TÍTULO: A EVOLUÇÃO DO SISTEMA CRISPR CAS9 TÍTULO:
CATEGORIA: CONCLUÍDO CATEGORIA:
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE ÁREA:
SUBÁREA: BIOMEDICINA SUBÁREA:
INSTITUIÇÃO: CENTRO UNIVERSITÁRIO DAS FACULDADES METROPOLITANAS UNIDAS INSTITUIÇÃO:
AUTOR(ES): BRENDA SILVA DO CARMO AUTOR(ES):
ORIENTADOR(ES): CHARLOTTE CESTY BORDA DE SAENZ ORIENTADOR(ES):
Este trabalho tem por objetivo principal analisar a evolução do sistema e os benefícios do CRISPR Cas9, demonstrando futuras técnicas de manipulação genética para trazer benefício a humanidade e também aborda os processos recentes, em um estudo baseado em uma análise sistemática entre os anos 2002 a 2017. O CRISPR Cas9 é uma nova ferramenta de edição do genoma que permite a modificação do mesmo com uma grande precisão e flexibilidade. Desde a descoberta do DNA que tem um papel fundamental na construção e sustentação da vida, cientistas já sonharam em ter a capacidade de editar facilmente o DNA de formas muito precisas, e atualmente as alterações especificas para a sequência de DNA podem ajuda-los a entender melhor a função de certos genes, produzir modelos de doenças especificas ou mesmo reparar genes defeituosos que causam doenças em humanos. Esta é uma perspectiva excitante dentre os métodos já conhecidos. Há alguns anos um presente da biologia veio da investigação fundamental do sistema imunitário de bactérias que deu aos cientistas a capacidade precisa de facilmente customizar e editar genomas. Neste trabalho são apresentados recentes avanços da tecnologia CRISPR Cas9 que aproximam sua aplicação na ciência, agropecuária, medicina e várias áreas. Esse sistema atualmente está sendo muito pesquisado por ter resultados positivos, sendo uma nova revolução para a Biologia Molecular.
2. INTRODUÇÃO
Em biologia molecular CRISPR Cas9 é um acrônimo para Grupos de Repetições Palindrômicas Curtas Regularmente Espaçadas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat), este nome refere-se à sistematização única de sequências de DNA curtas, repetidas e parcialmente palindrômicas que tenha a propriedade de poder ser lida de diferentes vertentes, por exemplo a sequência AATT//TTAA¹. Esta ferramenta contém componentes que são uma transcrição do locus CRISPR que resulta em curtos fragmentos de RNA com capacidade de exercer o reconhecimento de um DNA exógeno específico e efetivo como um guia a um local particular no genoma. Para efeitos de edição de gene, pode-se controlar aonde a proteína parte o genoma para inserir um novo gene no corte e juntá-lo novamente, sendo que essa proteína é nomeada como Cas9 (ARN guiado a um ADN de uma enzima endonucleática) ligada com o CRISPR. 1
2
Atualmente, cientistas usam esse sistema CRISPR Cas9 para operar como tesouras moleculares para cortar ou editar repartidores específicos de DNA, e também utilizado como regulação gênica, com a finalidade de comandar genes ativados ou desativados.
Recentemente feito o grande avanço foi descoberto que o sistema é capaz de alterar a sequência de ADN de qualquer organismo. Desde a descoberta veio trazendo entusiasmo aos pesquisadores, a entender melhor a função de certos genes, e novas aplicações desse sistema na indústria, laboratório e medicina.
3. OBJETIVO
Avaliar a evolução do sistema e os benefícios do CRISPR Cas9, exploração para futuras técnicas de manipulação genética para trazer o benefício a humanidade e também abordará os progressos recentes em nosso conhecimento do regulamento de sistemas CRISPR Cas9.
4. METODOLOGIA
Baseia na análise sistemática e na organização dos princípios e processos racionais e experimentais. Permitindo por meio da investigação de analises de dados, conclusões generalizadas, sobre a aquisição do conhecimento cientifico sobre o sistema CRISPR Cas9 em banco de dados como NCBI, Pubmed , Scielo entre os anos 2002-2017 e também de livros de didáticos cujos assuntos foram edição de DNA e engenharia genética.
5. DESENVOLVIMENTO
5.1 FERRAMENTA CRISPR Cas9
Essa ferramenta permite alternar curtas repetições de DNA da série bacteriana do CRISPR estão a subsequência variadas chamadas de espaçadores. Logo os espaçadores são sequentes do DNA de vírus que no início atacaram a bactéria hospedeira. Contudo, os espaçadores agem como uma “lembrança genética “ de infeções passadas. Caso aconteça a reinfecção do vírus passado o sistema de defesa CRISPR cliva a sequência viral regulando junto com a sequência espaçadora, no caso se um vírus novo atacar determinada bactéria, um novo espaçador é adicionado e a cadeia de espaçadores se repete.
O uso desta ferramenta permite executar modificações genéticas precisas e específicas por meio da indução de quebras duplas (DSBs, do inglês, double-strand
breaks) nas cadeias de DNA que estimulam os mecanismos celulares de reparo
podendo gerar rearranjos genômicos. Esses mecanismos de reparo podem ser de três tipos: 1- recombinação não homóloga que liga extremidades diferentes do DNA [do inglês: error-prone non-homologous end joining (NHEJ)]; 2- ligação de extremidades mediada por micro-homologia (MMEJ, do inglês: microhomology-mediated end
joinining); 3- sistema de reparo direcionado por uma das fitas do DNA (do inglês:
homology-directed repair, HDR).2 O sistema de reparo NHEJ é intrigante para estudos
de função gênica, pois introduz mutações durante o reparo aleatório da molécula de DNA que pode gerar perda de função ou silenciamento gênico (knockout).3
Figura 1: As etapas da imunidade mediada pela CRISPR. CRISPR são regiões do genoma bacteriano que ajudam a defender contra vírus invasores. Estas regiões são compostas de repetições curtas de DNA (diamantes negros) e espaçadores (caixas coloridas). Quando um vírus novo infecta pela primeira vez uma bactéria, um novo espaçador derivado do vírus é incorporado entre os espaçadores existentes. Esses espaçadores são os genomas dos vírus. A sequência CRISPR é transcrita e processada para gerar moléculas curtas de RNA CRISPR. O RNA CRISPR associa-se com e guia a maquinaria molecular bacteriana para uma associa-sequência alvo
4
correspondente à dos vírus invasores. A maquinaria molecular corta e destrói o genoma viral invasor. Fonte (Molecular Cell 54, 2014).
A tecnologia empregando o sistema CRISPR-Cas9 consiste em três genes, incluindo um que codifica para nuclease Cas9 e dois genes fundidos de RNA não codificantes: o precursor crRNA (pré-crRNA) e o transativador (tracrRNA) de crRNA. A especificidade de ligação de Cas9 com o DNA é determinada pelo pareamento de bases entre o crRNA e o DNA alvo e a sequência PAM. Ambos os domínios nucleases de Cas9, HNH e RuvC-like, cortam as duas fitas do DNA na região que está pareada com os 20 nucleotídeos de crRNA e sempre no mesmo sítio localizado três nucleotídeos de distância abaixo (downstream) da sequência-alvo.4
5.2 APLICAÇÕES DO SISTEMA CRISP
Na área médica podemos notar o grande avanço da ferramenta CRISPR Cas9, o grande enfoque é a aplicação de tratamento de doenças genéticas, executando o silenciamento e edição genica com o CRISPR causando um efeito neutralizador exercido sobre um gene pelo RNAi, molécula criada em laboratório que difere do RNA convencional por apresentar duas fitas de pares de base em vez de apenas uma. Com o sucesso da aplicação da ferramenta CRISPR foi aplicado a técnica para modificar embriões humanos com o objetivo de corrigir uma mutação no gene MYBPC3 que causa cardiomiopatia hipertrófica, resultado da utilização da técnica foi satisfatório, durante a fertilização os pesquisadores obterão cura 42 dos 58 embriões.56
Na área laboratorial, desde a descoberta do DNA que tem um papel fundamental na construção e sustentação da vida, cientistas já sonhou em ter a capacidade de editar facilmente o DNA de formas muito precisas, atualmente as alterações especificas para a sequência de DNA pode ajudar os cientistas a entender melhor a função de certos genes, produzir modelos de doenças especificas ou mesmo reparar genes defeituosos que causam doenças em humanos, esta é uma perspectiva excitante mas métodos para tentar e fazer isso não fosse pratico, no entanto, há alguns anos um presente de biologia veio da investigação fundamental do sistema imunitário bactérias que deu cientistas a capacidade de facilmente customizar e precisa editar genomas,
bactérias envolvidas engenhosa formas de se proteger contra os agentes patogênicos. Esse sistema também se tornou mais esperançoso, pois ele representa uma alternativa apta.7
A ciência utiliza alguns organismos como modelos de estudo, como por exemplo camundongos, moscas e algumas espécies de peixes, pois esses seres tem uma gama gigantesca de estudos, o que permite uma manipulação para modificar o genoma de qualquer animal. Essa nova ferramenta para editar o DNA trouxe interesse de vários cientista como os parasitologistas que com o potencial da CRISPR Cas9 eles efetuaram uma pesquisa de agentes causadores de doenças como o
Trypanossoma cruzi, causador da doença de Chagas, após pesquisas mostrou que é
possível alterar genes, os cientistas avaliou genes ligados ao flagelo dos parasitas- a estrutura semelhante a uma cauda que lhes permite locomover-se.8
Na agricultura as aplicações são imensas, cientistas exploram o sistema CRISPR Cas9 para livrar a natureza de germe indesejáveis, uma edição genética ainda estudada envolve um sistema CRISPR Ca9 capaz de substituir determinado gene para toda uma população. Essa edição genética ainda não foi experimentado em ambientes naturais, mas em organismos de laboratório como a drosófila, e o sistema foi apto de conduzir praticamente uma população inteira de moscas a carregar uma determinada forma de um gene. Acredita-se que essa técnica pode eliminar a resistência a pesticidas e herbicidas em insetos e ervas daninhas, além de controlar espécies invasoras, prevenir a transmissão de doenças também como malária, dengue entre outros.1
6. CONSIDERAÇOES FINAIS
Pode-se destacar outros avanços na área da saúde que estão em andamento conforme o experimento realizado em embriões humanos, esse trabalho ainda está em andamento em processo de estudo, logo sendo uma inspiração para tratar doenças humanas.
Baseados nos estudos, o sistema CRISPR Cas9 indica ser uma ferramenta genética poderosa e futura, podendo ser uma das mais requisitadas por ter baixo custo e de fácil manipulação e menos dispendiosas do que outras técnicas. Essa ferramenta
6
está se destacando, já sendo utilizadas em várias áreas, na agropecuária, em laboratórios, ciência e entre outros, mas é importante ressaltar cautela na utilização dessa ferramenta pois tem que entender seu mecanismo completamente, de modo que a ferramenta não expresse de maneira erronia. Embora ainda há muito a ser apurado, o sistema não deixa incertezas para a revolucionar as abordagens de engenharia gênica.
7. FONTES CONSULTADAS
1. SANDER, Jeffry D.; JOUNG, J. Keith. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature biotechnology, v. 32, n. 4, p. 347-355, 2014.
2. Gaj, Thomas, Charles A. Gersbach, and Carlos F. Barbas. "ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering." Trends in biotechnology 31.7 (2013): 397-405
3.BARRANGOU, Rodolphe; DOUDNA, Jennifer A. Applications of CRISPR technologies in research and beyond. Nature Biotechnology, v. 34, n. 9, p. 933-941, 2016.
4.JINEK, Martin et al. A programmable dual-RNA–guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science, v. 337, n. 6096, p. 816-821, 2012.
5.Mitalipov, Shoukhrat. "Correction of a pathogenic gene mutation in human embryos." (2017). Nature 548, 413–419
6.LANDER, Noelia et al. CRISPR/Cas9-induced disruption of paraflagellar rod protein 1 and 2 genes in Trypanosoma cruzi reveals their role in flagellar attachment. MBio, v. 6, n. 4, p. e01012-15, 2015.
7.SAMANTA, Milan Kumar; DEY, Avishek; GAYEN, Srimonta. CRISPR/Cas9: an advanced tool for editing plant genomes. Transgenic research, v. 25, n. 5, p. 561-573, 2016.
8.WENINGER, Astrid et al. Combinatorial optimization of CRISPR/Cas9 expression enables precision genome engineering in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. Journal of biotechnology, v. 235, p. 139-149, 2016.
9.LEVASSEUR, Anthony et al. MIMIVIRE is a defence system in mimivirus that confers resistance to virophage. Nature, v. 531, n. 7593, p. 249-252, 2016.
10.SÁNCHEZ-RIVERA, Francisco J.; JACKS, Tyler. Applications of the CRISPR-Cas9 system in cancer biology. Nature Reviews Cancer, v. 15, n. 7, p. 387-395, 2015. 11.CENCIC, Regina et al. Protospacer adjacent motif (PAM)-distal sequences engage CRISPR Cas9 DNA target cleavage. PLoS One, v. 9, n. 10, p. e109213, 2014.
12.LIANG, Puping et al. CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes. Protein & cell, v. 6, n. 5, p. 363-372, 2015.
13.JANSEN, Ruud et al. Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Molecular microbiology, v. 43, n. 6, p. 1565-1575, 2002.
14.RICHTER, Corinna; CHANG, James T.; FINERAN, Peter C. Function and regulation of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR associated (Cas) systems. Viruses, v. 4, n. 10, p. 2291-2311, 2012.
15.BARRANGOU, Rodolphe; MARRAFFINI, Luciano A. CRISPR-Cas systems: prokaryotes upgrade to adaptive immunity. Molecular cell, v. 54, n. 2, p. 234-244, 2014.
16.LUM, Andrew G. et al. Global transcription of CRISPR loci in the human oral cavity. BMC genomics, v. 16, n. 1, p. 401, 2015.
17.RICHTER, Hagen; RANDAU, Lennart; PLAGENS, André. Exploiting CRISPR/Cas: interference mechanisms and applications. International journal of molecular sciences, v. 14, n. 7, p. 14518-14531, 2013.
8
18.GARRETT, Roger A. et al. CRISPR-Cas adaptive immune systems of the sulfolobales: Unravelling their complexity and diversity. Life, v. 5, n. 1, p. 783-817, 2015.
19.MARTIN, Francisco et al. Biased and Unbiased Methods for the Detection of Off-Target Cleavage by CRISPR/Cas9: An Overview. International Journal of Molecular Sciences, v. 17, n. 9, p. 1507, 2016.
