Mapeamento do potencial biossintético em linhagens de Streptomyces

Texto

(1)UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Instituto de Química Departamento de Química Orgânica. Dissertação de Mestrado Mapeamento do Potencial Biossintético em linhagens de Streptomyces Pedro Luís Rocha da Cruz. Dissertação apresentada junto ao Programa de Pós-Graduação em Química para obtenção do título de Mestre em Química na área de Química Orgânica Orientador: Luciana Gonzaga de Oliveira Campinas, 2011 i.

(2) ii.

(3) iv.

(4) Human intelligence, culture and technology have left all other plant and animal species out of the competition… but we have too many illusions that we can govern the microbes that remain our competitors of last resort for domination of the planet. In natural evolutionary competition, there is no guarantee that we will find ourselves the survivors Joshua Lederberg v.

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(6) Dedico essa dissertação aos meus pais Celso e Sandra, meu irmão Guilherme e minha namorada Daniela pela compreensão e apoio que me deram durante todo o mestrado. vii.

(7) viii.

(8) Agradecimentos. À minha orientadora Luciana pela amizade, ensinamentos, conversas, orientação e otimismo que sempre me motivaram nas horas mais difíceis.. Muito. obrigado pela oportunidade de fazer parte deste grupo e proporcionar um ambiente de trabalho estimulante e realizar um projeto que contribuiu tanto para minha vida profissional. E muito obrigado pelos momentos alegres e inesquecíveis. Aos meus pais e meu irmão pelo imenso apoio, dedicação, confiança e carinho recebido ao longo de toda a minha vida e por me servirem como exemplo a ser seguido. Às minhas avós Tereza (in memorian) por todo carinho, amor e diversão nas férias em Itajubá e Hanna (in memorian) por me mostrar a beleza por trás da ciência e o valor da educação e do trabalho. À minha namorada Daniela por me fazer sentir uma pessoa completa, sempre me apoiando, compreendendo e ensinando. Muito obrigado por fazer parte da minha vida, me dando tanta felicidade, amor e alegria. Ao pessoal do laboratório: Renata, Raquel, Suellen Moraes, Suelen Rocha, Lucas, Débora, Gilcelene, Kathryn, Patrícia, Larissa, Morgana, Renan, Paula, Gisele e Gabriela. Muito obrigado a cada um de vocês que fizeram e fazem parte do meu cotidiano, pelas conversas, conselhos e ajudas durante a realização deste trabalho. À minha amiga Melissa pelas ajudas, conselhos e apoio durante o mestrado. Ao meu amigo Armando pelo companheirismo, ensinamentos, conselhos e conversas que sempre me nortearam. Aos meus amigos Erik, José Tiago, Marlon e Douglas pelas cervejas e as discussões sobre futebol, química e filosofia e por sempre mostrarem nos momentos de maiores dificuldades que tudo tem um lado bem humorado. Aos amigos da graduação: Bruno, Evandro, Raquel, Juliana, Thaís, Roberta, Ricardo, Guilherme, Cíntia e Fernanda.. ix.

(9) Ao meu amigo José Augusto pela amizade de 10 anos. Muito obrigado pelo companheirismo, saídas, jogos de basquete e os conselhos. Aos professores Marcelo Menossi e Anita Marsaioli pela orientação na iniciação científica e pelos valiosos ensinamentos durante a graduação que sem dúvida pude aplicar durante o mestrado. Aos professores da graduação que contribuíram enormemente para minha formação. Ao professor Fabio César Gozzo e seus alunos Alexandre, Alana e Pilau pelos inúmeros auxílios e esclarecimentos sobre espectrometria de massas. À Rita Zacardi, pela ajuda e ensinamentos sobre a técnica de LC/MS e sua utilização. À Professora Anete e seus alunos por permitirem realizar alguns experimentos em seu laboratório. Aos funcionários do Instituto de Química, especialmente à Bel, da CPG pela ajuda e orientação sobre o curso; ao Toninho, Rosemary e Simone, da BIQ, sempre solícitos; Sônia, Paula e Anderson pela aquisição dos espectros de RMN; Cláudia pelo auxílio com medidas de ultravioleta; Everaldo pela impressão dos painéis. À Fapesp pelo auxílio financeiro. A Deus que sempre me ilumina.. x.

(10) Curriculum vitae 1.. Formação acadêmica. 1998-2001 2004-2008 2009-2011 2.. Curso técnico em química. Colégio Oswaldo Cruz Graduação em Química com atribuições tecnológicas Mestrado em Química. Formação complementar. 2009 Transition metal catalysis in organic synthesis. (Carga horária: 3h). Universidade Estadual de Campinas, Brasil. 2009 Catálise organometálica. (Carga horária: 3h). Universidade Estadual de Campinas, Brasil. 2009 Técnicas Microbiológicas. (Carga horária: 6h). Universidade Estadual de Campinas, Brasil. 2006 Amostragem e Validação do método analítico. (Carga horária: 8h). Instituto de Química (UNICAMP). 2001 Pesquisa e Desenvolvimento na Indústria Química. (Carga horária: 7h). P&D consultoria química. 3.. Atuação profissional. 1.. Departamento de Química Orgânica-UNICAMP (01/2007-06/2008) Projeto de iniciação científica: “Caracterização de acil-homosserina lactonas produzidas por Methylobacterium mesophilicum em meio de cultura contendo glucose”. 2.. Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética-Unicamp (04/2005-092006) Projeto de iniciação científica: “A subunidade do fator de transcrição TFIIA em cana de açúcar: caracterização da expressão e ensaios estruturais”. 4.. Artigos completos publicados em periódicos Cabeça, L.F.; Pomini, A. M.; Cruz, P. L. R.; Marsaioli, A. J.; Binding Events of (S)-N-(3-Oxo-octanoyl)-homoserine Lactone with Agrobacterium tumefaciens Mutant Cells Studied by Saturation Transfer Difference NMR. Journal of the Brazilian Chemical Society (Online); 2011, 22, 702. Gentile, A.; Cruz, P.L.R.; Tavares, R. G.; Krug-Baldacin, M. G.; Menossi, M.; Molecular characterization of ScTFIIA , encoding the putative TFIIA small subunit from sugarcane. Plant Cell Reports (Print); 2010, 29, 857. xi.

(11) Pomini, A. M.; Cruz, P. L. R.; Gai, C.; Araújo, W. L.; Marsaioli, A. J.; Long-Chain Acyl-Homoserine Lactones from Synthesis and Absolute Configuration. Journal of Natural Products (Print); 2009, 72, 2125. 5.. 6.. Trabalhos publicados em anais de eventos (resumo) Cruz, P. L. R.; Giarola, L.; Vivian, A. F.; Moraes, S. S.; Gomes, S.R.; De Oliveira, L.G.; Exploring the metabolic potencial for producing polyketides and nonribosomal polypeptides in brazilian Streptomyces strains, Segundo Simposio Iberoamericano de Química Orgánica (SIBEAQO-II), Santiago de Compostela, 2010. Marsaioli, A. J.; Cruz, P. L. R.; Pomini; A. M.; Araújo, W. L.; Caracterização de acil-homosserina lactonas produzidas por Methylobacterium mesophilicum em meio de cultura TSB, 31a Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, Águas de Lindóia, 2008. Pomini, A. M.; Cruz, P. L. R.; Gai, C.; Araújo, W. L.; Marsaioli, A. J.; A new acyl homoserine lactone from Methylobacterium mesophilicum, 1st Brazilian Conference on Natural Products, São Pedro, 2007. Apresentação de Trabalho Cruz, P. L. R.; Prospecção de genes biossintéticos visando ao isolamento de peptídeos não ribossomais em Streptomyces, 2011. (Apresentação de Trabalho/Seminário). Cruz, P. L. R.; Gomes, S. R.; De Oliveira, L.G.; Fingerprint molecular em actinomicetos, 2011. (Apresentação de Trabalho/Congresso). Cruz, P. L. R.; De Oliveira, L.G.; Prospecção de genes biossintéticos visando ao isolamento de peptídeos não ribossomais em Streptomyces sp., 2011 (Apresentação de Trabalho/Congresso). Cruz, P. L. R.; Pomini, A. M.; Gai, C.; Araújo, W. L.; Marsaioli, A. J.; Avaliação da atividade antimicrobiana de acil-homosserina lactonas contra bactérias endofíticas da laranja (Citrus sinensis L.), 2011. (Apresentação de Trabalho/Congresso). Cruz, P. L. R.; Mapeamento do potencial biossinético de Streptomyces, 2010. (Apresentação de Trabalho/Seminário). Pomini, A. M.; Cruz, P. L. R.; A new acyl homoserine lactone from Methylobacterium mesophilicum, 2007. Cruz, P. L. R.; Caracterização das acil-homosserina lactonas produzidas por Methylobacterium mesophilicum em meio de cultura contendo glucose, 2007. (Congresso, Apresentação de Trabalho). CRUZ, P. L. R.; Caracterização da subunidade y do fator basal de transcrição TFIIA em cana de açúcar (Saccharum sp.), 2006. xii.

(12) RESUMO. MAPEAMENTO DO POTENCIAL BIOSSINTÉTICO EM LINHAGENS DE STREPTOMYCES. Actinobactérias são fontes importantes para a descoberta de novas moléculas com atividades biológicas destacadas. A este grupo pertencem Streptomyces, microorganismos que possuem dentre outros, dois grupos de enzimas multimodulares conhecidas como policetídeo sintase (PKS) e peptídeo não ribossomal sintetase (NRPS) que catalisam a produção de policetídeos e peptídeos não ribossomais respectivamente. A biossíntese destas moléculas se dá geralmente seguindo uma relação linear entre o gene, a enzima e a estrutura da molécula. Desta forma, com o conhecimento das sequências do gene é possível prever a molécula a ser produzida e sua manipulação amplia a possibilidade de obter novas moléculas. Neste sentido foi adotada uma estratégia para o mapeamento dos genes biossintéticos sem a necessidade do sequenciamento extensivo do micro-organismo com o objetivo de prever o tipo de policetídeo e peptídeo não ribossomal produzido por linhagens de Streptomyces isoladas de Citrus ssp. Com o objetivo de conhecer os metabólitos produzidos por estes micro-organismos foi feito também o cultivo destes em meios contendo fontes de nutrientes variadas e o monitoramento de metabólitos presentes nos extratos utilizando técnicas de cromatografia líquida acoplada com espectrometria de massas. Ensaios em placas permitiram a visualização da produção de sideróforos e a atividade antibiótica dos meios de cultivo.. xiii.

(13) xiv.

(14) ABSTRACT. MAPPING THE BIOSYNTHETIC POTENTIAL IN STREPTOMYCE STRAINS. Actinobacteria are important sources of new molecules with biological activities. Streptomyces are the most important genera studied. Such microorganisms carries out among a variety of biosynthetic enzymes, two main groups known as polyketide synthase (PKS) and non ribosomal peptide synthetase (NRPS), both catalyzing the biosynthesis of polyketide and non ribosomal peptides respectively. PKS and NRPS biosynthesis follows a collinear relationship among the gene cluster, the enzyme and the secondary metabolite. Therefore, the knowledge of the gene sequences allows to find new molecules. In this work we adopted a strategy to map the biosynthetic genes without the need of extensive whole genome sequencing in order to predict the metabolite produced by Streptomyces strains isolated from Citrus ssp. The strains were also cultivated and the metabolite production monitored by liquid chromatography coupled with mass spectrometry. In addition, the biological activity of these medium was estimated using qualitative biochemical assays.. xv.

(15) xvi.

(16) Sumário Lista de abreviaturas ...................................................................................................................... xix Lista de Tabelas .......................................................................................................................... xxi Lista de Figuras............................................................................................................................. xxiv Introdução ............................................................................................................................ 1. 1. 1.1. Contexto atual ............................................................................................................... 1. 1.2. Streptomyces ................................................................................................................. 3. 1.3. Policetídeo Sintases (PKSs)............................................................................................ 5. 1.4. Peptídeo Não Ribossomal Sintetase (NRPS) ................................................................. 7. 1.5. Peptídeos não ribossomais e Policetídeos .................................................................. 10. 1.6. Bioinformática ............................................................................................................. 13. 1.7. Prospecção de genes e genes crípticos ....................................................................... 15. 1.8. Cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas .................................... 18 Objetivos gerais ................................................................................................................ 24. 2. 2.1. Objetivos específicos................................................................................................... 24 Parte experimental ........................................................................................................... 25. 3. 3.1. Reagentes químicos, equipamentos e outros materiais utilizados ............................ 25. 3.1.1. Material de biologia molecular ................................................................................ 25. 3.1.2. Soluções e meios de cultivo ................................................................................... 26. 3.1.3 Micro-organismos .......................................................................................................... 28 3.1.4. Equipamentos ........................................................................................................... 29. 3.1.5. Cromatografia Líquida acoplada à espectrometria de massas ......................... 29. 3.1.6. Espectrometria de massas de ressonância ciclotrônica de íons ...................... 29. 3.2 Métodos ............................................................................................................................... 30 3.2.1. Técnica de coloração de Gram .............................................................................. 30. 3.2.2. Determinação do tempo de fermentação ............................................................. 30. 3.2.3. Técnica de inibição vertical ..................................................................................... 31. 3.2.4. Obtenção dos extratos ............................................................................................ 31. 3.2.5. Teste de inibição em disco ..................................................................................... 32. xvii.

(17) 3.2.6. Cromatografia em camada delgada ...................................................................... 32. 3.2.7. Preparo de células quimicamente competentes ................................................. 32. 3.2.8. Preparo de células eletrocompetentes ................................................................. 33. 3.2.9. Extração do DNA ...................................................................................................... 33. 3.2.10 Reações de amplificação por PCR ........................................................................ 35 3.2.11 Purificação dos produtos de PCR.......................................................................... 38 3.2.12 Clonagem .................................................................................................................. 38 3.2.13 Transformação de células quimicamente competentes ..................................... 39 3.2.14 Eletroporação ............................................................................................................ 39 3.2.15 PCR de colônia ......................................................................................................... 39 3.2.16 Mini prepreparação .................................................................................................. 40 3.2.17 Estoque de glicerol ................................................................................................... 40 3.2.18 Sequenciamento....................................................................................................... 40 3.2.19 Análise das sequências ........................................................................................... 41 3.2.20 Análise da produção de sideróforos em placa..................................................... 41 3.2.21 Teste para produção de sideróforos ..................................................................... 42 3.2.22 Purificação dos sideróforos .................................................................................... 42 Resultados......................................................................................................................... 43. 4. 4.1. Taxonomia metabólica das linhagens ......................................................................... 51. 4.1.1. Streptomyces wadayamensis (A23) ...................................................................... 51. 4.1.2. Streptomyces sp B1 ................................................................................................. 59. 4.1.3.. Micro-organismo A30 ............................................................................................... 63. 4.1.4. Streptomyces bicolor A19 ....................................................................................... 65. 4.1.5. Streptomyces coelicolor ATCC 10147 .................................................................. 68. 4.2. Avaliação da atividade biológica de Streptomyces de Citrus ssp ............................... 70. 4.3. Busca pela entidade química ...................................................................................... 79. 5.. Conclusão final ............................................................................................................... 109. 6.. Bibliografia ....................................................................................................................... 110. 7.. Anexos ............................................................................................................................. 115. xviii.

(18) Lista de abreviaturas A: AA-tRNA: ACP: ACV: AHBA: APCI: AT: ATP: BLAST: C: CAS: CDA: CI: : dNTP: Da: DDBJ: DEBS: DMSO: DNA: EDTA: EI: EMBL: ESI: FAB: FT-ICR: GC/MS: HDTMA: IV: LC/MS: MALDI: m/z: pks: PKS: KS: mRNA: L: M: NCBI:. Domínio de adenilação aminoacil-tRNA Proteína carreadora de acila L-aminoadipil-L-cisteinil-D-Valina ácido 3-amino-5-hidroxibenzóico Ionização química a pressão atmosférica Acil transferase Adenosina trifosfato Basic local alignment search tool Domínio de condensação Cromazurol Sulfonato Peptídeo dependente de cálcio Ionização química Deslocamento químico Desoxirribonucleotídeos fosfatados Dalton DNA data base of japan 6-deoxieritronolídeo sintase Dimetil sulfóxido Ácido deoxirribonucléico Ácido etileno diamino tetraacético Ionização por elétrons European molecular biology laboratory Ionização por electrospray Bombardeamento rápido de átomo Ressonância ciclotrônica de íons com transformada de Fourier cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas Hexadeciltrimetilamônio Infravermelho cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas Ionização/dessorção assistida por matriz relação massa/carga gene que codifica PKS enzima policetídeo sintase cetossintase RNA mensageiro microlitros micromolar National center for biotechnology information xix.

(19) NJ: nrps: NRPS: pb: PCI: PCP: PCR: ppm: Q: RMN: RNA: RNase: RPM: SDS: TBE: TE: TOF: tRNA: UPGMA: UPLC: UV: V:. Neighbor joining gene que codifica para NRPS enzima peptídeo não ribossomal sintetase pares de base Fenol:clorofórmio:isoaminoálcool Proteína carreadora de peptidila Reação em cadeia da polimerase partes por milhão quadrupolo Ressonância magnética nuclear Ácido ribonucléico Ribonuclease rotações por minuto Dodecil sulfato de sódio Tampão tris-borato-EDTA Tioesterase Tempo de vôo RNA transportador Unweighted pair group method with arithmetic averages Cromatografia líquida de ultraperformance Ultra violeta Volts. xx.

(20) Lista de Tabelas Tabela 1. Domínios conservados de adenilação em NRPS ................................ 9 Tabela 2. Materiais de biologia molecular .......................................................... 25 Tabela 3. Meios de cultura utilizados ................................................................ 27 Tabela 4. Linhagens de Streptomyces utilizadas no estudo ............................... 28 Tabela 5. Micro-organismos patogênicos utilizados neste estudo...................... 28 Tabela 6. Quantidade de reagentes utilizados na reação de PCR quando se utilizou a enzima Platinum Taq DNA Polimerase (Invitrogen) ....................................... 35 Tabela 7. Condições de amplificação de domínios de adenilação por PCR utilizando Platinum Taq DNA Polimerase (Ayuso, 2005) .............................................. 36 Tabela 8. Condições de amplificação por PCR do domínio de adenilação utilizando a enzima Pfx50 DNA polimerase .................................................................. 36 Tabela 9. Quantidade de reagentes utilizados quando a enzima utilizada foi a Pfx50 DNA polimerase .................................................................................................. 36 Tabela 10. Quantidade de reagentes utilizados para amplificação do domínio de adenilação quando a enzima foi a Phusion DNA polimerase (Finnzymes) ................... 37 Tabela 11. Condições de amplificação dos domínios de cetossintasemetilmalonila transferase por PCR ................................................................................ 37 Tabela 12. Quantidade de reagentes utilizados para amplificação por PCR dos domínios de cetossintase-metilmalonila transferase utilizando a enzima Phusion DNA polimerase..................................................................................................................... 37 Tabela 13. Condições de amplificação por PCR dos domínios de cetossintasemetilmalonila transferase .............................................................................................. 38 Tabela 14. Quantidade de reagentes utilizados para amplificação dos domínios de cetossintase -metilmalonila transferase utilizando a enzima Platinum Taq DNA Polimerase .................................................................................................................... 38 Tabela 15. Clones que tiveram sequências significativas. ................................. 50. xxi.

(21) Tabela 16. Resultados obtidos para o alinhamento de sequências do inserto clonado em B43 ............................................................................................................ 52 Tabela 17. Resultados obtidos para o alinhamento de sequências do inserto clonado em B11 ............................................................................................................ 52 Tabela 18. Resultados obtidos para o alinhamento de sequências do inserto clonado em B12. ........................................................................................................... 53 Tabela 19. Alinhamento de sequências de nucleotídeos do clone A23-1. ......... 55 Tabela 20. Alinhamento das sequências de aminoácido do clone A23-1........... 55 Tabela 21. Resíduos conservados do primeiro domínio de adenilação de LgrC. ...................................................................................................................................... 58 Tabela 22. Resíduos conservados do segundo domínio de adenilação de LgrC. ...................................................................................................................................... 58 Tabela 23. Sequências de aminoácidos que apresentaram semelhanças com a sequência amplificada. .................................................................................................. 59 Tabela 24. Comparação entre os resultados de alinhamento para a sequência de nucleotídeos de B1-17. ................................................................................................. 60 Tabela 25. Resultado do alinhamento de aminoácidos do suposto domínio de adenilação presente no clone B1-17. ............................................................................ 61 Tabela 26. Especificidade da sintetase do pigmento azul a partir de seus resíduos conservados. .................................................................................................. 62 Tabela 27. Comparação entre os resultados de alinhamento para a sequência de nucleotídeos de C12. .................................................................................................... 64 Tabela 28. Alinhamento para a sequência de aminoácidos gerados a partir do fragmento clonado em C12. .......................................................................................... 64 Tabela 29. Alinhamento da sequência de nucleotídeos do fragmento de cetossintase metilmalonila-transferase do clone E2. .................................................... 66 Tabela 30. Alinhamento da sequência de nucleotídeos do fragmento de cetossintase-metilmalonila transferase do clone E5...................................................... 66. xxii.

(22) Tabela 31. Alinhamento da sequência de aminoácidos traduzida a partir do fragmento de cetossintase-metilmalonil transferase do clone E2. ................................ 67 Tabela 32. Resultados observados no teste de inibição do micro-organismo Streptomyces sp B1. ..................................................................................................... 71 Tabela 33. Resultados observados no teste de inibição do micro-organismo Streptomyces wadayamensis A23. ............................................................................... 72 Tabela 34. Resultados observados no teste de inibição do micro-organismo A30. ...................................................................................................................................... 72 Tabela 35. Resultado dos testes de inibição em disco promovida pelos extratos de Streptomyces wadayamensis A23. .......................................................................... 73 Tabela 36. Resultados do teste de inibição em disco promovida pelos extratos de Streptomyces sp B1 ................................................................................................. 74 Tabela 37. Íons mais comuns presentes nos extratos de cultivo do microorganismo Streptomyces wadayamensis A23............................................................... 86. xxiii.

(23) Lista de Figuras Figura 1. Gráfico da taxa de mortalidade ao longo dos anos a partir de 1937 (modificado de Dancer, 2008). ........................................................................................ 1 Figura 2. Entidades químicas introduzidas no mercado mundial entre 1981 e 2006: peptídeo ou proteína isolado de organismo ou produzido por biotecnologia (B); produto natural (N); derivado de produto natural com modificação (ND), totalmente sintético (S); síntese total, mas o farmacóforo é de um produto natural (S*) e vacina (V) (modificado de Newman, 2007). ..................................................................................... 2 Figura 3. Ciclo de vida de bactérias do gênero Streptomyces (modificado de Kieser, 2000). .................................................................................................................. 3 Figura 4. Maquinaria biossintética da DEBS1-3. Cada proteína possui módulos extensores contendo três domínios obrigatórios: KS, AT e ACP. Os domínios redutivos podem variar em cada módulo (KR, DH, ER). ................................................................ 6 Figura 5. Estrutura tridimensional dos módulos da DEBS ACP (entrada 2JU1 do PDB) (A) e TE (entrada 1MN6 do PDB) (B). ................................................................... 7 Figura 6. Maquinaria biossintética de NRPS. Cada proteína possui módulos extensores contendo três domínios obrigatórios: A, C e PCP. ........................................ 8 Figura 7. Peptídeos não ribossomais tripeptídeo ACV (1); vancomicina (2) e epotilona (3). ................................................................................................................. 11 Figura 8. Estruturas dos policetídeos eritromicina A (4); anfotericina B (5); monensina A (6) e rifamicina S (7). ............................................................................... 12 Figura 9. Esquema da abordagem metodológica utilizada para prospecção de genes crípticos. ............................................................................................................. 15 Figura 10. Compostos descobertos utilizando a metodologia de prospecção de genes (genome mining)................................................................................................. 18 Figura 11. Desenho esquemático do espectrômetro de massas. ....................... 19 Figura 12. Ionização por ESI. ............................................................................. 20 Figura 13. Analisador Quadrupolo. ..................................................................... 21. xxiv.

(24) Figura 14. Amplificação dos domínios de adenilação dos microrganismos A23 e B1. 1. B1 na presença de DMSO e 40 nL de Pfx50; 2. B1 na presença de 40 nL de Pfx50 e ausência de DMSO; 3. B1 sem DMSO com 200 nL de Pfx50 50; 4. A23 com Phusion e 5. B1 com Phusion. ...................................................................................... 45 Figura 15. a. Amplificação dos insertos correspondentes aos domínios de adenilação (700 pb) de Streptomyces coelicolor utilizando Phusion DNA Polimerase. b. Marcador de peso molecular 1 kb plus DNA ladder (Invitrogen). .................................. 45 Figura 16. a. Amplificação dos insertos de cetossintase-metilmalonila transferase de 1. A23, 2. B1 e 3. A30. M: marcador de peso molecular (1 kb ladder plus Invitrogen). b. Marcador de peso molecular 1 kb plus DNA ladder (Invitrogen). .............................. 46 Figura 17. Mapa do plasmídeo pCRBlunt. .......................................................... 48 Figura 18. Análise de restrição de 14 clones de Streptomyces wadayamensis A23. ............................................................................................................................... 49 Figura 19. Resíduos conservados de KS que incorporam propanoato. Alinhamento gerado no programa Geneius (Drumond, 2011). ...................................... 50 Figura 20. Resíduos conservados de domínio de adenilação (Drumond, 2011). 51 Figura 21. Árvore taxonômica para os fragmentos clonados contendo domínios de cetossintase-metilmalonila transferase do micro-organismo A23. ........................... 54 Figura 22. Árvore taxonômica gerada a partir de Streptomyces wadayamensis (A23) dos transcritos de NRPS. .................................................................................... 56 Figura 23. Estrutura do pentadecapeptídeo gramicidina. ................................... 57 Figura 24. Estrutura da indigoidina. .................................................................... 60 Figura 25. Mecanismo proposto para biossíntese da indigoidina. ...................... 61 Figura 26. Pigmento azul produzido pelo micro-organismo B1. ......................... 61 Figura 27. Árvore taxonômica para o fragmento clonado em B1-17. ................. 63 Figura 28. Árvore taxonômica gerada a partir das sequências de nucleotídeos dos fragmentos clonados em C12. ................................................................................ 65 Figura 29. Árvore taxonômica gerada a partir do alinhamento de sequências de cetossintase-metilmalonila transferase dos clones E2 e E5. ......................................... 67 xxv.

(25) Figura 30. Estruturas de sideróforos: vibriobactina (8); desferrioxamina (9) e estafiloferrina (10). ........................................................................................................ 75 Figura 31. Avaliação qualitativa da produção de sideróforos em placa contendo CAS: a produção de sideróforo promove a mudança de coloração do meio azul para o amarelo. ........................................................................................................................ 76 Figura 32. Frações da coluna com resina Diaion HP-20 (Supelco) do cultivo de Streptomyces coelicolor em meio CDLIM. .................................................................... 77 Figura 33. Padrões de peptídeos não ribossomais actinomicina (15) e bacitracina (16) e policetídeos eritromicina (17) e claritromicina (18).............................................. 80 Figura 34. Espectro de massas da eritromicina.................................................. 81 Figura 35. Espectro de massas da claritromicina. .............................................. 81 Figura 36. Espectro de massas da actinomicina. ............................................... 82 Figura 37. Espectro de massas da vancomicina. ............................................... 82 Figura 38. Cromatograma contendo os padrões: tirotricina (2,41 min), eritromicina (2.58 min), claritromicina (2,70 min), vancomicina (3,16 min) e actinomicina (4,36 min). ..................................................................................................................... 83 Figura 39. Macrolídeos de 12 membros como a metimicina (R1=OH, R2=H), neometimicina (R1=H, R2=OH) e YC-17 (R1, R2=H). ..................................................... 83 Figura 40. a. Estrutura de macrolídeos de 16 membros. R 1= H, COCH3, COCH2CH3;. R2=. COCH2CH(CH3)2,. COCH2CH2CH3,. COC4H9;. R3 =. OH,. COCH2CH(CH3)2; R4= H, COCH3; b. D-forosamina. .................................................... 84 Figura 41. Perfil cromatográfico dos extratos de acetato de etila dos cultivos do micro-organismo Streptomyces wadayamensis A23 em 9 meios contendo diferentes fontes de nutrientes. ...................................................................................................... 85 Figura 42. Padrão de fragmentação do íon de m/z 601 encontrado em meios de cultivo de A23. ............................................................................................................... 87 Figura 43. Proposta de fragmentação do composto de m/z 601. ....................... 88 Figura 44. Padrão de fragmentação do íon de m/z 912 com a. 40 eV e b. 50 eV. ...................................................................................................................................... 89 xxvi.

(26) Figura 45. Estrutura da quimeramicina. .............................................................. 89 Figura 46. Padrão de fragmentação do íon de m/z 898. .................................... 90 Figura 47. Padrão de fragmentação do íon de m/z 585. .................................... 90 Figura 48. Espectro full scan do meio INA no tr 1,3 (a); fragmentação do íon de m/z 453 (b) e fragmentação do íon de m/z 521 (c). ..................................................... 91 Figura 49. Padrão de fragmentação da eritromicina envolvendo a perda neutra referente à cladinose (158 Da) e levando ao íon de m/z 576 observado no espectro de massas. ......................................................................................................................... 92 Figura 50. Padrão de fragmentação da eritromicina proposto por Kearney: a eritromicina protonada (a) pode sofrer um ataque nucleofílico intramolecular gerando um anel de 5 membros (b). Posteriormente ocorre a formação do íon oxônio (d), através da eliminação de água (c). ............................................................................... 92 Figura 51. Sequências de perda de massa possíveis para eritromicina. ............ 93 Figura 52. Fragmentação de uma eritromicina padrão (a); Padrão de fragmentação do íon de m/z 734 encontrado no cultivo de A23 (b) e espectro ampliado (c). ................................................................................................................................. 93 Figura 53. Perfil cromatográfico dos extratos de acetato de etila do cultivo do micro-organismo Streptomyes sp B1. ........................................................................... 95 Figura 54. Espectro full scan dos meios de cultivo V6 e Vegetativo n de Streptomyces sp B1. ..................................................................................................... 96 Figura 55. Padrão de fragmentação do íon de m/z 687 dos meios de cultivo de Streptomyces SP B1. .................................................................................................... 97 Figura 56. Padrão de fragmentação do íon de m/z 777. .................................... 97 Figura 57. Padrão de fragmentação do íon de m/z 939. .................................... 97 Figura 58. Cromatograma de íons do meio de cultivo de B1. ............................. 98 Figura 59. Espectro full scan do meio de cultivo AFMS de B1. .......................... 98 Figura 60. Espectro de FT-ICR no modo positivo do extrato de acetato de etila do meio AFMS de Streptomyces wadayamensis A23. ................................................ 101. xxvii.

(27) Figura 61. Espectro de FT-ICR no modo negativo do extrato de acetato de etila do meio AFMS de Streptomyces wadayamensis A23. ................................................ 102 Figura 62. Estrutura das antimicinas. ............................................................... 102 Figura 63. Espectro de FT-ICR no modo positivo do extrato de acetato acetato de etila do meio GYM de Streptomyces wadayamensis A23. ..................................... 103 Figura 64. Espectro de FT-ICR no modo negativo do extrato de acetato de etila do meio GYM de Streptomyces wadayamensis A23. ................................................. 104 Figura 65. Espectro de FT-ICR no modo positivo do extrato de acetato de etila do meio A de Streptomyces wadayamensis A23. ....................................................... 105 Figura 66. Espectro de FT-ICR no modo negativo do extrato de acetato de etila do meio GYM de Streptomyces wadayamensis A23. ................................................. 106 Figura 67. Gráfico contendo a razão elemento/carbono dos dos extratos de acetato de etila dos meios de cultivo no modo positivo............................................... 107 Figura 68. Gráfico contendo a razão elemento/carbono dos extratos dos meios de cultivo no modo negativo. ....................................................................................... 107 Figura 69. Índice de insaturação dos compostos presentes no meio AFMS (modo positivo). ...................................................................................................................... 108 Figura 70. Índice de insaturação dos compostos presentes no meio AFMS (modo negativo). .................................................................................................................... 109. xxviii.

(28) 1.. Introdução 1.1. Contexto atual. Existe uma constante necessidade de se descobrir novos fármacos com propriedades antibióticas e capacidade de inibir o crescimento de micro-organismos patogênicos. A partir da introdução da penicilina, a taxa de mortalidade por microorganismos infecciosos caiu pela metade no período de sete anos (Dancer, 2008). No entanto, nas últimas duas décadas tem sido observado um aumento considerável de bactérias resistentes a antibióticos tais como Staphylococcus aureus resistente à penicilina, linhagens de Staphylococcus aureus resistentes (MRSA) e susceptíveis (MSSA) à meticilina e vancomicina (VISA) (Figura 1), de tal modo que a taxa de mortalidade em função dos processos de infecção tem aumentado a uma quantidade equiparável a era anterior a descoberta da penicilina, constituindo uma preocupação com a saúde pública e exigindo uma releitura na busca por novas entidades com atividade antibiótica (Brötz-Oesterhelt, 2010).. Figura 1. Gráfico da taxa de mortalidade ao longo dos anos a partir de 1937 (modificado de Dancer, 2008). 1.

(29) Nesse contexto, os produtos naturais servem como modelos para o desenvolvimento de novas moléculas. De acordo com Newman e Cragg (2007), no período entre 1981 e 2006 foram introduzidas 1184 novas entidades químicas no mercado mundial, das quais 66% eram provenientes de produtos naturais ou derivadas (Figura 2). Estas entidades compreendem produtos naturais (5%), derivados semisintéticos (23%), compostos sintéticos com farmacóforos baseados em produtos naturais (4%), compostos sintéticos mímicos de produtos naturais e peptídeos (20%) e proteínas isoladas de organismos ou produzidas por biotecnologia (14%). Em uma revisão recente, Cragg utiliza apenas pequenas moléculas introduzidas no mercado atual, afirmando que neste mesmo período, 63% das 1024 pequenas moléculas eram provenientes de produtos naturais ou derivados e 68,3% desses produtos naturais apresentaram atividades antibióticas (Cragg, 2009). Estes dados contribuem para demonstrar que a natureza é a maior inspiradora para a obtenção de novas moléculas bioativas. S 4. 10 30. 10. ND N B V. 4. S*/NM. 14 23. 5. S* S/NM. Figura 2. Entidades químicas introduzidas no mercado mundial entre 1981 e 2006: peptídeo ou proteína isolado de organismo ou produzido por biotecnologia (B); produto natural (N); derivado de produto natural com modificação (ND), totalmente sintético (S); síntese total, mas o farmacóforo é de um produto natural (S*) e vacina (V) (modificado de Newman, 2007).. Micro-organismos terrestres são fontes prolíficas para o isolamento de produtos naturais, dentre os quais se destacam as actinobactérias, reconhecidamente as maiores produtoras de antibióticos (Strobel, 2004). Um levantamento realizado entre 1950 e 2006 pelo Antibiotic Literature Database (http://www.antibiotics.or.jp/journal/database/database-top.htm) mostrou que das 31600 entidades de origem microbiana, 48% eram provenientes de actinobactérias. 2.

(30) 1.2. Streptomyces. Streptomyces são bactérias gram-positivas, aeróbias e possuem um alto conteúdo de bases guanina e citosina incorporada em seu genoma, cuja quantidade pode variar entre 69 e 78 mol%. Taxonomicamente, este gênero pertence à família Streptomycetales e à ordem dos actinomycetales, um grupo caracterizado por sua diversidade em termos de morfologia, ecologia e patogenicidade (Anderson, 2001). Estas bactérias possuem uma organização filamentosa cuja colonização é facilitada pelo crescimento de hifas que se diferenciam em esporos (Figura 3). Seu ciclo de vida varia de acordo com as condições de nutrientes: sob boas condições exibem micélios septados multicelulares semelhantes aos fungos, enquanto em condições limitantes desenvolvem micélios vegetativos que se diferenciam em hifas aéreas que formarão esporos (Sherr, 2009).. Figura 3. Ciclo de vida de bactérias do gênero Streptomyces (modificado de Kieser, 2000).. 3.

(31) O sistema de classificação das actinobactérias foi proposto por Waksman com base em sua morfologia e quimiotipo da parede celular (Waksman, 1943), sendo Streptomyces caracterizado como tipo I, devido à presença do ácido LLdiaminopimélico e glicina. Dentre as ferramentas utilizadas para classificar os gêneros dentro do grupo de actinobactérias, a filogenia de grupo baseada em 16S rRNA é a mais comum (Embley, 1994). Streptomyces estão presentes em todo lugar na natureza, preferencialmente em solos ricos em detritos orgânicos e crescem em microcolônias que degradam biopolímeros como lignocelulose, polifenóis, quitosanas, queratinas, pectinas, dentre outros (Rehm, 1993). Estes micro-organismos estão entre as bactérias mais bem estudadas, devido ao impacto econômico obtido por meio dos metabólitos produzidos. Dentre estes metabólitos destacam-se os policetídeos e peptídeos não ribossomais. A produção de metabólitos secundários inicia-se na fase estacionária quando o micro-organismo é cultivado em meio líquido, enquanto que em ágar sua produção coincide com o início da diferenciação morfológica (Weber, 2003). Os antibióticos produzidos industrialmente possuem estruturas e funções extremamente. variadas:. bactericidas. e. bacteriostáticos. como. penicilinas,. cefalosporinas e vários macrolídeos; agentes antifúngicos como a anfotericina B e nistatina; imunossupressores como FK-506, rapamicina, ascomicina; quimioterápicos como. bleomicina,. dactinomicina,. doxorubicina,. estaurosporina;. herbicidas. (fosfinotricina); no tratamento de diabetes (acarbose) e agentes anti-helmínticos (avermectina, milbemicina) (Weber, 2003). A maioria das Streptomyces contém plasmídeos, geralmente associados a fatores de fertilidade, que podem ser circulares ou lineares com tamanhos que variam entre 10 e 600 kb. Os cromossomos são lineares com um tamanho de aproximadamente 8 a 10 Mb e em geral contém mais de 20 clusters de genes associados com a biossíntese de metabólitos secundários (Nett, 2009).. 4.

(32) 1.3. Policetídeo Sintases (PKSs). Os policetídeos são biossintetizados por PKSs, enzimas multifuncionais que estão presentes em diversos organismos como bactérias, fungos e plantas. Os metabólitos biossintetizados por estes organismos em geral exercem papel de defesa e no caso das plantas também atuam como agentes para pigmentação de flores, resposta à exposição de luz e interação planta-hospedeiro (Castoe, 2007). As PKSs catalisam a formação de policetídeos por meio de sucessivas reações de condensação do tipo Claisen. As enzimas são constituídas por vários domínios contendo uma composição mínima encontrada em todas elas: cetossintase (KS), responsável pela ligação C-C; aciltransferase (AT), que introduz unidades malonila, metilmalonila-CoA, ou outras subunidades ativadas durante a extensão da cadeia; domínio da proteína carreadora de acila (ACP) e um domínio finalizador ou domínio de tioesterase (TE - alocado no último módulo enzimático). A tioesterase é uma enzima de 28 kDa pertencente à família de. hidrolase, que incluem lipases, esterases e. proteases, localizada no carboxiterminal da PKS. Todas possuem uma tríade catalítica conservada composta por serina, histidina e asparagina, responsáveis pela liberação do produto. Quando o policetídeo atinge seu comprimento, interage com a última ACP, que transfere o policetídeo ao grupo hidroxila do resíduo de serina, formando um éster. O resíduo de histidina, atuando como base, retira o próton da hidroxila do resíduo de serina. O oxigênio nucleofílico ataca a carbonila do tioéster ligado à ACP, obtendo o oxoéster. Em seguida pode ocorrer um ataque nucleofílico pela água, gerando o produto linear ou por um nucleófilo interno, levando a um macrociclo (Liangcheng, 2010). Após a saída da enzima, as estruturas dos policetídeos são modificadas por monooxigenases, metilatransferases e glicosilatransferases. Existem três tipos de PKSs, classificadas em tipo I, tipo II e tipo III. As PKSs tipo I possuem seus domínios ligados como elos em uma corrente enquanto que no tipo II, as enzimas possuem seus domínios separados e as enzimas do tipo III são enzimas condensadoras que agem interativamente. No caso particular das bactérias pode ser encontrado qualquer um dos tipos (Weber, 2003). 5.

(33) A PKS tipo I é subclassificada em interativa, geralmente encontrada em fungos e modular, comum em bactérias. A PKS interativa é composta de uma enzima capaz de conduzir várias etapas de extensão da cadeia. A PKS modular é formada por grandes polipeptídeos multifuncionais cujos ciclos de extensão de cadeia são catalisados por diferentes sítios ativos situados em módulos separados. Cada sítio ativo é utilizado apenas uma vez (Moss, 2004). Um exemplo clássico de PKS-I é a responsável pela biossíntese da eritromicina, chamada 6-deoxieritronolídeo sintase (DEBS). O cluster de genes que codifica para este complexo enzimático é formado por 3 ORFs: eryAI, eryAII e eryAIII que codificam para três enzimas que formarão a PKS: DEBS I, II e III (Stauton, 2001), como pode ser visualizado na Figura 4.. Figura 4. Maquinaria biossintética da DEBS1-3. Cada proteína possui módulos extensores contendo três domínios obrigatórios: KS, AT e ACP. Os domínios redutivos podem variar em cada módulo (KR, DH, ER).. 6.

(34) Alguns módulos da DEBS já foram estruturalmente elucidados (Figura 5), como por exemplo, a ACP (A) (entrada 2JU1 do PDB; Alekseyev, 2007) e TE (B) (entrada 1MN6 do PDB; Tsai, 2002). O domínio de ACP foi determinado por espectroscopia de ressonância magnética nuclear. Esta proteína é composta por três hélices maiores e uma hélice curta. A TE possui uma interface do dímero hidrofóbico rica em leucina e um canal de substrato que passa através da proteína inteira. A tríade do sítio ativo, composto de Asp-169, His-259, e Ser-142, está localizada no meio do canal de substrato sugerindo a passagem do substrato através da proteína.. A. B. Figura 5. Estrutura tridimensional dos módulos da DEBS ACP (entrada 2JU1 do PDB) (A) e TE (entrada 1MN6 do PDB) (B).. 1.4. Peptídeo Não Ribossomal Sintetase (NRPS). A biossíntese de peptídeos nos micro-organismos pode ser realizada de duas maneiras: por meio do ribossomo, ou por enzimas denominadas Peptídeo Não Ribossomal Sintetases (NRPS). Na produção de proteínas ou peptídeos ribossomais estão envolvidos o RNA mensageiro, que contém a informação genética do DNA e direciona a biossíntese do peptídeo. A enzima aminoacila-tRNA sintetase seleciona então o aminoácido cognato e 7.

(35) o carrega para o grupo hidroxila do tRNA correspondente. Com o auxílio do fator de elongação (EF)-Tu, o ribossomo posteriormente seleciona o aa-tRNA correto durante cada ciclo de elongação do polipeptídeo de acordo com a sequência do mRNA (Finking, 2004; Lehninger). De forma análoga, a síntese de peptídeos não ribossomais é mediada por enzimas conhecidas como peptídeo não ribossomal sintetases e requer ao menos o envolvimento de três domínios enzimáticos (Figura 6). O domínio de adenilação (A) seleciona o aminoácido cognato e o ativa como aminoacila adenilato. O aminoácido ativado é então transferido para uma proteína carreadora de peptidila (PCP) que o transfere ao domínio de condensação (C) que finalmente catalisa a formação da ligação peptídica (Kleinkauf, 1996).. Figura 6. Maquinaria biossintética de NRPS. Cada proteína possui módulos extensores contendo três domínios obrigatórios: A, C e PCP. 8.

(36) NRPSs ativam seus substratos, por meio da hidrólise do ATP, como acilaadenilatos. Estes intermediários instáveis são posteriormente ligados aos cofatores 4’fosfopanteteinila na forma de tioésteres. Para cada resíduo incorporado, a enzima possui sítios ativos específicos para o reconhecimento, ativação, tiolação e em alguns casos modificações como epimerização e N-metilação de um único substrato. Em sistemas bacterianos, os genes que codificam para estas enzimas multimodulares são organizados em operons em regiões que podem variar entre 6 e 45 kb (Konz, 1999). Os substratos de NRPSs não se restringem apenas aos 20 aminoácidos usuais, mas se estendem a aminoácidos não-proteinogênicos como D-isômeros,. -hidroxi-. ácidos, -aminoácidos, carboxi-ácidos, e resíduos N-metilados. Estima-se que mais de 500 aminoácidos não-proteinogênicos possam ser incorporados (Sieber, 2003; Marahiel, 1997). Análises de sequências e funções dos genes responsáveis pela síntese de NRPSs levaram a compreensão de suas estruturas, tornando possível detectar sequências conservadas dentro de cada domínio. As sequências de domínio de adenilação conservadas podem ser observadas na tabela 1 abaixo. Tabela 1. Domínios conservados de adenilação em NRPS Domínio Adenilação. Centro. Sequência consenso L(TS)YxEL LKAGXAY(VL)P(LI)D LAYxxYTSG(ST)TGxPKG FDxS NxYGPTE GELxLxGxG(VL)ARGYL Y(RK)TGDL GRxDxQVKIRGxRIELGEIE LPxYM(IV)P NGK(VL)DR. A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10. 9.

(37) 1.5. Peptídeos não ribossomais e Policetídeos. Peptídeos não ribossomais são uma classe de metabólitos secundários produzidos por uma variedade de procariotos. Seu mecanismo de produção foi descrito pela primeira vez por Lippman na década de 70 ao observar que os antibióticos gramicidina S e tirocidina produzida por Bacillus eram sintetizados por enzimas capazes de formar ligações peptídicas de maneira similar à síntese de ácidos graxos (Moffit, 2000). A esfera de atividade destes peptídeos alcança desde antibióticos até citotóxicos, passando por imunossupressores e agentes citostáticos. Como pode ser visualizado na Figura 7, o tripeptídeo ACV (1), por exemplo, é um precursor do antibiótico da família das penicilinas e cefalosporinas. A vancomicina (2) é um antibiótico glicopeptídeo com atividade contra bactérias gram-positivas. Peptídeos não ribossomais são na maior parte macrocíclicos, podendo conter aminoácidos não-proteinogênicos, e anéis heterocíclicos como tiazolina, oxazolina ou tiazol no caso da epotilona (3) (Schwarzer, 2003). Adicionalmente, esses peptídeos podem conter N-metilações, N-formilações e glicolisações, assim como inserção de acetato ou propanoato e ácidos graxos. Esses metabólitos exercem um papel variado na ecologia dos microorganismos: Yersinia pestis e Mycobacterium tuberculosis produzem peptídeos não ribossomais iersiniabactina e micobactina que são fatores de virulência. A serravetina é um biossurfactante produzido por Serratia liquefaciens e quebra a tensão superficial de líquidos que a impediria de se locomover sobre uma superfície (Lindum, 1998). Stigmatela aurantiaca produz o mixotiazol, um inibidor de transporte de elétrons (Silakowski, 1999).. 10.

(38) tripeptídeo ACV (1). vancomicina (2). epotilona (3) Figura 7. Peptídeos não ribossomais tripeptídeo ACV (1); vancomicina (2) e epotilona (3).. Os policetídeos podem ser derivados de policetonas não reduzidas que originam moléculas aromáticas, ou possuir a carbonila reduzida durante a biossíntese. No caso de policetídeos reduzidos (Figura 8), a cadeia linear pode ser ciclizada formando uma macrolactona e os metabólitos podem ser divididos em duas classes principais: os macrociclos e poliéteres (Weissman, 2005). Macrociclos tais como a eritromicina A (4) contém uma macrolactona em suas estruturas. Polienos como a anfotericina B (5) formam um subconjunto de macrolídeos 11.

(39) que geralmente incorporam três a sete duplas ligações conjugadas. Antibióticos da classe de poliéteres ionóforos, como a monensina A (6) possuem um grupo carboxilato e dois a cinco átomos de oxigênio. O antibiótico da classe das ansamicinas pertence a um segundo conjunto de macrolídeo que inclui a rifamicina S (7) e incorporam o aminoácido não proteinogênico ácido 3-amino-5-hidróxibenzóico (AHBA) como primeiro bloco construtor e são híbridos de policetídeos e peptídeos não ribossomais (Weissman, 2005).. eritromicina A (4). anfotericina B (5). monensina A (6). rifamicina S (7). Figura 8. Estruturas dos policetídeos eritromicina A (4); anfotericina B (5); monensina A (6) e rifamicina S (7).. Os macrolídeos são classificados de acordo com o número de membros que compõem a lactona, geralmente sendo de 12, 14 ou 16 membros e a maioria contém 12.

(40) ao menos um aminoaçúcar ligado em sua estrutura. De forma geral são produzidos por fermentação aeróbia a partir de fontes variadas, de carbono e nitrogênio. A extração pode ser feita com partição líquido-líquido do meio de cultivo com solventes orgânicos como acetato de etila ou clorofórmio. Todos os antibióticos da classe dos poliéteres conhecidos são isolados de cultivos de Streptomyces. O grupo carboxilato e os grupos éter servem como ligantes a metais alcalinos. O complexo neutro atravessa a membrana celular de microorganismos despolarizando-a e levando a morte celular (Oliynyk, 2003). Esses compostos em geral possuem atividade antibiótica contra bactérias gram positivas e micobactérias. Polienos são metabólitos produzidos por uma variedade de Streptomyces. As condições de cultivo para sua produção são as mesmas que utilizadas para macrolídeos. A maior parte dos polienos está contida no micélio, que é então separado do meio de cultura e extraído com n-butanol. Entretanto, há relatos na literatura de isolamento de polienos do meio de cultivo líquido a partir da extração com n-butanol (Haeder, 2009; Mendes, 2001). Os polienos são classificados de acordo com o número de dupla ligação presente: trienos, tetraenos, pentaenos, hexaenos ou heptaenos.. 1.6. Bioinformática. O desenvolvimento de novos sequenciadores e a disponibilidade de banco de dados de genomas de micro-organismos na internet permitiu à química de produtos naturais relacionarem a estrutura dos compostos produzidos no metabolismo secundário com os genes responsáveis pela sua biossíntese. Até o final de 2009, 53 genomas de actinobactérias foram completados e anotados, sendo a grande maioria pertencente à ordem dos actinomicetales. Vários clusters de genes envolvidos na biossíntese de metabólitos foram identificados. No entanto, os potenciais metabólitos não foram detectados em meios de cultivo (Nett, 2009).. 13.

(41) Atualmente é possível prever a expressão de um gene e a função do produto gênico por meio do alinhamento de sua sequência com outras disponíveis em bancos de dados como o NCBI. No caso de clusters de genes responsáveis pela síntese de NRPs e PKs pode-se avaliar o potencial para produção da classe química destes metabólitos e estudar as condições de sua extração. Existem várias ferramentas úteis de bioinformática disponíveis na rede que auxiliam na realização de alinhamentos e construção de árvores filogenéticas. Um meio muito comum é o BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). Há várias formas de alinhamentos no BLAST, dependendo da análise desejada. Pode-se fornecer uma sequência de nucleotídeos ou aminoácidos e utilizar algoritmos diferentes dependendo da informação desejada. BLASTP faz a comparação de uma sequência de aminoácidos com um banco de dados de proteínas. De maneira similar o BLASTN faz a comparação entre sequências de nucleotídeos. O BLASTX traduz automaticamente a sequência de nucleotídeos e realiza o alinhamento com sequências de aminoácidos do banco de dados. Utilizando o programa TBLASTN, é realizada a comparação de uma sequência de aminoácidos com nucleotídeos traduzidos em aminoácidos. O último programa é TBLASTX que compara a sequência de nucleotídeos traduzidos com sequências de nucleotídeos traduzidos em banco de dados (Baxevanis, 2001). Acessa-se. o. BLAST. através. do. site. do. NCBI:. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), e é também a melhor alternativa para se ter acesso às mais recentes atualizações do GenBank, assim como outros, como por exemplo o DDBJ (Japão) e EMBL (Europa). O indicador de importância de um alinhamento BLAST é o expect value (evalue), que indica o número de chances esperado do banco de dados de obter o mesmo resultado por um alinhamento aleatório. Quanto mais próximo este valor de zero maior será o grau de similaridade entre as sequências.. 14.

(42) 1.7. Prospecção de genes e genes crípticos. A prospecção de genes (genome mining) tem sido utilizada para a descoberta de novas moléculas bioativas. O conhecimento das sequências de nucleotídeos dos clusters de genes ou até mesmo de todo o genoma do micro-organismo, proporcionou novas abordagens para a química de produtos naturais, permitindo prever a estrutura do metabólito e facilitando a sua obtenção. Os clusters de genes que codificam para sistemas biossintéticos, mas não estão associados com metabólitos conhecidos podem ser denominados genes crípticos, e a busca pela funcionalidade pode ser realizada utilizando ferramentas de bioinformática (genome mining). O termo críptico pode de maneira errônea ser associada com o silenciamento gênico. Gene críptico está relacionado com o gene que tem o potencial para produzir um determinado metabólito, mas este não foi detectado, uma vez que sua expressão em laboratório ocorre em uma condição otimizada (Zerikli, 2009). Na literatura existem várias abordagens utilizando esta metodologia, que variam dependendo das condições com que se trabalha como pode ser visualizada na Figura 9. É possível prever o metabólito relacionado com um conjunto de genes e se estes estão sendo expressos.. Figura 9. Esquema da abordagem metodológica utilizada para prospecção de genes crípticos.. 15.

(43) Salinispora tropica é uma actinobactéria marinha produtora de metabólitos secundários, como a salinisporamida A, um potente anticancerígeno, tornando este micro-organismo interessante para descoberta de novos compostos. Com o sequenciamento de seu genoma foi identificado um gene que supostamente codifica para uma PKS, responsável pela biossíntese de um metabólito contendo uma via mista PKS-NRPS produzindo possivelmente uma macrolactama contendo um policetídeo poliênico salinisporamida (8). Este produto foi previsto a partir da comparação de sua sequência com outras disponíveis em banco de dados, e sua detecção foi confirmada a partir de métodos físico-químicos (Udwary, 2007). O método genomisotópico é uma técnica de avaliação do genoma utilizando ferramentas de bioinformática com a utilização de precursores marcados nos substratos previstos das supostas enzimas codificadas pelo cluster críptico. Este método permitiu a descoberta da orfamida A (9), produzida por Pseudomonas fluorescens Pf-5, e codificada por 3 orfs: ofaA, ofaB e ofaC. Conhecendo-se a sequência de domínios de adenilação foi possível prever o substrato que se liga em cada domínio (Gerwick, 2007). O método de reconstituição in vitro utiliza enzimas biossintéticas codificadas pelos genes crípticos de interesse incubados com o substrato previsto utilizado na descoberta das haloduracinas, lantibióticos biossintetizados por Bacilus halodurans. A utilização de ferramentas de bioinformática permitiu a identificação de genes que codificam para os lantibióticos HalA1 e HalA2 e duas proteínas envolvidas na modificação pós-traducional HalM1 e HalM2 (McClerren, 2006). Foi proposto que o cluster de genes cch de Streptomyces coelicolor codificava para uma NRPS responsável pela biossíntese de um tripeptídeo quelante de ferro (sideróforo) denominado coeliquelina (10) a partir da comparação da sequência dos nucleotídeos com o banco de dados. Assim, foi realizada a clonagem em um vetor heterólogo e a comparação do perfil metabólico por meio do cultivo em meio rico em ferro e ausente de ferro (Lautru, 2005).. 16.

(44) Com os inúmeros genomas completados e o crescente número sequências de genes envolvidos no metabolismo secundário disponível em banco de dados, a taxonomia molecular tornou-se uma abordagem útil para estabelecer uma relação evolutiva entre os genes biossintéticos de espécies como Streptomyces. Existem duas áreas de pesquisa em produtos naturais que envolvem análise de filogenia: a primeira utiliza árvores baseadas em sequências de genes biossintéticos para prever a função do gene e reconstruir sua evolução. A segunda se baseia em marcadores ribossomais para identificar linhagens de organismos e compreender características evolutivas. A combinação destas duas abordagens estabelece relações de ortologia e paralogia e a ocorrência de transferência horizontal de genes (xenologia) (Schmitt, 2009). Dentro das árvores filogenéticas, as sequências são organizadas em grupos ou clados que refletem sua distância evolutiva, que é descrita por meio de monofilia. Um grupo monofilético inclui todos os descendentes de uma sequência ancestral (JenkeKodama, 2009). As principais técnicas utilizadas para análise filogenética são de distância, parsimonia e likehood (incluindo análise bayesiana). Métodos de distância são métodos baseados em distâncias evolutivas, como o número estimado de substituição de nucleotídeos ou aminoácidos. A árvore é então construída tendo como base a distância entre os pares de sequências, utilizando um algoritmo ou um procedimento de otimização. Os algoritmos mais utilizados são UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Averages) e o NJ (Neighbor Joining). Esta abordagem permitiu a descoberta de um análogo de pimaricina, JBIR-13 (11), produzido por Streptomyces bicolor a partir da análise filogenética de fragmentos de genes de PKS depositados no NCBI, demonstrando que é possível descobrir novas estruturas a partir desta metodologia (Komaki, 2009). As estruturas descobertas utilizando a metodologia de prospecção de genes podem ser visualizadas na Figura 10.. 17.

(45) Salinisporamida (8). Orfamida A (9). Coeliquelina (10). JBIR-13 (11). Figura 10. Compostos descobertos utilizando a metodologia de prospecção de genes (genome mining).. 1.8. Cromatografia líquida acoplada à espectrometria de. massas O avanço das técnicas instrumentais de análise facilitou o método de triagem de extratos identificando novos produtos naturais e separando compostos que já foram isolados (desreplicação) (Wolf, 2007). Os métodos mais comuns são a cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC/MS) que é aplicada quando se tem compostos orgânicos voláteis, de massas moleculares baixas e estáveis a temperaturas altas. A vantagem desta técnica é a reprodutibilidade da análise e a disponibilidade de uma biblioteca de fragmentos de massas que identifica o composto 18.

(46) caso este seja conhecido. A desvantagem é o limite de sua aplicação para compostos com massa molecular maior, que não são voláteis e a necessidade de procedimentos de derivatização (Sarker, 2006). Para compostos com massas maiores e não-voláteis, a técnica de cromatografia líquida mostra-se a mais adequada, possuindo vários sistemas de detecção como ultravioleta (UV), infravermelho (IV), RMN ou um espectrômetro de massas (Corcoran, 2003). A técnica de cromatografia líquida acoplada com espectrometria de massas pode ser útil na análise de policetídeos e peptídeos não ribossomais em meios complexos como o meio de cultura. Enquanto a cromatografia líquida separa cada composto presente no extrato, o espectrômetro de massas fornece o valor da razão massa/carga (m/z) de cada composto ionizado que sai da coluna cromatográfica e entra no espectrômetro. Pode-se ter a informação sobre o tempo de retenção que cada íon monoprotonado possui. O espectrômetro fornece também a possibilidade de realizar fragmentações dos íons desejados, o que auxilia na identificação estrutural do composto, baseando-se em padrões de fragmentação. O espectrômetro de massas consiste em uma fonte de ionização, um analisador de massas e um detector (Figura 11).. Figura 11. Desenho esquemático do espectrômetro de massas.. Após ser introduzida a amostra, esta é ionizada na fonte de ionização cujo método pode variar. As técnicas de ionização mais comuns são: Ionização por Elétrons (EI),. Ionização. Química. (CI),. Bombardeamento. 19. Rápido. de. Átomo. (FAB),.