TÍTULO: INFLUÊNCIA DE DIFERENTES FOTOPERÍODOS SOBRE O METABOLISMO DE CARBONO EM PLANTAS DE SETARIA ITALICA
TÍTULO:
CATEGORIA: CONCLUÍDO CATEGORIA:
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE ÁREA:
SUBÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS SUBÁREA:
INSTITUIÇÃO: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS INSTITUIÇÃO:
AUTOR(ES): KEILA SUEMI KAWAKAMI AUTOR(ES):
ORIENTADOR(ES): MARINA CÂMARA MATTOS MARTINS ORIENTADOR(ES):
COLABORADOR(ES): LUCIA DANIELA WOLF COLABORADOR(ES):
Influência de diferentes fotoperíodos sobre o metabolismo de carbono em plantas de Setaria italica
1. Resumo
As plantas são consideradas os sistemas químicos mais sofisticados existentes no planeta, capazes de utilizar a luz solar para converter CO2 em
carboidratos nas folhas durante o dia pelo processo de fotossíntese. Durante a noite, o metabolismo e crescimento vegetal dependem das reservas de carboidratos, acumuladas geralmente na forma de amido. Pelo seu estilo de vida séssil, as plantas necessitam adaptar-se às flutuações ambientais diárias, sincronizando eventos internos e externos. Neste projeto estudamos a influência de diferentes fotoperíodos no metabolismo de carbono (C) na gramínea Setaria italica, considerada uma planta modelo de fotossíntese C4. Flutuações na síntese e degradação de amido, açúcares solúveis e açúcares fosforilados foram avaliadas em dois fotoperíodos: natural (13 h luz/11 h escuro) e de dias curtos (8 h luz/16 h escuro). Foi possível verificar que essa espécie possui níveis de amido nas folhas similares aos descritos para a planta modelo C3 Arabidopsis thaliana e também consegue se adaptar em relação à mudança no fotoperíodo, alterando a velocidade de degradação de amido conforme o comprimento da noite, de maneira a evitar privação de C. Essa gramínea acumula grandes quantidades de açúcares solúveis nos caules, que se comportam como órgão de armazenamento.
2. Introdução
Devido seu estilo de vida séssil, as plantas necessitam adaptar-se às flutuações ambientais diárias, sincronizando eventos internos como suprimento de carbono (C) e externos como mudanças de luz e temperatura. As plantas são consideradas os sistemas químicos mais sofisticados existentes no planeta (Stitt et al. 2010a) e durante o dia utilizam a luz solar para converter CO2 em carboidratos
nas folhas pelo processo de fotossíntese, geralmente acumulando parte dos fotoassimilados na forma de amido transitório (Stitt & Zeeman 2012). Resumidamente, o amido é sintetizado nos cloroplastos a partir de frutose-6P, um dos intermediários do ciclo de Calvin-Benson, que é convertida em diferentes reações a ADP-glicose, utilizada na formação de novas ligações glicosídicas para alongar cadeias de glicanos (para informação detalhada sobre a fixação de C e
síntese de amido ler Stitt et al. 2010b, Zeeman et al. 2010). Durante a noite, o amido é degradado de maneira tão controlada que as reservas disponíveis sustentam as atividades metabólicas (crescimento, respiração e exportação de C na forma de sacarose para outros órgãos da planta) durante toda a noite, e apenas uma
pequena porcentagem de amido resta no final da noite. Esse controle do “turnover”
de amido permite que a planta evite períodos recorrentes de privação de C durante a noite, e maximiza a disponibilidade de reservas para o crescimento (Smith& Stitt 2007, Stitt et al. 2007, Graf et al. 2010).
O padrão aparentemente simples de assimilação, acúmulo e utilização de C durante o ciclo diuturno depende de uma complexa e flexível rede de controle, importante para manter um balanço apropriado de C (Smith & Stitt 2007). Parâmetros de comprimento de onda, intensidade, direção e duração da luz podem alterar a quantidade de C fixado no ciclo de 24 h. Alguns exemplos seriam a estimulação da síntese de amido em plantas crescidas em períodos curtos de luz e o fato da degradação de amido ser afetada pelo comprimento do fotoperíodo (Chatterton & Silvius 1980, Gibon et al. 2004).
As diferentes espécies de plantas podem armazenar diferentes quantidades de amido em suas folhas, dependendo de sua estratégia e/ou mecanismos para sobreviver o período de escuro. O controle eficiente do uso das reservas de amido é um fator importante na determinação do crescimento e da biomassa da planta (Sulpice et al. 2009). A biomassa vegetal é a matéria prima para a produção de biocombustíveis e compreender como as plantas crescem em resposta a diferentes estímulos ambientais e como o metabolismo se adéqua frente a estes estímulos é de extremo interesse para a conversão de biomassa em biocombustíveis.
O presente projeto teve por objetivo estudar a influência de diferentes fotoperíodos no metabolismo de C em plântulas de Setaria italica, uma gramínea diplóide com sistema de fotossíntese C4 que tem se destacado como planta modelo (Li & Brutnell 2011, Lata et al. 2013) devido ao tamanho pequeno do genoma (aproximadamente 515 Mb) já sequenciado, ciclo de vida curto e estreita relação filogenética com gramíneas amplamente utilizadas para a produção de biocombustíveis, como milho, sorgo e cana-de-açúcar .
3. Objetivos
O projeto teve por objetivo geral estudar a influência de diferentes fotoperíodos no metabolismo de carbono em plântulas de Setaria italica, uma gramínea diplóide com sistema de fotossíntese C4 que tem se destacado como planta modelo. Os objetivos específicos foram: avaliar os conteúdos de amido, açúcares solúveis e fosforilados em dois fotoperíodos distintos.
4. Metodologia e Desenvolvimento 4.1. Cultivo de Plantas
Sementes de Setaria italica foram cultivadas em duas condições: (a) fotoperíodo natural (13 h luz/11 h escuro) e (b) dias curtos (8 h luz/ 16h escuro), em casa de vegetação. Após cerca de 30 dias de cultivo, quatro replicatas (compostas por 4 plântulas cada) foram coletadas em diferentes períodos do ciclo diuturno sendo imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e conservadas a -80ºC.
4.2. Extração e quantificação de açúcares solúveis
Alíquotas de aproximadamente 20 mg de matéria fresca foram extraídas com etanol de acordo com Cross et al. (2006). Os extratos etanólicos foram secos em concentrador a vácuo e ressuspendidos em água Mili Q. As amostras foram filtradas e analisadas por cromatografia de troca aniônica de alta resolução com detector de pulso amperométrico (HPAEC/PAD) em sistema Dionex (modelo ICS-3000), utilizando-se coluna CarboPac PA-1. Identificação, integração e quantificação de açúcares foram realizadas pela comparação com padrões externos utilizando o software Chromeleon (versão 6.8, Dionex).
4.3. Determinação de amido
O amido foi determinado na fração insolúvel após a extração etanólica de acrodo com Hendriks et al. (2003). Após a digestão do amido, o conteúdo de glicose foi ensaiado enzimaticamente, acoplando a redução de NADP+ a NADPH em leitor de microplacas (Stitt et al. 1989).
4.4. Extração e quantificação de hexoses fosfato
Alíquotas de 100 mg de de matéria fresca extraídas com ácido tricloroacético em éter conforme Jelitto et al. (1992). Hexoses-fosfato foram determinadas por espectrofotometria através de ensaio enzimático sensível acoplando a redução de
5. Resultados
Para o experimento de fotoperíodo natural, plantas de S. italica foram cultivadas entre os meses de setembro e outubro de 2013. Após 30 dias de cultivo, as plantas possuíam uma altura média de 10,4 cm e cerca de 11 folhas. As plantas do experimento de dias curtos foram cultivadas nos meses de janeiro e fevereiro de 2014. A coleta foi realizada após apenas 24 dias de cultivo, devido ao intenso calor que ocasionou o florescimento prematuro das plantas. Devido ao fato das plantas mudarem seu metabolismo e o modo de gerenciar as reservas de C durante a floração, este estudo teve como prioridade a análise no período vegetativo. No momento da coleta, plantas de dias curtos apresentavam uma altura média de 9,6 cm e 9 folhas.
Os níveis de amido apresentaram padrão de acúmulo durante o dia e degradação linear durante a noite em folhas, com consumo quase total das reservas ao final da noite (Fig. 1A e B). Pelo fato dos experimentos terem sido realizados em condições naturais de luminosidade, foi possível notar um atraso de algumas horas para o início significativo do acúmulo de amido nas folhas, provavelmente devido à baixa intensidade luminosa durante as primeiras horas do dia. Como esperado, no cultivo em fotoperíodo natural houve uma maior produção de amido (71,8 µmol por grama de peso fresco às 12h de luz) quando comparado aos dias curtos (43,8 µmol por grama de peso fresco às 8h de luz), devido ao maior tempo de luz para realização da fotossíntese e acúmulo de reservas. Nas folhas de plantas de S. italica cultivadas em fotoperíodo natural, ocorreu uma maior taxa de síntese de amido entre 4h e 8h de luz, que se manteve constante até às 12h. A degradação de amido começou já no final do período de luz, indicando que a intensidade de luz ao final do dia não era suficiente para suprir a demanda energética da folha. No final da noite, as folhas de S. italica de fotoperíodo natural continham cerca de 7% (5,1 µmol por grama de peso fresco) de amido remanescente.
Nas plantas expostas a dias curtos, a concentração de amido nas folhas aumentou consideravelmente entre 6h e 8h de luz. Essas plantas já começam o período noturno com quantidade menor de amido em relação ao fotoperído natural (39% a menos), e a taxa de degradação de amido necessita ser ajustada de forma a garantir que as reservas durem até o amanhecer. Entretanto, essa diminuição na taxa de degradação de amido é geralmente acompanhada por um decréscimo no consumo de carbono utilizado para o crescimento (Sulpice et al. 2014). No final da
noite, o amido remanescente correspondeu a 2,4% (1,05 µmol por grama de peso fresco) do conteúdo no final do dia.
No caule, em ambos os tratamentos, o conteúdo de amido se manteve relativamente constante ao longo do dia e da noite (Fig. 1A e B).
Figura 1. Comparação do teor de amido em folhas e caules de S. italica cultivadas em fotoperíodo natural (13 h luz/11 h escuro) (A) e dias curtos (8 h luz/16 h escuro) (B). Dados mostrados são média ± desvio padrão (n=4), em µmol por grama de peso fresco.
A análise de açúcares solúveis revelou uma tendência geral de acúmulo de açúcares durante o dia, com pico às 8 h de luz, e decréscimo durante a noite, em todos os órgãos e tratamentos (Fig. 2). A exceção foi a sacarose em folhas de plantas cultivadas em dias curtos, que apresentou maiores teores às 6 h de luz.
O carboidrato encontrado em maior quantidade em folhas e caules de S. italica, em ambos os tratamentos, foi a sacarose (Fig. 2A e B), um dissacarídeo considerado produto final da fotossíntese e também sintetizado durante a noite a partir dos produtos de degradação de amido (glicose e maltose) (Smith & Stitt 2007). Enquanto nas plantas cultivadas em fotoperíodo natural o conteúdo de sacarose nos diferentes órgãos foi similar (com exceção de 8 h de luz, em que as folhas apresentaram mais sacarose que os caules) (Fig. 2A), plantas cultivadas em dias curtos apresentaram maior quantidade de sacarose nos caules em relação às folhas (Fig. 2B). É importante destacar que várias gramíneas armazenam o excesso de carboidratos solúveis nas células do parênquima que circundam os feixes vasculares localizados nos entrenós do caule (Slewinski 2012) e esta observação é clara para plantas de S. italica cultivadas em dias curtos.
Os níveis de glicose foram geralmente superiores nos caules, quando comparados às folhas, em ambos os fotoperíodos. Contudo, em condição de fotoperíodo natural a diferença entre os órgãos foi mais expressiva que em dias curtos (Fig. 2C e D).
Figura 2. Comparação de açúcares solúveis em folhas e caules de S.italica cultivadas em fotoperíodo natural (13 h luz/11 h escuro) (A e C) e dias curtos (8 h luz/16 h escuro) (B e D). (A) e (B) Sacarose, (C) e (D) Glicose. Dados mostrados são média ± desvio padrão (n=4), em µmol por grama de peso fresco.
Devido à importância dos açúcares fosforilados como intermediários não apenas da via glicolítica, mas também para a síntese e degradação de carboidratos como sacarose e amido, foi utilizado um ensaio enzimático específico para verificar as flutuações diárias nos conteúdos de glicose-6-P (Glc6P), frutose-6-P (Fru6P) e glicose-1-P (Glc1P). Os níveis hexoses-fosfato estiveram mais elevados em fotoperíodo natural quando comparado a dias curtos, com exceção da Glc1P (Fig. 3). Em dias curtos, as folhas apresentaram maiores teores de açúcares fosforilados e o inverso foi detectado em fotoperíodo natural, no qual estes açúcares foram
A
C D
encontrados em maior quantidade no caule (Fig. 3). Nas folhas das plantas cultivadas em fotoperíodo natural, houve uma tendência de um pico de hexoses fosfato às 8 h de luz. Após esse período, os níveis decaem e permanecem baixos ao longo do período noturno (Fig. 3A, C e E). Nos dias curtos foi observado um padrão de açúcares fosforilados em níveis constantes ao longo do ciclo diuturno no caule (Fig. 3B, D e F). Já nas folhas, foi possível verificar um pico às 6 h de luz, seguido de queda e níveis baixos de hexoses fosfato ao longo da noite. A exceção foi a Fru6P, que se manteve elevada até 8 h de luz e após o início da noite decaiu de maneira quase linear (Fig. 3D). Tanto a Glc6P quanto a Glc1P apresentaram um acúmulo gradativo ao longo do dia nas folhas em dias curtos e decréscimo rápido já nas primeiras horas da noite, permanecendo sem grandes flutuações (Fig. 3B e F).
A B
C D
Figura 3. Comparação do conteúdo de hexoses-fosfato presentes em folhas e caules de S. italica cultivadas em fotoperíodo natural (13 h luz/11 h escuro) (A, C e E) e dias curtos (8 h luz/16 h escuro) (B, D e F). (A) e (B) Glicose-6-P, (C) e (D) Frutose-6-P, (E) e (F) Glicose-1-P. Dados mostrados são média ± desvio padrão (n=4), em nmol por grama de peso fresco.
6. Conclusão
Em conjunto, esses resultados mostram as diferenças no metabolismo de C em folhas e caules de S. italica ao longo do ciclo diuturno e a flexibilidade das plantas para se adaptarem a diferentes situações ambientais, como por exemplo, mudanças no comprimento do dia e da noite. As folhas suprem a demanda por energia de todos os órgãos da planta através da exportação de fotossiamilados durante o dia, que são convertidos em carboidratos de reserva na forma de amido, consumido para seu próprio metabolismo e crescimento durante a noite. Quanto maior o tempo de luz, maior o acúmulo de amido nas folhas. Quanto maior o tempo de escuro, mais lentamente as plantas precisam degradar as reservas de amido. É sabido que o relógio circadiano controla a regulação temporal de diversos processos moleculares e fisiológicos ao longo do ciclo diuturno, incluindo a degradação do amido. Entretanto estudos mais aprofundados são necessários para desvendar o exato mecanismo pelo qual o relógio determina a velocidade da degradação de amido.
7. Agradecimentos
KSK foi bolsista de iniciação científica no laboratório Nacional de Ciência e Tecnologia do Bioetanol e agradece ao CNPq pelo financiamento concedido (PIBIC 162864/2013-2).
8. Referências
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