TÍTULO: ANÁLISE DA EXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS C-FOS E C-JUN EM DIFERENTES FASES DO COMPORTAMENTO ALIMENTAR: PRÉ-PRANDIAL, PRANDIAL, PÓS-PRANDIAL E JEJUM 48 HORAS
TÍTULO:
CATEGORIA: EM ANDAMENTO
CATEGORIA:
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE
ÁREA:
SUBÁREA: BIOMEDICINA
SUBÁREA:
INSTITUIÇÃO: UNIVERSIDADE CIDADE DE SÃO PAULO
INSTITUIÇÃO:
AUTOR(ES): AGOSTINHO DE ALMEIDA NETO
AUTOR(ES):
ORIENTADOR(ES): ANA LUCIA BEIRÃO CABRAL, SANDRA REGINA MOTA ORTIZ
UNIVERSIDADE CIDADE DE SÃO PAULO
PRÓ-REITORIA ADJUNTA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA - PIBIC
TÍTULO DO TRABALHO DE PESQUISA DO ALUNO
“ANÁLISE DA EXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS C-FOS E C-JUN EM DIFERENTES FASES DO COMPORTAMENTO ALIMENTAR: PRÉ-PRANDIAL, PRANDIAL,
PÓS-PRANDIAL E JEJUM 48 HORAS”
PROFESSOR ORIENTADOR: : Profa. Dra. Sandra Regina Mota Ortiz CO ORIENTADOR: Profa. Dra. Ana Lúcia Beirão Cabral
LABORATÓRIO BASES NEURAIS DO COMPORTAMENTO NÚCLEO DE PESQUISA EM NEUROCIÊNCIA (NUPEN)
ALUNO: AGOSTINHO DE ALMEIDA NETO CURSO: BIOMEDICINA
São Paulo 2014
CARACTERIZAÇÃO DO PROBLEMA
O ciclo alimentar é caracterizado por flutuações hormonais e por variações de moléculas sinalizadoras séricas de diversas naturezas, distribuídos através da circulação entero-hepática. Esta sinalização conecta o intestino ao fígado, dando início a regulação, nestes órgãos, de genes alvo que irão comandar, por exemplo, a síntese de ácidos biliares e o metabolismo glicolítico (De Fabiani et al, 2010).
Associado a regulação entérica, o cérebro deve comandar o comportamento alimentar, o que é vital para a sobrevivência do organismo e, portanto, tem alta prioridade nos circuitos neurais.
O comportamento alimentar pode ser dividido em duas categorias: o hedônico e o homeostático. O primeiro refere-se ao “comer por prazer” e é comandado principalmente por sensações prazerosas ao paladar que passam por dois centros no tronco cerebral, o primeiro localizado no trato solitário e o segundo no núcleo parabraquial (Herbert et al 1990; Travers et al, 1987) e atingem vários alvos hipotalâmicos (revisado por Saper et al, 2002).
A necessidade de se alimentar para manutenção do balanço energético caracteriza o comer homeostático, cujo único prazer associado é a eliminação da sensação de fome que causaria desconforto. Os mecanismos cerebrais que comandam este comportamento são dependentes de dois grupos celulares com atividades antagônicas: o hipotálamo lateral que estimularia o comportamento alimentar e o ventromedial que o inibiria, causando a sensação de saciedade. Muitos estudos (Ahima et al, 2000, Barsh e Schwartz, 2002, Elmquist et al, 1998, Elmquist et al 1999, Friedman e Halaas, 1998, Schwartz et al, 2000, Spiegelman e Flier, 2001, Woods et al, 1998) tem detalhado os componentes da circuitaria que regula a manutenção do peso corporal, que por sua vez está intimamente relacionada a saciedade e envolve um importante sinal periférico que regularia este processo fisiológico, denominado leptina (Zhang et al, 1994).
A leptina é um hormônio secretado pelo tecido adiposo branco e mostra um nível sérico elevado quando os animais ou seres humanos estão alimentados, o que poderia sugerir que esta seria responsável pela inibição do comportamento alimentar, ainda mais porque no jejum o nível deste hormônio cai drasticamente (Zhang et al, 1994, Ahima et al, 2000). Entretanto, o alto nível sérico deste hormônio em humanos obesos contradizem esta observação, além do que o apetite voraz em humanos que não expressam leptina (ou
mesmo seu receptor) indica que sua falta é um forte estímulo para a indução da alimentação (Barsh e Schwartz, 2002).
No sistema nervoso central a leptina age sobre receptores tipo 1 de citocinas localizados em vários núcleos cerebrais, que deflagram uma via de transdução dependente de JNK/STAT (Tartaglia, 1997, Tartaglia et al, 1995), porém é no hipotálamo que os receptores estão mais densamente localizados (revisado por Saper et al, 2002). A via JNK/STAT quando ativada mobilizará, dentre outros fatores, c-Jun e c-Fos (Gupta et al, 1995).
Outro hormônio denominado grelina, responsabilizado por agir concomitantemente com a leptina (Bagnasco et al, 2002), é sintetizado no estômago e seus níveis séricos aumentam consideravelmente no jejum (Kojima, et al, 1999), atingindo um pico pré-prandial observado em humanos, o que sugere um possível papel no iniciar da alimentação (Cummings et al, 2001). Da mesma forma que para a leptina os receptores de grelina estão preferencialmente localizados no hipotálamo, principalmente na região ventromedial e núcleo arqueado (Horvath et al, 2001). Outro ponto comum a leptina é que a via de transdução de sinal de grelina também estimula GRIs como c-fos (Dickson e Luckman, 1997) tendo portanto um importante papel na motivação da alimentação e consequentemente um grande potencial terapêutico para o tratamento da obesidade (Delporte, 2012, Kirchner et al, 2012).
Um grande número de estudos tem demonstrado claramente que alguns compostos da dieta afetam a regulação de genes específicos através de múltiplos mecanismos. Para ilustrar esta afirmação podemos mencionar os ácidos graxos que podem agir como ligantes tanto de membrana como nucleares, regulando assim a sinalização intracelular e a expressão gênica (Shimizu, 2009; Wahli et al, 1999). Além disso, estes componentes da dieta podem regular a conformação da cromatina, como por exemplo sulfonafano, um isotiocianato presente em vegetais como o brócolis, que in vitro e in vivo demonstrou aumento global de acetilação de histonas (Myzak et al, 2004, Myzak et al 2006a, Myzak et al 2006b).
De Fabiani e colaboradores (2010) demonstraram que inibidores de HDAC afetam o metabolismo energético, uma vez que camundongos tratados com estes compostos apresentam um decréscimo dos triglicerídeos plasmáticos e não ganham peso, apesar do aumento da ingestão.
Resumindo o que foi fundamentado teoricamente até aqui, entendemos que a regulação gênica clássica ou mesmo por conformação da cromatina, desencadeada pelo
comportamento alimentar, frente ao balanço energético ou mesmo em resposta a determinados componentes da dieta, vem sendo explorada há muito tempo. Entretanto a regulação gênica do comportamento alimentar homeostático por conformação da cromatina ainda carece de exploração científica. Da mesma forma que o hábito alimentar circadiano, o jejum ainda não tem elementos que determinem se as áreas cerebrais que são afetadas por tal estado fisiológico têm seus genes regulados por conformação da cromatina.
O relógio circadiano habilita o indivíduo a antecipar eventos cíclicos do ambiente e está localizado no núcleo supraquiasmático do hipotálamo, onde envolve vias auto-regulatórias de genes específicos denominados clock genes. A regulação destes genes é deflagrada pela luz, o que causa uma sincronização inicial do indivíduo com o ciclo claro/escuro que será posteriormente refinada pelo sistema food-entrainable, e que por sua vez caracterizará os processos antecipatórios alimentares que dependem do relógio circadiano, porém a exata localização deste sistema no cérebro ainda não é totalmente esclarecida (Challet et al, 2009).
O metabolismo dos tecidos periféricos responde, de várias formas, aos sinais metabólicos do organismo e o SNC coordena estes eventos periféricos através de controles diretos e indiretos, tais como a regulação da ingesta e do gasto energético (revisado por Green et al, 2008). Este balanço é responsável pela liberação de fatores como o NAD+ e AcetilCoA que por sua vez podem modular a conformação da cromatina (revisado por Naimi et al, 2009) em tecidos exaustivamente estudados como o hepático, o adiposo (branco e marrom) e o muscular esquelético (Yang et al, 2006) por causa de seu claro envolvimento com o metabolismo.
A escolha do comportamento alimentar como modelo do presente estudo deve-se principalmente ao fato deste ser regido por uma área claramente identificada no SNC. O hipotálamo é considerado um relógio circadiano hierarquicamente superior aos demais e estimulado não só pelo balanço energético, mas também por estímulos externos como o luminoso. Sendo assim, este relógio coordena vários ritmos comportamentais relacionados as atividades diárias do organismo e promove a inter-relação entre os demais relógios periféricos (Green et al, 2008).
Desta forma, o presente projeto tem como objetivo principal avaliar se o hipotálamo como um todo e/ou seus núcleos isoladamente são ativados por regulação gênica dependente da estrutura da cromatina, quando o animal está passando por eventos
antecipatórios ao período alimentar, durante o período alimentar e comparar esta estimulação frente a períodos longos de privação alimentar.
Deste objetivo principal certamente serão derivados outros que sempre estarão relacionados ao comportamento alimentar homeostático, hedônico ou ainda frente a atuação de determinados componentes da dieta na estimulação do SNC. A padronização desta metodologia no laboratório permitirá estudar futuramente o comportamento da cromatina frente a substâncias que alterem o comportamento alimentar ou ainda distúrbios neurológicos relacionados ao controle da ingesta, pelo SNC.
Estes objetivos não perdem de vista a necessidade de avaliar se outros FTs, diferentes de c-Fos, poderiam ser concomitante ou primariamente estimulados. Os fatores c-Jun e CREB seriam fortes eleitos para iniciar esta investigação. O presente estudo pode confirmar ou descobrir possíveis candidatos a ativação gênica que passem a ser utilizados como referencia pela comunidade científica que atualmente considera principalmente Fos como um marcador de atividade neuronal.
OBJETIVOS
Analisar o padrão de expressão das proteínas c-fos e c-jung em diferentes fases do comportamento alimentar: pré prandial, prandial, pós prandial e jejum de 48 horas.
PROCEDIMENTOS METODOLÓGICOS
Para os ensaios de imunohistoquímica (IHC) os animais serão anestesiados com uma injeção intraperitoneal de cloridrato de Ketamina 5% (Konig) e cloridrato de xilazina 2% (Konig) (Merck) a 0,2% na proporção 0,4ml/100g de peso corporal. Em seguida, através de uma bomba peristáltica (Cole Parmer) os animais serão perfundidos por via trans-aórtica inicialmente com 150 ml de uma solução salina 0,9% seguida de 800 ml de uma solução fixadora de paraformaldeído a 4% diluído em tampão fosfato de sódio 0,1M (pH 7,4). Os encéfalos permanecerão na caixa craniana por 3 horas antes de serem removidos e transferidos para uma solução contendo sacarose 20% em tampão fosfato de potássio 0,02M, onde permanecerão por aproximadamente 12 horas. Cortes frontais seriados, com 40m de espessura serão obtidos utilizando-se um micrótomo de congelação. Os cortes serão colhidos sequencialmente em 4 compartimentos, de forma
que a distância entre os cortes adjacentes em um mesmo compartimento será de 160m. Um dos compartimentos será utilizado para detecção imunohistoquímica da proteína Fos e um outro corado pelo método de Nissl, com tionina 0,25% como corante para servir como referência para citoarquitetura.
Os cortes serão incubados inicialmente em uma solução de tampão fosfato de potássio 0,02M contendo triton X-100 a 0,3%, soro normal de cabra a 2% (Vector Laboratories) e anticorpo primário (testaremos anti-Fos incialmente numa diluição de 1:20.000), sob agitação constante, a 4C, durante 72 horas. Para localização do complexo antígeno-anticorpo os cortes serão incubados por 90 minutos com o anticorpo secundário biotinilado. O complexo antígeno-anticorpo será visualizado usando-se a técnica de imunoperoxidase com o complexo biotina-avidina (ABC Elite Kit, Vector Laboratories) para ligar a peroxidase ao complexo antígeno-anticorpo, seguindo o protocolo de Itoh e cols. (1979), ou seja, após lavagens sucessivas, os cortes serão incubados em uma solução contendo 50mg de tetrahidrocloreto de 3-3'diaminobenzidina (DAB), 0,6mg de glicose oxidase, 40mg de cloreto de amônio e 2ml de solução aquosa de sulfato de níquel a 10% em 100ml de tampão fosfato de sódio 0,1M, por 5 minutos. Em seguida, será adicionada a ß-D-glicose (Sigma), e a reação enzimática interrompida após um período de tempo variável, em geral em torno de 15 minutos. Por fim, os cortes serão montados em lâminas recobertas com gelatina, desidratados e recobertos com DPX (Aldrich Chemical Co.). Cortes adjacentes serão corados pelo método de Nissl, com tionina 0,25% como corante.
O material usado para a contagem das células imunorreativas será analisado em microscopia de campo claro e escuro (microscópio óptico Nikon 80i), utilizando como referência citoarquitetônica os cortes corados pelo método de Nissl.
Inicialmente, será feita a seleção de imagens correspondentes a região da matéria cinzenta periaquedutal, utilizando-se a objetiva 10X de aumento, de um microsópio Nikon 80i (Nikon Corporation, Chiyoda-Ku, Tokyo-To, Japan) equipado com uma câmera digital Nikon DXM1200F (Nikon Corporation). Para a quantificação das células Fos positivas, será feito o delineamento das bordas da região de interesse, definidas com o auxílio da série corada pelo método de Nissl. As células Fos positivas serão contadas dentro das bordas da região de interesse, sendo consideradas apenas aquelas com núcleos ovais corados em preto. A densidade de células Fos positivas será determinada pelo número de células Fos positivas, dividido pela área da região de interesse. A contagem do número total de células e a determinação da área serão feitas com o auxílio do programa computacional
Image-Pro Plus (Image-Pro Plus, versão 4.5.1, Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA).
RESULTADOS E IMPACTOS ESPERADOS
O presente trabalho pretende mapear as regiões hipotalâmicas (a princípio) ativadas pelo comportamento alimentar homeostático e frente ao jejum, reproduzindo inicialmente dados da literatura com c-Fos, para posteriormente investigar a expressão de novos fatores de transcrição relacionados a genes de resposta imediata, como o c-jun. O mapeamento inicial será fundamental para que, a partir das mesmas técnicas sedimentadas (isolamento dos tecidos e preparo de extratos por exemplo) possamos avaliar, por novas metodologias a serem incorporadas no laboratório, se a expressão dos reguladores de conformação da cromatina ou ainda de modificação das histonas foram alteradas.
CRONOGRAMA DE EXECUÇÃO Agosto a Novembro de 2014: # Levantamento bibliográfico; # Padronização dos experimentos;
Dezembro de 2014 a Março de 2015:
# Realização dos experimentos de imunoistoquímica; # Processamento dos resultados;
Abril a Julho de 2015: # Análise dos resultados; # Preparação do manuscrito.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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