Efeito do herbicida glifosato sobre a morfologia e morfometria dos folículos ovarianos do peixe Danio rerio

Suzany Cristina Veloso da Silva

EFEITO DO HERBICIDA GLIFOSATO SOBRE A MORFOLOGIA E MORFOMETRIA DOS FOLÍCULOS

OVARIANOS DO PEIXE Danio rerio

Trabalho apresentado como requisito da disciplina de Trabalho de Conclusão de Curso II (BIO 7016) do currículo do Curso de Graduação em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Santa Catarina.

Orientador: Profa. Dra. Evelise Maria Nazari

Coorientadora: Bióloga Carla Eliana Davico

Florianópolis 2017

Suzany Cristina Veloso da Silva

EFEITO DO HERBICIDA GLIFOSATO SOBRE A MORFOLOGIA E MORFOMETRIA DOS FOLÍCULOS

OVARIANOS DO PEIXE Danio rerio

Este Trabalho de Conclusão de Curso foi julgado adequado para obtenção do Título de “Licenciado em Ciências Biológicas”, e aprovado em sua forma final pelo Curso em Ciências Biológicas.

Florianópolis, 09 de fevereiro de 2017.

________________________ Prof. Dr. Carlos Roberto Zanetti Coordenador do Curso de Ciências Biológicas

Banca Examinadora:

________________________ Dr.ª Evelise Maria Nazari

Orientadora

Universidade Federal de Santa Catarina

________________________ Dr.ª Luiz Carlos de Pinho

Membro titular

Universidade Federal de Santa Catarina

________________________ MSc. Aline Guimarães Pereira

Membro titular

Dedico este trabalho as pessoas que sempre acreditaram em mim, meus pais José Hugo e Nadir, a minha irmã Suelem, e ao meu marido Renan. E especialmente ao meu avô Sadi (in memorian) por sempre me alegrar. Sei que hoje quem se alegra é você. Eu amo muito vocês!

AGRADECIMENTOS

Desde que comecei a cursar Ciências Biológicas muitas foram as incertezas e as certezas, finalizo está etapa com a confiança que tomei a decisão certa, e tenho muito a quem agradecer.

Agradeço especialmente a minha orientadora Profª. Dra. Evelise Maria Nazari por me receber de braços abertos em seu laboratório, por compartilhar comigo seus conhecimentos, e me orientar ao longo do trabalho, me fazendo perceber que na vida acadêmica nada é tão difícil se você se dedicar e der o melhor de si.

Agradeço imensamente aos meus colegas de laboratório, principalmente a Carla e a Luciane, pelos momentos de aprendizagem ao lado de vocês, por sempre estarem a disposição quando precisei, este trabalho se tornaria muito mais difícil sem vocês ao meu lado.

Agradeço aos meus colegas de curso e hoje amigos Rafaela, Karla, Monique, Fabiana e Gisele, por alegrarem meus dias dentro da universidade, isso deixou tudo mais leve.

Aos meus pais José Hugo e Nadir por confiarem em mim, e acreditarem que mesmo longe eu faria a coisa certa, a minha irmã Suelem por sempre me apoiar independente das minhas decisões, e ser aquela pessoa que sempre está lá para me escutar.

Ao meu esposo e colega de curso por me ajudar a chegar aonde cheguei, e a me dar forças para continuar quando situações difíceis surgiam, você foi essencial neste período.

Ao meu sogro Valmor e a minha sogra Eliane por me acompanharem ao longo desta jornada, me apoiando e dando forças para continuar.

Agradeço a todos que de alguma maneira contribuíram para este trabalho, e me ajudaram ao longo deste período.

RESUMO

Os agrotóxicos vêm sendo usados cada vez mais, tanto em ambientes agrícolas quanto em ambientes urbanos, e dentre estes, o glifosato é o herbicida mais utilizado no Brasil. Este trabalho tem por objetivo avaliar os efeitos da concentração de 0,065 mg/L de glifosato sobre os ovários do peixe-zebra Danio rerio, especificamente sobre a morfologia e morfometria dos folículos ovarianos (ovócito, envelope vitelínico e células foliculares). A partir da massa corporal das fêmeas e da massa dos ovários foi obtido o índice gonadossomático (IGS), o qual mostrou que as fêmeas expostas por 15 dias apresentaram um aumento significativo deste índice. A partir da análise morfológica foram reconhecidos os folículos ovarianos constituídos pelos ovócitos, envelope vitelínico e células foliculares. Foram reconhecidos os ovócitos pré-vitelogênicos I, caracterizados pela presença de citoplasma homogêneo e sem grânulos de vitelo; ovócitos pré-vitelogênicos II caracterizados pela presença de grânulos de vitelo no citoplasma; e ovócitos vitelogênicos caracterizados por apresentar citoplasma repleto de grânulos de vitelo. Após a exposição ao glifosato, não foram observadas mudanças na organização morfológica dos folículos ovarianos. Quanto ao número médio dos ovócitos, também não foram observadas diferenças significativas entre os ovócitos pré-vitelogênicos I, pré-vitelogênicos II e vitelogênicos. Contudo, a partir da análise morfométrica observou-se que o glifosato induziu a uma diminuição significativa no diâmetro dos ovócitos pré-vitelogênicos I. Já o diâmetro dos ovócitos pré-vitelogênicos II e vitelogênicos não foram alterados após a exposição ao glifosato. A espessura do envelope vitelínico, o maior eixo das células foliculares, bem como o número destas células diminuíram significativamente nas fêmeas expostas ao glifosato. Com base nesses resultados, podemos concluir que a exposição de fêmeas a concentração de 0,065 mg/L de glifosato por 15 dias alterou a organização dos folículos ovarianos, principalmente do envelope vitelínico e das células foliculares.

Palavras-chave: ovário, envelope vitelínico, células foliculares, fêmeas, zebrafish, agrotóxico.

LISTA DE FIGURAS E TABELAS

Figura 1: Fórmula estrutural do ácido N-fosfonometil glicina ... 3

Figura 2: Exemplar de fêmea de peixe-zebra (a) e secção histológica de fêmea de peixe-zebra (b) destacando a organização do ovário e dos folículos ovarianos (c).. ... 5 Figura 3: Esquema representativo das análises morfométricas realizadas nos folículos ovarianos de fêmeas de D. rerio. Medida do diâmetro do ovócito, medida da espessura do envelope vitelínico realizada em quatro pontos e medida do maior eixo das células foliculares ... 13 Figura 4: Representação da maturação do folículo ovariano de D. rerio. Ovogônia, ovócitos pré-vitelogênicos I, ovócitos pré-vitelogênicos II e ovócitos vitelogênicos ... 16 Figura 5: Morfologia dos ovários de D. rerio evidenciando as ovogônias, ovócitos pré-vitelogênicos I, ovócitos pré-vitelogênicos II, ovócitos vitelogênicos ... 17 Figura 6: Número de ovócitos pré-vitelogênicos I, pré-vitelogênicos II e vitelogênicos de fêmeas de D. rerio expostas ao glifosato... 18 Figura 7: Diâmetro dos ovócitos vitelogênicos I, ovócitos pré-vitelogênicos II e ovócitos vitelôgenicos de fêmeas de D. rerio expostas ao glifosato ... 19 Figura 8: Folículo ovariano de D. rerio evidenciando ovócito vitelogênico com grânulos de vitelo, o envelope vitelínico e as células foliculares. ... 20 Figura 9: Número de células foliculares de ovócitos vitelogênicos de fêmeas de D. rerio expostas ao glifosato. ... 20 Figura 10: Medida do maior eixo das células foliculares dos ovócitos vitelogênicos de fêmeas de D. rerio expostas ao glifosato... 21 Figura 11: Espessura do envelope vitelínico dos ovócitos vitelogênicos de fêmeas de D. rerio expostas ao glifosato.. ... 21

Tabela 1: Valores de massa corporal e massa do ovário para o cálculo do IGS de fêmeas de D. rerio expostas a 0,065 mg/L de glifosato. ... 15

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AMPA – Ácido Aminometilfosfônico

ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária CCB – Centro de Ciências Biológicas

CEUA – Comissão de Ética no Uso de Animais CONAMA – Conselho Nacional do Meio Ambiente

CONCEA – Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal EPSPS – Enzima 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintase

FAO – Organização das Nações Unidas para a Alimentação e a Agricultutra, do inglês Food and Agriculture Organization

Gli – Glifosato

HE – Hematoxilina-Eosina IAA – Ácido Indolilacético IGS – Índice Gonadossomático L – Litro

LAMEB – Laboratório Multiusuário de Estudos em Biologia LRDA – Laboratório de Reprodução e Desenvolvimento Animal mg – Miligrama

UFSC – Universidade Federal de Santa Catarina

USEPA – Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos da América, do inglês The United States Environmental Protection Agency µm – Micrometro

SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ... 1 2. OBJETIVOS ... 9 2.1. Objetivo geral ... 9 2.2. Objetivos específicos ... 9 3. METODOLOGIA ... 11 3.1. Animais ... 11 3.2. Desenho experimental ... 11

3.3. Biometria corporal e ovariana ... 12

3.4. Análise morfológica ... 12

3.5. Análises morfométricas ... 13

4. ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 14

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 15

5.1. Biometria corporal e índice gonadossomático (IGS) ... 15

5.2. Efeito do glifosato sobre a morfologia dos ovários ... 16

5.3. Efeito do glifosato sobre a morfometria dos ovócitos ... 17

5.4. Efeito do glifosato sobre a morfologia e morfometria das células foliculares e do envelope vitelínico ... 19

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1. INTRODUÇÃO

Os agroquímicos ou defensivos agrícolas também denominados agrotóxicos se popularizaram a partir da Segunda Guerra Mundial e por volta da década de 1980 passaram a ser amplamente comercializados e produzidos, com a expansão de lavouras cultivadas em grande escala (BULL e HATHAWAY, 1986). No Brasil, a agricultura passou por inúmeras transformações, que modificaram tanto a composição das culturas como os processos de produção e padrões tecnológicos, intensificando o emprego de fatores de produção, como máquinas, equipamentos e os defensivos agrícolas (RÜEGG et al., 1986). Desse modo, e considerando a territorialidade do país, o Brasil tornou-se nos últimos anos, o maior consumidor de agrotóxicos no mundo (PORTO e SOARES, 2012).

A utilização excessiva dos agrotóxicos gera a poluição dos solos, das águas e do ar, comprometendo a saúde humana e causando danos à fauna e flora (BRASIL, 2015). Contudo, há controvérsias na literatura acerca da toxicidade dos defensivos agrícolas, cuja toxicidade está sendo reavaliada visando à definição dos limites máximos de utilização no Brasil (ANVISA, 2016).

Os agrotóxicos constituem uma categoria especial de insumos agrícolas, promovendo benefícios à produtividade, onde sua utilização tem o objetivo de evitar a perda nas safras, causadas pelo ataque prejudicial de pragas e doenças às culturas (RÜEGG et al., 1986). Segundo a Organização das Nações Unidas para a Alimentação e a Agricultura (FAO, do inglês Food and Agriculture Organization), os agrotóxicos são definidos como qualquer substância, ou mistura de substâncias, usadas para prevenir, destruir ou controlar pragas agrícolas (PERES et al., 2003).

Conforme a legislação brasileira vigente, agrotóxicos são produtos e agentes de processos físicos, químicos ou biológicos, utilizados nos setores de produção, armazenamento e beneficiamento de produtos agrícolas, pastagens, proteção de florestas nativas ou implantadas, de outros ecossistemas e de ambientes urbanos, hídricos e industriais. Podem também ser considerados agrotóxicos as substâncias e produtos empregados como desfolhantes, dessecantes, estimuladores e inibidores de crescimento (BRASIL, 1989).

Os agrotóxicos podem ser classificados de diferentes maneiras, com base no padrão de uso (desfolhantes, repelentes, dissecantes), no organismo-alvo (inseticidas, herbicidas), na estrutura química

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(piretróides, organofosforados), na toxicidade e no grau de periculosidade (ALVES e OLIVEIRA-SILVA, 2003).

A classificação dos agrotóxicos quanto à periculosidade ambiental é baseada em estudos físico-químicos, toxicológicos e ecotoxicológicos, considerando o acúmulo do agrotóxico nos organismos, sua persistência no ambiente e seu poder de deslocamento no solo, ar e água. São propostas quatro classes de periculosidade ambiental: produtos altamente perigosos ao meio ambiente (Classe I), produtos muito perigosos ao meio ambiente (Classe II), produtos perigosos ao meio ambiente (Classe III) e produtos pouco perigosos ao meio ambiente (Classe IV) (BRASIL, 2015; BRASIL, 1996; RIBAS e MATSUMURA, 2009;).

Muitos agrotóxicos, além do princípio ativo tóxico, apresentam elementos ou compostos potencialmente poluidores, como metais pesados, surfactantes, emulsificantes, entre outros (RIBAS e MATSUMURA, 2009). Um dos efeitos indesejados provocados pelos agrotóxicos é a contaminação de organismos não alvos, que são aqueles organismos que não interferem no processo de produção (RIBAS e MATSUMURA, 2009; STEFFEN et al., 2011).

O comportamento e a interação do agrotóxico com o ambiente variam conforme o produto e os fatores relacionados à sua aplicação. As propriedades físico-químicas do agrotóxico, a quantidade e a frequência de uso e o modo de aplicação determinaram qual vai ser o destino do agrotóxico no ambiente (BORSOI et al., 2014).

A transferência dos agrotóxicos dos ecossistemas terrestres para os aquáticos é constante, tanto em áreas agrícolas (pelo uso elevado nas pulverizações, a utilização de diferentes princípios ativos e alta erosão do solo) quanto e em áreas urbanas (na manutenção de gramados, no controle de vegetação indesejada, horticulturas e plantas em viveiros). Essas atividades são consideradas de difícil identificação, monitoramento e, consequentemente, controle (BERTI et al., 2009; BORSOI et al., 2014). Nos ambientes aquáticos, os agrotóxicos são os contaminantes mais graves decorrentes das atividades antropogênicas, que podem interagir com organismos não alvos, causando inúmeras alterações que levam a um desequilíbrio ecológico (ARAIS et al., 2007; BERTI et al., 2009).

Os herbicidas são amplamente utilizados em zonas rurais para fins agrícolas e não agrícolas, representando quase metade do total de agrotóxicos utilizados, sendo os herbicidas à base de glifosato e seus sais, como o Roundup®, os que lideram o ranking de uso no mercado brasileiro (BORSOI et al., 2014; BRASIL, 2015).

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O glifosato é indicado no controle de ervas daninhas, usado de maneiras diversas na agricultura, para a limpeza do terreno no pré-plantio, no manejo da vegetação em rotação de culturas, na dessecação na pré-colheita de cereais e para o controle geral das plantas invasoras. Aplicado em culturas de arroz irrigado, cana-de-açúcar, café, milho, pastagens, soja, fumo, em pomares, viveiros, em culturas de plantas ornamentais, além de margens de estradas e em ambientes industriais diversos (AMARANTES JR et al., 2002; RAHE, 2007).

O glifosato, uma molécula de nome N-fosfonometil glicina (Figura 1), foi originalmente sintetizado em 1950, mas na época, não apresentava perspectiva farmacêutica. Em 1970 a molécula foi re-sintetizada e testada como herbicida. O qual foi patenteado em 1971 como um herbicida comercial chamado Roundup® (SZÉKÁCS e DARVAS, 2012).

Figura 1: Fórmula estrutural do ácido N-fosfonometil glicina. Fonte: ANVISA (2015).

O glifosato é um potente herbicida, pós-emergente, classificado como não-seletivo, de ação sistêmica e de largo espectro, o que possibilita um excelente controle de plantas daninhas, capaz de controlar efetivamente 76 das 78 plantas invasoras mais agressivas (AMARANTE JR et al. 2002; GALLI e MONTEZUMA, 2005; YAMADA e CASTRO, 2007). O glisofato é absorvido basicamente pela região clorofilada das plantas e tem rápida translocação para as raízes, rizomas e meristemas apicais, resultando na destruição total da planta (GALLI e MONTEZUMA, 2005; YAMADA e CASTRO, 2007).

A atuação do glifosato na planta se dá pela inibição da enzima 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase (EPSPs), que catalisa a síntese do ácido chiquímico em ácido corismático. Por sua vez, o ácido corismático é responsável pela síntese dos aminoácidos aromáticos fenilalanina, tirosina e triptofano. A fenilalanina e a tirosina produzem numerosos produtos secundários, muitos destes, implicados na defesa da

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planta contra doenças e pragas. O triptofano é precursor do ácido indolilacético (IAA), hormônio vegetal necessário para expansão celular e a manutenção da dominância apical (GALLI e MONTEZUMA, 2005; RAHE, 2007; YAMADA e CASTRO, 2007). Todas as formulações comerciais do glifosato, independente dos sais utilizados, apresentam o mesmo princípio de ação, inibindo a enzima EPSPs (MORAES e ROSSI, 2010).

A degradação do glifosato pode seguir por duas rotas, sendo que em uma delas, o glifosato é transformado em sarcosina por ação de bactérias; na outra rota, o glifosato é transformado em ácido aminometilfosfônico (AMPA). O glifosato livre é degradado rapidamente, e quando adsorvido ao solo é degradado lentamente, ou não degradado, persistindo inativo por anos (AMARANTE JR et al., 2002; GALLI e MONTEZUMA, 2005; YAMADA e CASTRO, 2007). O glifosato quando não adsorvido ao solo possui mobilidade no ambiente e potencial para contaminar águas superficiais e subterrâneas (DORES e DE-LAMONICA-FREIRE, 2001).

Quanto à toxicidade, o glifosato/Roundup®, bem como seus metabólitos foram considerados como pouco tóxicos, no trabalho proposto por Williams et al. (2000). No entanto, há evidências de efeitos nocivos do glifosato/Roundup® e seus metabólitos em espécies vegetais, de mamíferos, aves e peixes (AMARANTES JR et al, 2002; SILVA, 2014). Um dos efeitos nocivos do glifosato é o seu potencial como disruptor endócrino, provocando alterações hormonais e gerando efeitos na reprodução (MESNAGE et al., 2015; ROMANO et al., 2009). A Resolução nº 357 de 2005 do Conselho Nacional do Meio Ambiente (CONAMA) classifica e enquadra corpos de água, estabelecendo a concentração máxima permitida de diversas substâncias. Para o glifosato, a concentração máxima permitida é de 0,065 mg/L para águas destinadas ao consumo humano após tratamento, recreação de contato primário, irrigação de hortaliças e plantas frutíferas, aquicultura e atividade de pesca (BRASIL, 2005).

Para os ensaios de toxicidade são utilizados organismos aquáticos, invertebrados e vertebrados, dentre os quais se destaca o peixe Danio rerio (Hamilton, 1822), conhecido como zebrafish ou paulistinha, é um peixe teleósteo de água doce, pertencente à família Cyprinidae. Este peixe é muito utilizado também como peixe ornamental, pois é de simples manejo, com tolerância a variações ambientais e fácil reprodução em cativeiro (DAMMSKI et al., 2011; SCHENEIDER et al., 2009).

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O peixe-zebra possui tamanho médio quando adulto de 2-3 cm, seu corpo é esguio e alongado, com cabeça curta, narina protuberante e uma boca inclinada e voltada para cima, às nadadeiras são inseridas posteriormente e possui padrão de listras preto e amarelo-prateadas ao longo do corpo e das nadadeiras anal e caudal (DAMMSKI et al., 2011). O biólogo norte-americano George Streisinger, da Universidade do Oregon, em seus estudos para selecionar linhagens que permitissem entender como defeitos em diferentes genes afetavam o desenvolvimento, consolidou D. rerio como modelo experimental em 1981, considerando também a facilidade de manejo (ZORZETTO e GUIMARÃES, 2013).

Experimentos utilizando este peixe têm aumentado devido à facilidade de criação e manutenção em aquário e pela similaridade de 70% de seus 26 mil genes semelhantes aos genes humanos (DAMMSKI et al., 2011; ZORZETTO e GUIMARÃES, 2013). Assim, peixe-zebra está sendo utilizado em estudos genéticos, farmacológicos, comportamentais e toxicológicos. Para os estudos toxicológicos, sua utilização é incentivada, pois esses peixes são sensíveis a produtos químicos, sendo capazes de absorver e acumular nos seus tecidos os compostos adicionados na água (SCHENEIDER et al., 2009; ZORZETTO e GUIMARÃES, 2013).

O sistema reprodutivo das fêmeas de peixe-zebra é formado por um par de ovários alongados e um oviduto que conduz os ovócitos até a abertura genital. Por sua vez, são reconhecidos nos ovários os folículos ovarianos, que são constituídos pelos ovócitos (células germinativas) envoltos pelo envelope vitelínico e pelas células foliculares (células somáticas) (MENKE et al., 2011; NAGAHAMA, 1983) (Figura 2).

Figura 2: Exemplar de fêmea de peixe-zebra (a) e secção histológica de fêmea

de peixe-zebra (b) destacando a organização do ovário e dos folículos ovarianos (c). Fonte: Adaptado de http://www.fishbase.org e de Menke et al., 2011).

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No processo de ovogênese, as ovogônias crescem e originam os ovócitos primários. Essa etapa de crescimento corresponde a vitelogênese, na qual ocorre a síntese e o acúmulo de vitelo no citoplasma dos ovócitos. A vitelogênese é gradual, onde o acúmulo de vitelo é acompanhado pelo aumento no diâmetro dos ovócitos e por mudanças nas características do citoplasma. Assim, os ovócitos durante a vitelogênese podem ser classificados de acordo com as características do citoplasma em ovócitos vitelogênicos I, ovócitos pré-vitelogênicos II e ovócitos pré-vitelogênicos. De um modo geral, os ovócitos pré-vitelogênicos I apresentam citoplasma homogêneo sem grânulos de vitelo, núcleo grande com poucos nucléolos; os ovócitos pré-vitelogênicos II caracterizam-se por apresentar citoplasma com grânulos de vitelo, núcleo volumoso e com muitos nucléolos periféricos; já o ovócito vitelogênico é caracterizado por apresentar citoplasma repleto de grânulos de vitelo e núcleo que pode ou não ser reconhecível, devido à desorganização da carioteca, que precede a meiose I. À medida que ocorre o processo de vitelogênese, ocorre também a estruturação dos folículos ovarianos. O início da formação do envelope vitelínico e da organização das células foliculares coincide com a formação do ovócito pré-vitelogênico I; já nos ovócitos pré-vitelogênicos II e vitelogênicos observa-se o envelope vitelínico com estriações e a organização de duas camadas de células foliculares (ARMILIATO et al., 2014; QUAGIO-GRASSIOTTO et al., 2013; RADAEL et al., 2016). As células foliculares são fundamentais na maturação dos ovócitos, responsável por receber moléculas precursoras de vitelo e transferi-las para o ovócito. Juntos as células foliculares e os ovócitos sintetizam o envelope vitelínico, que é acelular (QUAGIO-GRASSIOTTO et al., 2013; RADAEL et al. 2016).

A estrutura geral de ovários de peixes pode ser modificada por fatores físico-químicos, pois a presença de compostos químicos altera a qualidade do ambiente, levando a modificações na organização histológica dos folículos. Deste modo os ovários podem ser utilizados em estudos de toxicidade, que avaliam os efeitos de compostos químicos na reprodução (COSTA et al., 2008; MESNAGE et al., 2015). A toxicidade do glifosato foi testada em fêmeas de D. rerio expostas à concentração máxima permitida do herbicida glifosato para rios do Brasil, sendo evidenciadas alterações nos ovários deste peixe (ARMILIATO et al, 2014; WEBSTER et al., 2013).

Assim, considerando o aumento da utilização de agrotóxicos, especialmente o herbicida glifosato, que é usado em ampla escala, tanto

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em ambientes agrícolas e urbanos, este trabalho propõe investigar os efeitos da concentração de 0,065 mg/L de glifosato nos ovócitos, no envelope vitelínico e nas células foliculares. Para tal, a hipótese estabelecida é a de que a concentração de 0,065 mg/L de glifosato, a máxima permitida pela legislação brasileira, provoca a diminuição no número e no diâmetro dos ovócitos, além de interferir no envelope vitelínico causando uma diminuição na sua espessura, bem como diminuindo o número de células foliculares, que compõem os folículos ovarianos do peixe-zebra D. rerio.

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2. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GERAL

Caracterizar o efeito da concentração de 0,065 mg/L de glifosato, a máxima permitida pela legislação brasileira, sobre a organização dos ovócitos, das células foliculares e do envelope vitelínico, que constituem os folículos ovarianos de D. rerio.

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Verificar a massa corporal e ovariana, bem como o índice gonadossomático (IGS) de fêmeas de peixe-zebra expostas ao glifosato;

 Analisar a morfologia dos folículos ovarianos e identificar os tipos de ovócitos (pré-vitelogênicos I, pré-vitelogênicos II e vitelogênicos) nos ovários de fêmeas expostas ao glifosato;  Quantificar e obter a medida do diâmetro dos ovócitos

pré-vitelogênicos I, ovócitos pré-pré-vitelogênicos II e ovócitos vitelogênicos de fêmeas expostas ao glifosato;

 Quantificar o número de células foliculares que circundam os ovócitos vitelogênicos, bem como obter a medida do maior eixo destas células foliculares;

 Determinar a espessura do envelope vitelínico que circundam os ovócitos vitelogênicos.

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3. METODOLOGIA 3.1. ANIMAIS

Para este trabalho foram utilizados peixes fêmeas da espécie Danio rerio obtidos em estabelecimento comercial de animais aquáticos, transportados em embalagem adequada para o Laboratório de Reprodução e Desenvolvimento Animal (LRDA) no Centro de Ciências Biológicas (CCB) da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC).

No Laboratório as fêmeas foram aclimatadas em aquários de 20 L, em uma densidade de 2 peixes/L, com água corrente declorada (pH 7,6), por um período de 7 dias, em condições de aeração constante, temperatura de 27,5ºC (± 0,5) e ciclo claro:escuro de 12h:12h (Westerfield, 2000), sendo o período claro simulado com lâmpada Philips® TLT40W. Os parâmetros de qualidade da água, temperatura e pH foram monitorados, diariamente e semanalmente, respectivamente. Os peixes foram alimentados com ração comercial Alcon Botton Fish®. Todos os experimentos realizados neste trabalho foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA-UFSC), projeto número 5466040416/CEUA/UFSC.

3.2. DESENHO EXPERIMENTAL

As fêmeas de D. rerio foram divididas em dois grupos e mantidas nas mesmas condições descritas para o período de aclimatação.

 Grupo 1: fêmeas expostas à concentração de 0,065 mg/L da formulação de glifosato (Roundup® WG) por 15 dias.

 Grupo 2: fêmeas não expostas ao glifosato e mantidas em aquário por 15 dias, as quais constituíram o grupo controle.

A concentração de glifosato utilizada neste trabalho está regulamentada como a concentração máxima permitida para corpos de água classe 1 e 2, conforme Resolução Nº 357/2005 do CONAMA. O tempo de exposição foi definido com base nos valores estimados de meia-vida do herbicida em água, que corresponde a um período de 14 dias (GIESY et al., 2000) e considerando o protocolo da Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos da América (USEPA, do inglês The United States Environmental Protection Agency) que estabelece 14 dias para testes de toxicidade com substâncias com potencial de

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desregular o sistema endócrino (USEPA, 1998). Após o período de experimentação, a água dos aquários contendo glifosato foi armazenada em recipiente plástico apropriado para descarte e encaminhada para o Setor de Gestão de Resíduos da Universidade Federal de Santa Catarina.

3.3. BIOMETRIA CORPORAL E OVARIANA

As fêmeas (n = 6/grupos) foram submetidas à eutanásia por decapitação, de acordo com o Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA, 2013). Após, foi obtida a massa corporal (mg), bem como a massa fresca dos ovários (mg) para o cálculo do IGS, utilizando a fórmula: IGS = (massa dos ovários/massa corporal das fêmeas) x100.

3.4. ANÁLISE MORFOLÓGICA

Para a análise em microscopia de luz, os ovários (n = 6/ grupo) foram fixados em solução de formaldeído a 4% por 24 h e posteriormente conservado em solução de etanol a 70% à temperatura ambiente. Em seguida, os ovários foram desidratados em série de etanol crescente a 70% (por 5 min), 80% (por 20 min), 90% (por 50 min), e 100% (por 60 min), diafanizados em xilol (por 25 min), posteriormente incluídos em parafina e seccionados a 7 µm em micrótomo rotativo. Para análise da morfologia dos ovários foi realizada coloração com hematoxilina-eosina (HE). Para tal, as secções foram desparafinizadas em xilol por 20 min e hidratadas em série de etanol decrescente 100% (por 20 min), 90% (por 5 min), 80% (por 5 min) e 70% (por 5 min), após as secções foram lavadas em água destilada e coradas com Hematoxilina de Harris por 5 seg, lavadas com água destilada e coradas com eosina aquosa por 7 seg. Na sequência as secções foram lavadas em água destilada, desidratadas em série alcoólica crescentes de 70% (por 5 min), 80% (por 5 min), 90% (por 5 min) e 100% (por 20 min) e diafanizadas em xilol por 20 min, para montagem das lâminas com Entellan. As secções coradas foram analisadas e fotografadas ao microscópio de luz Nikon® 80i.

Foram avaliadas as características morfológicas gerais dos folículos ovarianos, sendo considerados: (i) o aspecto do citoplasma e acúmulo de vitelo nos ovócitos vitelogênicos I, ovócitos pré-vitelogênicos II e ovócitos pré-vitelogênicos, (ii) a presença de envelope vitelínico e (iii) das células foliculares que circundam os ovócitos vitelogênicos.

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3.5. ANÁLISES MORFOMÉTRICAS

Foram realizadas medidas das células germinativas, das células foliculares e do envelope vitelínico, bem como foram realizadas contagens do número de células germinativas e células foliculares (n = 6 ovários/grupo).

Para a obtenção das medidas (µm) das células germinativas foram utilizadas fotografias feitas em aumentos de 400X em microscópio de luz convencional (LRDA). Para as medidas (µm) das células foliculares e do envelope vitelínico foram utilizadas fotografias feitas em aumento de 1000X em microscópio invertido Olympus® IX83 no Laboratório Multiusuário de Estudos em Biologia (LAMEB). As medidas foram obtidas utilizando-se o software Image J®, calibrado nas escalas de 400X e 1000X. As medidas realizadas foram o diâmetro do maior eixo tanto das células germinativas, como das células foliculares, e a medida da espessura do envelope vitelínico em quatro pontos diametralmente opostos.

Figura 3: Esquema representativo das análises morfométricas realizadas nos

folículos ovarianos de fêmeas de D. rerio. Medida do diâmetro do ovócito (linha contínua), medida da espessura do envelope vitelínico realizada em quatro pontos (setas) e medida do maior eixo das células foliculares (linha pontilhada). Fonte: Autora.

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A quantificação das células germinativas foi obtida através de contagens utilizando o software Image J, a partir das mesmas fotografias utilizadas para a obtenção das medidas. A quantificação das células foliculares foi realizada por contagem direta no microscópio de luz (Olympus® CX22LED). Foram consideradas todas as células foliculares visualizadas em secções dos ovócitos vitelogênicos (n = 70 ovócitos/grupo).

4. ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os resultados foram analisados no programa estatístico Statistica® versão 13.0 para Windows. As diferenças significativas entre os grupos foram analisadas através do teste t Student, sendo considerado significativo p < 0,05.

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5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. BIOMETRIA CORPORAL E ÍNDICE GONADOSSOMÁTICO (IGS)

A massa corporal média das fêmeas expostas ao glifosato (0,065 mg Gli/L) foi de 336,7 mg (± 43,3), enquanto que a massa corporal das fêmeas do grupo controle foi de 280,0 mg (± 36,4). Já a massa média dos ovários das fêmeas do grupo controle foi de 14,0 mg (± 1,7) e das fêmeas do grupo exposto ao glifosato foi de 22,5 mg (± 5,8). O cálculo do IGS diferiu significativamente entre o grupo controle (4,4 ± 0,1) e o grupo exposto ao glifosato (6,1 ± 0,5) (Tabela 1).

Tabela 1: Valores de massa corporal e massa do ovário para o cálculo do IGS

de fêmeas de D. rerio expostas a 0,065 mg/L de glifosato.

Massa Corporal (mg)

Massa dos Ovários

(mg) IGS Controle 280,0 (± 36,4) 14,0 (± 1,7) 4,4 (± 0,1) 0,065 mg Gli/L 336,7 (± 43,3) 22,5 (± 5,8) 6,1 * (± 0,5)

Dados apresentados em média ± erro padrão (n = 6 fêmeas/grupo). * p ≤ 0,05

Quando avaliamos o efeito da concentração de 0,065 mg Gli/L observamos um aumento no IGS, o qual reflete o aumento tanto na massa corporal das fêmeas, mas principalmente da massa dos ovários. Em estudos de toxicologia, utiliza-se biomarcadores, que são medidas de fluidos corporais, células, tecidos ou medidas realizadas sobre o organismo completo, que vão indicar a intensidade da resposta a um contaminante ambiental, em termos bioquímicos, celulares, fisiológicos, comportamentais ou energéticos (ARAIS et al., 2007). Um parâmetro levado em consideração em um estudo de população de peixes é a massa corporal, que pode fornecer um indicativo de condição geral do organismo, estimando estado geral de saúde do peixe (ARAIS et al., 2007). O IGS é um importante parâmetro reprodutivo para fêmeas e é usado para estimar a condição reprodutiva, expressando a porcentagem que as gônadas representam no peso total do corpo do indivíduo. Variações no IGS podem estar relacionadas com efeitos subletais de substâncias químicas indicando a necessidade de análises ecotoxicológicas (CASTIGLIONI et al., 2006; FURLEY e PERÔNICO, 2015; NAVARRO et al., 2006). Armiliato (2014) em seu estudo com a

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toxicidade do glifosato sobre os ovários do peixe-zebra, também verificou um aumento significativo do IGS, o que corrobora com os resultados deste trabalho, ela ainda sugeriu que este aumento foi resultante do aumento da expressão da proteína SF-1, envolvida na biossíntese de hormônios esteroides, que ela também verificou em seu trabalho.

5.2. EFEITO DO GLIFOSATO SOBRE A MORFOLOGIA DOS OVÁRIOS

Nos dois grupos analisados foi possível constatar a presença dos ovócitos pré-vitelogênicos I, pré-vitelogênicos II e ovócitos vitelogênicos, bem como o envelope vitelínico e as células foliculares, que constituem o folículo ovariano (Figura 4). As características morfológicas dos ovários do grupo exposto ao glifosato (Figura 4) não apresentaram modificações significativas comparadas ao grupo controle (Figura 5).

Figura 4: Representação da maturação do folículo ovariano de D. rerio.

Ovogônia, ovócitos pré-vitelogênicos I, ovócitos pré-vitelogênicos II e ovócitos vitelogênicos. Nucléolos (seta). nu = núcleo. Fonte: Autora.

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Figura 5: Morfologia dos ovários de D. rerio evidenciando as ovogônias

(asterisco), ovócitos vitelogênicos I (cabeça de seta), ovócitos pré-vitelogênicos II (dupla cabeça de seta), ovócitos pré-vitelogênicos (seta). nu = núcleo; v = vitelo.

A morfologia dos ovários das fêmeas sobre o efeito da concentração de 0,065 mg Gli/L apresentou uma organização típica dessa espécie de peixe, sendo do tipo assincrônica, possível de observar todos os estágios de maturação dos ovócitos (vitelogênicos I, pré-vitelogênicos II e pré-vitelogênicos). Assim como nos organismos de reprodução sexuada, nos peixes teleósteos toda a estrutura reprodutiva se desenvolve para produzir gametas férteis necessários para a reprodução, e a morfologia do ovário é organizada para que a desova ocorra várias vezes ao longo do período reprodutivo (RADAEL et al., 2016). O envelope vitelínico e as células foliculares apresentaram-se típicos nos diferentes ovócitos, encontrando mais evidenciados nos ovócitos vitelogênicos. O envelope vitelínico apresenta mudanças estruturais e completa a sua formação ao término da vitelogênese, já as células foliculares aumentam em número e distribuem-se em camadas contínuas envolta do ovócito à medida que ele cresce. As células foliculares desempenham um papel significativo na vitelogênese e na maturação final dos ovócitos (GRIER et al., 2007; QUAGIO-GRASSIOTTO et al., 2013; RADAEL et al. 2016).

5.3. EFEITO DO GLIFOSATO SOBRE A MORFOMETRIA DOS OVÓCITOS

As fêmeas expostas ao glifosato apresentaram número médio de ovócitos vitelogênicos I igual a 66,3 (± 13,3), de ovócitos pré-vitelogênicos II igual a 40,3 (± 6,5) e ovócitos pré-vitelogênicos de 51,2 (± 13,2). Esses valores não diferiram significativamente dos ovários das

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fêmeas do grupo controle, que apresentaram em média, 70,0 (± 9,8) de ovócitos pré-vitelogênicos I, 28,3 (± 2,4) pré-vitelogênicos II e 36,8 (± 4,8) de vitelogênicos (Figura 6).

Figura 6: Número de ovócitos pré-vitelogênicos I, pré-vitelogênicos II e

vitelogênicos de fêmeas de D. rerio expostas ao glifosato (n = 6 fêmeas/grupo). Dados expressos em média ± erro padrão.

O diâmetro dos ovócitos pré-vitelogênicos I das fêmeas do grupo exposto ao glifosato apresentaram uma diminuição significativa (80,0 µm ± 1,6), quando comparado ao grupo controle (86,6 µm ± 2,1, p < 0,01). Entretanto, os ovócitos pré-vitelogênicos II (163,0 µm ± 3,1) e ovócitos vitelogênicos (268,1 µm ± 4,6) expostos a concentração de 0,065 mg/L de glifosato não apresentaram diferença significativa no diâmetro comparados com os ovócitos do grupo controle (pré-vitelogênicos II de 191,9 µm (± 4,5) e (pré-vitelogênicos (263,7 µm ± 4,4) (Figura 7). 0 30 60 90 Pré-vitelogênico I Pré-vitelogênico II Vitelogênico Núm ero de o v ó cit o s Tipos de ovócitos Controle 0,065 mg Gli/L

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Pré-vitelogênico I Pré-vitelogênico II Vitelogênico 0 30 60 90 180 240 300 Controle 0,065 mg Gli/L * Tipos de ovócitos Di â m e tr o ( µm )

Figura 7: Diâmetro dos ovócitos pré-vitelogênicos I, ovócitos pré-vitelogênicos

II e ovócitos vitelôgenicos de fêmeas de D. rerio expostas ao glifosato (n ≅ 390 ovócitos pré-vitelogênicos I; 190 ovócitos pré-vitelogênicos II; 340 ovócitos vitelogênicos/grupo). Dados apresentados em média ± erro padrão. * p < 0,01

O número médio de ovócitos (vitelogênicos I, pré-vitelogênicos II e vitelôgenicos) de ovários de fêmeas expostos ao glifosato não apresentou diferença significativa. Com relação ao diâmetro, os ovócitos pré-vitelogênicos I apresentaram uma diminuição significativa, contudo os ovócitos pré-vitelogênicos II e vitelôgenicos não apresentaram mudança significativa. De acordo com Grier et al. (2007) o volume do citoplasma do ovócito aumenta em relação a sua maturação, os grânulos de vitelo aumentam em quantidade e em tamanho, consequentemente o diâmetro do ovócito aumenta.

5.4. EFEITO DO GLIFOSATO SOBRE A MORFOLOGIA E

MORFOMETRIA DAS CÉLULAS FOLICULARES E DO

ENVELOPE VITELÍNICO

As células foliculares dos folículos ovarianos de fêmeas expostas ao glifosato (Figura 8) apresentaram formato alongado, assim como as células foliculares dos folículos ovarianos das fêmeas do grupo controle (Figura 8).

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Figura 8: Folículo ovariano de D. rerio evidenciando ovócito vitelogênico com

grânulos de vitelo (gv), o envelope vitelínico (cabeça de seta) e as células foliculares (dupla cabeça de seta).

O número de células foliculares apresentado pelas fêmeas do grupo exposto a 0,065 mg Gli/L foi de 104,7 (± 3,0), o qual diferiu significativamente do número de células foliculares apresentado pelas fêmeas grupo controle que foi de 124,6 (± 3,2; p < 0,0001) (Figura 9).

Figura 9: Número de células foliculares de ovócitos vitelogênicos de fêmeas de D. rerio expostas ao glifosato. Dados expressos em média ± erro padrão. * p < 0,0001. n = 70 ovócitos/grupo.

A medida do maior eixo das células foliculares das fêmeas expostas ao glifosato apresentou uma diminuição (5,6 µm ± 0,10) em comparação com a medida obtida nas fêmeas do grupo controle (6,0 µm ± 0,08, p < 0,01) (Figura 10). * 0 20 40 60 80 100 120 140 Controle 0,065 mg Gli/L Núm ero de célula s fo licula res

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Figura 10: Medida do maior eixo das células foliculares dos ovócitos

vitelogênicos de fêmeas de D. rerio expostas ao glifosato. Dados apresentados em média ± erro padrão. *p < 0,01. n = 10 células foliculares/24 ovócitos/grupo. A espessura do envelope vitelínico das fêmeas expostas ao glifosato apresentou uma diminuição significativa (4,2 µm ± 0,12) quando comparado ao grupo controle (4,7 µm ± 0,9, p < 0,001) (Figura 11).

Figura 11: Espessura do envelope vitelínico dos ovócitos vitelogênicos de

fêmeas de D. rerio expostas ao glifosato. Dados apresentados em média ± erro padrão. *p < 0,001. n = 4/24 ovócitos/grupo.

As células foliculares e o envelope vitelínico foram apenas analisados nos folículos ovarianos com ovócito vitelogênico, pois essas estruturas não são adequadamente visualizadas na microscopia de luz nos folículos ovarianos com ovócitos pré-vitelogênicos. As células foliculares e o envelope vitelínico apresentaram morfologia esperada para a fase de maturação do folículo ovariano com ovócito vitelogênico.

* 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 Controle 0,065 mg Gli/L Diâ m et ro da s célula s fo licula res (µ m )

*

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Contudo, o número médio das células foliculares diminuiu nas fêmeas do grupo exposto ao glifosato, o mesmo aconteceu com a medida do maior eixo das células foliculares e para a espessura do envelope vitelínico. Essas reduções podem estar relacionadas com a diminuição no diâmetro dos ovócitos pré-vitelogênicos I, pois o glifosato pode interferir na fisiologia tanto da célula folicular quanto do envelope vitelínico, mesmo antes dessas estruturas serem visualizadas em microscopia de luz. O estágio de maturação dos ovócitos pré-vitelogênico I é inicial, o folículo ovariano neste momento apresenta modificações, as células foliculares e o envelope vitelínico estão passando por mudanças estruturais, além do número de células foliculares estarem começando a aumentar, consequentemente essas mudanças se refletem na síntese e acúmulo de vitelo no citoplasma dos ovócitos. As células foliculares se modificam e aumentam de número à medida que os ovócitos crescem e se distribuem de forma contínua. Na maturação inicial do folículo ovariano a célula folicular apresenta forma cúbica, modificando-se e tomando aspecto pavimentoso ao longo da maturação do folículo. O mesmo acontece com o envelope vitelínico, que passa por mudanças estruturais e fica mais espesso conforme o folículo se torna maduro (GRIER et al., 2007; QUAGIO-GRASSIOTTO et al., 2013; RADAEL et al. 2016).

Assim, considerando a ampla utilização do glifosato no Brasil e no mundo, seu efeito não-seletivo e sua mobilidade no ambiente, a preocupação com seus efeitos tóxicos em organismos não-alvos é pertinente. Os peixes, quando em ambientes contaminados são suscetíveis aos efeitos causados pelo glifosato, passando a ser um organismo não-alvo.

Neste trabalho pode-se concluir que a concentração de 0,065 mg/L de glifosato induziu danos na organização dos folículos ovarianos, principalmente no envelope vitelínico e células foliculares, nos ovários de peixe-zebra.

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