Fisiologia digestiva e dieta peletizada para engorda do polvo Octopus vulgaris tipo II
Tese submetida ao Programa de Pós-Graduação em Aquicultura da Universidade Federal de Santa Catarina para a obtenção do Grau de Doutor em Aquicultura.
Orientadora: Dra. Débora Machado Fracalossi Coorientadora: Dra. Tatiana Silva Leite
Florianópolis 2018
Este trabalho é dedicado à minha mãe e amiga, Rute e aos professores, que nos inspiram e nos ensinam a voar.
Agradeço a Deus pela oportunidade trilhar esta jornada incrível que é a vida.
À minha orientadora Dra. Débora M. Fracalossi, por aceitar este desafio que foi trabalhar com os polvos, pela carinhosa acolhida e por acreditar no meu trabalho. Mais que orientadora, tornou-se uma amiga! Foi um grande presente ser sua aluna.
Ao co-orientador e colaborador Dr. Carlos Rosas Vásquez pelos ensinamentos e inspiração para a ciência e a vida, pela oportunidade do estágio do doutorado sanduíche na Universidade Nacional Autónoma do México. À Maru Chimal, pela ajuda fundamental nas análises de laboratório, pelo carinho e por ter sido “mi mamá” mexicana durante o estágio sanduíche.
À co-orientadora Dra. Tatiana Leite, pelo aprendizado e por me fazer compreender um pouco da visão ecológica e taxonômica dos polvos. Aos professores do Departamento de Aquicultura, Felipe Vieira, Andreatta, Walter, Katt, Marcão e Claudio por acreditarem no projeto, no meu trabalho e pelas oportunidades. Aos professores Evoy e Alex pelo importante apoio nas atividades de campo e laboratório. Às profas Aimê e Anita, pelas oportunidades de mostrar um pouco do mundo dos polvos para os alunos da graduação e pelo apoio.
Aos colegas do Labnutri Vitor, Renatinha, Camila, Tati, Lula, Jorge, Adriano, Jeff, Lizi, Bruna, Amarilis, Maria Fernanda, Alan, Janice, Bruno, Flávio, Johnes, Marcos, Lucas e Marieta. À Stefany (UNIPAMPA) pelo auxílio nas análises centesimais no Labnutri. À Soninha por todo o esforço e empenho em ajudar, sempre. Por nos motivar ao sair cantando depois de um dia exaustivo de trabalho!
Aos colegas do Lapad Renata, Maurício, Ronaldo, Pedrão, Luciano, Vinícius, Jô, Samara, aos vigilantes Felipe, Deni, Bê e Cleber e ao pessoal responsável pela limpeza pela grande ajuda durante as atividades.
Aos técnicos, servidores e alunos do LCM pelo apoio e auxílio antes, durante e pós-experimentos.
Aos professores da UNAM, Pedro Gallardo, Cristina Pascual e Maité pelos ensinamentos e pelo apoio nas atividades. À Claudia Caamal pela ajuda e supervisão no laboratório. À Ariadna Sánchez pela dedicação e apoio nas análises enzimáticas. Ao professor Alberto Olivares (Universidade de Antofagasta, Chile) pelo auxílio no laboratório e pelos ensinamentos.
À família Paraíso das Ostras por serem grandes parceiros. Em especial ao Vinícius, Joyce, Gi, D. Ione e Paulista por “pegarem junto” conosco e acreditarem meu trabalho.
Ao Ricardo S. Lopes pela ajuda incondicional no projeto, por estar sempre junto nas capturas debaixo de sol e chuva, nos experimentos e pelas muitas aventuras em prol dos polvos no Brasil e no México. Obrigada pela parceria, paciência e motivação...mais do que aluno do projeto, tornou-se um grande amigo.
À equipe polvo Douglas, Ricardo, Rodrigo, Ana Paula, Carol, Débora, Clara e José Parra por vestirem a camisa do projeto e atuarem com toda dedicação para fazer o melhor em prol da aquicultura e dos polvos. À Luciana, pelo apoio nas atividades desde a graduação e pela parceria, auxílio e colaboração durante o projeto.
Aos colegas da UNAM pelo apoio e carinhosa recepção. À amiga Itzel pela parceria, ajuda no laboratório e pelos momentos divertidos e gastronômicos. Aos colegas do Club Pulpito, Ariadna, José, Nelly, Neli, Eloy, Adriana, Estefy pelos momentos de descontração.
À Dona Silvia e Don Antônio pela carinhosa recepção, pelos ensinamentos nas pescarias de polvo, na fabricação das dietas e cuidado com os polvos.
À minha família, pelo apoio, paciência e compreensão. À minha mãe por ser um exemplo de superação, força e amor incondicional. À minha irmã Isis pelo carinho e apoio, ao meu padrasto José Paulo pelo apoio e torcida. Ao meu cunhado Fabrício pelo incentivo de sempre. Em especial à vó Zulma, por entender minha ausência e todos os dias me guardar nas suas orações.
Ao meu namorado Fernando pelo carinho, incentivo, apoio, paciência e compreensão. Por estar sempre ao meu lado nesta caminhada. Pelo importante auxílio e apoio técnico nas coletas, experimentos e discussões científicas. Ao Tito pelos inúmeros momentos de alegria e por ser um grande parceiro em todas as horas. Às queridas Ges, Lili, Cacá e Gugu pela torcida sempre, mesmo tão longe de nós e do mar.
Aos meus grandes amigos que foram essenciais nesta caminhada. Ao meu amigo Felipe Weber por acreditar em mim, no meu projeto de doutorado e pro ter iluminado o caminho para o início de tudo. À minha amiga Leila pela amizade, irmandade, companheirismo e pelo apoio fundamental em todos os sentidos, sem o qual meu doutorado não teria sido possível.
À minha amiga Bia Sarzana por ser mais uma irmã nesta caminhada, pelas palavras de conforto, risadas, incentivo às mudanças e a manter o foco, obrigada!
caminhadas na praia para espairecer.
Ao meu amigo André Brandão por ser um exemplo de fé e perseverança, por mostrar que podemos ir muito além do que imaginamos..és meu eterno guerreiro! Ao amigo Rafinha pelo apoio, por sempre acreditar no meu trabalho com os polvos, pelas inúmeras conversas, choros e risos, música e cultura, e pelo companheirismo.
Ao meu grande amigo e mestre, Anildo. Por ser uma luz nesta jornada, pelos ensinamentos e pelas oportunidades de aprender amis sobre mim mesma a cada dia.
Aos amigos Natyta, Augusto e Pipoca pelas inúmeras conversas, churrascos, surfe, pelos momentos de alegria, risadas e descontração. Em especial à Natyta pelo incentivo, sempre. Aos amigos Juliano, Claudia, Isabela Bacalhau, Ana Carol Marcelino, Gui Zanette e Lula pela torcida e motivação.
Ao amigo Combo pela torcida e apoio desde o início e pelas conversas motivacionais, tornando mais leve essa caminhada. Xero!
Ao Marcelo e família, pela recepção carinhosa e acolhedora durante as pescarias de polvo.
Ao Carlito pela grande ajuda, orientação perante as dúvidas, puxões de orelha e abraço fraterno quando preciso. Obrigada também pelo incentivo!
À CAPES e CNPq pela concessão da bolsa e financiamento do projeto.
“Queremos ter certezas e não dúvidas, resultados e não experiências, mas nem mesmo percebemos que as certezas só podem surgir através das dúvidas e os resultados somente através das experiências.”
RESUMO
Os polvos são espécies emergentes para a diversificação da aquicultura marinha mundial. Uma das principais problemáticas para o cultivo comercial de polvos é a ausência de dietas peletizadas ou extrusadas que promovam crescimento e sobrevivência adequados. Dietas formuladas com ingredientes processados em altas temperaturas tem promovido baixas taxas de crescimento e sobrevivência ou até mesmo taxas de crescimento negativas, atribuídas à baixa digestibilidade da dieta. Portanto, conhecer os processos de digestão, absorção e assimilação dos nutrientes e os fatores que modulam o ambiente digestivo é fundamental para elaboração de dietas eficientes de acordo com a capacidade digestiva dos animais. Para tanto, foram propostos dois experimento. No primeiro, caracterizamos a atividade das proteases totais no suco gástrico e glândula digestiva em Octopus vulgaris Tipo II adultos e avaliamos sua dinâmica digestiva. Esta espécie apresentou digestão predominantemente ácida, com máxima atividade proteolítica em pH 3 a 4 e em altas temperaturas (40 a 70 °C), o que confirma o seu hábito carnívoro com alta capacidade adaptativa das enzimas digestivas. A digestão ocorreu em duas etapas: a primeira aos 60 min após a alimentação, com rápida passagem de nutrientes solúveis ao longo do trato digestório e a segunda a partir dos 200 min, tornando-se gradativamente mais lenta, envolvendo digestão, absorção e assimilação de nutrientes mais complexos. O tempo de digestão foi de 400 min, quando o trato digestório está preparado para iniciar uma nova refeição. Esta espécie utiliza proteínas como principal fonte de energia e mobiliza proteínas antes dos lipídios na digestão intracelular, com padrão de digestão diferente de espécies tropicais e subtropicais-temperadas. No segundo experimento, testamos uma dieta peletizada com ingredientes processados a 40 °C e uma dieta semiúmida com ingredientes in natura (dieta controle) para engorda de Octopus vulgaris Tipo II subadultos, quanto ao desempenho zootécnico e atividade de enzimas digestivas. Observamos boa aceitação da dieta peletizada pelos polvos, além de maior estabilidade na água e menor lixiviação desta em relação à dieta controle. Ambas as dietas proporcionaram o mesmo crescimento, sobrevivência, eficiência e conversão alimentar, embora as taxas de ingestão total, proteica e energética tenham sido maiores em polvos alimentados com a dieta semiúmida. Ainda, a dieta peletizada estimulou maior atividade de amilase, pepsina-like e quimotripsina no ceco como resposta fisiológica para melhorar a absorção e assimilação dos nutrientes. Concluímos que a dieta peletizada com ingredientes processados a 40 ºC promove efeito positivo sobre o crescimento,
sobrevivência e atividade das enzimas digestivas dos polvos e, portanto, pode ser utilizada como dieta referência para o estudo da nutrição e alimentação de polvos.
Palavras-chave: Aquicultura, cefalópode, dieta formulada, dinâmica digestiva, processamento térmico.
ABSTRACT
Octopus are emerging species for the diversification of world marine aquaculture. However, one of the main problems for their commercial grow out is the absence of pelleted or extruded diets that promote adequate growth and survival. Diets formulated with ingredients processed at high temperatures have promoted low rates of growth and survival or even negative growth rates, which are attributed to the low diet digestibility. Therefore, knowing the processes of digestion, absorption and assimilation of nutrients and factors that modulate the digestive environment is fundamental to elaborate efficient diets, according to the digestive capacity of the animals. In this sense, two experiments were proposed. In the first one, we characterize the activity of the total proteases in the gastric juice and digestive gland in Octopus vulgaris type II adults, and evaluate its digestive dynamics. This species presented a predominantly acidic digestion, with maximum proteolytic activity at pH 3 to 4 and at high temperatures (40 to 70 ° C), which confirm its carnivorous feeding habit, with a high adaptive capacity of the digestive enzymes. The digestion occurred in two stages: the first one at 60 min after feeding, with fast passage of soluble nutrients along the digestive tract, and the second, after 200 min, becoming gradually slower, involving digestion, absorption and assimilation of more complex nutrients. The timing of digestion was 400 min, when the digestive tract was ready to digest a new meal. This species uses proteins as the main source of energy and mobilizes proteins before the lipids in intracellular digestion, presenting a different pattern of digestion from octopus species from tropical, subtropical-temperate species. In the second experiment, we tested a pelleted diet with ingredients processed at 40 ° C and a semi-moist diet with raw ingredients (control diet) for subadults of O. vulgaris type II, with respect to the performance and activity of digestive enzymes. We observed good acceptance of the pelleted diet pelleted by the animals, besides greater stability in the water and less leaching when compared to the control diet. Both diets provided the same growth, survival, feed efficiency, and feed conversion, although total protein and energy intake rates were higher in octopus fed the semi-moist diet. Furthermore, the pelleted diet stimulated higher activity of amylase, pepsin-like and chymotrypsin in the cecum, as a physiological response to improve absorption and assimilation of nutrients. We conclude that the pelleted diet manufactured with ingredients processed at 40 ºC promotes positive effect on the growth, survival and activity of the digestive enzymes of the
octopus and, therefore, can be used a reference diet for nutrition and feeding studies with octopus.
Keywords: Aquaculture, cephalopod, formulated diet, digestive dynamic, thermal treatment.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Volume desembarcado na pesca de grupos de cefalópodes (FAO, 2016). ... 30 Figura 2. Octopus vulgaris Tipo II no costão do Pântano do Sul, Florianópolis, Santa Catarina. P= polvo na toca; R= Resto alimentar (crustáceo) ao redor da toca. ... 39 Figura 3. Visão ventral da anatomia externa do polvo Octopus vulgaris tipo II. MB: Massa bucal. ... 41 Figura 4. Parte superior e inferior do bico de Octopus vulgaris tipo II. A barra representa 1 cm ... 41 Figura 5. Anatomia interna de Octopus vulgaris Tipo II. Visão dorsal dos órgãos internos, com ênfase no sistema digestório: a) bico; b) massa bucal; c) primeiro par de glândulas salivares; d) esôfago e) sistema nervoso; f) segundo par de glândulas salivares; g) papo (ou estômago anterior); h) estômago posterior; i) ceco; j) glândula digestiva ou hepatopâncreas; l) aorta; m) brânquias; n) coração branquial. ... 42 Figura 6. (A). Anatomia do trato digestório de Octopus vulgaris, (B) passagem do alimento pelo trato digestório de O. vulgaris. Setas finas indicam fluxo das partículas sólidas e setas grossas indicam locais de absorção. Adaptado de Boucaud-Camou e Boucher-Rodoni (1983) e Martinez (2014). ... 43 Figura 7. Fisiologia digestiva de Octopus maya e Octopus mimus, demonstrando a rota do alimento e a sequência necessária para o quimo alcançar cada parte do trato digestório (GALLARDO et al., 2017). ... 45 Figura 8. Análise de Componentes Principais (PCO) por tempo de amostragem e variáveis: variação do volume do quimo no estômago anterior (EA), estômago posterior (EP) e ceco (Ce), como porcentagem do volume total do suco gástrico (mL kg polvo-1), índice da glândula digestiva (IGD, %) e taxa de ingestão (TI, %) durante o processo digestivo em adultos de Octopus vulgaris tipo II. ... 73
Figura 9. Variações na proteína total solúvel (mg. mL-1) no suco gástrico e quimo durante a digestão em O. vulgaris tipo II adultos alimentados com siri. Valores expressos em média ± SEM. Letras diferentes indicam diferenças estatísticas entre os tempos amostrais (p < 0,05). ... 74 Figura 10. Efeito do pH na atividade das proteases totais da glândula digestiva de Octopus vulgaris tipo II adultos nos tempos 0 min (n=03) e 200 min (n=03) após a alimentação. Valores expressos em média ± SEM. ... 75 Figura 11. Atividade das proteases totais do suco gástrico de Octopus vulgaris tipo II adultos nos tempos 0 min (n= 03) e 200 min (n=03) após a alimentação na faixa de pH 1-12.Valores expressos em média ± SEM. Letras diferentes indicam diferenças estatísticas entre os tempos (p < 0,05). ... 76 Figura 12. Atividade de proteases ácidas e alcalinas no estômago anterior de O. vulgaris Tipo II adultos durante a dinâmica digestiva nos períodos antes (tempo zero) e após a ingestão (tempos 60, 120, 200, 300 e 400 min). Valores expressos como media ± SEM. Letras diferentes indicam diferença estatística entre médias dos tratamentos (p < 0,05). ... 79 Figura 13. Atividade de proteases ácidas e alcalinas no segundo estômago de O. vulgaris Tipo II adultos durante a dinâmica digestiva nos períodos antes (tempo zero) e após a ingestão (tempos 60, 120, 200, 300 e 400 min). Valores expressos como media ± SEM. Letras diferentes indicam diferença estatística entre médias dos tratamentos (p < 0,05). ... 80 Figura 14. Atividade de proteases ácidas e alcalinas no ceco de O. vulgaris Tipo II adultos durante a dinâmica digestiva nos períodos antes (tempo zero) e após a ingestão (tempos 60, 120, 200, 300 e 400 min). Valores expressos como media ± SEM. Letras diferentes indicam diferença estatística entre médias dos tratamentos (p < 0,05). 81 Figura 15. Atividade de proteases ácidas e alcalinas na glândula digestiva de adultos de O. vulgaris Tipo II durante a dinâmica digestiva nos períodos antes (tempo zero) e após a ingestão (tempos 60, 120, 200, 300 e 400 min). Valores expressos como media ± SEM.
Letras iguais indicam médias estatisticamente iguais entre os tratamentos (p < 0,05). ... 82 Figura 16. Análise de Coordenadas Principais (PCoA) dos metabólitos solúveis da glândula digestiva (GD) e hemolinfa de O. vulgaris Tipo II adultos durante a dinâmica digestiva nos períodos antes (tempo zero) e após a ingestão (tempos 60, 120, 200, 300 e 400 min). Números nos símbolos indicam os tempos em minutos dos períodos experimentais. ... 84 Figura 17. Atividade enzimática (média ± erro padrão) de amilase (A) e “pepsina-like” (B) na glândula digestiva (GD) e suco gástrico (SG) em subadultos de Octopus vulgaris tipo II, alimentados com dieta semiúmida e dieta peletizada, por 25 dias. SG EA: suco gástrico do estômago anterior, SG EP: suco gástrico do estômago posterior, SG Ce: suco gástrico do ceco. Letras diferentes na mesma série indicam diferença significativa entre as médias dos tratamentos (P < 0,05). .... 110 Figura 18. Atividade enzimática (média ± erro padrão) de tripsina e quimotripsina no suco gástrico (SG) e glândula digestiva (GD) em subadultos de Octopus vulgaris Tipo II alimentados com dieta semiúmida e dieta peletizada, por 25 dias. SG EA: suco gástrico do estômago anterior, SG EP: suco gástrico do estômago posterior, SG Ce: suco gástrico do ceco. Letras diferentes na mesma série indicam diferença significativa entre as médias dos tratamentos (P < 0,05). .... 111 Figura 19. Zimograma da atividade das proteases totais na faixa de pH 3,0 a 9,0 da glândula digestiva e suco gástrico de subadultos de Octopus vulgaris Tipo II alimentados com dieta semiúmida e dieta peletizada, por 25 dias. GD: glândula digestiva, SG EA: suco gástrico do estômago anterior, SG EP: suco gástrico do estômago posterior, SG Ce: suco gástrico do ceco. Os sufixos (C) indicam os polvos que receberam a dieta semiumida e (D) polvos que receberam a dieta peletizada... 113 Figura 20. Zimograma da atividade das amilases na faixa de pH 5,0 a 9,0 da glândula digestiva e suco gástrico de subadultos de Octopus vulgaris Tipo II alimentados com dieta semiúmida e dieta peletizada, por 25 dias. GD: glândula digestiva, SG EA: suco gástrico do estômago anterior, SG EP: suco gástrico do estômago posterior, SG Ce: suco gástrico do ceco. Os sufixos (C) indicam polvos que
receberam a dieta semiúmida e (D) polvos que receberam a dieta peletizada. ... 114 Figura 21. Taxas de crescimento específico (% peso corporal dia-1) expressas em % da matéria seca obtidas em diferentes experimentos realizados em condições semelhantes de temperatura (18-21°C) e período experimental (26-29 dias), com dietas formuladas extrusadas e semiúmidas para subadultos de Octopus vulgaris. ... 118
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Fontes proteicas em dietas formuladas para Octopus maya. . 54 Tabela 2. Fontes proteicas em dietas naturais e formuladas para Octopus vulgaris. ... 55 Tabela 3. Condições de ensaio para avaliação da atividade das proteases ácidas e alcalinas em Octopus vulgaris tipo II adultos durante o processo digestivo. SG = suco gástrico antes da ingestão; Quimo = mistura de suco gástrico e alimento; GD = atividade das enzimas da glândula digestiva antes do alimento; GDaa = atividade das enzimas da glândula digestiva após a alimentação; Hb % = porcentagem de hemoglobina utilizada como substrato para enzimas ácidas; % Cas = porcentagem de caseína utilizada como substrato para enzimas alcalinas. ... 69 Tabela 4. Peso corporal (kg), índice da glândula digestiva (IGD, %), taxa de ingestão (TI, g kg-1 polvo) e volume do quimo (mL kg-1) de O. vulgaris tipo II adultos durante a dinâmica digestiva nos períodos antes (tempo zero) e após a ingestão (tempos 60, 120, 200, 300 e 400 min). ... 72 Tabela 5. Efeito da temperatura na atividade enzimática das proteases totais do suco gástrico em pH 3, 6, 8 e 10, coletadas de Octopus vulgaris Tipo II adultos antes (0 min) e após a alimentação (200 min). .. 77 Tabela 6. Efeito da temperatura na atividade enzimática das proteases totais do da glândula digestiva em pH 3, 4, 10 e 11, coletadas de Octopus vulgaris Tipo II adultos antes (0 min) e após a alimentação (200 min). ... 78 Tabela. 7. Variações (média ± SEM) de proteínas solúveis, glicose, acilgliceróis e colesterol na glândula digestiva (GD) e hemolinfa, e proteína solúvel e glicose no músculo de Octopus vulgaris Tipo II durante a dinâmica digestiva nos períodos antes (tempo zero) e após a ingestão (tempos 60, 120, 200, 300 e 400 min)... 85 Tabela 8. Análise de PERMANOVA e PERMADISP (valores de p para os testes de permutação) para dados de metabólitos na hemolinfa (M H) e glândula digestiva (M GD) em Octopus vulgaris Tipo II durante a dinâmica digestiva nos períodos antes (tempo zero) e após a ingestão (tempos 60, 120, 200, 300 e 400 min)... 86
Tabela 9. Formulação e composição centesimal das dietas experimentais (%, na matéria seca)... 162 Tabela 10. Índices zootécnicos de subadultos de Octopus vulgaris Tipo II alimentados com dieta semiúmida e dieta peletizada por 25 dias...109 Tabela 11. Atividade enzimática em mU mg proteína -1 de amilase, tripsina, quimotripsina e pepsina-like na glândula digestiva (GD), suco gástrico do estômago anterior (SG EA), suco gástrico do estômago posterior (SG EP) e suco gástrico do ceco (SG Ce) em subadultos de Octopus vulgaris Tipo II alimentados com dieta semiúmida e dieta peletizada, por 25 dias... 112
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
BSA... Albulmina sérica bovina DNS... Ácido dinitrossalissílico SDS... Dodecil sulfato de sódio TCA……. Ácido tricloroacético
PUFA…...ácido graxo poli-insaturado (polyunsaturated fatty acid)
AOAC…. Association of Official Analytical Chemists
FAO……. Food and Agriculture Organization of United Nations IBGE... Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
Cm... centímetros G... grama Mg... miligrama mL... mililitro mm... milímetro min... minuto mM... micromol mJ... milijoule mU ... miliU L... litro H... hora
UI... Unidade Internacional pH... potencial hidrogeniônico
LISTA DE SÍMBOLOS °C graus Celsius < maior > menor ≈ aproximadamente % porcentagem α letra grega alfa
µ micro (sistema internacional de unidades) ± mais ou menos
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO GERAL ... 29 Importância dos polvos na aquicultura ... 29 Antecedentes e estado atual da criação de polvos no Brasil ... 33 Biologia dos polvos ... 36 Anatomia e fisiologia do polvo ... 40 Enzimas digestivas ... 46 Desafios na nutrição de polvos ... 49 OBJETIVOS ... 58 Objetivo geral ... 58 Objetivos específicos ... 58 CAPÍTULO 1 ... 61
Caracterização enzimática e dinâmica digestiva em Octopus vulgaris Tipo II ... 61 Resumo ... 62 Introdução ... 62 Materiais e métodos ... 65 Delineamento experimental ... 65 Origem dos animais e condições experimentais ... 66 Procedimentos éticos ... 66 Coleta de amostras ... 67 Quantificação da proteína total solúvel e preparação dos ensaios enzimáticos ... 67 Condições ótimas de pH, temperatura e concentração de substrato para enzimas digestivas... 68 Metabólitos da hemolinfa, glândula digestiva e músculo ... 69 Análises estatísticas ... 69 Resultados ... 70 Peso total, índice da glândula digestiva, taxa de ingestão e volume do quimo ... 70 Proteína total solúvel no quimo ... 73 Condições ótimas de pH, temperatura e concentração de substrato para enzimas digestivas... 75
Atividade enzimática durante o processo de digestão ... 78 Metabólitos na hemolinfa, glândula digestiva e músculo ... 83 Discussão ... 86 Caracterização da atividade das proteases totais ... 86 Dinâmica digestiva ... 87 Conclusão ... 90 Agradecimentos ... 91 Referências ... 91 CAPÍTULO 2 ... 97
Dieta peletizada com tratamento térmico de ingredientes para engorda de Octopus vulgaris Tipo II: desempenho e atividade enzimática. ... 97 Introdução ... 98 Materiais e métodos ... 100 Delineamento e dietas experimentais ... 100 Material biológico e condições experimentais ... 102 Procedimentos éticos ... 104 Índices zootécnicos calculados ... 104 Análise da composição centesimal e energia das dietas ... 105 Coleta de amostras de suco gástrico e tecidos ... 105 Extração das enzimas e dosagem de proteínas totais solúveis ... 106 Ensaios enzimáticos ... 106 Atividade enzimática em gel ... 107 Análises estatísticas ... 108 Resultados ... 108 Desempenho zootécnico ... 108 Enzimas digestivas ... 109 Discussão ... 114 Agradecimentos ... 121 Referências ... 121 CONCLUSÃO GERAL ... 127 REFERÊNCIAS DA INTRODUÇÃO GERAL ... 129 ANEXOS ... 145
INTRODUÇÃO GERAL
Importância dos polvos na aquicultura
Os moluscos constituem, em volume, o segundo grupo mais cultivado na aquicultura mundial, o que corresponde a 32% (16,1 milhões de toneladas) da produção aquícola marinha e o terceiro grupo em termos econômicos, gerando 19 bilhões de dólares, em 2014 (FAO, 2016).
No Brasil, o cenário para o desenvolvimento e inovação da aquicultura marinha é otimista, especialmente pela ampla região litorânea, com cerca de 8.500 km de extensão, à diversidade das áreas costeiras e variedade de espécies nativas com potencial para criação. Entretanto, apesar de os moluscos representarem o segundo grupo de maior biodiversidade animal do Brasil (FERREIRA e MAGALHÃES, 2004), a malacocultura ainda é pouco explorada. É baseada na exploração de apenas três grupos: mexilhões, ostras e vieiras, representando somente 1,5% da produção aquícola nacional (IBGE, 2016). Diante da necessidade de diversificação da maricultura, esforços precisam ser direcionados para pesquisas de novas espécies nativas de moluscos para a aquicultura.
Dentre os moluscos, os polvos apresentam grande potencial para a aquicultura marinha devido à crescente demanda de consumo para alimentação humana no mercado mundial, ao elevado valor comercial e às características zootécnicas favoráveis à criação (VAZ-PIRES et al., 2004). Os polvos são muito apreciados na gastronomia mundial e consumidos em diversos continentes, principalmente na Ásia, Europa e América. Além disso, a exploração dos polvos pela indústria da pesca tem crescido significativamente em nível global nas últimas décadas, o que explica sua importância como recurso pesqueiro. Segundo dados da FAO (2016), o volume de polvo capturado passou de 0,5 milhões de toneladas em 1950 para 4,2 milhões de toneladas entre 2014 e 2015, período em que foi registrado o novo recorde em termos de volume de polvos desembarcados (Figura 1). De acordo com Jereb et al. (2016), este volume pode, ainda, estar subestimado devido a problemáticas na coleta destes dados, as quais estão relacionadas: 1) aos volumes de captura não declarados por alguns países, 2) a falhas na coleta de dados provenientes de pesca artesanal ou de subsistência, 3) a polvos capturados na fauna acompanhante da pesca de outras espécies alvo e 4) a polvos utilizados como iscas. Esta expansão nas capturas de polvo pode ser explicada em parte, pela substituição de espécies marinhas sobrexplotadas, que tiverem seus nichos ecológicos ocupados por espécies oportunistas, como os polvos (DOUBLEDAY et al., 2016), mas principalmente, pelo reflexo da
crescente demanda de polvo para consumo humano. O valor comercial bastante atrativo, entre 10 a 14 € kg-1 no mercado internacional (GARCIA et al., 2014), também estimula o crescimento deste mercado.
Figura 1. Volume desembarcado na pesca de grupos de cefalópodes
(FAO, 2016).
O principal interesse pela criação de polvos é para alimentação humana, pois são excelente fonte proteica. Os polvos, em geral, apresentam em sua composição corporal (na matéria seca) cerca de 84 % proteínas, 7% lipídios, 7% cinzas e 1 % carboidratos (LEE, 1994). Apresentam alto rendimento de carcaça, pois a porção comestível representa cerca de 80 a 85 % do corpo inteiro (LEE, 1994), o que reflete aproveitamento corporal bastante atrativo quando comparado a 40 a 50 % para crustáceos e 20 a75 % para peixes (KREUZER, 1984; FAO, 1989). Além do valor nutricional, as principais características zootécnicas que destacam a potencialidade dos polvos para criação, são: fácil adaptação ao confinamento; reprodução natural com elevada fecundidade, podendo produzir de 100 a 500 mil ovos por fêmea (IGLESIAS et al., 2007) e paralarvas recém eclodidas com comprimento dorsal do manto de 2 a 3 mm (VIDAL et al., 2010); aceitação de alimento inerte (ROSAS et al., 2013); eficiência alimentar entre 25 e 54 % com dieta natural (PRATO et al., 2010), elevadas taxas de crescimento, que podem variar entre 18 a 40 g. dia-1 com dieta natural (AGUADO-GIMÉNEZ, GARCÍA-GARCÍA, 2002; DOMINGUES; GARCIA, GARRIDO, 2010). Adicionalmente, pode-se obter subprodutos do processamento da carcaça dos polvos como a tinta e o bico. A tinta,
produzida naturalmente nos cefalópodes, é utilizada como ingrediente no preparo de iguarias na culinária mundial. O bico possui quitina, da qual se pode obter a quitosana (KOUETA et al., 2014), com múltiplos usos na indústria farmacêutica, alimentícia, fotográfica, no tratamento de água e efluentes, entre outros (KUMAR, 2000).
Nas últimas décadas, o interesse crescente por polvos em distintas áreas tem contribuído significativamente para avanços da criação experimental de diferentes espécies. Além da criação (ITAMI et al., 1963; IGLESIAS et al., 2014), estudos em diversas temáticas como biologia (BOYLE, 1983; VILLANUEVA et al., 2017), comportamento (WELLS, 1962; CARDWELL et al., 2012), fisiologia (WELLS, 1978; GALLARDO et al., 2017), ecologia (BOYLE e HODHOUSE, 2005; OLMOS-PEREZ et al., 2017) e, mais recentemente, aspectos relacionados ao bem estar animal (FIORITO et al., 2014) e às mudanças climáticas (REPOLHO et al., 2014; CAAMAL-MONSREAL et al., 2015), aumentam o conhecimento sobre as principais espécies com potencial para aquicultura. Os polvos também são utilizados como modelos de estudo na neurociência (FIORITO et al., 2015), robótica (SFAKIOTAKIS et al., 2015) e biomedicina, incluindo potenciais componentes no tratamento de câncer (DING et al., 2011). Adicionalmente, polvos e sépias são muito apreciados para fins ornamentais, sendo responsáveis pelo rápido crescimento do setor de criação de cefalópodes (VIDAL et al., 2014).
Atualmente, o maior conhecimento sobre criação de polvos está baseado em duas espécies: Octopus vulgaris (Cuvier 1797), espécie cosmopolita, e Octopus maya (Voss & Solis 1966), espécie endêmica do México. Ambas são consideradas “espécies bandeira” pela importância como recurso pesqueiro, mercado consumidor estabelecido e maior conhecimento sobre os aspectos biológicos e zootécnicos (VIDAL et al., 2014). Um livro publicado recentemente por Iglesias et al. (2014) sobre criação de cefalópodes, reuniu os principais avanços na criação de outras espécies de polvo, em diferentes países. São elas: Amphioctopus aegina (Gray 1849), Octopus mimus (Gould 1839), Octopus minor (Sasaki 1920), Enteroctopus megalocyathus (Gould 1852) e Robsonella fontaniana (d’Orbigny 1834).
Os polvos apresentam, basicamente, duas estratégias de vida. Algumas espécies produzem relativamente poucos ovos (algumas centenas) e de grande tamanho, produzindo juvenis bentônicos bem desenvolvidos e outras espécies produzem milhares de ovos pequenos que, após a eclosão, liberam indivíduos planctônicos (paralarvas) os quais
nadam ativamente, capazes de se dissipar no meio, ocupando nichos ecológicos distintos dos adultos (VILLANUEVA e NORMAN, 2008). De maneira geral, os polvos apresentam quatro transições durante o ciclo de vida (ROBIN et al., 2014):
I) Do adulto ao ovo: transição do ovo fertilizado dentro da fêmea até a postura dos ovos, mudando o modo de vida de dentro da fêmea para o ambiente externo à fêmea.
II) Do ovo à paralarva (algumas espécies): transição da alimentação endógena para exógena.
III) Primeira alimentação da paralarva ao subadulto: transição do modo de vida planctônico para o bentônico, no qual a paralarva adota o modo de vida dos adultos. Em espécies holobentônicas, refere-se à transição da primeira alimentação do juvenil ao período em que adotam o modo de vida dos pais. O indivíduo subadulto é morfologicamente similar, porém com menor tamanho em relação ao indivíduo adulto e é imaturo sexualmente (YOUNG e HARMAN, 1988).
IV) Subadulto ao adulto: transição do indivíduo imaturo para maduro, ou seja, quando alcança a maturidade sexual,independente do tamanho.
Apesar do potencial aquícola e mercadológico, uma das principais problemáticas para o desenvolvimento da criação de polvos a nível mundial, é a dependência de dietas naturais. Espécies que possuem a fase de paralarva, como Octopus vulgaris, apresentam altas taxas de mortalidade nos primeiros dois meses do ciclo de vida devido à qualidade nutricional das dietas ofertadas, que não suprem adequadamente às exigências nutricionais das paralarvas (IGLESIAS e FUENTES, 2014). Por esta razão, a produção em escala comercial do O. vulgaris, a qual é realizada somente na Espanha, ocorre a partir da engorda de indivíduos subadultos, capturados no ambiente natural, mantidos em estruturas no mar (flutuantes ou bentônicas) e alimentados com espécies marinhas de peixes e crustáceos de baixo valor comercial, em sistema intensivo (GARCÍA-GARCIA et al., 2014). Nesse sistema, polvos com peso mínimo inicial de 750 g podem alcançar até 3500 g no período de 90 a 120 dias, com 80 % de sobrevivência (GARCÍA-GARCIA et al., 2014). Já a criação do polvo Octopus maya é realizada com ciclo completo em laboratório, em escala piloto, no México. Em sistema semi-intensivo, é possível obter animais com cerca de 500 g, a partir de 6 a 7 meses de criação (ROSAS et al., 2014). As principais limitações para a produção comercial do O. maya são a falta de competitividade do preço de mercado do polvo de criação frente ao oriundo da pesca artesanal e a ausência de
dietas formuladas comercialmente viáveis, que garantam adequado crescimento na fase da engorda.
Para alcançar a produção comercial de polvo, é primordial o uso de dietas nutricionalmente completas, adequadas à espécie alvo e obtidas a um custo economicamente viável. Atualmente, os custos elevados das dietas formuladas que são utilizadas com sucesso na alimentação de juvenis de polvo, impedem a transição da criação em escala experimental para produção em larga escala.
O desenvolvimento de uma dieta eficiente para polvos, passível de consumo e que proporcione bom desempenho e sobrevivência, exige o conhecimento dos aspectos básicos da sua fisiologia digestiva. Estas informações permitem compreender que tipo de ingredientes são digeridos e assimilados adequadamente pelos polvos e quais métodos de processamento dos ingredientes e das dietas são capazes de melhorar a absorção e assimilação do alimento de acordo com a capacidade digestiva dos polvos.
No cenário atual, estudos relacionados à nutrição de polvos são praticamente inexistentes no Brasil apesar da sua grande importância para o desenvolvimento da atividade. Portanto, é essencial que esforços sejam direcionados para estudos sobre aspectos fisiológicos e nutricionais das espécies nativas de polvo, o que irá possibilitar o desenvolvimento da produção comercial e minimizar a exploração dos estoques naturais. Antecedentes e estado atual da criação de polvos no Brasil
No Brasil, há pelo menos seis espécies nativas com potencial para a aquicultura: Octopus insularis (Leite e Haimovici 2008), Octopus vulgaris tipo II (Cuvier 1797), Eledone massyae (Voss 1984), Eledone gaucha (Haimovici 1988), Octopus hummelincki (Adam 1936) e Octopus joubini (Robson, 1929).
As espécies Octopus insularis e Octopus vulgaris tipo II são consideradas de alto potencial para a diversificação da maricultura no Brasil, em razão da importância comercial e das características biológicas adequadas para a criação (MYHRE et al., 2017). O polvo O. insularis, é uma espécie recém-descrita que habita zonas tropicais, encontrada no Brasil desde o Espírito Santo até a região Nordeste, estendendo-se até a região do Caribe e ilhas oceânicas (AMOR et al., 2015; JEREB et al., 2016; LIMA et al., 2017).
O polvo Octopus vulgaris tipo II, anteriormente denominado O. vulgaris, está classificado como uma nova espécie e sua descrição taxonômica está sendo reavaliada. O. vulgaris compreende um complexo
de espécies com morfologia e comportamento semelhantes, porém geneticamente diferentes entre si (AMOR et al., 2017). Este complexo de espécies, historicamente consideradas uma única espécie cosmopolita (O. vulgaris), são encontradas no Mar Mediterrâneo, Australásia, Europa, África, Ásia e nas Américas (AMOR et al., 2017). Habitam a plataforma continental em profundidades de 0 a 200 m (VAZ-PIREZ et al., 2004). Em razão das diferentes espécies, a faixa de tolerância de temperatura das espécies que compõem o “complexo vulgaris” variam conforme a região. Na Europa, recomenda-se mantê-los em temperaturas entre 10°C e 20°C (VAZ-PIREZ et al., 2004) e no limite máximo até 22°C (AGUADO-GIMENEZ e GARCIA-GARCIA, 2002). Na costa da África do Sul, habita águas com temperatura entre 12°C e 24°C (OOSTHUIZEN e SMALE, 2003). A salinidade é um fator limitante para esta espécie, não devendo ultrapassar a faixa entre 25 e 37 (VAZ-PIREZ et al., 2004). No Brasil, distribui-se em toda a costa brasileira, sendo capturada principalmente nas regiões Sudeste e Sul, onde é mais representativa em termos de volume de desembarque e valor econômico (ÁVILA-DA-SILVA et al., 2014). No sul do Brasil, O. vulgaris Tipo II é encontrado em áreas marinhas e estuarinas (TEIXEIRA, 2011). De modo geral, ambas as espécies, O. insularis e O. vulgaris tipo II, possuem rápido crescimento, alta fertilidade, ciclo de vida curto e produção massiva de ovos (VIDAL et al., 2014; LENZ et al., 2015), o que lhes confere características bastante atrativas para a aquicultura.
As espécies Eledone massyae e Eledone gaucha habitam regiões de águas frias entre 15 a 22 °C, sendo capturadas na pesca nas regiões Sudeste e Sul do Brasil (PEREZ et al., 2010) no tamanho comercial entre 100 e 350 g, quando alcançam a fase adulta (CARVALHO, 2007). O pequeno tamanho destas espécies explica porque são, muitas vezes, comercializadas como “mini polvo”. São espécies bastante atrativas para a maricultura por desenvolvimento direto, isto é, sem fase paralarval e pelo fato de já existir mercado consumidor.
O mercado também é promissor para o setor de ornamentais marinhos, especialmente para espécies nativas de polvos de pequeno tamanho como Octopus hummelincki e o polvo pigmeu Octopus joubini. Apesar da potencialidade e diversidade de espécies para a maricultura, do valor atrativo de mercado e da necessidade de aliviar a pressão pesqueira sobre os estoques naturais, a criação de polvos no Brasil é praticamente inexistente. Os poucos estudos taxonômicos, a dificuldade de acesso às pequenas comunidades pesqueiras e a escassez de informações in situ sobre pesca e comercialização de polvos dificulta a real caracterização da produção destes cefalópodes no Brasil. Os dados
mais recentes disponíveis, mostram que os polvos são o terceiro grupo mais capturado na pesca extrativa de moluscos, equivalendo a 14% do total da produção pesqueira de moluscos marinhos no Brasil (MPA, 2012), tendo, como principal destino, a exportação para União Europeia e Ásia (MDIC, 2014).
Assim como no cenário mundial, a fase crítica da criação do O. vulgaris tipo II no Brasil é a larvicultura. Por conseguinte, a obtenção de juvenis e adultos depende da pesca no ambiente, o que exige bastante esforço de captura. Isto porque, informações sobre a distribuição espacial e temporal desta espécie, em áreas rasas e intermediárias do litoral sul e sudeste do Brasil são praticamente inexistentes. Este fator associado a uma tímida tradição da pesca artesanal de polvos nessas regiões, tornam a obtenção de polvos do ambiente para fins de aquicultura uma atividade difícil e bastante onerosa.
As primeiras experiências na criação de polvos no Brasil foram realizadas em Santa Catarina, em 2005. Nas pesquisas com engorda experimental, subadultos de O. vulgaris tipo II foram mantidos em gaiolas flutuantes, semelhantes ao sistema utilizado na Espanha, com taxas de crescimento entre 0,5 e 1,0 kg mês-1 (SALUM, 2005; VIDAL et al., 2007). Posteriormente, foi registrada a ocorrência de O. vulgaris tipo II em áreas de maricultura, possivelmente relacionada à atratividade destas áreas como abrigo e fonte de alimento para os polvos (TEIXEIRA, 2011), o que despertou maior interesse em aproveitar estes animais como fonte de renda complementar para o maricultor. Neste contexto, Bastos et al. (2014) ao utilizarem gaiolas leves, de pequeno volume e fácil manejo, demonstraram que é possível engordar polvos subadultos com ganho em peso médio de 400 g em 36 dias, utilizando dieta natural de baixo valor comercial. Adicionalmente, Ferreira (2012), verificou em estudo experimental, que o manejo alimentar em dias alternados é uma prática viável para engorda de polvos entre 500 g e 1,8 kg, em sistema artesanal.
Os primeiros ensaios de reprodução e larvicultura do O. vulgaris tipo II no Brasil foram realizados na Universidade Federal do Rio Grande (FURG) e publicados em uma revisão internacional sobre a criação desta espécie, elaborado por Iglesias et al. (2007). Neste estudo, foi possível manter paralarvas até 40 dias de vida, com taxas de sobrevivência de 20 a 39 %, em laboratório.
O polvo O. insularis apresenta características zootécnicas semelhantes às espécies do “complexo vulgaris”, o que justifica sua grande potencialidade para a aquicultura marinha. As primeiras informações sobre reprodução, desenvolvimento embrionário e estágio inicial do ciclo de vida das paralarvas em criação experimental são
bastante recentes (LENZ et al., 2015). Ainda, um novo estudo relatou respostas fisiológicas frente à tolerância salina de O. vulgaris e O. insularis sob condições controladas em laboratório (AMADO et al., 2015).
Apesar da grande potencialidade das espécies nativas de polvo para aquicultura marinha no Brasil, há uma grande lacuna no que diz respeito ao conhecimento sobre sua fisiologia digestiva e nutrição. Estudos sobre estas temáticas são praticamente inexistentes no Brasil, o que evidencia a necessidade de gerar informações, tanto sobre a dieta dos polvos no ambiente, quanto da capacidade digestiva destas espécies, tendo em vista o desenvolvimento de dietas formuladas adequadas. Diante desta problemática, é primordial dar início a estas ações para viabilizar a produção de polvos no Brasil.
Biologia dos polvos
Os polvos pertencem à classe Cephalopoda, juntamente com as lulas, lulas vampiro, sépias e nautilus (BOYLE e RODHOUSE, 2005). São animais bentônicos, com exceção de algumas espécies (neotênicos e holopelágicos) (VILLANUEVA e NORMAN, 2008), que têm ampla distribuição geográfica, desde a linha do equador até as zonas polares, sendo encontrados tanto em águas rasas de recifes tropicais como regiões de águas frias até 5.000 m de profundidade (JEREB et al., 2016).
As espécies mais conhecidas são da família Octopodidade, abrangendo atualmente cerca de 300 espécies, as quais são encontradas até 600 m de profundidade (JEREB et al, 2016). São animais exclusivamente marinhos. Com exceção de polvos que habitam ambientes recifais e zonas entre marés, a maioria das espécies de polvos toleram salinidade na faixa de 27 e 37 (VAZ-PIREZ et al., 2004; AMADO et al., 2015).
Os polvos são dioicos e possuem desenvolvimento direto (sem fase larval propriamente dita) (BOLETZKY e VILLANUEVA, 2014). Cabe esclarecer que o termo “paralarva”, proposto por Young e Harman (1988), é definido como “cefalópode que, logo após a eclosão dos ovos, é planctônico em águas superficiais, durante o dia e tem modo de vida distinto dos adultos”. As paralarvas nascem completas e não sofrem metamorfose propriamente dita como ocorre com larvas de peixes e camarões (VILLANUEVA e NORMAN, 2008), portanto, são praticamente miniaturas dos adultos. Ao nascerem, apresentam braços curtos e capacidade natatória limitada (VILLANUEVA, 1996) e, portanto, são bastante delicadas. Nos primeiros dias de vida, as paralarvas
fazem a transição da alimentação endógena (vitelo) para o exógena (alimento vivo), período crítico em razão da inabilidade das paralarvas em tolerar até mesmo curtos períodos de inanição devido às elevadas taxas metabólicas (VIDAL et al., 2002). A temperatura é um fator determinante durante esta fase de transição alimentar. O tempo necessário para a completa absorção do vitelo diminui exponencialmente com o aumento da temperatura (VIDAL et al., 2002). Em condições controladas a 16°C, o vitelo é totalmente absorvido nos primeiros dois dias após a eclosão (VIDAL et al., 2002b) e as paralarvas, se forem privadas de alimentação exógena, conseguem sobreviver até o 4º dia após a eclosão (VIDAL et al., 2006).
A mudança do hábito planctônico para o bentônico depende da espécie e de fatores ambientais. As paralarvas do O. vulgaris assentam com 7,5 mm de comprimento dorsal do manto,independente da idade e temperatura da água (ITAMI et al., 1963, VILLANUEVA et al., 1995). Mudanças alométricas durante o crescimento exponencial das paralarvas limitam a capacidade natatória das mesmas, favorecendo o assentamento no final da fase planctônica (VILLANUEVA, 1996). Nesta fase de transição, sob condições controladas, ocorrem altas mortalidades, as quais são atribuídas principalmente à deficiência nutricional das dietas, que não atendem adequadamente às exigências das paralarvas (IGLESIAS et al., 2007). Na criação experimental, as altas taxas de mortalidade que ocorrem durante a transição da absorção do vitelo para consumo do alimento vivo (PARRA et al., 2000) e a ausência de dietas capazes de suprir, tanto a elevada demanda metabólica, quanto as particularidades nutricionais das paralarvas, explicam porque a larvicultura é uma etapa crítica para viabilizar a criação comercial do O. vulgaris.
Os polvos são carnívoros, considerados predadores oportunistas e extremamente versáteis (BOYLE e RODHOUSE, 2005). Assim como os demais cefalópodes, são conhecidos como o grupo mais avançado entre os invertebrados, com cérebro grande e altamente desenvolvido (HUFFARD, 2013), o que lhes confere competências variadas e bastante particulares para identificar, capturar e ingerir alimento vivo ou inerte desde os primeiros estágios do ciclo de vida. Possuem um sistema sensorial complexo, o que permite comportamento sofisticado para detectar o alimento, evitar predadores e comunicar-se entre congêneros de forma similar aos vertebrados (VILLANUEVA et al., 2017). Os polvos podem localizar e reconhecer uma presa de diversas maneiras e têm capacidade para utilizar uma ou mais combinações de habilidades, tais como visual, tátil e via órgãos sensoriais (ROCHA, 2003). A visão dos polvos é bem desenvolvida, com estrutura ocular muito semelhante à
dos peixes (JAGGER e SANDS, 1999), são capazes de diferenciar objetos quanto ao formato, tamanho, orientação e brilho, mas não as cores (WELLS, 1978). Além disso, possuem visão polarizada, que lhes permite detectar e reconhecer o alimento com mais precisão (VILLANUEVA et al., 2017). A capacidade sensorial dos polvos vai além destas aptidões. Os cefalópodes possuem receptores sensoriais que formam uma linha lateral semelhante à dos peixes, a qual permite sentir suaves correntes de água e vibrações (VILLANUEVA et al., 2017). Órgãos olfativos situados na cabeça, respondem a estímulos químicos também pelo odor, auxiliando na detecção de presas (BOAL e GOLDEN, 1999). Além disso, células receptoras presentes nos braços, ventosas e na região bucal conferem aos cefalópodes a capacidade de detectar um amplo espectro de estímulos químicos e mecânicos (WELLS, 1978; VILLANUEVA et al., 2017). Nos polvos, cada ventosa possui cerca de 10.000 células quimiorreceptoras, as quais são bastante úteis e precisas na detecção de alimento vivo (BUDELMANN, 1996) ou de alimento inerte, especialmente dos compostos lixiviados na água, como os aminoácidos (LEE, 1992).
O conhecimento do hábito alimentar e aspectos comportamentais para captura e tomada do alimento são informações chave para garantir a manutenção segura de polvos em ambiente controlado. No habitat natural, os polvos procuram diversidade de presas para atender às exigências nutricionais e o metabolismo proteico, os quais mudam dramaticamente conforme o desenvolvimento ontogenético, o habitat e as fases do ciclo de vida (VILLANUEVA et al., 2017). São predadores visuais e forrageiam o fundo para encontrar e capturar as presas (HANLON e MESSENGER, 1996). No ambiente, alimentam-se principalmente de crustáceos e bivalves (MATHER et al., 2012) e, em menor proporção, de gastrópodes, quitons, peixes teleósteos, poliquetas e equinodermos (AMBROSE, 1984; SCHEEL e ANDERSON, 2012). A dieta natural pode variar conforme a localização geográfica, abundância e disponibilidade de alimento (LEITE et al., 2016), bem como a demanda energética para a captura e manipulação da presa (Mc QUAID, 1994). Ainda, a dieta pode variar em função da exigência metabólica, a qual está relacionada ao estágio reprodutivo e sexo (CORTEZ, 1995; ARMENDARIZ-VILLEGAS et al., 2014).
Em determinadas situações, quando os recursos são escassos e há alta densidade de indivíduos, os polvos podem praticar canibalismo, possivelmente relacionado a sua alta demanda metabólica (VILLANUEVA et al., 2017). Outros fatores que podem influenciar esta prática são as mudanças ambientais, disponibilidade de alimento, tamanho e dimorfismo sexual (IBÁÑEZ e KEYL, 2010). Embora sejam
animais solitários, a falta de socialização entre indivíduos também pode provocar este comportamento, quando em contato com seus pares (MATHER e SCHELL, 2014). Sob condições controladas, o canibalismo pode se tornar um problema se não for realizado manejo adequado dos animais. Portanto, o conhecimento destes aspectos é importante para evitar que o canibalismo seja uma prática recorrente na criação.
A composição da dieta no ambiente pode ser determinada por meio da identificação de restos alimentares espalhados ao redor das tocas (SCHEEL et al., 2016), análise do conteúdo estomacal (REGUEIRA et al., 2017), isótopos estáveis (CHEREL et al., 2009) e técnicas moleculares (ROURA et al., 2012; GARRIDO et al., 2017). No ambiente natural, o O. vulgaris tipo II (Figura 2), assim como outras espécies de polvo, deixam partes rígidas não ingeridas das presas, tais como carapaças, conchas e espinhos, ao redor das tocas que habitam (MATHER e SCHEEL, 2014).
Figura 2. Octopus vulgaris Tipo II no costão do Pântano do Sul, Florianópolis, Santa Catarina. P= polvo na toca; R= Resto alimentar (crustáceo) ao redor da toca. .
De maneira geral, os crustáceos são predominantes na dieta dos polvos (SMITH, 2003) e, dentro deste grupo, a composição das espécies pode variar conforme o tipo de habitat, profundidade e o tipo de substrato (GUERRA, 1978; DANTAS, 2017). Em determinados ambientes, como na costa da África do Sul, outros grupos aparecem como os itens mais abundantes na dieta do O. vulgaris, como bivalves (SMALE e BUCHAN, 1981) e gastrópodes (HATANAKA, 1979), o que confirma o padrão comportamental oportunista desta espécie.
( P) ( R) (P) (R)
O conhecimento sobre a dieta das paralarvas no ambiente ainda é bastante incipiente. Estudos recentes com uso de técnicas moleculares têm demonstrado informações importantes sobre o hábito alimentar das paralarvas. Segundo Roura et al. (2012; 2016), as paralarvas de O. vulgaris alimentam-se principalmente de larvas de crustáceos, independente da abundância de outros tipos de presas, pelo menos nas primeiras semanas de vida. Além dos crustáceos, as paralarvas ingerem uma grande diversidade de outras espécies em menor abundância, porém, com certa frequência temporal, tais como larvas de peixes, moluscos e outros invertebrados como poliquetas, equinodermos e hidrozoários (OLMOZ-PEREZ et al., 2017). Estas informações abrem um leque maior de possibilidades de dietas para a larvicultura do O. vulgaris e, por conseguinte, um novo cenário para o desenvolvimento da criação de polvos com fase paralarval.
Anatomia e fisiologia do polvo
As adaptações morfológicas para alimentação de cefalópodes são fundamentadas nos braços, na boca e no trato digestório (ROCHA, 2003). Nos polvos, a boca é formada pelo bico envolto em uma massa muscular, chamada massa bucal (Figura 3), a qual é rodeada por um anel de oito apêndices denominados “braços” (BOUCAUD-CAMOU e BOUCHER-RODONI, 1983; BOYLE e HODHOUSE, 2005). Espécies do gênero Octopus possuem duas fileiras de ventosas sésseis em cada braço, com as quais o polvo agarra e segura presas que podem ser maiores que seu próprio tamanho (MATHER, 1998). Cada ventosa apresenta um anel quitinoso e contém células mecano e quimiorreceptoras que atuam na identificação física e quimiotátil das presas (BOUCAUD-CAMOU e BOUCHER-RODONI, 1983). Os braços também são utilizados para desmembrar crustáceos, separando o exoesqueleto, e para abrir a concha de bivalves, enquanto a retirada do músculo das presas é resultado da ação conjunta do bico (Figura 3) e rádula (ALTMAN e NIXON, 1970), os quais são estruturas quitinosas localizadas na parte interna da massa bucal (HUNT e NIXON, 1981).
Figura 3. Visão ventral da anatomia externa do polvo Octopus vulgaris tipo II. MB: Massa bucal.
Figura 4. Parte superior e
inferior do bico de
Octopus vulgaris tipo II.
A barra representa 1 cm .
O trato digestório dos polvos tem formato em “U” e é composto dos seguintes órgãos: massa bucal, esôfago, primeiro estômago ou estômago anterior, segundo estômago ou posterior, ceco, apêndices dos canais digestivos, glândula digestiva, intestino e ânus (Figura 5). Nos cefalópodes, o cérebro envolve o esôfago (BUDELMANN, 1995), o que limita o tamanho do alimento que pode ser engolido (HUFFARD, 2013).
Figura 5. Anatomia interna de Octopus vulgaris Tipo II. Visão dorsal dos órgãos internos, com ênfase no sistema digestório: a) bico; b) massa bucal; c) primeiro par de glândulas salivares; d) esôfago e) sistema nervoso; f) segundo par de glândulas salivares; g) papo (ou estômago anterior); h) estômago posterior; i) ceco; j) glândula digestiva ou hepatopâncreas; l) aorta; m) brânquias; n) coração branquial.
[ C a pt u re a at e n ç ã o d o le it o r c o m u m a ót i m a ci ta ç ã o d o d
O sistema digestório dos polvos é bem desenvolvido e altamente especializado, com dois pares de glândulas salivares (Figura 6A): anterior e posterior, esta última responsável pela secreção de aminas biologicamente ativas, de cefalotoxinas (glicoproteínas) que atuam na paralisação e morte da presa, bem como de enzimas proteolíticas, envolvidas na digestão externa (BOUCAUD-CAMOU e BOUCHER-RODONI, 1983; ROCHA, 2003).
Figura 6. (A). Anatomia do trato digestório de Octopus vulgaris, (B) passagem do alimento pelo trato digestório de O. vulgaris. Setas finas indicam fluxo das partículas sólidas e setas grossas indicam locais de absorção. Adaptado de Boucaud-Camou e Boucher-Rodoni (1983) e Martinez (2014).
A digestão em cefalópodes é dividida em dois processos: digestão extracelular e intracelular (BOUCHER-RODONI et al., 1987). O processo de digestão dos polvos foi descrito por Boucaud-Camou e Boucher-Rodoni (1983), utilizando a espécie Octopus vulgaris como modelo e por Gallardo et al. (2017) para as espécies Octopus maya e Octopus mimus. Conforme descrito por Boucaud-Camou e Boucher-Rodoni (1983), a primeira etapa da digestão extracelular, é também, extracorpórea. Após segurar e imobilizar o alimento com os braços e, eventualmente paralisar a presa com cefalotoxinas, os polvos perfuram a presa com o bico e a seguram durante todo o tempo de ingestão, engolindo pedaços da presa com ajuda do bico e da rádula. Nesta etapa, ocorre a
B
liberação de enzimas proteolíticas (principalmente quimotrispsina), secretadas pelas glândulas salivares posteriores, sobre a presa. Na massa bucal, o alimento começa então a ser degradado pelas enzimas digestivas, formando o quimo. Após ser ingerido, o quimo passa pelo esôfago e, por movimentos peristálticos, chega, quase que simultaneamente ao estômago anterior, estômago posterior, cecos e glândula digestiva. No estômago anterior, a mistura de enzimas e proteínas solúveis resultantes digestão externa do alimento, ativam os zimógenos do suco gástrico ao longo do trato digestivo (GALLARDO et al., 2017). No estômago posterior, o quimo sofre quebra mecânica devido à forte musculatura deste órgão e hidrólise enzimática, devido à ação de enzimas digestivas secretadas pela glândula digestiva (digestão extracelular) (Figura 6B), formando um líquido que passa pelos apêndices da glândula digestiva, glândula digestiva e cecos, onde ocorre a absorção de nutrientes (digestão intracelular) (BOUCAUD-CAMOU e BOUCHER-RODONI, 1983). Os resíduos resultantes da digestão intracelular e das partes não absorvidas nos cecos passam ao intestino, onde ocorre a última etapa de absorção de nutrientes (BOUCAUD-CAMOU e BOUCHER-RODONI, 1983). Os pedaços não digeríveis no estômago como ossos, espinhos, escamas de peixe e pedaços de cutículas, são envolvidos em um muco e impedidos de entrar no ceco por um epitélio ciliado, passando diretamente ao intestino (MANGOLD, 1983). As paredes do intestino produzem mais muco, o qual envolve: o material particulado grosso que chega diretamente do estômago posterior, o resíduo mais refinado proveniente dos cecos e resíduos da digestão intracelular (“corpos marrons”) da glândula digestiva, formando o bolo fecal, no formato de um cordão, que será eliminado pelo ânus (MANGOLD, 1983).
O processo digestivo, conforme a Figura 7, ocorre em diferentes etapas. Inicialmente, ocorre a mistura de enzimas e proteínas solúveis entrando no estômago anterior após a digestão externa da presa, ativando zimógenos no suco gástrico localizados ao longo do trato digestório (1). Quase ao mesmo tempo, proteínas solúveis são rapidamente lançadas na glândula digestiva, ativando os sítios de absorção (2a), enquanto a glândula digestiva aumenta sua atividade, absorvendo nutrientes e liberando enzimas em pulsos (2b). Dependendo do tempo, enzimas ácidas e alcalinas atuam no estômago posterior e cecos (3). A mudança de coloração da seta na figura (azul escuro ao azul claro) indica mudanças no ambiente digestivo, modulado pelo tipo de enzima envolvida ao longo do processo digestivo, mudando do alimento bruto ingerido (azul escuro) para a assimilação e estocagem de nutrientes (vermelho). Restos celulares e material não digerido formam as fezes que são liberadas pelo ânus (4).
Como resultado da digestão interna na glândula digestiva, aminoácidos e outros nutrientes são transportados pela hemolinfa para os tecidos para serem usados como fonte de energia e moléculas para restaurar tecidos (6). Finalmente, em torno de 400-480 min após a alimentação, os nutrientes são estocados nos tecidos e músculos (6) (GALLARDO et al., 2017).
Figura 7. Fisiologia digestiva de Octopus maya e Octopus mimus, demonstrando a rota do alimento e a sequência necessária para o quimo alcançar cada parte do trato digestório (GALLARDO et al., 2017).
O processo de digestão dos polvos é afetado pelo tipo de dieta, fase do ciclo de vida e pela temperatura do habitat de cada espécie (LINARES et al., 2015). Quanto maior a temperatura da água, mais rápido é o processo de digestão (BOUCHER-RODONI et al., 1987; MARTINEZ et al., 2012). Em espécies tropicais, o processo digestivo é mais rápido comparado ao de espécies de zonas temperadas (GALLARDO et al., 2017). Em polvos subadultos da espécie tropical O. maya, o tempo do processo digestivo é de 6 h, enquanto que, para a espécie de águas temperadas O. mimus, o tempo da digestão é de 8 h (LINARES et al., 2015).
Os polvos apresentam sensação de saciedade e, em geral, rejeitam alimento pouco antes do estômago anterior estar funcionando na sua
capacidade máxima (NIXON, 1966). Quando este órgão está cheio, o animal para de comer e, quando o órgão está vazio, o animal pode ingerir alimento novamente (BOUCAUD-CAMOU e BOUCHER-RODONI,1983). Bidder (1966) observou que os polvos podem, com certa frequência, iniciar uma nova refeição antes mesmo do término da digestão anterior, o que confirma a rapidez e eficiência do processo digestivo. Podem, ainda, ocorrer casos de regurgitação em cefalópodes, conforme observado por Andrews et al. (2013), possivelmente relacionados à toxicidade do alimento, obstrução do trato digestório ou desordem neural (PONTE et al., 2017). Contudo, o conhecimento sobre causas e situações em que cefalópodes regurgitam alimento ainda é bastante restrito. Enzimas digestivas
As enzimas são compostos essenciais ao organismo, atuando em diversos processos metabólicos como permeabilidade da membrana, diferenciação celular, metabolismo ósseo, síntese de esteróis e digestão lisossomal (LEHNINGER, 2007). O tipo e funcionalidade das enzimas digestivas em espécies aquáticas é resultado de um processo evolutivo no qual o fator de seleção é o regime alimentar, desde a composição do alimento até a conduta alimentar (MOYANO, 2006).
A importância de estudar enzimas na aquicultura é dada pelas alterações no regime alimentar das espécies cultivadas, desde a fase larval até a etapa de engorda, em função das mudanças do regime de alimentação nos sistemas aquícolas em relação ao ambiente natural. Componentes e aspectos quantitativos e qualitativos da dieta como qualidade nutricional, tamanho, densidade, palatabilidade, disponibilidade de nutrientes, frequência alimentar, entre outros aspectos, geralmente diferem das condições e ritmo biológico natural das espécies. No ambiente de criação, estas diferenças repercutem na efetividade com que o alimento é processado e digerido porque: 1) as enzimas digestivas podem não ser produzidas em quantidade suficiente para manter uma relação enzima/substrato adequada à composição de um determinado alimento; 2) podem não atuar nas condições ideais de temperatura e pH; 3) podem ser inibidas ou inativadas parcialmente por alguma substância do alimento (MOYANO, 2006).
Em cefalópodes são encontradas enzimas proteolíticas, amilolíticas e lipolíticas em distintos órgãos do sistema digestório e sua atividade varia de acordo com cada órgão e etapa da digestão (BOUCAUD-CAMOU e BOUCHER-RODONI, 1983). A atividade enzimática é encontrada no lúmen de praticamente todo o trato digestório,
contudo, os órgãos capazes de secretar enzimas digestivas a nível epitelial são as glândulas salivares, as glândula digestiva, o ceco e os canais digestivos, sendo que, o esôfago e o estômago não secretam enzimas (BOUCAUD-CAMOU e BOUCHER-RODONI, 1983).
Estudos sobre amilases e lipases em cefalópodes são pouco aprofundados e, portanto, o conhecimento da atuação destas enzimas é ainda limitado. A presença de amilase foi detectada em baixa atividade em paralarvas de O. vulgaris (BOUCAUD-CAMOU e ROPER, 1995) e na glândula salivar e cecos de O. vulgaris selvagens adultos (MANCUSO et al., 2014), o que condiz com o hábito alimentar carnívoro dos polvos (BOUCAUD-CAMOU e BOUCHER-RODONI, 1983). Sabe-se que a atividade de enzimas lipolíticas são predominantes na glândula digestiva (MANCUSO et al., 2014), intrinsecamente relacionada aos processos de absorção e assimilação de nutrientes, dada a importância deste órgão no metabolismo dos cefalópodes (SEMMENS, 2002).
Nos polvos, por serem carnívoros, as enzimas proteolíticas são predominantes e desempenham papel fundamental na digestão e disponibilidade de nutrientes (GALLARDO et al., 2017), sendo encontradas desde o esôfago até o intestino (BOUCAUD-CAMOU e BOUCHER-RODONI, 1983). Enzimas proteolíticas ácidas e alcalinas foram detectadas nas glândulas salivares, estômago, cecos e glândula digestiva pela primeira vez, em O. vulgaris, por MORISHITA (1972). Mais recentemente, proteases ácidas e alcalinas foram relatadas também em O. maya (MARTINEZ et al., 2011) e O. mimus (LINARES et al., 2015). Assim como nos polvos, proteases alcalinas (tripsina e quimotripsina) e ácidas (fosfatases ácidas e catepsinas) também estão presentes em outros cefalópodes, como na lula Euprymna tasmanica (SWIFT et al., 2005) e na sépia Sepia officinalis (SAFI et al., 2017), o que demonstra a importância desta classe de enzimas para a digestão, absorção e assimilação dos nutrientes da dieta para cefalópodes.
Várias enzimas proteolíticas, como pepsina, tripsina e quimotripsina são sintetizadas na forma de precursores inativos (zimógenos) e assim mantidas nas suas células de origem, sem risco de haver digestão das proteínas celulares (MARZZOCO e TORRES, 1999). A transformação do zimógeno para enzima, ocorre fora destas células, no local onde a atividade digestiva deve ser exercida, como no caso do pepsinogênio que origina a pepsina no estômago pela ação de íons H+; tripsinogênio e quimotripsinogênio que originam a tripsina e quimotripsina, respectivamente, pela ação de enzimas específicas que hidrolizam cadeias polipeptídicas separando as moléculas proteicas em pequenos peptídeos (MARZZOCO e TORRES, 1999). Em polvos, a
