CITOMETRIA DE FLUXO, ANÁLISES ULTRAESTRUTURAIS E BIOQUÍMICA DE ESTRUTURAS SEMELHANTES A PROTOCORMOS (ESPs) DE Cattleya tigrina A. Richard.
Tese submetida ao Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais da Universidade Federal de Santa Catarina para obtenção do grau de Doutora em Ciências; área de concentração: Recursos Genéticos Vegetais.
Orientadora: Profª. Drª Rosete Pescador
Co-Orientador: Profº. Dr. Paulo César Poeta Fermino Jr
Florianópolis 2017
DEDICATÓRIA
Dedico aos meus pais Zauri Duarte de Liz (in memoriam) e Maria Leni de Liz, com todo meu amor e gratidão, por tudo que fizeram por mim ao longo de minha vida.
Ao meu filho Nicolas Heráclito Liz de Lima pelo apoio e amor incondicional. Amo vocês!
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus pelo presente da vida, pelas pessoas que o Senhor tem colocado em meu caminho. Algumas delas me inspiram, me ajudam, me desafiam e me encorajam a ser cada dia melhor. Por todas as oportunidades que me fizeram chegar onde eu cheguei, e me fizeram ser quem eu sou. Foi nesta caminhada de tropeços, vitórias e derrotas, que pude enxergar o verdadeiro significado e beleza da Vida.
Aos meus amados pais, Zauri Duarte de Liz (in memoriam) e Maria Leni de Liz, pelo amor incondicional. Gratidão eterna por tudo o que vocês sempre fizeram por mim. Por todo esforço para me dar o melhor, por me ensinar a viver com dignidade, por investirem na minha educação, pelas orações, carinho e dedicação que iluminam os meus caminhos. Amo muito vocês!
Ao meu amado filho Nicolas Heráclito Liz de Lima, pelo amor incondicional, por compreender os momentos em que nos privamos de estarmos juntos. Suas palavras firmes e sinceras demonstram todo o seu carinho. Te amo filho!
Aos meus queridos irmãos Zauri Duarte de Liz Jr, Nathan de Liz Pereira, Júlio Cesar de Liz, fontes de inspiração que eu carrego sempre comigo. E especialmente a minha querida irmã Raquel Duarte de Liz, minha companheira e protetora desde a infância e até os dias de hoje. Agradeço pelas suas orações, por todo amor, amizade e carinho que vocês sempre tiveram comigo.
Aos meus amados sobrinhos Camila de Liz Pereira, Vinícius de Liz Pereira, Victória de Liz Arruda, Lucas Stalbaum de Liz e Julia Stalbaum de Liz que sempre me proporcionam muito orgulho e alegria.
Ao querido Prof. Dr. Cassio Renato Montenegro de Lima pelo apoio e palavras de incentivo. Obrigada pela ajuda durante o desenvolvimento do trabalho. Por me ouvir nas horas de angústia e aconselhar nos momentos de decisão. Muito obrigada!
A minha orientadora, Profa. Dra. Rosete Pescador, pela confiança em mim depositada e ao meu co-orientador Paulo César Poeta Fermino Jr, pela amizade, pelas oportunidades e as discussões sobre o trabalho de tese.
Ao Prof. Dr. Jonny Everson Scherwinski Pereira, pela competência científica, pela dedicação ao desenvolvimento do ensino e pesquisa e pela oportunidade em realizar parte de meu trabalho na EMBRAPA - Cenargen em Brasília – DF e me orientar durante as
análises de citometria de fluxo, disponibilizando de seu tempo para contribuir com sugestões construtivas para o meu trabalho.
A Prof. Dra. Marisa Santos por toda ajuda desde o mestrado, me acolhendo com carinho nos momentos em que precisei durante o doutorado e sempre me encorajando para mais conquistas. Seu amor pela profissão e dedicação são fontes de inspiração e exemplos a serem seguidos.
Ao Prof. Dr. José Marcello Salabert Campos, pela oportunidade em fazer o curso de Citometria de Fluxo, na UFJF-MG, e por não medir esforços em transmitir seu conhecimento sobre citometria de fluxo e contribuir com as discussões do trabalho.
Aos professores que aceitaram fazer parte da banca, Prof. Dr. Aparecido Lima da Silva, Prof. Dr. Jonny Everson Scherwinski Pereira, Prof. Dr. Lírio Luiz Dal Vesco, Prof. Dr. Luiz Antônio de Souza, Profa. Dra. Marisa Santos, agradeço pela disponibilidade em avaliar e contribuir com o trabalho.
Aos professores do curso de Citogenética Vegetal, no qual eu tive a oportunidade de conviver durante 15 dias, na EMBRAPA-Cenargen, através de muito aprendizado e amizades conquistadas, em especial a Prof. Dra. Ana Claúdia Guerra pelos ensinamentos e pela forma divertida e espontânea de conquistar as pessoas ao seu redor. Ao Prof. Dr. Jose Francisco Montenegro Valls, por todo conhecimento e ensinamentos sobre a citogenética de plantas, a Dra. Adriana Custodio, Dra. Marisa Toniolo Pozzobon e Dr. Artur Fonseca pela contribuição e atenção disponibilizada durante o curso e também aos colegas que tive a oportunidade de conhecer e conviver durante estes dias.
Aos professores da disciplina Célula Vegetal, Prof. Dra. Zenilda Laurita Bouzon, Prof. Dra. Luciane Cristina Ouriques, Dr. Eder Carlos Schmidt e Dra. Carmen Simioni pelas sugestões e ensinamentos durante a disciplina, que contribuíram muito para a elaboração da tese.
Meu agradecimento aos professores e colaboradores da disciplina Ecofisiologia Vegetal, Prof. Dr. Aparecido Lima da Silva, Prof. Dr. José Afonso Voltolini e Dr. Alberto Fontanella Brighenti pelos conhecimentos que foram transmitidos, desde a utilização dos aparelhos fotossintéticos até a degustação dos vinhos. Aos colegas com quem eu tive a oportunidade de participar da disciplina e conhece-los um pouco mais, uma experiência incrível e enriquecedora ao lado de vocês, queridos Anyela Rojas Molina, Marcia Regina Faita, Marcos Leandro dos Santos, Tamara Cristina Campos, Tiago Camponogara Tomazetti,
Tomás Pellizzaro Pereira, Vivian Almeida, obrigada por compartilhar os momentos de aprendizado e diversão.
Ao Prof. Dr. Marcelo Maraschin pela disponibilidade do uso dos aparelhos do Laboratório de Morfogênese e Bioquímica Vegetal e a querida Eva Regina de Oliveira Rodrigues, pelo carinho e atenção disponibilizada durante as análises bioquímicas.
Aos professores do programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, em especial ao Prof. Dr. Rubens Onofre Nodari e Prof. Dr. Miguel Pedro Guerra, pelos ensinamentos passados durante os anos em que fiz parte do PPG RGV. E a secretária do programa, Bernadete Ribas, pela ajuda e disponibilidade em resolver dúvidas e questões burocráticas.
Aos organizadores e palestrantes do Curso de Criopreservação em Recursos Genéticos Vegetais realizado na UFLA-MG, no qual obtive aprendizado e excelentes discussões, especialmente ao Prof. Dr. Diogo Pedrosa Corrêa da Silva pela atenção disponibilizada, ao Prof. Dr. Renato Paiva, Prof. Dr. Maurizio Lambardi, Prof. Dr. Bart Panis, Dr. Renato Fernandes Galdiano Júnior, pelas palestras proferidas e conhecimentos adquiridos, muito obrigada! E tambem aos colegas que conheci durante o curso, Jean Carlos Betoni, Juliana Aparecida Souza, Naiana Dinato e Kamila Antunes pela troca de experiencias, aprendizado e descontração durante os intervalos.
À querida Gabriela Ferreira Nogueira, pela amizade e ajuda durante as análises de citometria de fluxo e durante as discussões do trabalho, muito obrigada Gabi!
A querida Jennifer Nogueira, minha colega de apartamento, durante o tempo em que estive em Brasília, pela disponibilidade de me acolher e me situar em Brasília. E a todos os colegas do Laboratório de Cultura de Tecidos II da EMBRAPA - Cenargen, por me receber com tanto carinho durante os dias em que estive trabalhando e utilizando o laboratório. E especial ao técnico André Luís Xavier de Souza, pela atenção e ajuda disponibilizada.
Às queridas Aline Cristina Velho, Marília Shibata e Pâmela Dall'Asta, meus primeiros contatos quando entrei no PPG em Recursos Genéticos Vegetais, e desde então permaneceu uma grande amizade. O quarteto "Meninas do RGV" que pouco tempo dispõem para os encontros, mas graças a tecnologia, conseguimos manter as conversas em dia.
À querida Daniela De Conti, que ocupa um espaço no meu coração, te agradeço pelas discussões, parceria nas viagens a congressos
e por compartilhar das informações e dificuldades do cultivo in vitro da
Cattleya tigrina. E por sempre tem um tempo na sua agenda de
professora, para me ouvir e me ajudar.
Aos meus queridos estagiários voluntários, que tive a oportunidade conviver durante estes 4 anos de doutorado, Jessica Podeleski sempre determinada e confiante, Guilherme Sebold prestativo e dedicado, foram grandes parceiros na fase inicial de subcultivo das culturas das orquídeas. Agradeço por toda ajuda dedicada durante o tempo em que vocês estiveram comigo.
Ao meu querido Rubens Cândido Zimmermann, pelas horas intermináveis na câmara de fluxo, que foi durante muito tempo, nossa câmara anti recalque, pelos feriados ensolarados no laboratório, almoçando pastel do Rosa e bebendo cajuína, mas que no final valeu a pena, pois "você supriu as minhas carências". Meus momentos de diversão, foram por conta de sua simplicidade e simpatia. Muito obrigada!
À queridíssima Ana Paula Florindo, que aos poucos foi demonstrando interesse pelo trabalho. Obrigada pela companhia nas madrugadas no laboratório e por você ser a minha estagiária "ryca". Sempre disposta a aprender e ajudar no que foi preciso.
Ao querido Stefano Gomes Kretzer pela ajuda disponibilizada nos experimentos de aclimatação de orquídeas, pelas conversas e discussões a respeito das orquídeas e ao Diogo Klock Ferreira, pelas conversas sobre Cattleya e pela cápsula de Cattleya tigrina, meu muito obrigada.
Aos colegas do laboratório de Fisiologia do Metabolismo, Daniel Rosa, Jenny Paola Corredor Prado, Julia Zappelini, Lara Ribeiro de Carvalho, Luiza Giacomolli Polesi, Marcia Rossarola, Sebastian Montoya, Willian Goldoni Jr e aos IC's Bruno Bacheiga Navarro, Djalma Roecker Jr, pela amizade conquistada, parceria nos churrascos e ajuda disponibilizada.
A todos os colaboradores do Laboratório Central de Microscopia Eletrônica e um obrigado especial à Eliana de Medeiros Oliveira, por seu olhar preciso, pela ajuda, pelas conversas e pela grande contribuição ao trabalho.
A todos os colegas do Laboratório de Fisiologia do Desenvolvimento e Genética Vegetal, em especial ao Dr. Ramon Felipe Scherer, pela disponibilidade em ajudar sempre que foi preciso e ao André Felipe Knop pela ajuda com equipamentos, reagentes e técnicas laboratoriais.
A todos os colegas do PPG RGV em especial, Ana Paula Lando, André Felipe Lohn, Daniela Werner Ribeiro, Fernando Sanchez, Gustavo Klabunde, Hugo Pacheco de Fraga, Liliana Quinga Pila, Luciano Saifert, Maiby Teodoro de Oliveira, Moisés Pollak Júnior, Morgana Elis Lopes, Thiago Ornellas, Tiago Montagna, Vanessa Samara Petry, Vanessa Tedesco, pelos momentos de descontração, conversas, companheirismo e ajuda durante o desenvolvimento do trabalho.
Aos queridos alunos da disciplina prática de Biotecnologia vegetal, pela convivência e questionamentos durante a disciplina. Aos participantes do curso de cultivo in vitro de orquídeas e aos colaboradores, que se dispuseram em me ajudar durante os 3 anos consecutivos em que o curso foi oferecido. Meu muito obrigada a todos vocês, pelas idéias compartilhadas, pelo entusiasmo apaixonado e estimulante, que ampliaram meu conhecimento científico e me possibilitaram desenvolver e concluir este trabalho.
Ao programa Zumba®, da qual eu participo, que me ajudou muito durante esses 4 anos de doutorado. Sou grata por ter conhecido e aprendido com o querido Prof. Leandro Porto, com quem eu tive a oportunidade de conhecer e conviver durante o tempo em que estava em Florianópolis e me proporcionou momentos inesquecíveis e verdadeiros, juntamente com minhas queridíssimas amigas da Zumba, com quem eu posso contar para sempre, Eliete Vaz, Marcia Romio, Maria Claudia Beirão Tonolli, Rosângela Loureiro, Rossana Valeria Chaya Piraccini. Amo vocês!
A Universidade Federal de Santa Catarina, pelo ensino público e de qualidade.
À CAPES pelo apoio financeiro através da bolsa de estudos, e ao CNPq e FAPESC pelos recursos financeiros que permitiram a realização de todo esse trabalho.
A todos que os que conheci durante esses 7 anos em que estive na UFSC/CCA/CCB e direta ou indiretamente colaboraram para a realização deste trabalho, o meu eterno muito obrigado!
Trem Bala Ana Vilela
Não é sobre ter todas pessoas do mundo pra si É sobre saber que em algum lugar alguém zela por ti É sobre cantar e poder escutar mais do que a própria voz É sobre dançar na chuva de vida que cai sobre nós
É saber se sentir infinito Num universo tão vasto e bonito, é saber sonhar Então fazer valer a pena Cada verso daquele poema sobre acreditar
Não é sobre chegar no topo do mundo e saber que venceu É sobre escalar e sentir que o caminho te fortaleceu É sobre ser abrigo e também ter morada em outros corações E assim ter amigos contigo em todas as situações
A gente não pode ter tudo Qual seria a graça do mundo se fosse assim? Por isso eu prefiro sorrisos E os presentes que a vida trouxe para perto de mim
Não é sobre tudo que o seu dinheiro é capaz de comprar E sim sobre cada momento, sorriso a se compartilhar Também não é sobre correr contra o tempo pra ter sempre mais Porque quando menos se espera a vida já ficou pra trás
Segura teu filho no colo Sorria e abraça os teus pais enquanto estão aqui Que a vida é trem bala, parceiro E a gente é só passageiro prestes a partir
RESUMO
A orquídea Cattleya tigrina encontra-se dispersa no bioma Mata Atlântica sendo uma espécie considerada vulnerável à extinção segundo a Resolução da SMA do Estado de São Paulo e se encontra na lista vermelha da flora do Rio Grande do Sul. Devido ao seu valor ornamental, torna se alvo da ação predatória de colecionadores e orquidófilos. Com sua população em declínio reforça-se a necessidade de estudos para entendimento e conservação da espécie. A cultura de tecidos vegetais engloba um conjunto de ferramentas biotecnológicas que possibilitam a conservação e melhoramento genético de plantas. Por ser uma espécie vulnerável a extinção e endêmica da Mata Atlântica, C.
tigrina foi utilizada como modelo nesse estudo. Uma das rotas
morfogênicas de regeneração in vitro de orquídeas ocorre durante a formação de Estruturas Semelhantes a Protocormos (ESPs) e pode ser empregada para a propagação massal. Nesse contexto, o objetivo do trabalho foi caracterizar o padrão de desenvolvimento das ESPs através de análises ultraestruturais, citometria de fluxo (CF) e bioquímica em diferentes estádios de formação e regeneração de C. tigrina. Explantes foliares, obtidos de plantas in vitro foram inoculados em meio de cultura MS/2 suplementado com 9μM de TDZ, para a indução e desenvolvimento das ESPs. As culturas foram coletadas aos 7, 14, 21, 30, 60, 120 e 180 dias de cultivo para posteriores análises. As análises de CF foram realizadas mediante a combinação de observações durante a morfo histodiferenciação em diferentes regiões da planta. Durante a indução e desenvolvimento das ESPs foram realizadas análises histológicas em microscopia de luz (ML) e em microscopia eletrônica de transmissão (MET). Adicionalmente, foram quantificados também, os carboidratos solúveis totais e amido, níveis de clorofilas a, b e carotenoides. A partir da CF foi possível verificar a estabilidade da espécie mantida in vitro, bem como as alterações anatômicas, bioquímicas e metabólicas durante a indução e desenvolvimento das ESPs. Os resultados alcançados permitiram inferir que as ESPs de C.
tigrina possuem um conteúdo semelhante, do valor C de DNA, durante
as primeiras semanas de indução. O estudo histológico revelou que as ESPs são estruturas formadas por células meristemáticas e a protoderme contém células que estão em constante divisão, com um citoplasma denso e núcleos proeminentes. Em MET observa-se que as células apresentam organelas como mitocôndrias de vários tamanhos e formas, núcleos grandes com nucléolo, abundância de amiloplastos nos estádios
iniciais de desenvolvimento das ESPs e cloroplastos. Durante o desenvolvimento das ESPs ocorreu uma diminuição no teor de clorofilas
a e b, porém, a razão de clorofilas a/b se manteve em todos os
tratamentos. Os maiores teores de amido nas células das culturas foram registrados aos 14 dias de cultivo em meio de cultura isento de regulador de crescimento vegetal (RCV). A partir disto, observou-se um decréscimo do teor de amido. Este evento pode estar relacionado com a degradação deste composto para o suprimento energético durante a manutenção do crescimento celular. Assim, as características celulares observadas nos estudos ultraestruturais e de CF descrevem e ampliam a base científica para a compreensão dos fatores que modulam o processo de indução e desenvolvimento das ESPs em C. tigrina. Além disso, estas informações são de grande importância para a otimização do processo de propagação e regeneração, principalmente, por se tratar de uma espécie de orquídea endêmica da Mata Atlântica do sul do Brasil, de grande valor ornamental e por ser considerada vulnerável à extinção. Palavras-chave: Microscopia de Luz, Microscopia Eletrônica de Transmissão, orquídeas, pigmentos fotossintéticos, propagação in vitro, Valor C de DNA.
ABSTRACT
The Cattleya tigrina orchid is found in the Atlantic Forest biome. A species considered vulnerable to extinction, according to the SMA Resolution of the São Paulo State, and to the red list of the flora of Rio Grande do Sul. Due to its ornamental value, it has become a target of predatory actions of collectors and orchidophiles. Its declining population reinforces the studies to understand and to conserve the species. The plant tissue culture comprises a set of biotechnological tools that allows its genetic improvement and the conservation of the plants. Because it is a species vulnerable to extinction and endemic to the Atlantic Forest, C. tigrina was used as a model in this study. One of the morphogenetic route of in vitro regeneration of orchids occur during the formation of Protocorm-like bodies (PLBs), and can be used for mass propagation. In this context, the objective of the study was to define the pattern of development of PLBs by ultrastructural analysis, flow cytometry (FC) and biochemistry at different stages of formation and regeneration of C. tigrina. Leaf explants obtained from young plants micropropagated in vitro were inoculated into culture medium MS/2 supplemented with 9μM TDZ for the induction and development of PLBs. The cultures were collected after 7, 14, 30, 60, 120 and 180 days of cultivation for further analysis. FC analyses were performed with morphological histodifferentiation observations in different regions of the plant. During the induction and development of PLBs, histological analyses were performed in Light Microscopy (LM) and in Transmission Electron Microscopy (TEM). Total soluble carbohydrates and starch, levels of chlorophyll a, b and carotenoids were also quantified. In FC, the stability of the species maintained in vitro could be verified. Just as the anatomical, biochemical and metabolic alterations during the induction and development of PLBs. The results allowed to infer that the PLBs of C. tigrina have a similar content, of the C value of DNA, during the first weeks of induction. The histological study revealed that PLBs are structures formed by meristematic cells. And the protoderm contains cells that are in a constant division, with a dense cytoplasm and prominent nuclei. In TEM analyses, mitochondria of various sizes and shapes, large nuclei with nucleolus, amyloplasts in the early stages of development of PLBs and chloroplasts were observed. During the development of PLBs there was a decrease in chlorophyll a and b, and chlorophyll a/b ratio was maintained in all treatments. The highest levels of starch were recorded at 14 days of
culture in plant growth regulator (PGR) free medium. A decrease in the starch content was observed. May be related to the degradation of this compound to the energetic supply during cell growth maintenance. Cellular characteristics observed in ultrastructural and FC studies describe and extend the scientific basis for understanding the factors that modulate the induction and development process of PLBs in C. tigrina. This information is important for optimizing the process of propagation and regeneration. Mainly because it's an endemic orchid of the Atlantic Forest in southern Brazil, of great ornamental value and considered vulnerable to extinction.
Keywords: Light Microscopy, Transmission Electronic Microscopy, orchids, photosynthetic pigments, in vitro propagation, C Value DNA.
LISTA DE FIGURAS Revisão de Literatura
Figura 1 - (a) Aspecto geral da flor de Cattleya tigrina e (b) Planta de
C. tigrina com cápsula madura...30
Figura 2 - Esquema da transformação da energia luminosa (fóton) em energia química (ATP) nas membranas tilacoides no cloroplasto...43 CAPÍTULO I
Figure 1 - Protocorm-like bodies (PLBs) formed between 7 and 180 d after inoculation in Cattleya tigrina………..….98 Figure 2 - Fresh mass increase and percentage of leaf explants oxidized in protocorm-like bodies (PLBs) of Cattleya tigrina at different in vitro culture times after inoculation. ………....100 Figure 3 - Histograms of relative fluorescence intensity obtained after the analysis of propidium iodide-stained nuclei isolated from Cattleya
tigrina PLBs at different stages of development………..102
Figure 4 - Histograms of relative fluorescence intensity obtained after the analysis of propidium iodide-stained nuclei isolated from leaf (A) and root tip (B) of Cattleya tigrina cultivated in vitro without plant growth regulators………..………103 CAPÍTULO II
Figure 1 - Histological observation on the formation of PLBs of
Cattleya tigrina…..……….………..123
Figure 2 - Histological analysis in the formation of PLBs of Cattleya
tigrina...124
Figure 3 - Analysis in TEM of foliar bases and ESPs of Cattleya
tigrina...125
Figure 4 - Analysis in TEM of Cattleya tigrina with 9μM TDZ...126 Figure 5 - Total soluble carbohydrate contents during induction and development of Cattleya tigrina PLBs at different concentrations of TDZ...Err o! Indicador não definido.28
Figure 6 - Starch contents during induction and developmen of Cattleya
tigrina PLBs at different concentrations of
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO I
Table 1 - Relative DNA content (pg) of leaves, leaf tips and leaf bases
of Cattleya tigrina at 0 (control) and 30 d of
cultivation………..………..…….…101 Table 2 - Relative DNA content (pg) of protocorm-like bodies (PLBs)
of Cattleya tigrina at different in vitro culture
times……….………103
CAPÍTULO II
Table 1 - Mean values of the quantification of the photosynthetic pigments chlorophyll a (Chla), chlorophyll b (Chlb), relation between chlorophyll a and chlorophyll b (Chla / Chlb), total chlorophylls (Chl T) and carotenoids (Carot) in μg / g -1 Of fresh matter of Cattleya tigrina PLBs……….…...…..………...127
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA...23
2. REVISÃO DE LITERATURA...27
2.1 Família Orchidaceae...27
2.2 Formação de Protocormos em orquídeas...28
2.3 Gênero Cattleya...29
2.4 Conservação das Orquídeas do Gênero Cattleya...30
2.5 Padrões morfogênicos in vitro das estruturas semelhantes a protocormos...31
2.6 TDZ como Regulador de Crescimento Vegetal...34
2.7 Estimativa do valor C de DNA nuclear...35
2.8 Formação e desenvolvimento dos cloroplastos em ESPs...37
2.9 Fotossíntese e autofluorescência do Cloroplasto...43
2.10 Microscopia como ferramenta de análise no cultivo in vitro...44
2.11 Pigmentos fotossintéticos...49
2.12 Carboidratos e amido...53
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...55
3. CAPÍTULO I. Nuclear DNA content in in vitro morphogenesis of Cattleya tigrina A. Richard……….93
3.1 Abstract……….93
3.2 Introduction………...93
3.3 Materials and methods………..………95
3.4 Results………...97
3.5 Discussion……….104
3.6 Conclusions………...109
3.7 Perspectives………..109
4. CAPÍTULO II. Ultrastructure and biochemistry in the induction and development of Protocorm-like bodies (PLBs) of Cattleya tigrina A Rich…..118
4.1 Abstract……….118 4.2 Introduction………...119 4.3 Materials and methods………..120 4.4 Results………...122 4.5 Discussion……….129 4.6 Conclusion………134 4.7 References……….136 5. CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS...144
1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA
Orchidaceae representa uma das famílias de plantas com flores mais diversificadas, com cerca de 899 gêneros, 27 mil espécies descritas e valorizadas por suas flores que exibem ampla diversidade, tamanhos e cores (Dressler 2005; Roberts e Dixon 2008; Souza e Lorenzi 2008, The Plant List 2017). Apresentam distribuição cosmopolita, embora sejam mais abundantes e diversificadas em florestas tropicais, especialmente da Ásia e das Américas (Dressler 1993, 2005). O Brasil detém uma das maiores diversidades de orquídeas do continente americano e do mundo (Barros et al. 2010). Estimativas atuais sugerem a ocorrência de 291 gêneros e 2539 espécies, distribuídas por todas as regiões do país, principalmente pela plasticidade adaptativa (Koch e Silva 2012). Destas, 1632 são endêmicas (Barros et al. 2017), 72 são relatadas como raras (Giulietti et al. 2005) e 34 constam na "Lista Oficial das Espécies Brasileiras Ameaçadas de Extinção" (MMA 2014).
Fatores como mudanças climáticas, destruição de habitats, colheita excessiva e diminuição das populações de polinizadores contribuem para a suscetibilidade das orquídeas que pode levar à extinção (Houri et al. 2012). Orchidaceae tem uma alta proporção de gêneros e espécies ameaçados (Swarts e Dixon 2009). São plantas com alto valor ornamental, em virtude da beleza e diversidade morfológica de suas flores (Chai et al. 2007). A sua intensa exploração tem acarretado extinção de espécies, além da degradação do seu habitat natural (Hosomi et al. 2012). A exploração do habitat também é fator que colabora para o desaparecimento de muitas espécies (Koopowitz 2001). Assim, o monitoramento e as práticas de gestão podem ser a melhor forma de conservar orquídeas (Işık 2011, Houri et al. 2012).
Orchidaceae tem fundamental importância para a manutenção da biodiversidade e várias espécies da família são consideradas bioindicadoras ambientais do estado de conservação das florestas, sendo sensíveis às interferências em matas primárias em virtude da ocupação de nichos especializados (Marrara et al. 2007).
Em orchidaceae, muitas espécies são restritas a determinadas regiões do mundo, dependendo das condições climáticas e vegetacionais de cada local, sendo comum na família a alta representatividade de espécies endêmicas.
As orquídeas são plantas herbáceas, perenes, terrícolas ou, mais comumente, epífitas, representando aproximadamente 73% das espécies (Rodrigues e Barros 2011). Dressler (1990, 1993) afirma que em média duas em cada três espécies de Orchidaceae são epífitas. As espécies
epífitas correspondem à parte significativa da diversidade vegetal e contribuem positivamente para tornar as florestas tropicais úmidas um dos mais complexos ecossistemas da biosfera (Kersten 2006).
O gênero Cattleya foi estabelecido originalmente por John Lindney, em 1822, na obra “Collectanea Botanica”, ao descrever a espécie brasileira Cattleya labiata Lindney (Braem 1984). Fowlie (1977) descreveu que o centro de origem de Cattleya seria na região costeira entre o Litoral Norte Paulista e o Sul do Rio de Janeiro, e também o Vale do Paraíba e regiões montanhosas da Serra da Mantiqueira e Serra dos Órgãos.
O gênero Cattleya está representado por duas espécies no Estado de Santa Catarina: C. leopoldii Versh. (Sinonímia de C. tigrina A. Rich) e C. intermedia Grah.; encontradas na Ilha de Santa Catarina, nos seus arredores e também em outros locais do Estado (Klein et al. 1977).
Cattleya tigrina A. Rich. apresenta-se com comportamento
epífita ou rupícola (Buzatto et al. 2010) e se distribui pelo bioma Mata Atlântica, nos estados do Rio Grande do Sul, Santa Catarina, São Paulo, região Sul da Bahia e Pernambuco (Cruz et al. 2003). Embora C. tigrina não conste na lista de espécies ameaçadas de extinção do MMA (2014), é uma espécie considerada vulnerável à extinção, de acordo com a Resolução da Secretaria do Meio Ambiente (Resolução SMA 48/2004) e se encontra na lista vermelha da flora do Rio Grande do Sul (CONSEMA 42.099/2002).
As orquídeas apresentam um padrão bastante uniforme de germinação e desenvolvimento (Arditti 2008). Elas possuem sementes extremamente diminutas e sem reservas nutritivas. A germinação inicia com o intumescimento da semente que rompe o tegumento seminal e libera o embrião (Liz 2013). Este se desenvolve numa estrutura tuberiforme, geralmente clorofilada, denominada protocormo (Arditti 1992).
Devido a lenta e ineficiente multiplicação por via sexuada de propagação (Junghans e Souza 2013), a conservação de orquídeas depende de estratégias a longo prazo (Machado Neto e Custódio 2005). O cultivo in vitro é utilizado para a propagação de orquídeas, possibilitando obtenção de plantas tanto para a pesquisa, preservação das espécies ameaçadas ou não de extinção, ou para a produção massal (Sorgato et al. 2015). Estudos com finalidade de estabelecer processos de propagação das orquídeas são extremamente importantes para viabilizar a sua multiplicação em coleções vivas e possibilitar tanto a
reintrodução na natureza quanto à conservação das espécies ameaçadas de extinção (Ferreira e Suzuki 2008).
Para a conservação e melhoramento genético das espécies diversas técnicas vêm sendo utilizadas. As biotecnologias compreendem um conjunto de técnicas que possibilitam o estudo de células, tecidos, órgãos ou organismos inteiros, por meio da indução e controle da morfogênese in vitro (Rao e Ravishankar 2002). Dentre estas, destaca-se a micropropagação, por ser uma ferramenta de larga aplicação para a conservação da biodiversidade. A micropropagação engloba um conjunto de técnicas que possibilitam a propagação massal de genótipos selecionados que permitem a captura e fixação de ganhos genéticos (Guerra et al. 1999).
Pesquisas desenvolvidas para a propagação em larga escala de orquídeas cultivadas in vitro utilizam como fontes de explantes, hastes florais (Chen e Chang 2000; Chen et al. 2002); ápices meristemáticos (Malabadi et al. 2005); protocormos (Silva e Tanaka 2006; Naing et al. 2011; Ng e Saleh 2011); segmentos caulinares (Luo et al. 2008); segmentos foliares (George et al. 2008; Gantait e Sinniah 2012) e ápices de raiz (Manners et al. 2010). Estes explantes, quando submetidos ao cultivo in vitro, formam estruturas denominadas "estruturas semelhantes a protocormos” (ESPs), pois se assemelham aos protocormos obtidos pela germinação simbiótica (Arditti e Ernst 1993).
Embora a morfologia e aspectos do desenvolvimento estrutural das ESPs sejam conhecidos, são poucos os estudos a respeito da ontogênese (Lee et al. 2013). Muitos autores afirmam que as ESPs são embriões somáticos (Steward e Mapes 1971; Begum et al. 1994; Ishii et al. 1998; Chen e Chang 2000; Huan et al. 2004; Hossain et al. 2013; Lee et al. 2013; Teixeira Da Silva 2013), ou que a embriogênese somática é um passo inicial na formação das ESPs (Arditti e Ernst 1993; Begum et al. 1994; Zhao et al. 2008). Liz (2013) estudando sobre a morfo-histodiferenciação de protocormos de C. amethystoglossa e ESPs de C.
tigrina observou que os protocormos e as ESPs formadas,
respectivamente, evidenciaram um padrão de morfogênese distinto. As ESPs são capazes de converter-se em plântulas facilmente, quando cultivadas em meio com regulador de crescimento (Ng e Saleh 2011). E, por isso, o estudo deste padrão de desenvolvimento é fundamental para o avanço das pesquisas em transformação genética de orquídeas (Liau et al. 2003). No entanto, o cultivo in vitro de algumas espécies tem sido limitado devido às mudanças anatômicas, morfológicas e fisiológicas inerentes ao processo de morfogênese
(Grattapaglia e Machado 1998; Louro e Santiago 2000; Chandra et al. 2010).
Algumas pesquisas foram realizadas com o objetivo de compreender os fatores que modulam esse processo em C. tigrina. Fritsche (2012) estudou a regeneração de ESPs e CF aplicadas ao melhoramento genético e ao estudo do genoma nuclear de orquídeas. Liz (2013) elucidou aspectos envolvidos na morfo histodiferenciação do desenvolvimento de ESPs, e evidenciou a diferenciação dos tecidos na primeira semana de cultivo, onde as células epidérmicas de folhas utilizadas como fonte de explante, começaram a sofrer divisões mitóticas para formação dessas estruturas.
No trabalho realizado por Almeida (2014) foi analisada a dinâmica das poliaminas, amido, proteínas totais e metilação do DNA durante 35 dias de cultivo das ESPs. Foi verificado que a ontogênese dessas estruturas está associada às alterações bioquímicas e eventos epigenéticos como a metilação do DNA. De Conti (2016) verificou reprogramação gênica durante a indução e desenvolvimento das ESPs. Na indução das ESPs verificou proteínas relacionadas ao metabolismo energético e carboidratos expressas ao zero dia de cultivo. Durante o desenvolvimento das ESPs, alterações na expressão de proteínas associadas aos processos metabólicos; metabolismo energético de carboidratos; ciclo celular; metabolismo secundário foram observados.
Mesmo com alguns avanços na elucidação dos mecanismos associados à modulação desse sistema regenerativo em C. tigrina, a compreensão ultraestrutural dessas células com elevado potencial morfogênico que regulam esse sistema de regeneração foi proposta nesse estudo. O uso de análises da morfo histodiferenciação do material vegetal, utilizando técnicas de microscopias de luz, eletrônica confocal e de transmissão, foi de fundamental importância para a interpretação na identificação e caracterização na formação das ESPs, acompanhadas de alterações bioquímicas e metabólicas.
A tese está organizada em dois capítulos, precedidos por uma revisão bibliográfica. O primeiro capítulo abrange o estudo da CF, durante a indução e regeneração das ESPs, enquanto o segundo refere-se à análise ultraestrutural dos cloroplastos no desenvolvimento das ESPs, e utiliza abordagens bioquímicas para compreender os fatores que modulam a indução e desenvolvimento das ESPs em C. tigrina.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Família Orchidaceae
Orchidaceae é uma das famílias botânicas mais numerosas e diversificadas (Chase 2005), apresentando cerca de 27.801 espécies aceitas, distribuídas em 899 gêneros (The Plant List 2017). Seus representantes possuem diferentes hábitos, com espécies terrícolas, epífitas, rupícolas, escandentes ou até mesmo saprófitas. Isso possibilita uma distribuição cosmopolita, embora sejam mais abundantes e diversificadas em florestas tropicais (Pinheiro et al. 2004). Cada espécie de orquídea possui adaptações para ocupar um ambiente específico e, devido as suas especializações, muitas possuem distribuição restrita e o endemismo é bastante elevado (Pritchard 1989). As orquídeas apresentam frutos com milhares de sementes, contudo a germinação destas é pouco eficiente em condições naturais, chegando ao máximo em 5% (Stoutamire 1964).
São cultivadas por suas belas flores e amplamente conhecidas por sua importância ecológica e econômica. Devido à sua gama de diversidade na forma, tamanho e cor das flores, caracterizada pela distinta morfologia floral, mecanismo de polinização, associação com fungos (micorrizas) e sementes minúsculas é considerada uma família evolutivamente avançada de monocotiledôneas (Linthoingambi et al. 2015).
Não obstante, o fato de serem membros da maior família de plantas com flores, as orquídeas estão entre as mais seriamente ameaçadas de extinção, sendo que a vulnerabilidade resultaria de várias razões, as principais seriam: o ciclo de vida especializado, como por exemplo, longo período vegetativo até atingir o período reprodutivo, sementes com pouca ou nenhuma reserva, a germinação de sementes dependente da associação com fungos micorrízicos, e a ação do homem por meio da destruição do habitat, derrubando árvores e florestas, além da coleta indiscriminada de orquídeas na natureza (Ferreira & Suzuki 2008). No Brasil, não só com relação às orquídeas, mas também às demais espécies, a preocupação com o aumento do número de espécies ameaçadas de extinção é crescente. A possibilidade de produzir plantas de orquídeas em grandes quantidades poderia garantir que essas plantas ocupem um lugar no futuro, evitando sua extinção (Suzuki & Ferreira 2007).
No bioma Mata Atlântica, de acordo com a Lista Oficial das Espécies da Flora do Brasil (2017), ocorrem cerca de 2.550 espécies distribuídas em 238 gêneros, das quais 1.620 são endêmicas (Barros et al. 2010). Apesar de o bioma estar sob grande ameaça poucas espécies de orquídeas são consideradas em risco de extinção. Na Lista Nacional Oficial de Espécies da Flora Ameaçadas de Extinção, do Ministério do Meio Ambiente (MMA 2014), apenas 168 espécies de orquídeas estão listadas, 15 espécies do gênero Cattleya. Cattleya tigrina é listada como vulnerável.
Taxonomicamente as orquídeas estão divididas em seis subfamílias: Apostasioideae, Cypripedioideae, Spiranthoideae, Orchidoideae, Epidendroideae e Vandoideae (Dressler 1990). Em Epidendroideae, encontra-se dentre outros, o gênero Cattleya, com enorme valor horticultural e ocorrência natural no Brasil, sendo muito utilizado para a produção de híbridos comerciais (Van Den Berg et al. 2009).
2.2 Formação de Protocormos em orquídeas
As sementes de orquídeas, como as de outras plantas saprófitas ou semi-parasíticas, contêm um pequeno embrião de apenas cerca de 0,1 mm de diâmetro, sem tecido associado de armazenamento como o endosperma. Após a germinação, o embrião aumenta para formar uma pequena estrutura “como um corpo”, denominado protocormo. Na natureza, um protocormo torna-se verde e acumula reservas de carboidratos pela fotossíntese. Só quando cresce e tem matéria orgânica armazenada suficiente, dá origem a ápice caulinar e raiz (Arditti 1967; Churchill et al. 1973; Arditti e Krikorian 1996; Arditti e Ghani 2000; Yam et al. 2009; Arditti 2010).
Corpos que em sua estrutura e crescimento são formados durante a cultura in vitro em diferentes tipos de órgãos e tecidos nas orquídeas, são denominados pelos pesquisadores de "protocorm-like bodies" (PLBs), devido à semelhança aos protocormos observados na germinação de orquídeas a partir de sementes. Estruturas semelhantes a protocormos também surgem diretamente em outros explantes de orquídeas e proliferam de outros ESPs de uma forma que é exatamente comparável à formação direta de embriões (Arditti 1967; Churchill et al. 1973; Arditti e Krikorian 1996; Arditti e Ghani 2000; Yam et al. 2009; Arditti 2010).
Morel (1960) observou através de seus estudos que quando protocormos de Cymbidium foram divididos, formaram novos
protocormos, e quando não eram divididos, protocormos originais se regeneravam e desenvolviam em novas plântulas. Morel (1960, 1964) sugeriu que o meristema ou os explantes apicais poderiam ser utilizados para estabelecer culturas para a propagação de orquídeas, proporcionando assim a base do método que é agora muito usado para diversos gêneros de orquídeas. Hoje em dia as taxas de propagação foram melhoradas com a utilização de meios mais complexos, incluindo reguladores de crescimento (George 1996). Contudo, muitos laboratórios de micropropagação comerciais acabam não utilizando protocormos na micropropagação devido à falta de fidelidade clonal (Arditti 1967; Churchill et al. 1973; Arditti e Ghani 2000; Arditti e Krikorian 1996; Yam et al. 2009; Arditti 2010). Algumas orquídeas não formam apenas protocormos de meristemas apicais, mas também diretamente de explantes como folhas (Churchill et al. 1971, 1973; Tanaka et al. 1975), hastes florais (Flamée e Boesman 1977; Arditti et al. 1977).
2.3 Gênero Cattleya
Cattleya Lindl. é um gênero de orquídeas exclusivamente
neotropical que abrange aproximadamente 120 espécies principalmente epífitas, raramente, rupícolas e terrícolas. Este gênero se insere na subfamília Epidendroideae Lindl. tribo Epidendreae Kunth, subtribo Laeliinae Benth (Chase et al. 2003; Van Den Berg 2009).
Cattleya é um gênero Neotropical com 113 espécies (Van Den
Berg 2014; Chase et al. 2015). O gênero é dividido em diversos subgêneros e mais da metade das espécies são exclusivas do Brasil (Van Den Berg 2014). O restante é de distribuição nos Andes, estendendo-se no sentido Leste da Venezuela até Trinidad e no sentido Norte da América Central até o Sul do México (Van Den Berg 2005). A maioria das espécies encontra-se em habitats montanhosos e prefere o frio para se desenvolver, embora algumas tenham se adaptado ao calor e às condições de umidade das planícies (Withner 1988).
A beleza de suas flores constitui o gênero, como um dos mais belos ornamentos das matas tropicais e subtropicais da América, tornando-se o mais popular e o mais cultivado gênero da família das orquídeas (Raposo 1993), conferindo-lhe considerável importância econômica. Cattleya é um gênero muito comercializado na atualidade,
agrupando inúmeras espécies e milhares de híbridos que apresentam flores grandes e coloridas (Paula e Silva 2006).
No Brasil existem cerca de 20 espécies nativas de Cattleya (Zanenga-Godoy e Costa 2003) destacando-se a Cattleya tigrina (Fig. 1). Esta espécie é endêmica do bioma Mata Atlântica e habita trechos de matas ribeirinhas, caracterizados pela alta umidade, sendo encontrada nos estados do Rio Grande do Sul, São Paulo, região Sul da Bahia e Pernambuco (Cruz et al. 2003). Destaca-se pela coloração e número de flores, sendo muito cultivada e comercializada pelos orquidófilos devido ao seu alto valor comercial (Rocha 2008). Assim, devido à coleta indiscriminada, o ciclo de vida altamente especializado e a destruição dos seus habitats pela expansão humana, esta espécie está em constante declínio, sendo vulnerável à extinção, segundo o Livro Vermelho da Flora do Brasil (MMA 2013).
Figura 1 - (a) Aspecto geral da flor de Cattleya tigrina e (b) Planta de C. tigrina com cápsula madura.
2.4 Conservação das Orquídeas do Gênero Cattleya
Este gênero é considerado um dos mais importantes da família, tendo em vista sua diversidade e seu elevado valor ornamental, além de seu uso no desenvolvimento de híbridos interespecíficos e intergenéricos para fins comerciais (Van Den Berg 2014). Quase todas as espécies do gênero têm sido coletadas intensamente na natureza para cultivo (CNCFlora 2017). A elevada frequência, com a qual vem ocorrendo essa procura, tem levado a uma redução e desaparecimento de várias populações e, consequentemente, várias destas espécies
apresentam-se ameaçadas de extinção (CNCFlora 2017; FZB e SEMA 2017).
As orquídeas do gênero Cattleya que ocorrem na Mata Atlântica possuem alto valor comercial pelo seu atrativo ornamental (Pinheiro et al. 2012). Porém, as espécies do gênero são pouco representadas em coleções de herbário (Cruz et al. 2003).
Especialistas em conservação, em um contexto nacional e regional (CNCFlora 2017; FZB e SEMA 2017), sugerem que as espécies alvo deste estudo necessitam de programas de conservação urgentes. Atualmente, estão incluídas nas listas vermelhas oficiais de espécies ameaçadas de extinção (CNCFlora 2017, FZB e SEMA 2017), porque enfrentam um risco muito elevado de extinção na natureza. O apelo para a conservação das orquídeas tem sido realizado mundialmente com diferentes opiniões, ideais e esforços para atacar o problema (Mirenda 2011). Cribb (2011) destaca que as mudanças climáticas têm uma grande probabilidade de ser um efeito dramático nas orquídeas do mundo.
2.5 Padrões morfogênicos in vitro das estruturas semelhantes a protocormos
As técnicas de cultura in vitro, baseadas no princípio da totipotência das células vegetais, ou seja, na potencialidade de células se diferenciarem e regenerarem uma planta completa, têm gerado grandes avanços na pesquisa básica, principalmente na fisiologia, bioquímica e genética de plantas, fornecendo ferramentas de ação em áreas práticas como o melhoramento genético vegetal, a farmacologia, a micropropagação e a conservação de germoplasma (Kerbauy 2008).
Na propagação in vitro, tecidos, órgãos ou células podem adquirir novas competências, geralmente pela ação de determinados sinais químicos (reguladores de crescimento) que ativam seletivamente determinados genes (epigênese). A resposta final é a expressão morfogenética em dois níveis básicos: organogênese direta ou indireta e embriogênese somática direta ou indireta (Reinert 1977).
Na organogênese direta se obtém eixos caulinares monopolares originados de gemas pré-existentes. Quando é indireta ocorre a desdiferenciação do explante, resultando na formação de calos, que podem ser definidos como a proliferação de células não diferenciadas, originado meristemoides (Thorpe 1980).
A embriogênese somática é o processo pelo o qual se desenvolvem embriões a partir de uma célula simples ou um grupo de células que não resultaram da fusão de gametas e que se diferenciam nos mesmos estádios ontogenéticos observados na embriogênese zigótica (Maheswaran e Wiliams 1985). Este padrão de expressão da morfogênese é fundamentado pela totipotencialidade celular, postulado pelo fisiologista alemão Haberlandt, em 1902, para o qual, uma vez fornecidas às condições e estímulos adequados à célula nucleada, ela poderia originar uma planta completa (Zimmerman 1993). A formação de uma estrutura bipolar integrada em um único eixo, sem ligações vasculares com o tecido matriz, torna a embriogênese somática diferente do padrão organogênico (Guerra et al. 1999).
Orchidaceae apresenta uma rota de desenvolvimento incomum às demais plantas com sementes. Confere um padrão uniforme de germinação e desenvolvimento, iniciando-se pelo intumescimento da semente que rompe o tegumento seminal e libera o embrião, desenvolvendo numa estrutura tuberiforme, geralmente clorofilada, denominada protocormo (Arditti 1992).
Sob condições in situ, as sementes germinam e permanecem como um protocormo até que seja infectada por micorrizas, que fornecerão a nutrição inicial (Harrison 1977). George e Debergh (2008) afirmam que na fase de protocormo, a diferenciação do meristema apical e radicular ocorre em polos opostos, como constatado na histodiferenciação de protocormos em Cattleya amethystolossa, onde havia um ápice caulinar e um polo oposto na base do protocomo, que apresentava rizóides (Liz 2013).
Tanto a germinação das sementes quanto o desenvolvimento dos protocormos in vitro não diferem dos mesmos eventos observados naturalmente (Arditti 1992). Kraus et al. (2006) postularam que o padrão de desenvolvimento dos protocormos in vitro deve ser similar ao dos protocormos desenvolvidos in situ, conforme proposto por Arditti (1992).
Em orquídeas, além da germinação assimbiótica de sementes e da organogênese convencional existe uma rota morfogênica específica para a regeneração in vitro. Este tipo de propagação clonal de orquídeas pode ser realizado utilizando explantes somáticos de diferentes origens como, por exemplo, folhas (Chen e Chang 2001; Gow et al. 2008; Mayer et al. 2010), hastes florais (Chen e Chang 2000), raízes (Kerbauy e Estelita 1996) e ápices caulinares (Roy et al. 2007) com a obtenção de estruturas globulares similares aos embriões de origem zigótica. A
maioria dos trabalhos publicados refere-se a esta rota como sendo embriogênese somática, muito provavelmente devido às peculiaridades dos embriões de origem zigótica das orquídeas (Ishii et al. 1998; Huan et al. 2004; Lee et al. 2013).
Muitos trabalhos sobre micropropagação de orquídeas citam Morel, que em 1960, informou que explantes de Cymbidium Sw. haviam sido cultivados em meio “Knudson III”, e cada broto originava várias plantas (Yan e Arditti 2009). No entanto a grande contribuição de Morel foi a introdução de uma nova terminologia para as estruturas que surgiam a partir de explantes inoculados de orquídeas, “protocorm like body” (PLB). O termo que traduzido para o português ficou conhecido como “Estruturas Semelhantes a Protocormos” (ESPs).
Em tecidos ou calos de orquídeas cultivadas in vitro, formam estruturas similares aos protocormos, sendo por esta razão denominadas ESPs (Arditti e Ernst 1993). Este termo protocorm-like bodies é também utilizado para qualquer estrutura originada de orquídeas a partir de explantes meristemáticos (Kraus et al. 2006), como por exemplo mericlones (Kuehnle 2007), embriões somáticos (Chen e Chang 2004), brotos (Chen et al. 2004), segmentos nodais axilares (Shiau et al. 2005; Dohling et al. 2012) e a própria estrutura semelhante a protocormo (Young et al. 2000; Paek et al. 2011).
Muitos autores afirmam que ESPs são embriões somáticos (Ishii et al. 1998; Huan et al. 2004; Lee et al. 2013), no entanto, evidências claras de embriogênese somática ainda são limitadas. Baseando-se no fato de que o termo protocormo foi proposto devido às sementes de orquídeas apresentarem um padrão de desenvolvimento inicial distinto das demais angiospermas, e específico para o grupo, sugere-se que este comportamento diferenciado perpetue na morfogênse in vitro, justificando neste trabalho o uso do termo ESPs, quando se refere às estruturas obtidas diretamente dos explantes foliares.
Lee et al. (2013) verificaram com estudos histológicos e histoquímicos, que nos estágios iniciais de formação das ESPs, as células apresentam características citológicas e marcadores de membrana semelhantes ao desenvolvimento do embrião zigótico. No entanto, em estudos mais recentes sobre a expressão gênica de vários tecidos reprodutivos e eventos moleculares em Phalaenopsis aphrodite Rchb. f. foi observado que a regeneração das ESPs não segue o programa da embriogênese e possui um gene específico que desempenha o papel na regeneração das ESPs (Fang et al. 2016).
O estudo desafia a compreensão atual da origem embrionária das ESPs. Os dados obtidos estabelecem uma estrutura fundamental para o desenvolvimento reprodutivo das orquídeas e constituem um novo recurso para permitir a cadeia regulatória de genes que são necessárias para programas especializados no desenvolvimento de orquídeas (Fang et al. 2016).
A propagação pela formação de ESPs é a opção preferida pelo grande número destas estruturas que podem ser obtidas dentro de um curto período de tempo. ESPs podem proliferar-se rapidamente e regenerar facilmente em plântulas completas, por isso é o alvo para estudos de transformação genética em orquídeas (Liau et al. 2003). ESPs são capazes de converter-se em plântulas facilmente quando cultivados em um meio com regulador de crescimento (Ng e Saleh 2011). Pouco tem se estudado sobre essas morfologias, havendo a necessidade de descrições para entender sua estrutura e a rota morfogênica in vitro em ESPs de C. tigrina.
2.6 TDZ como Regulador de Crescimento Vegetal
Thidiazuron (N-phenyl-N'-1,2,3-thiadiazol-5-ylurea) é uma feniluréia que mostra atividade citocinínica. As citocininas são substâncias que, entre outras coisas, em combinação com a auxina, estimulam a divisão celular nas plantas (Greene 1996). O potencial morfo-regulador do TDZ, têm levado à sua aplicação na cultura de tecidos vegetais, para o desenvolvimento de sistemas morfogenéticos (Guo et al. 2011). TDZ surgiu como um bioregulante eficaz na cultura de células e tecidos, em grande variedade de plantas (Li et al. 2000; Hosseini-Nasr e Rashid 2000; Svetla et al. 2003; Matand e Prakash 2007).
As células vegetais têm o potencial de reproduzir plantas intactas pela organogênese ou embriogênese (George 1996). Reguladores de crescimento vegetal desempenham um papel de espinha dorsal nos processos de desdiferenciação e rediferenciação. Esses processos regenerativos em culturas de células e tecidos podem ser estimulados somente pelo TDZ ou em associação com outros reguladores de crescimento vegetal (Guo et al. 2011). Um sistema de regeneração in vitro eficiente na cultura de tecidos e células é um pré-requisito para a aplicação biotecnológica da planta (Confalonieri et al. 2003).
TDZ é um substituto da fenil ureia com atividade de citocinina. É usado para a regeneração de plantas de diversas espécies pela organogênese e promove a formação de brotos in vitro em várias espécies de orquídeas (Huetteman e Preece 1993).
As citocininas podem mediar aspectos do desenvolvimento regulado pela luz, incluindo a diferenciação dos cloroplastos, o desenvolvimento do metabolismo autotrófico e a expansão de folhas e cotilédones (Taiz e Zeiger 2013). Durante sua ontogênese, uma célula inicial usa o seu potencial genético em divisões celulares complexas e consecutivas que resultam em um organismo pluricelular. Esse processo configura um modelo biológico importante para estudos associados à competência celular, histogênese e histodiferenciação (Cangahuala-Inocente 2007).
De acordo com Gantait e Sinniah (2012), um sistema de propagação de sucesso depende da indução, assim como a regeneração de órgãos para formar plântulas. As citocininas, fitohormônio derivado da adenina (aminopurina), tem apresentado um papel fundamental na diferenciação e regeneração de plantas na maioria das espécies testadas (Santiago 2001). Pesquisas com orquídeas tem utilizado citocininas, como o TDZ, e verificado sua eficiência na indução da morfogênese in
vitro para regeneração de ESPs de espécies de Phalaenopsis Blume e Doritaenopsis Guillaumin & Lami (Ernst 1994); Oncidium Sw. (Chen e
Chang 2000); Vanda coerulea Griff. (Malabadi et al. 2004); Ansellia
africana Lindl. (Vasudevan e Van Staden 2011); híbrido de orquídea
(Gantait e Sinniah 2012).
Os mecanismos de ação do TDZ ainda não são completamente conhecidos. Alguns estudos têm demonstrado sua ligação com modificações nas membranas, absorção e assimilação de nutrientes e a síntese e transporte de hormônios endógenos, como o AIA (Guo et al. 2011).
A utilização de reguladores de crescimento pode induzir alterações no material de cultivo (Carvalho e Vidal 2003), para fazer um monitoramento dessas alterações, pode-se utilizar a quantificação do DNA. A quantidade de DNA nuclear (valor C) é um caráter de significado biológico fundamental e o conhecimento para um grupo de organismos pode ser útil em vários campos, como biologia molecular e celular, ecologia, fitogeografia e sistemática (Bennet e Leitch 1995). 2.7 Estimativa do valor C de DNA nuclear
As plantas obtidas por cultura de tecidos vegetais são em teoria, clones idênticos às matrizes, pois o crescimento de células in vitro e a sua regeneração é um processo assexuado, envolvendo somente divisões mitóticas que, de certo modo, não causam nenhuma variação genética (Bairu et al. 2011). Contudo, variabilidade genética tem sido observada em várias plantas durante o desenvolvimento in vitro (Rezende et al. 2008; Santana et al. 2008; Lima et al. 2008).
Esse fenômeno é normalmente relacionado à falta de estabilidade genética do material produzido (Larkin e Scowcroft 1981), caracterizado por uma variação fenotípica de origem genética, ou seja, uma variação cromossômica que pode se tornar herdável nas gerações seguintes, ou epigenética, que é uma variação transitória devido ao estresse fisiológico que o material sofre, quando submetido ao cultivo in
vitro (Illg 1990; Bairu et al. 2011).
Os riscos de variações genéticas geralmente são maiores quando as plantas são micropropagadas, ou seja, originam-se por meio de calo, de protoplastos e de embriogênese somática (Cid e Teixeira 2014). Phillips et al. (1994) consideram esses aspectos e indicam que as variações decorrentes do cultivo in vitro apresentariam características de mutagênese auto-imposta devido à quebra do controle do ciclo celular normal. A indução de ESPs in vitro é a rota regenerativa mais utilizada na propagação clonal em larga escala de orquídeas (Murthy e Pyati 2001; Park et al. 2002; Chugh et al. 2009).
Técnicas de melhoramento, como alterações do nível de ploidia (Chen et al. 2009) e eventos de transformação genética (Chai et al. 2002; Mishiba et al. 2005) vêm sendo utilizados no melhoramento genético de orquídeas com objetivos específicos. Nesse contexto a técnica da CF, que mede a intensidade da fluorescência de partículas em movimento, surge como uma alternativa a estes métodos clássicos de contagem, permitindo rapidamente a identificação de tetraplóides, haplóides, aneuplóides, alopoliplóides e a estimativa do conteúdo de DNA nuclear de amostras de tecido vivo (Loureiro e Santos 2004).
O conteúdo de DNA nuclear em um cromossomo haplóide não replicado é denominado valor C de DNA (Swift apud Bennet et al. 2000). Portanto, um núcleo na fase G1 do ciclo celular contendo duas cópias do genoma não replicado possui um valor 2C de DNA (Doležel e Bartos 2005). O conhecimento do valor C de DNA é importante para diversos ramos da biologia como a taxonomia, ecologia e a genética molecular (Bennet et al. 2000).
Atualmente se conhece o conteúdo de DNA nuclear de um grande número de espécies. Bennet et al. (2000), em um trabalho de compilação de resultados de diversas pesquisas, reportaram que aproximadamente 2802 espécies de angiospermas têm seu conteúdo de DNA nuclear estimado, o que representa apenas 1% de todas as angiospermas.
Em orquídeas 233 espécies possuem estimativas para o valor C de DNA (Plant DNA C-value database 2017). Os resultados sugerem que Orchidaceae, entre as angiospermas, é a família que possui maior variabilidade nos conteúdos de DNA nuclear com valores entre 0.33 e 55.4 pg (Leitch et al. 2009). A falta de estimativas utilizando a técnica da citometria de fluxo vem das dificuldades em se obter estimativas corretas para esta família (Leitch et al. 2009). Em um trabalho para estimar o valor C de 70 espécies de orquídeas, pertencentes a 26 gêneros distintos, Jones et al. (1998) utilizaram tanto estandardização interna quanto externa, além de utilizarem glóbulos vermelhos de galinha como padrão de referência, que pode levar a estimativas totalmente equivocadas (Doležel e Bartos 2005).
De acordo com o Plant DNA C-value Database (2017) não existem estimativas do valor C de DNA para a maioria das espécies de orquídeas brasileiras, indicando a necessidade de pesquisas com esta abordagem. Fritsche (2012) pesquisou sobre a citometria de fluxo aplicada ao melhoramento genético e ao estudo do genoma nuclear de orquídeas. Para as análises dos regenerantes obtidos por meio da regeneração de ESPs de C. tigrina, foi constatado que todos apresentavam o dobro da ploidia em relação ao tecido das plantas utilizadas como fonte de explantes.
Portanto, é essencial identificar e propor um conjunto de métodos confiáveis sobre a estimativa do valor C de orquídeas. Dentre as técnicas empregadas para analisar possíveis variações genéticas em plantas micropropagadas, está a CF que, além de poder proporcionar importantes informações a respeito das diferentes formações in vitro, também tem a capacidade de detectar precocemente possíveis alterações no conteúdo de DNA nuclear das células, tecidos ou órgãos em cultivo, incluindo plantas completas (Orbovic et al. 2008).
2.8 Formação e desenvolvimento dos cloroplastos em ESPs
Em 1848, os cloroplastos foram descritos pela primeira vez por Unger, como estruturas ligadas ao pigmento, mais tarde, no século XIX, Schimper (1883, 1885) caracterizou estas estruturas, que chamou de
“Chlorophyllkorner”, em maiores detalhes. Com a disponibilidade apenas da resolução do microscópio de luz, descreveu plastídios como componentes de células contendo clorofila ou outros pigmentos que se desenvolvem a partir de precursores incolores. Schimper percebeu a existência de vários tipos de plastídios e fez observações de que eles poderiam passar durante o seu desenvolvimento.
Após a invenção do microscópio eletrônico, as primeiras micrografias eletrônicas de cloroplastos foram publicadas (Kausche e Ruska 1940), e logo depois, foi utilizado para os primeiros estudos detalhados do desenvolvimento dos plastídios (Lichtenthaler et al. 1984; Lichtenthaler 2007).
Os cloroplastos são organelas intracelulares presentes em algas e plantas, responsáveis pelo processo fotossintético, desde a captação da energia luminosa até a formação de compostos orgânicos, participando também da assimilação do nitrogênio, na síntese e armazenamento de amido e na biossíntese de aminoácidos e lipídios (Carrer 1998; Staehelin e Newcomb 2000).
Nas plantas, os cloroplastos se desenvolvem a partir de proplastídios, que não possuem membranas de tilacoides e estão presentes em todas as células vegetais, principalmente em células meristemáticas e em células pós-mitóticas jovens (Vothknecht e Westhoff 2001).
Os proplastídios, são os precursores dos cloroplastos, são pequenos (0.5-1.0 µm de diâmetro), geralmente esféricos (Thomson 1980). Estas organelas normalmente têm origem durante a formação de zigotos e são mantidas num estado indiferenciado em células meristemáticas no desenvolvimento da planta (Kirk e Tilney-Bassett 1978). A membrana interna encontrada nos cloroplastos é quase ausente em proplastídios. No entanto, o proplastídio contém baixas quantidades de DNA plastidial, RNA ribossomal e proteínas solúveis (Newcomb 1967; Dyer e Miller 1971; Miyamura 1986).
Os cloroplastos apresentam três principais regiões estruturais: (a) uma rede de membranas internas altamente organizada formada de vesículas, os tilacoides, (b) um fundo amorfo rico em proteínas solúveis e ribossomas, o estroma e (c) um par de membranas externas, o envelope do cloroplasto (Taiz e Zeiger 2013).
O envelope do cloroplasto consiste em duas biomembranas: o envelope interno e o externo. A matriz interna do cloroplasto, o estroma, é caracterizado por dois grandes elementos estruturais: (1) os tilacoides fotoquimicamente ativos e (2) os plastoglóbulos osmiofílicos
(Lichtenthaler 2013). Além disso, cloroplastos nas condições de incidência de luz, por exemplo, nas folhas expostas ao sol, um terceiro componente estrutural aparece: grãos de amido. Os grãos de amido, não são encontrados em condições de pouca luz ou em plantas no escuro, enquanto que os tilacoides e os plastoglóbulos osmiofilicos são estruturas regulares dos cloroplastos (Lichtenthaler 1966, 1968, 2007).
As biomembranas de tilacoides contendo pigmentos fotossintéticos (Lichtenthaler e Park 1963; Lichtenthaler e Calvin 1964) ligado a vários complexos de proteína clorofila-carotenoide (Thornber 1975, Lichtenthaler et al. 1982a, b; Bennett 1983; Lichtenthaler e Babani 2004) estão dispostas em maneiras particulares pelas quais se pode diferenciar entre livre, tilacoides do stroma e regiões de grana (Lichtenthaler e Babani 2004; Lichtenthaler et al. 1984; Lichtenthaler 2007), onde os tilacoides são empilhados formando pilhas de grana largas e altas (cloroplastos de sombra) ou pilhas de grana estreitas e baixas (cloroplastos de sol).
As tilacoides estão associadas a reações de transporte de elétron, incluindo fotólise da água, que conduzem à formação de ATP (fotofosforilação) e a redução agente NADPH, que funcionam como coenzimas na assimilação do CO2 aos fosfatos de açúcar no estroma do cloroplasto. Este processo é conhecido como ciclo de redução de carbono, Ciclo de Calvin ou ciclo de Calvin-Benson (Lichtenthaler 2007; Rolland et al. 2009).
Os cloroplastos, com os seus tilacoides fotoquimicamente ativos, são organelas essenciais de todos os tecidos de plantas verdes, como em folhas, frutos verdes e caules. Eles realizam o processo de fotossíntese, isto é, a indução da luz na transformação do CO2 inorgânico em compostos orgânicos ricos em energia, como açúcares, amido, glicero-lípidos e isoprenóide lípidos (Lichtenthaler 2013).
Um elemento estrutural essencial nos cloroplastos são os plastoglóbulos osmiofilicos que funcionam como um local de armazenamento extratilacoidal para excesso de lípidos isoprenoides, tais como α-tocoferol (vitamina E) e plastoquinona-9, vestígios de xantofilas, mas estão praticamente livres de clorofila, β-caroteno e filoquinona K1 (Lichtenthaler 1964; Lichtenthaler e Sprey 1966; Grumbach e Lichtenthaler 1974; Lichtenthaler 2007).
Estes "glóbulos osmiofilicos” são componentes regulares no estroma do cloroplasto e foram denominados "Plastoglóbulos osmiofilicos" por Lichtenthaler e Sprey (1966) que isolaram e analisaram plastoglóbulos de várias plantas (Billbergia, Eucharis,
