopia (WAGNER et al., 2011), cromatografia em camada delgada (MONFORTE-GONZÁLEZ, et al., 2007) , cromatografia gasosa (PEÑA-ALVAREZ et al., 2009), eletroforese capilar (LIU et al., 2010) e cromatografia líquida de alta eficiência, sendo a última a mais utilizada (OTHMAN et al., 2011) (SCHWEIGGERT et al., 2006) (BARBERO et a., 2008) (ESTRADA et al., 2002). Nos últimos anos começaram a ser publicados trabalhos utilizando a cromatografia líquida de ultra-alta eficiência, do inglês ultra high pressure liquid chromatography (UHPLC) (SGANZERLA et al., 2014) (HA et al., 2010). Os sistemas de ultra eficiência são caracterizados por equipamentos que trabalham com colunas de menores dimensões e tamanho de partícula, o que resulta em análises mais rápidas e com menores gastos de solventes, gerando menos resíduos.

Os processos de otimização multivariada vêm sendo muito utilizados em separações cromatográficas, tendo como principal característica a redução do tempo de análise e número de experimentos, tendo como consequência a redução de custos, e melhor separação. Um exemplo é o trabalho realizado por Breitkreitz (2009), que trabalhou com a separação cromatográfica de 10 pesticidas. Inicialmente esses compostos foram separados

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em cerca de 12 minutos, havendo coeluições parciais entre dois pares de picos, e após a otimização através de ferramentas estatísticas multivariadas conseguiu-se uma separação de todos os compostos em 9 minutos. O trabalho realizado por Ballus (2011), cujo objetivo foi a separação de 13 compostos fenólicos em azeite de oliva, inicialmente utilizava uma condição cromatográfica que separava todos os compostos em 14 minutos, entretanto os picos apresentaram bases relativamente largas e assimétricas. Após o uso de otimização multivariada se obteve uma separação em 12 minutos, com picos simétricos e de menor base, o que resultou numa melhora não só na separação como também na sensibilidade do método proposto.

De uma forma geral os trabalhos encontrados na literatura analisam somente os capsaicinoides majoritários, sendo encontrados poucos trabalhos que analisaram os minoritários nordihidrocapsaicina, homocapsaicina e homodihidrocapsaicina e apenas um trabalho que analisa seis (SGANZERLA et al., 2014) e nove (SCHWEIGGERT et al., 2006) capsaicinoides minoritários.

Esse trabalho tem por objetivo o uso de ferramentas estatísticas multivariadas para o desenvolvimento de um método rápido, reprodutível e com baixo gasto de solvente para análise de capsaicina, dihidrocapsaicina e mais 15 capsaicinoides minoritários.