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Prevalência e susceptibilidade aos antifúngicos de isolados de leveduras do gênero candida da cavidade bucal de pacientes com hanseníase

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PREVALÊNCIA E SUSCEPTIBILIDADE AOS ANTIFÚNGICOS DE ISOLADOS DE LEVEDURAS DO GÊNERO Candida DA CAVIDADE

BUCAL DE PACIENTES COM HANSENÍASE

Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia de São José dos Campos, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do Título de MESTRE pelo Programa de Pós Graduação em BIOPATOLOGIA BUCAL, Área Biopatologia Bucal.

Orientadora: Profa Dra Cristiane Yumi Koga Ito

São José dos Campos 2007

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FOLHA DE APROVAÇÃO

Navas EAFA. Prevalência e susceptibilidade aos antifúngicos de isolados de leveduras do gênero Candida da cavidade bucal de pacientes com hanseníase. [Dissertação]. São José dos Campos: Faculdade de Odontologia de São José dos Campos, UNESP; 2007.

São José dos Campos,

Banca Examinadora 1) Prof.(a) Dr.(a) :______________________________________________________ Titulação: ______________________________________________ Julgamento: ________________ Assinatura:___________________ 2) Prof.(a) Dr.(a) :______________________________________________________ Titulação: ______________________________________________ Julgamento: ________________ Assinatura:___________________ 3) Prof.(a) Dr.(a) :______________________________________________________ Titulação: ______________________________________________ Julgamento: ________________ Assinatura:___________________

(3)

Dedicatória

Aos pacientes portadores de Hanseníase, dos quais guardarei comigo a lembrança das muletas...,

das mãos muitas vezes mutiladas que faziam questão de assinar o termo de consentimento como se assim pudessem ser melhor aceitos

socialmente...,

dos sorrisos e lágrimas nas fisionomias desfiguradas, que arrastam uma história onde famílias foram destruídas, filhos arrancados do convívio de seus pais doentes pelo isolamento e o peso da segregação e do preconceito que mutilou e ainda mutila mais as suas

almas do que seus corpos.

Que os governantes desse país levem a saúde e a reintegração destes pacientes a sério,

que nós os aceitemos e os respeitemos com suas limitações, e que o sofrimento ao longo de tantos anos seja transformado em cuidados e assistência à altura de suas necessidades e de suas famílias,

lhes devolvendo a dignidade, auto-estima, respeito, e a esperança de dias melhores e mais felizes...

(4)

Dedicatória especial

À minha filha Lívia, “acessora para assuntos de informática”, meu presentinho de “ouro“,

minha força, alegria de viver e a vontade de vencer... que com tanta prontidão e dedicação nos seus ensinamentos

muito me ajudou a chegar até aqui, obrigada!

Ao meu marido Gilson,

que me deu o incentivo para enfrentar esta jornada, enfrentou horas e dias, vários fins de semana frente ao

computador,

sempre com muita paciência e dedicação, a certeza das horas incertas,

a paz e serenidade nos momentos difíceis, meu equilíbrio, meu porto seguro.

À você, grande companheiro, todo o meu amor e minha gratidão!

Aos meus pais Geraldina e Benedito, que me deram a vida e que se pudessem estar aqui certamente estariam orgulhosos...

A minha grande e ao mesmo tempo pequena, maravilhosa família, que durante toda a vida sempre me apoiou em todos os momentos,

particularmente os mais difíceis...

A Deus, fonte de toda a Sabedoria, a graça de tê-los colocado em meu caminho...e todos os dias de minha vida!

(5)

Agradecimento especial

À minha orientadora profa. Dra. Cristiane Yumi Koga Ito, pela amizade, pelo apoio nos momentos difíceis, que muitas vezes sacrificou a sua família por este projeto,

sempre com palavras de apoio e estímulo, pela orientação competente e dedicada,

confiança em meu trabalho, oportunidade de crescimento pelo exemplo de constante trabalho, paciência e serenidade

(6)

Agradecimentos

À Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, na pessoa do Diretor da Faculdade de Odontologia de São José dos Campos, Prof. Adj. Paulo Villela Santos Junior e do vice-diretor Prof. Dr. José Roberto Rodrigues;

À Profa. Adj. Rosilene Fernandes da Rocha, Coordenadora do Programa de Pós-graduação em Biopatologia Bucal, pela competência e dedicação com que administra este curso, pelo apoio e amizade;

A todos os Profs. do Departamento de Biociências e Diagnóstico Bucal, especialmente à Profa. Dra. Adriana Aigotti Haberbeck Brandão que com carinho me recebeu logo no início deste curso, com palavras de encorajamento e estímulo;

À FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo) Processo no 2006/50503-5, pelo auxilio à pesquisa

Ao Sr. Sr. Carlos Guedes, pela grande colaboração referente ao processo FAPESP;

Ao Prof. Tit. Antonio Olavo Cardoso Jorge que me acolheu de braços abertos no Laboratório de Microbiologia desta Instituição de Ensino dispensando toda sua atenção e colaboração a mim e a este projeto científico. Guardarei sempre seu exemplo de professor e pesquisador sério, competente e dedicado;

Às Profas. Dras. Juliana Campos Junqueira e Luciane Dias de Oliveira, da Disciplina de Microbiologia e Imunologia e do Programa de Pós-graduação em Biopatologia Bucal desta Universidade pela colaboração e amizade, sempre com palavras de apoio e estímulo;

(7)

Ao Prof. Ivan Balducci da Disciplina de Bioestatística do Departamento de Odontologia Social da Faculdade de Odontologia de São José dos Campos, pela valiosa e paciente colaboração na elaboração da análise estatística;

À Profa. Dra. Janete Dias de Almeida da Disciplina de Semiologia da Faculdade de Odontologia de São José dos Campos/UNESP, que com toda a sua competência realizou o exame intra-bucal dos pacientes hansenianos, contribuindo de forma decisiva na execução deste trabalho, devo muito a ela;

À Profa. Dra. Célia Regina Gonçalves e Silva que me incentivou para seguir este caminho e participou do exame de qualificação do mestrado;

À Secretaria de Saúde de São José dos Campos na pessoa da Dra. Marli de Souza Ferronato, que autorizou as coletas na UES desta cidade;

Ao Dr. Augusto César Brandão, que intermediou os primeiros contatos com o programa de atendimento à Hanseníase de São José dos Campos, pela amizade e colaboração;

À Dra.Silvia Regina Lage Fonseca, coordenadora do programa de atendimento à Hanseníase de São José dos Campos, que muito cooperou com informações e literatura;

À Dra. Sheila Politi Crespim, dermatologista responsável pelo atendimento à hanseníase da UES – Unidade de Especialidades em Saúde – SUS, de São José de Campos, que me recebeu com muita simpatia e contribuiu com valiosas informações para a elaboração deste trabalho, tenho muito a agradecê-la pelo incentivo;

À Margarida da Silva, auxiliar de enfermagem do programa de atendimento à hanseníase da UES, de São José dos Campos, sempre dedicada aos pacientes hansenianos, muito colaborou neste projeto no agendamento e seleção de pacientes;

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Ao Dr. Sidnei J. Spinardi, diretor de Saúde de Jacareí e à Dra. Fátima Fernandes, dermatologista responsável pelo atendimento à hanseníase que autorizaram o contato com os pacientes da URE- Unidade de Referência e Especialidades Médicas de Jacareí, para a coleta das amostras;

À psicóloga Ana Consuelo Alves da Silva e à assistente social Elaine Cristina Barbosa, da URE – Unidade de Referências e Especialidades – SUS, de Jacareí, pela disponibilidade e colaboração para a seleção e agendamento dos pacientes;

Ao Dr. Pedro Henrique Silveira, Diretor da Secretaria de Saúde de Taubaté e à Dra. Sonia Paresque, dermatologista responsável pelo atendimento aos pacientes portadores de hanseníase, que autorizaram o acesso aos pacientes para a coleta de material;

À técnica de enfermagem Rute Lima Santos e à fisioterapeuta Fábia Regina Borges da Policlínica Municipal de Taubaté, que com tanta dedicação cuidam dos pacientes, pela calorosa recepção e grande disponibilidade na seleção e agendamento dos pacientes;

À Secretaria de Saúde de Caçapava, na pessoa da Dra. Dalila Magali R. Penteado, dermatologista responsável pelo atendimento aos pacientes de hanseníase e à Larissa Vasquez Bruno enfermeira da infectologia do Centro de Saúde II – Dr. Odilon Miranda Souza, SUS;

À Ir. Marina Esther Villa Pérez e à Ir. Maria de Nazareth Megia Moreno, responsáveis pelo Lar São Vicente de Paula, à Ir. Fabíola Arango Restrepo, responsável pelo Lar Frederico Ozanan de Jacareí, pela doação totalitária e incondicional no atendimento aos idosos, onde foram coletados alguns controles;

Aos funcionários das mesmas entidades, que com o mesmo amor e carinho com que cuidam dos idosos, ajudaram na seleção e coleta das amostras;

(9)

Aos colegas da Pós–Graduação Thaís, Martha, Patrícia pelos laços de amizade estabelecidos no convívio diário, particularmente Graziella Nuernberg Back Brito, Sílvia Maria Rodrigues Querido e Edson Yukio Komiyama pela grande colaboração na realização deste trabalho, devo muito a eles;

Às queridas amigas Francine Cristina da Silva Rosa e Claunencil de Fátima Carreto, com quem tive o privilégio de enfrentar esta jornada, compartilhar de sua amizade, alegrias e tristezas, vitórias e derrotas, sentirei saudades;

A todos os alunos de Iniciação Científica, particularmente Aline de Cássia Inocêncio, bolsista FAPESP, que muito me auxiliou neste projeto;

À assistente administrativa do Departamento de Biociências e Diagnóstico Bucal, Sílvia Scarpel, pela atenção, dedicação e a formatação da estrutura do trabalho final;

Às secretárias da Seção de Pós-Graduação Rosemary de Fátima Salgado, Erena Michie Hasegawa, Maria Aparecida Consiglio de Souza e Lílian Faria das Graças, pela atenção dispensada;

À bibliotecária Ângela de Brito Bellini pela revisão da estrutura do trabalho e demais funcionários da biblioteca pela imensa atenção e paciência na busca de artigos e literatura;

À Maria de Fátima Pires, funcionária da Faculdade de Odontologia de São José dos Campos, que sempre com boa vontade me atendeu;

Ao técnico de laboratório Sérgio Giovani Alves, funcionário do Laboratório da Disciplina de Microbiologia e Imunologia da Faculdade de Odontologia de São José dos Campos, que sempre com boa vontade e disponibilidade me atendeu, muito me ajudando neste trabalho;

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Aos amigos pessoais que sempre entenderam as ausências e de onde sempre recebi estímulo e encorajamento;

Aos colegas e amigos do Laboratório Municipal de Jacareí, que souberam compreender minhas ausências;

À Vivian, meu braço direito, que cuida de tudo em casa, há tantos anos;

Aos pacientes portadores de hanseníase, que embora com todo o sofrimento causado pela doença sempre colaboraram gentilmente para que este trabalho pudesse ser realizado;

A todos que direta ou indiretamente, de alguma forma colaboraram com a realização deste trabalho,

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LISTA DE ABREVIATURAS

AnB = anfotericina B

ANOVA = análise de variância

ATCC = American Type Culture Collection C = Candida

Clam = clamidoconídeo

DNA = Ácido desoxirribonucléico g = grama

GA = galactose GL = glicose h = hora Hf = Hifa

HIV = Human Imunodeficiency Virus Ig = Imunoglobulina IgA = Imunoglobulina A L = lactose M = maltose M = molar M. = Mycobacterium MDT = multi-drug therapy mg = miligrama ml = mililitros mm3 = milímetros cúbicos

MORHAN = Movimento de Reintegração do Hanseniano NaCl = Cloreto de Sódio

NCCLS = Committee for Clinical Laboratory Standards ºC = grau Celsius

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OMS = Organização Mundial de Saúde PBS = tampão fosfato

pH = potencial hidrogênico-iônico PMN = Polimorfonuclear neutrófilo

PNEH = Plano Nacional de Eliminação da Hanseníase PQT = poliquimioterapia

R = rafinose S = sacarose spp. = espécies

SUS = Sistema Único de Saúde TG = tubo germinativo

UFC = unidade formadora de colônia WHO = World Health Organization xg = vezes gravidade % = porcentual < = menor > = maior µL = microlitros 5FC = 5-fluorocitosina

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Navas EAFA. Prevalência e susceptibilidade aos antifúngicos de isolados de leveduras do gênero Candida da cavidade bucal de pacientes com hanseníase. [Dissertação]. São José dos Campos: Faculdade de Odontologia de São José dos Campos, UNESP; 2007.

RESUMO

O presente trabalho teve como objetivo avaliar a presença de leveduras do gênero Candida na cavidade bucal de pacientes hansenianos, comparando os resultados com indivíduos controle. Foram utilizados enxágües bucais de trinta e oito indivíduos com idade entre 10 a 89 anos, diagnosticados como portadores de hanseníase clinicamente e por exame baciloscópico, que estejam sob poliquimioterapia por no mínimo 45 dias. Para o grupo controle o mesmo número de indivíduos saudáveis e com perfil semelhante (quanto à idade, gênero e condições bucais) aos pacientes do grupo em estudo. As amostras foram processadas e semeadas em ágar Sabouraud dextrose acrescido de cloranfenicol. Após o crescimento, as colônias foram examinadas quanto às características morfológicas, contadas as unidades formadoras de colônias (ufc). As colônias representativas de cada morfologia diferente foram isoladas. A identificação foi realizada por provas de formação de tubo germinativo, produção de hifas/pseudohifas e clamidoconídeos, fermentação, assimilação de carboidratos. Para identificação presuntiva de Candida dubliniensis foi realizado o teste à temperatura diferencial de 45ºC. Também foram realizadas provas de susceptibilidade aos antifúngicos anfotericina B, fluconazol, cetoconazol e 5-fluorocitosina. As contagens de leveduras nos grupos hansenianos e controle foram comparadas estatisticamente por ANOVA teste de Mann-Whitney (5%). O porcentual de pacientes hansenianos positivos para leveduras foi superior aos de indivíduos controle; porém não foi observada diferença significativa entre as contagens de leveduras nos grupos estudados. Houve maior prevalência de C. albicans e C. tropicalis em ambos os grupos estudados. Apenas uma amostra de C. tropicalis foi resistente à anfotericina B e todas as demais cepas foram sensíveis aos antifúngicos testados.

PALAVRAS-CHAVE: Hanseníase, quimioterapia combinada; Candida, antimicóticos; boca

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SUMÁRIO

LISTA DE ABREVIATURAS ... 11 RESUMO ... 13 1 INTRODUÇÃO ... 15 2 REVISÃO DA LITERATURA ... 18 2.1 Hanseníase ... 18 2.2 Gênero Candida ... 25

2.2.1 Características gerais e fatores de virulência ... 25

2.2.2 Gênero Candida na cavidade bucal ... 29

2.3 Susceptibilidade aos antifúngicos ... 31

3 PROPOSIÇÃO ... 37

4 MATERIAL E MÉTODOS ... 38

4.1 Aspectos éticos ... 38

4.2 Critérios de inclusão ... 38

4.3 Critérios de exclusão ... 39

4.4 Anamnese e exame clínico ... 39

4.5 Coleta de amostras ... 39

4.6 Processamento das amostras ... 40

4.7 Identificação das amostras de Candida ... 41

4.7.1 Formação de tubo germinativo ... 41

4.7.2 Produção de hifas/pseudohifas e clamidoconídeos ... 41

4.7.3 Fermentação de carboidratos (Zimograma) ... 42

4.7.4 Assimilação de carboidratos (Auxonograma) ... 42

4.7.5 Testes de crescimento à temperatura de 45oC ... 45

4.8 Testes de susceptibilidade aos antifúngicos ... 45

4.9 Análise estatística ... 47 5 RESULTADOS ... 48 5.1 Gênero Candida ... 48 6 DISCUSSÃO ... 54 7 CONCLUSÕES ... 61 8 REFERÊNCIAS ... 62 ANEXOS ... 76 APÊNDICES ... 80 ABSTRACT ... 83

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1 INTRODUÇÃO

A hanseníase é considerada ainda na atualidade uma questão de saúde pública, considerando-se que seus índices são alarmantes chegando a 2,4 milhões de casos no mundo47, 55. As localidades com maior prevalência em 2002 foram a Ásia, África e América do Sul88. Em 2003, o Brasil ocupava o segundo lugar no mundo em número de casos (após a Índia) e o primeiro das Américas com 13% dos casos*.

Segundo o Ministério da Saúde, a hanseníase é uma doença endêmica que tem apresentado redução significativa de sua prevalência, de 19 por 10.000 habitantes em 1985 para 1,48 por 10.000 habitantes em 200511. No entanto, a redução do coeficiente de prevalência da doença no país está relacionada principalmente à diminuição observada nas regiões Sul e Sudeste, sendo que algumas áreas ainda apresentam um padrão de alta endemicidade.

Os primeiros relatos da hanseníase no Brasil são do período colonial, sendo que em 1904, foi introduzida a notificação compulsória para esta doença71. A década de 80 foi marcante no tratamento da hanseníase no Brasil com a adoção da poliquimioterapia (PQT) composta por rifampicina, dapsona e clofazimina21.

As formas de hanseníase podem estar associadas a doenças orofaciais, porém a maioria das lesões bucais é registrada nos pacientes com a forma lepromatosa26,54. As lesões faciais incluem lesões granulomatosas na pele e anexos cutâneos, particularmente nos nervos

*

Moreira TA. A panorama of Hansen’s disease: present status and perspectives. Hist Cienc Saúde-Manguinhos [periódico na internet] citado em 12-jun.2005. 2003; 10 (supl.1):[aproximadamente 16p.]. Disponível em: http://.../scielo.php

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facial e trigêmio26,56. Lesões bucais podem incluir extensas perdas teciduais podendo levar a perfurações palatinas e envolvimento periodontal26.

Nunez-Marti et al.44 após análise de índices CPOD e periodontal de pacientes hansenianos concluíram que estes apresentavam tendência à saúde bucal mais precária em relação a indivíduos controle independente da presença de lesões faciais e tipo de hanseníase.

Superinfecções são infecções que dificultam o tratamento de um processo já existente, podendo representar complicação de uma terapia antimicrobiana, que alterou a microbiota residente, causando aumento do número de patógenos residentes prejudiciais ou oportunistas83. Terapias com fármacos, assim como antimicrobianos e agentes imunossupressores, fatores nutricionais e diminuição do fluxo salivar são considerados fatores predisponentes29.

Estudos sobre a microbiota de pacientes com hanseníase são escassos na literatura. Sharma et al.75 não encontraram diferenças significativas na microbiota aeróbica da pele de pacientes com hanseníase e indivíduos controle. Reichart et al.55 relataram a presença aumentada de Candida krusei na cavidade bucal de pacientes hansenianos. Segundo os autores, este resultado tem grande importância clínica considerando-se que C. krusei é uma espécie que apresenta resistência intrínseca ao fluconazol o que pode representar um sério entrave terapêutico especialmente em casos de candidose sistêmica. Estudos sobre a função de neutrófilos polimorfonucleares de pacientes com hanseníase demonstraram que estas células apresentaram atividade anti-Candida semelhante a células provenientes de indivíduos controle22,52.

Considerando-se a emergência de cepas resistentes aos antifúngicos. Desta forma, testes de susceptibilidade in vitro tornaram-se muito importantes, agindo como um guia na seleção e controle de terapia

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antifúngica. Com este intuito, o Comitê Nacional de Padronização Laboratorial – Comiteé for Clinical Laboratory Standards (NCCLS42) – 1997, propôs um método de referência de testes de susceptibilidade a antifúngicos para fungos usando diluições seriadas27.

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2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Hanseníase

A hanseníase é conhecida desde a mais remota antiguidade como lepra e ainda hoje causa temor provavelmente pela sua origem nas referências bíblicas e históricas. Pacientes com lepra portavam sinos para serem evitados e foram rigidamente excluídos da sociedade, durante a Idade Média82.

Os primeiros relatos da doença no Brasil são do período colonial. Em 1904, Oswaldo Cruz introduziu a notificação compulsória e apoiou o isolamento de pacientes na Ilha Grande, Estado do Rio de Janeiro. Nas primeiras duas décadas prevaleceu a política de segregação compulsória seguida da implementação de leprosários, dispensários e preventórios (para abrigar filhos dos pacientes isolados) em cada Estado71.

Em 1940, a segregação passou a ser criticada, pois se observou que nos países desenvolvidos a eliminação de tal medida não representava perigo ao controle da endemia36. Nos anos 70 foi adotado o neologismo hanseníase (somente no Brasil), introduzido pelo Ministério da Saúde com o intuito de diminuir o estigma causado pela doença45. No entanto, até a atualidade, estudiosos do assunto questionam a eficácia desta medida.

A década de 80 foi marcante no tratamento da hanseníase no Brasil com a adoção da poliquimioterapia composta por rifampicina, dapsona e clofazidima21, causando marcante redução da prevalência da doença36. Constatou-se que com a instauração desta terapia, em curto período de tempo os pacientes tornavam-se não transmissores, não

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havendo mais a necessidade do isolamento social21. A partir desse momento, o tratamento passou a ser ambulatorial preservando-se o convívio familiar, permitindo ao paciente levar uma vida normal dentro da comunidade. Ebenezer et al.19, ressaltaram a necessidade de acompanhamento do paciente hanseniano por dez anos para certificar-se que não tenha recidiva. Atualmente, a hanseníase é considerada pouco transmissível (resistência natural em 95% da população), facilmente diagnosticável, curável e de bom prognostico se for realizado tratamento precoce e adequado21.

O Movimento de Reintegração do Hanseniano - MORHAN, entidade sem fins lucrativos fundada em 1981, constitui-se de pacientes e pessoas interessadas no combate à hanseníase no Brasil e no mundo, tem por finalidade promover medidas educativas que visem a prevenção, diagnóstico precoce, tratamento, reabilitação, informação e conscientização do portador de hanseníase, sua família e sociedade, objetivando a sua mais completa reintegração social.*

A hanseníase é considerada ainda na atualidade uma questão de saúde pública mundial, considerando-se que seus índices são alarmantes chegando a 2,4 milhões de casos no mundo47,55. Atualmente, o Brasil ocupa o segundo lugar em número de casos (após a Índia) e o primeiro das Américas com 13% dos casos. Em nosso país são diagnosticados 220 a 250 pacientes novos ao ano**.

A meta proposta pela Organização Mundial de Saúde era de erradicação da hanseníase até 2005. Durante os últimos 4 anos, o número global de casos detectados tem continuado a cair em torno de 20% ao ano. Entretanto, bolsões de alta endemicidade ainda são encontrados em algumas áreas da Angola, Madagascar, Moçambique, Nepal, Tanzânia e Brasil87. Verifica-se que esta meta não é plausível para

*

... de acordo com Movimento de Reintegração do Hanseniano (MORHAN). Carta aberta à população [texto na internet] citado em 27-fev.2007. disponível em

http://www.dhnet.org.br/mndh/encontros/ivencontronacionaldh/anexos/5_carta... **

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a realidade do nosso país porque embora na região Sul já se observe redução drástica do número de casos, nas regiões norte e centro-oeste esta doença pode ser considerada hiperendêmica*. Apesar da redução na taxa de prevalência observada no período compreendido entre 1985 e 2005 de 19 para 1,48 doentes em cada 10.000 habitantes11, a hanseníase ainda constitui um problema de saúde pública no Brasil, o que exige um plano de aceleração e de intensificação das ações de eliminação e de vigilância resolutiva e contínua. O Programa Nacional de Eliminação da Hanseníase (PNEH) estabeleceu, em 2004, o redirecionamento da política de eliminação da doença enquanto problema de saúde pública e da atenção à hanseníase no Brasil. O plano estratégico para eliminação da hanseníase 2006-2010 está baseado no princípio de sustentabilidade proposto pela OMS. A hanseníase se manifesta com maior freqüência nas áreas subdesenvolvidas, pois está relacionada com o nível de vida da população12. A meta é alcançar baixos níveis endêmicos dessa doença, investindo no diagnóstico precoce e no tratamento adequado assegurando assistência aos doentes de hanseníase, suas complicações e seqüelas, que deverá ser oferecida em todos os níveis de complexidade da rede de serviço do SUS, conforme a necessidade de cada caso. A meta é atingir a prevalência de menos de um caso por cada 10.000 habitantes12.

A hanseníase teve isolado e identificado o seu agente etiológico, Mycobacterium leprae em 1873, por Gerhard Hansen (Noruega). Foi o primeiro microorganismo a ser associado a uma doença infecciosa47. M. leprae pertence à ordem dos Actinomycetales, família dos Mycobacteriaceae até hoje não pode ser cultivado in vitro, por apresentar muitas exigências de cultivo. Bastonete aeróbico, não formador de esporo, com eventual crescimento filamentoso semelhante ao dos fungos, de onde se origina o prefixo “myco”. As características álcool-ácido-resistentes, resistência a antimicrobianos e sua patogenicidade estão

*

(21)

relacionados com sua parede celular distinta. Porém, a camada externa de lipopolissacarideos e substituída por ácido micólico, que forma uma camada cérea, resistente a água permitindo uma maior resistência a situações adversas, ressecamento e alguns antimicrobianos. Estima-se um período de crescimento muito longo, cerca de 12 dias.

M. leprae provavelmente é a única bactéria que cresce no sistema nervoso periférico e que infecta as células de Schwann, também se desenvolve nas células da pele e mucosas. M. leprae apresenta preferência pelas extremidades (dedos, nariz, lobo da orelha), provavelmente por serem regiões de temperatura mais baixa84. A hanseníase é de evolução crônica, exclusivamente humana*, transmitida de uma pessoa doente que não esteja em tratamento para outra sadia, principalmente pela respiração durante o convívio familiar. Afeta principalmente pele, nervos periféricos e mucosas. Sua evolução depende basicamente da resposta imune celular do indivíduo. As manifestações clínicas estão relacionadas com a proliferação bacteriana, resposta imunológica e a neurite periférica causada por ambos.

Na hanseníase predominam dois pólos, de um lado há um crescimento exacerbado do bacilo com resposta imune ineficaz, caracterizando-se clinicamente como forma Virshowiana, lepromatosa ou multibacilar (com grande quantidade de bacilos) considerada grave e destrutiva, responsável pelo contágio. No outro extremo, associada a uma resposta imune eficiente, está a forma tuberculóide, paucibacilar (assim chamada devido aos poucos bacilos encontrados nesta forma) ou neural, onde há controle do microorganismo, não há disseminação da doença. Formas intermediárias são registradas, porém tendem a evoluir para um pólo ou outro.

A classificação da Moléstia de Hansen é baseada nas suas formas clínicas e na resistência imunológica individual. Do ponto de

*

Sarno EM. Hansen’s disease in the laboratory. Hist Cienc Saúde – Manguinhos

[periódico na internet] citado em 12-jun.2005. 2003; 10 (supl.1):[aproximadamente 12p.].

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vista operacional, para fins de tratamento poliquimioterápico, a doença pode ser classificada em: paucibacilar, casos com até 5 lesões de pele e multibacilar, com mais de 5 lesões10,12,46. Clinicamente, a doença pode se apresentar na forma indeterminada, tuberculóide, virshowiana e dimorfa. A forma indeterminada caracteriza-se por manchas esbranquiçadas na pele, com limites imprecisos e alteração de sensibilidade. Na forma virshowiana ou lepromatosa, células cutâneas são infectadas e nódulos desfigurantes se formam pelo corpo todo, com conseqüente deformação da mão “em garra” e destruição dos tecidos. No outro extremo, encontra-se a forma tuberculóide ou neural, onde não há disencontra-seminação da doença, embora haja lesões neurológicas; regiões da pele perdem a sensibilidade. A forma dimorfa, clinicamente, oscila entre as manifestações da forma tuberculóide e as da forma virshowiana, o comprometimento neurológico troncular e os episódios reacionais são freqüentes, dando a esse paciente alto risco de desenvolver incapacidades e deformidades físicas. Formas intermediárias são registradas, porém tendem a evoluir para um pólo ou outro10.

A partir do contato com o paciente portador da forma Virshowiana, que dissemina grandes quantidades de bacilo em suas secreções nasais e exsudatos de suas lesões, a incubação ocorre por 2 a 4 anos. Evolui para a forma indeterminada representada por poucas lesões hipopigmentadas na pele que pode evoluir para a cura em 75% dos casos, graças à resposta imune do indivíduo ou para as formas avançadas da doença.

O diagnóstico é inicialmente dado pela clínica e confirmado com presença do bacilo pela coloração de Ziehl-Neelsen. No caso da forma tuberculóide, o bacilo é raramente encontrado e a confirmação é dada pela característica histológica da lesão que é bem delimitada e profundamente anestésica47. A reação de Mitsuda também auxilia no diagnóstico; a forma lepromatosa (Virshowiana) é Mitsuda negativo e a forma tuberculóide Mitsuda positivo.

(23)

A poliquimioterapia preconizada pela Organização Mundial de Saúde é constituída pelo conjunto dos medicamentos rifampicina, dapsona e clofazimina, com administração associada. Essa associação evita a resistência medicamentosa do bacilo que ocorre com freqüência quando se utiliza apenas um medicamento, impossibilitando a cura da doença. É administrada através de esquema-padrão, de acordo com a classificação operacional do doente em Pauci ou Multibacilar. É considerada uma pessoa de alta, por cura, aquela que completa o tratamento PQT nos seguintes prazos:

a) esquema Paucibacilar (PB): pacientes com até 5 lesões de pele: rifampicina – uma dose mensal de 600mg (2 cápsulas de 300 mg) com administração supervisionada, dapsona – uma dose mensal de 100 mg supervisionada e uma dose diária auto-administrada. A duração do tratamento é de 6 doses mensais supervisionadas de rifampicina e o critério de alta é de 6 doses supervisionadas em até 9 meses9; b) esquema Multibacilar (MB) – Pacientes com mais de 5

lesões de pele: rifampicina – uma dose mensal de 600 mg (2 cápsulas de 300 mg) com administração supervisionada, clofazimina – uma dose mensal de 300 mg (3 cápsulas de 100 mg) com administração supervisionada e uma dose diária auto-administrada. A duração do tratamento é de 12 doses mensais supervisionadas de rifampicina e o critério de alta é de 12 doses supervisionadas em até 18 meses. O bacilo torna-se inviável após o início do tratamento, não sendo mais transmissível e interrompendo a cadeia epidemiológica9.

O paciente que completa o tratamento PQT não deve mais ser considerado como um caso de hanseníase, mesmo que

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permaneça com alguma seqüela da doença. Deverá continuar sendo assistido pelos profissionais da Unidade de Saúde, especialmente nos casos de intercorrências pós-alta como reações e monitoramento neural. Em casos de reações pós-alta, o tratamento não deverá ser reiniciado9. A PQT destrói o bacilo tornando-o inviável, evita a evolução da doença, prevenindo as incapacidades e deformidades causadas por ela, levando à cura. O bacilo destruído é incapaz de infectar outras pessoas, rompendo a cadeia epidemiológica da doença. Desta forma, logo no início do tratamento, a transmissão da doença é interrompida, e sendo realizada de forma completa e correta, garante a cura9. Reichart et al.55, relataram diminuição drástica de casos no norte da Tailândia após ter sido adotada a PQT.

O estudo da baciloscopia positiva em material de mucosa bucal aparentemente sã já foi referido em 1939 por autores que, ao examinarem 456 pacientes virshowianos e de outras formas clínicas, encontraram uma freqüência geral nos virshowianos, de 19,1% de lesões na cavidade bucal, sendo 2,09% nos lábios, 1,4% na língua, 11,7% no palato duro, 5,9% no palato mole e 3,2 na úvula70. Lesões bucais na hanseníase só ocorrem na forma lepromatosa, inexistindo na forma tuberculóide, a não ser através de comprometimento nervoso26,55,72, afirmaram que o envolvimento da cavidade oral ocorre em 19% a 60% dos pacientes multibacilares, sendo as estruturas mais afetadas, o palato mole e duro, língua e gengiva. Trabalhos relativos ao tema são poucos, no entanto, há algumas décadas tem sido relatada a importância deste estudo na Odontologia. No Brasil, onde a hanseníase ainda é endêmica e sua prevalência atinge níveis bastante significativos, torna-se importante para o cirurgião-dentista o estudo das manifestações leprológicas na cavidade bucal, para que se possa dar diagnóstico, tratamento e aconselhamento sobre doenças infecciosas35.

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2.2 Gênero Candida

2.2.1 Características gerais e fatores de virulência

São conhecidas atualmente cerca de 200 espécies de Candida, classificadas como fungos imperfeitos da casse Deuteromycetes devido à inabilidade do gênero em apresentar formas sexuadas. Pertence à família Cryptococcaceae, subfamília Candidoideae, que compreende as principais leveduras patogênicas ao ser humano15,32,34,64. São organismos unicelulares e eucariotos34. Morfologicamente, em meio sólido ágar Sabouraud dextrose, apresentam-se como colônias úmidas, cremosas com aspectos liso ou rugoso e coloração branca amarelada. Microscopicamente, são células globosas ou ovaladas. A principal espécie de interesse clínico é C. albicans, seguida por C. tropicalis e C. glabrata, que juntas somam cerca de 80% do isolamento em candidoses, seguidas por C. parapsilosis, C. stellatoidea, C. guilliermondii, C. krusei e C. kefyr32,66. C. stellatoidea é diferenciada de C. albicans por sua inabilidade em assimilar sacarose64. C. stellatoidea tem sido considerada como uma variante sacarose negativa de C. albicans. Espécies de Candida são distintas entre as demais pela sua capacidade de formar pseudohifa, C. glabrata é a única exceção32,34,64. C. dubliniensis apresenta muitas semelhanças fenotípicas com C. albicans. Técnicas de biologia molecular permitiram a diferenciação genética e a descrição dessa nova espécie32.

Leveduras do gênero Candida fazem parte da microbiota residente do organismo15,34,57,64. O aumento no número de leveduras do gênero Candida provoca um desequilíbrio pela competição e inibição da microbiota endógena estabelecendo o quadro de candidose. Assim, alterações da microbiota associadas a doenças sistêmicas como o diabetes mellitus, o uso de medicamentos como corticosteróides e antibióticos, podem significar uma predisposição à candidose66. Alterações sistêmicas podem provocar o desequilíbrio da microbiota

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residente provocando um aumento exacerbado no número destes fungos, instigando seus fatores de virulência57. Hipócrates em 460 a 337 a.C. descreveu placas esbranquiçadas presentes na cavidade bucal de recém nascidos e pacientes debilitados, sugestivas de candidose15.

A incidência de candidoses tem aumentado nas últimas décadas relacionada ao uso indiscriminado de antibióticos, fármacos antifúngicos, imunossupressores e algumas doenças infecciosas, como AIDS27,38.

A presença crescente de infecções de Candida em ambiente hospitalar passou a ganhar importância a partir da década de 80, resultando do progresso da medicina com o surgimento de procedimentos invasivos, quebrando barreiras de proteção natural, uso intensivo de antibióticos de amplo espectro e a capacidade de sustentar a vida de pessoas muito debilitadas e susceptíveis a microrganismos oportunistas15. Assim, aumentou o número de casos de cepas de Candida envolvidas em doenças humanas, fazendo deste fungo um dos mais relevantes associados a doenças, principalmente em pacientes imunocomprometidos. Candida spp. tornou-se então um dos gêneros mais importantes de toda a área biológica principalmente pela capacidade intrínseca desta levedura como agente infeccioso, através de sua alta capacidade de aderência tecidual, tolerância à grande variação de pH e produção de exoenzimas57. Candida spp. é freqüentemente apontada como a quarta mais comum causa de infecções nosocomiais nos Estados Unidos, com um coeficiente de mortalidade de 40 a 60%48.

Estudos recentes têm demonstrado um crescente aumento de infecções com outras espécies além de C. albicans, como por C. krusei, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata e C. guilliermondii, em pacientes imunocomprometidos ou indivíduos saudáveis66,74,85. C. krusei tem sido relatado como um patógeno oportunista emergente que pode causar danos especialmente em pacientes imunocomprometidos64.

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Diferenças inter e intra-espécies indicam que esta característica entre outras podem determinar a hierarquia de virulência entre as espécies65.

Os principais fatores chamados de virulência de leveduras do gênero Candida são a aderência, o dimorfismo, variabilidade fenotípica, a produção de toxinas e enzimas34.

A capacidade de aderência é relacionada às características químicas (manoproteínas) e estruturais da parede celular (capa fibrilar), e receptores protéicos da superfície celular das mucosas. Temperatura, pH, nutrientes, Iga secretora e hidrofobicidade superficial celular também influenciam a aderência. A formação de pseudohifas e a rapidez com que pode variar sua morfologia também são características do seu alto grau de infecciosidade34,57.

As adesinas específicas de C. albicans têm sido bem estudadas, bem como os receptores celulares sobre as quais estas atuam. As adesinas compreendem manoproteínas, quitina, glucana, enquanto os receptores celulares incluem fucose, manose, N-acetil-glucosamina e mucinas34. Aderência às superfícies do hospedeiro é um pré-requisito na patogênese de muitas infecções microbianas66. Estudos realizados por Nikawa et al.43, demonstraram que C. albicans exibiu maior capacidade de aderência às células do epitélio gengival provavelmente devido à formação de tubo germinativo, seguido por C. tropicalis e C. glabrata que apresentou o menor grau de adesão.

Leveduras do gênero Candida com o desenvolvimento de micélios propiciam as infecções fúngicas em decorrência da grande variação antigênica, levando a maior aderência e dificultando a ação fagocitária do sistema imune. Estes microrganismos também têm a capacidade de emitir grandes filamentos invasivos aos tecidos de acordo com a maior oferta de nutrientes nestas regiões (tigmotropismo)57.

Alterações morfológicas e das propriedades de superfície celular das colônias, devido à alta freqüência e reversibilidade presenciadas nas leveduras do gênero Candida, levam também a

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mudanças na sensibilidade a fármacos antifúngicos. Leveduras do gênero Candida produzem substâncias tóxicas (toxicoglicoproteinas e canditoxinas) durante o processo infeccioso, que induzem, em determinadas doses, a morte de animais de laboratório, provando a sua importância como elemento de mecanismo de infecção fúngica57.

Exoenzimas proteinases e fosfolipases são importantes fatores de virulência das leveduras do gênero Candida7, desempenhando um importante papel na etiopatologia de candidoses62.

A produção das exoenzimas aspartil proteinases é mecanismo de virulência relacionado à capacidade de induzir a infecção pela penetração de tubos germinativos no tecido parasitado34. É possível que a proteinase da C. albicans possa colaborar na invasão fúngica, facilitando ao mesmo tempo a ativação de linfócitos na produção de anticorpos específicos34. As fosfolipases são importantes na ação infecciosa de C. albicans, pela sua participação no controle do crescimento do fungo, decorrente da sua presença nas extremidades do micélio e atuação lipídeos da estrutura celular da superfície da mucosa infectada8,57. Inibidores presentes na saliva, imunoglobulina A, inibição da aderência fúngica e imunodepressão favorecem uma maior patogenicidade, especialmente de C. albicans, assim permitindo a manifestação clínica7.

Shimizu et al.76 não encontraram diferenças na produção de enzimas entre cepas isoladas de C. albicans de saliva portadores assintomáticos e pacientes com candidose. A maioria das cepas de C. albicans (73%) era produtora de hialuronidase, condroitin sulfatase, proteinase e fosfolipase. As cepas que produziram as enzimas testadas foram altamente virulentas, enquanto as cepas que falharam na produção de algumas das enzimas foram menos virulentas. Os autores concluíram que quando a cepa perde a capacidade de produzir hialuronidase e condroitin sulfatase ou proteinase e fosfolipase, tornam-se avirulentas. Quando uma cepa perde a capacidade de produzir proteinase torna-se

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menos virulenta do que quando perde a capacidade de produzir fosfolipase14.

2.2.2 Gênero Candida na cavidade bucal

Leveduras do gênero Candida são fungos presentes na microbiota da pele e mucosa do homem e são detectadas logo após o nascimento na cavidade bucal do recém nascido e 2 a 3 semanas depois em todo o trato gastrointestinal57. Estão presentes como comensais na microbiota bucal normal, sendo C. albicans a espécie prevalente6,20,67. Isolamento freqüente de C. albicans tem sido reportado em alguns estudos com crianças, onde essa espécie é o microrganismo prevalente na cavidade bucal e esôfago7. Colonizam primariamente a língua e posteriormente mucosa, elementos dentários, biofilme supra gengival, saliva e bolsas periodontais20,32,53,78. A presença de leveduras do gênero Candida na cavidade bucal humana, pode estar relacionada, em determinadas situações, à doença bucal ou sistêmica39. Estudos in vitro demonstraram uma maior incidência de C. albicans posterior a antibioticoterapia, possivelmente atribuída à diminuição da flora bacteriana73. Leveduras foram descritas como superinfectantes em periodontites17,23, e os autores afirmaram que a presença de patógenos potenciais, como Candida, deve ser considerada, especialmente em pacientes com desordens sistêmicas como diabetes mellitus, neutropenia, agranulocitose ou AIDS.

Fatores nutricionais, equilíbrio com a microbiota bacteriana endógena, anticorpos específicos na saliva, doenças sistêmicas, fatores de virulência da levedura, fatores predisponentes do hospedeiro como grau de debilidade e alterações nas células de defesa predispõem a colonização e infecção por espécies de Candida20,32. Constantemente citados na literatura são os fatores sistêmicos como uso de antibióticos de

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amplo espectro, corticosteróides, terapia citotóxica, desnutrição, imunossupressão e diabetes mellitus5,29,28,33,58,77. Considera-se que o diabetes mellitus pode ser considerada como uma variável adicional que pode influenciar não somente a candidose, mas também a potencialização de Candida spp. nos seus fatores de virulência.

A cavidade bucal é um sistema ecológico de crescimento aberto, microrganismos são constantemente introduzidos e removidos deste sistema e o desequilíbrio pode ocorrer na vigência de doenças sistêmicas e durante o tratamento destas29. Estudos mostram que infecções por leveduras do gênero Candida, normalmente não encontrados de forma significativa na cavidade bucal de indivíduos saudáveis estão frequentemente associados à vigência de doença sistêmica29,61, devido à redução da resistência normal da mucosa bucal.

Leveduras do gênero Candida estão relacionados entre os patógenos mais oportunistas conhecidos, já que a presença de fatores predisponentes sistêmicos e ou locais são estritamente necessários para a patogenia das infecções bucais20,86. A prevalência de leveduras do gênero Candida em cavidade bucal de indivíduos saudáveis varia de 3 a 48%, a média foi de 34,4% para todos os fungos e 17% apenas para C. albicans63.

Entre os fatores predisponentes locais estão a presença de próteses e aparelhos ortodônticos, higiene e respiração bucal inadequadas, dieta, xerostomia e fumo5,18,30,31,41,79. A qualidade e a quantidade de saliva desempenham um papel crítico importante na modulação da população celular da cavidade bucal. Da mesma forma, o fumo pode levar a alterações no epitélio bucal permitindo a colonização por Candida spp.63.

Candidose oral é uma infecção oportunista com alto poder de invasão50associada a alterações locais e mecanismos de defesa em diversas patologias tendo aumentado em número expressivo nos últimos anos60. Dahlén17 relatou que a presença de Candida na cavidade oral de

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pacientes debilitados por uso de quimioterápicos ou antimicrobianos pode predispor graves infecções sistêmicas. Embora C. albicans seja o patógeno humano mais comum dos fungos, outra espécie de C. krusei é reconhecida como agente emergente, especialmente em paciente com hanseníase55.

A relativa incidência de infecções bucais causadas por C. albicans tem diminuído recentemente com o aumento de incidência de infecções causadas por outras espécies menos virulentas espécies de Candida, como C. glabrata, C. tropicalis e C. krusei. Por outro lado, uma nova espécie C. dubliniensis surgiu também como causador de infecções bucais, principalmente em pacientes HIV positivos74.

Poucos são os estudos que analisaram a influência da poliquimioterapia prescrita em casos de hanseníase sobre a microbiota bucal. Reichart et al.55 relataram a presença aumentada de C. krusei em pacientes hansenianos. Reservatórios bucais de microrganismos podem causar doenças e comprometer a vida de pacientes debilitados ou imunocomprometidos, podendo causar infecções sistêmicas, uma vez que a cavidade oral representa uma porta de entrada para estas infecções39.

2.3 Susceptibilidade aos antifúngicos

O uso indiscriminado de antifúngicos adotados para tratar e prevenir a ocorrência de candidose bucal em pacientes HIV positivos tem sido relatado como um importante fator na seleção de espécies não-albicans como patógenos oportunistas, já que os mesmos possuem susceptibilidade aos antifúngicos diferente de C. albicans48,74.

Sandvén et al.69 e Alves et al.2 relataram um crescente aumento de infecções graves causadas por fungos, assim como infecções causadas por fungos comensais que com o passar dos anos passaram a ser patogênicos. Algumas destas espécies pouco comuns são resistentes

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aos antifúngicos. Isolados de espécies de Candida diferem muito em sua habilidade de causar infecção e também na sua susceptibilidade aos agentes antifúngicos2.

O surgimento de cepas de Candida resistentes aos fármacos e relacionadas a casos de candidose potencialmente fatal tem destacado a necessidade de métodos confiáveis de isolamento e identificação de Candida85. C. albicans ainda representa a espécie mais freqüentemente isolada destas infecções, no entanto, outras espécies como C. parapsilosis, C. tropicalis, C. krusei e C. glabrata têm tido significativo aumento. A menor susceptibilidade de C. krusei e C. glabrata ao fluconazol é uma das implicações terapêuticas importantes neste contexto2,16,74.

A emergência de C. dubliniensis tem sido atribuída à importante redução da imunidade e/ou à terapêutica antifúngica que pode ter selecionado espécies menos sensíveis como C. krusei, C. glabrata e C. dubliniensis. Apesar desta possibilidade, os estudos de susceptibilidade de C. dubliniensis têm revelado que a grande maioria dos isolados é inicialmente sensível ao fluconazol e à anfotericina B, embora 3% dos isolados tenham sido inicialmente resistentes ao fluconazol2.

Leveduras do gênero Candida assim, como seu hospedeiro humano, são eucariotos o que leva as drogas antifúngicas a serem em sua maioria de baixa toxicidade seletiva. Este fato leva a uma grande restrição no tratamento antifúngico com fármacos eficientes, da mesma forma, compromete ainda mais a situação debilitante de pacientes imunocomprometidos. O sucesso do tratamento antifúngico parece estar relacionado à precocidade do diagnóstico, assim como o estado imunológico do paciente, pois a depressão do sistema imune pode não responder satisfatoriamente ao tratamento independente das propriedades do antifúngico utilizado, assim como terapêutica induzida tardiamente57.

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Candidoses são freqüentemente tratadas com anfotericina B, no entanto, sua formulação endovenosa tem limitado seu uso devido à alta toxicidade hepática, frequentemente associada com disfunção renal4,57. Atua sobre o ergosterol (principal esterol da membrana plasmática do fungo, que por sua vez é análogo ao colesterol das células humanas), causando prejuízo à sua função como barreira e perda dos seus constituintes celulares. Anfotericina B tem um largo espectro de ação que abrange a maioria dos fungos patogênicos ao homem, embora já tenham sido reportadas ocasionais cepas resistentes a este fármaco. Apesar da anfotericina B, ser um dos antifúngicos mais antigos ao seu emprego restringir-se quase que exclusivamente à administração sistêmica, ainda hoje, é considerada a droga de referência para o tratamento da maioria das infecções fúngicas15. É uma substância fungicida isolada de cepas de Streptomyces nodosus. O fármaco não é absorvido pelo trato gastrintestinal e deve ser administrada por via intravenosa4,15.

Com a introdução dos azóis, que possuem uma bioviabilidade oral e uma baixa incidência de efeitos colaterais, uma nova era no tratamento de infecções de fungos foi iniciada. No entanto, com o passar dos anos, a resistência das várias espécies de Candida aos agentes antifúngicos determinou a diminuição da resposta a esta terapia15. A descoberta de atividade antifúngica de componentes azólicos representou um importante avanço no tratamento de infecções fúngicas superficiais e sistêmicas, já que estes são considerados menos tóxicos que a anfotericina B, exibem um largo espectro de atividade e alguns deles podem ser ministrados por via oral para exercer ação sistêmica, tendo ampla aplicação na micologia médica4.

Cetoconazol e fluconazol têm sido usados com sucesso em algumas condições clínicas27. Efeitos colaterais menos danosos e de mais fácil administração tem tornado as drogas azólicas mais atrativas. Sua propriedade fungistática é devida às mudanças na permeabilidade na

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membrana citoplasmática do fungo63. Compostos azólicos agem na síntese da membrana celular de fungos, inibem a formação de tubo germinativo, reduzindo a aderência às células do epitélio bucal27.

Cetoconazol é o primeiro dos agentes imidazóis capaz de atingir níveis terapêuticos no sangue quando administrado oralmente. É usado no tratamento de pacientes imunocomprometidos, mas seus efeitos adversos incluindo náusea e hepatotoxicidade tem restringido seu uso63. O cetoconazol é um imidazol aprovado com antifúngico sistêmico em 1981. Atua inibindo os esteróis da membrana celular, porém difere do miconazol por ser bem absorvido pelo trato gastrintestinal. O cetoconazol possui uma excelente ação in vitro e in vivo contra a maioria das espécies de Candida15.

Fluconazol age pela inibição do ergosterol produzido pelo fungo, essencial na formação de sua parede celular63. A aderência de leveduras do gênero Candida às células epiteliais é amplamente reconhecida como um passo essencial no processo de colonização e subseqüente infecção e é também significantemente inibida pelo fluconazol. Devido às altas concentrações de fluconazol na saliva, acredita-se que o mesmo pode interferir com a síntese das estruturas dos receptores de Candida nas células epiteliais bucais. Fluconazol administrado oralmente tem sido geralmente bem tolerado63. O uso prolongado e contínuo de compostos azólicos na prevenção de infecções fúngicas sistêmicas, são relacionados à seleção de isolados resistentes a esta terapia57. O fluconazol apresenta alta eficácia contra espécies de Candida e vários outros fungos, e apresenta a melhor farmacocinética entre todos os antifúngicos estudados15.

Além destes fármacos, cabe ressaltar ainda, entre as drogas disponíveis ao tratamento de candidose, as drogas pirimidínicas, representadas pela 5-fluorocitosina57. A fluorocitosina foi descoberta em 1957 e usada no tratamento de candidemia desde 196815. Este fármaco que interfere com a síntese de ácido nucléico das células fúngicas pode

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ser usado como terapia oral para infecções sistêmicas fúngicas. A vantagem da fluorocitosina sobre a anfotericina B é a sua excelente absorção gastrintestinal15. A sua toxicidade é devida aos efeitos metabólicos como a disfunção hepática63.

Batista et al.4 relataram que o cetoconazol tem uma boa capacidade fungistática (17 das 19 cepas estudadas foram sensíveis a 4,00 µg/ml. Deve-se considerar que os níveis séricos, alcançados pelos azóicos são em torno de 8,00 µg/ml. Ruhnke et al.59 demonstraram em seus trabalhos que as espécies não-albicans podem desenvolver resistência ao fluconazol em pacientes que são repetidamente expostos ao cetoconazol. Estes autores também relataram que 2 de 15 pacientes que foram previamente expostos ao fluconazol, apresentaram altos resultados de CIM para fluconazol.

Alves et al.1 observaram que entre os isolados não suscetíveis ao fluconazol, a atividade da 5-fluorocitosina foi elevada em C. albicans (84,6%) e C. glabrata (94,1%). Também reportaram outros achados onde entre 234 isolados de C. krusei somente 4% foram suscetíveis a 5FC. Em seu estudo, 40% de C. krusei foram suscetíveis a 5FC. Segundo este autor, o grande potencial de 5FC contra C. glabrata não tem sido suficientemente explorado. Este antifúngico pode ser usado como uma opção terapêutica onde existe resistência aos azóis. Em um estudo de 601 isolados de C. glabrata a susceptibilidade observada foi de 98,5% a 100%.

Apesar do aumento do número de antimicóticos comercialmente disponíveis nos últimos anos, estes ainda se encontram em desvantagem, quando comparados às drogas antibacterianas. Além disso, a resistência aos antifúngicos, tem representado um grande desafio para a clínica. Frente às dificuldades observadas nos tratamentos de micoses em alguns grupos de pacientes, recomenda-se o isolamento do agente responsável pela infecção e a determinação da concentração

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inibitória mínima (CIM) e da concentração fungicida mínima (CFM) das drogas passíveis de utilização15.

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3 PROPOSIÇÃO

Considerando-se que pacientes portadores de hanseníase são submetidos à tratamento poliquimioterápico por longo período e que a maior presença de microrganismos superinfectantes na cavidade bucal destes pacientes pode ser considerado fator de risco para a ocorrência de infecções sistêmicas, a proposta deste estudo foi avaliar a presença de leveduras do gênero Candida na cavidade bucal de pacientes portadores de hanseníase, comparando os resultados com indivíduos controle. Também foi objetivo do estudo analisar a susceptibilidade das cepas isoladas de ambos os grupos aos antifúngicos anfotericina B, fluconazol, 5-fluorocitosina e cetoconazol.

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4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Aspectos éticos

A pesquisa está de acordo com os princípios éticos, seguindo diretrizes e normas regulamentadoras de pesquisa, envolvendo seres humanos, conforme as resoluções 196/96 do Conselho Nacional de Saúde e foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa sob o protocolo 021/2005 PH/CEP (Anexos A e B).

Os indivíduos foram informados a respeito dos objetivos da pesquisa assim como sobre o método de coleta e aqueles que concordaram participar do estudo o fizeram por meio do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Apêndice A).

4.2 Critérios de inclusão

Foram incluídos no presente estudo 38 indivíduos, com idade 10 a 89 anos, diagnosticados clinicamente como portadores de hanseníase multibacilar, confirmados pelo exame baciloscópico que estevam sob poliquimioterapia (PQT) por no mínimo 45 dias, nos serviços ambulatoriais da U.E.S. (Unidade de Especialidades de Saúde) de São José dos Campos, U.R.E. (Unidade de Referências e Especialidades) de Jacareí, Policlínica Municipal de Taubaté e Centro de Saúde II - Dr. Odilon Miranda Souza de Caçapava, todos pertencentes ao Sistema Único de Saúde (SUS). Para o grupo controle, foram selecionados 38 indivíduos sistemicamente saudáveis com perfil semelhante (quanto à idade, sexo e condições bucais), dentre os idosos assistidos no Lar Frederico Ozanan,

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do Lar São Vicente de Paula – Jacareí e os pacientes das clinicas da Faculdade de Odontologia de São José dos Campos – UNESP.

4.3 Critérios de exclusão

Foram excluídos indivíduos diabéticos, fumantes, que estavam sob terapia com medicamentos que pudessem interferir com as condições bucais e que haviam feito tratamento com antifúngicos ou antibióticos (além da PQT) nos últimos 45 dias. Também foram excluídos indivíduos diagnosticados clinicamente como portadores de hanseníase paucibacilar e os portadores de hanseníase multibacilar com uso de poliquimioterapia (PQT) por período inferior a 45 dias.

4.4 Anamnese e exame clínico

Foram avaliados durante a realização da anamnese os dados pessoais, as condições de saúde geral e bucal de todos os indivíduos, a associação dos medicamentos utilizados na poliquimioterapia (PQT) e a dosagem.

4.5 Coleta de amostras

A coleta de material na cavidade bucal foi realizada por meio de 10 ml de solução fisiológica esterilizada (NaCI a 0,85%) tamponada com fosfato (PBS 0,1 M e pH 7,2) contida em um recipiente universal estéril descartável. Os indivíduos realizaram bochecho com a solução durante um minuto, devolvendo em seguida a solução para o mesmo recipiente.

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Os recipientes foram mantidos em uma bolsa térmica com gelo até serem transportados para o laboratório de Microbiologia da Faculdade de Odontologia de São José dos Campos/UNESP, onde foi realizada a pesquisa, respeitando-se o período máximo de 3 horas entre a coleta e o processamento das amostras.

4.6 Processamento das amostras

As amostras de enxágüe bucal foram centrifugadas por 10 minutos, a 8000 Xg e o sobrenadante foi descartado. O depósito foi ressuspendido em 2,5 ml de PBS e misturado em agitador de tubos (Vortex) por 30 segundos, produzindo assim a suspensão de concentração final. Desta suspensão foi semeado 0,1 ml em duplicata em placas de Petri contendo ágar Sabouraud dextrose (Difco, Detroit, USA) acrescido de 01 mg/ml de meio de cloranfenicol (Vixmicina, União Química, Embú-Guaçú, SP) As placas foram incubadas a 37ºC por um período de 48 horas. Quando não houve crescimento nas placas de Sabouraud dextrose com cloranfenicol, estas foram incubadas por mais cinco dias à temperatura ambiente. A alíquota excedente de enxágüe bucal foi esterilizada e descartada.

Após o crescimento, as colônias foram examinadas quanto às características morfológicas (tamanho, forma, superfície) e contadas. Foram realizados esfregaços em lâminas e corados pelo método de Gram para cada colônia com morfologia diferente. Para obtenção de culturas puras foram realizados os seguintes procedimentos: as colônias sugestivas de leveduras foram semeadas em ágar Sabouraud dextrose inclinado e incubadas por 24 horas a 37ºC. Os tubos foram armazenados em geladeira, mantidos por repique trimestral, até posterior identificação.

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4.7 Identificação das amostras de Candida

As culturas obtidas foram identificadas, segundo Sandvén69e Williams, Lewis85, através das seguintes provas:

4.7.1 Formação de tubo germinativo

Foi adicionada uma alçada da cultura de 24 horas da levedura, previamente colocada em banho-maria a 37ºC no período de 2 até 3 horas, em tubo de ensaio (13 x 17 mm) contendo 0,5 ml de soro estéril de coelho. A formação de tubo germinativo foi observada em microscopia de luz colocando-se uma gota de suspensão entre lâmina e lamínula, no período de 2 até 3 horas após a incubação.

4.7.2 Produção de hifas / pseudohifas e clamidoconídeos

Foi utilizado o meio Corn Meal Agar (Difco). Para a verificação de hifas, pseudohifas e clamidoconídeos. O Corn Meal Agar previamente fundido, foi distribuído em lâminas depositadas sobre bastão de vidro em “U”, colocadas no interior de placas de Petri esterilizadas. Após a solidificação do ágar, cada amostra de levedura a ser testada foi semeada em estria única na superfície do meio e colocada uma lamínula no centro da lâmina. Foi adicionado ao fundo de cada placa um pedaço de papel filtro esterilizado e umedecido em água esterilizada, para evitar uma possível dessecação. Este preparado foi incubado por 48 a 72 horas em temperatura ambiente, quando então foi realizada a leitura em microscopia de luz, observando-se a presença de pseudohifas e clamidoconídeos.

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4.7.3 Fermentação de carboidratos (Zimograma)

Para a realização desta prova foi utilizado o caldo vermelho de fenol (Difco) distribuído em tubos de ensaio contendo tubos de Durhan em seu interior e autoclavados a 120ºC por 15 minutos. Foi adicionado cada carboidrato (glicose, maltose, sacarose, galactose e lactose) esterilizado por filtração (Filtro Millipore, GSWP-02500), de forma a se obter uma concentração de 1%. Os tubos foram semeados a partir de uma cultura pura de 24 horas de levedura em ágar Sabouraud dextrose. A leitura foi realizada após 48 horas e uma semana de incubação a 37ºC. A viragem de pH do meio vermelho de fenol para amarelo é indicação de resultado positivo para esta prova assim como a formação de bolhas no interior dos tubos de Durhan.

4.7.4 Assimilação de carboidratos (Auxonograma)

Para a verificação da assimilação de carboidratos pelas amostras de Candida foi utilizado meio mínimo, com constituição conforme o Quadro 1.

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Quadro 1 – Constituição do meio mínimo utilizado para assimilação de carboidratos das amostras de leveduras.

Constituintes Quantidade

Sulfato de amônia (Merck) 5 g

Sulfato ácido de potássio (Sigma) 1 g Sulfato de magnésio (Sigma) 0,5 g

Agar (Difco) 15 g

Água destilada 1000 ml

O meio foi distribuído em tubos de ensaio (20 ml) e autoclavado 120ºC por 15 minutos. Para cada mostra a ser testada, foi feita uma suspensão da levedura com turvação equivalente ao tubo número 10 da escala de Mac Farland, a qual foi semeada em pour plate. A seguir, foi colocado na superfície do meio um disco de papel filtro embebido numa solução de 1% dos seguintes açúcares: glicose, galactose, lactose, maltose, sacarose e rafinose. O crescimento da amostra nas proximidades do açúcar significa que o microrganismo assimilou-o como fonte de carbono. Os resultados obtidos para as provas descritas foram comparados com o Quadro 2 para a identificação da respectiva espécie.

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Quadro 2 – Classific

ação das espécies de

Candida

de acordo com a formação de tubo germinativo (TG), produção de

clamidoconídeos (Clam) e hifas, fermentação e assimilação de carboidratos

(Sandvén, 1990; Williams &

Lewis, 2000). Espécie Cândida TG Clam Hifas Fermentação Assimilação GL S M L GA GL S M L GA C. albicans + + + A/G A/- A/G -/- A/G + + + - + - C. stellatoidea V V + A/G A/- A/G -/- A/G + - + - + - C. guiller mondii - - + A/G A/G -/- -/- A/G + + + - C. glabrata - - - A/G -/- -/- -/- -/- + - - - C. krusei - - + A/G -/- -/- -/- -/- + - - - C. l ipolytic a - - + -/- -/- -/- -/- -/- + - - - C. lusitaniae - - + A/G A/G -/- -/- A/G + + + - + - C. parapsilosis - - + A/G -/- -/- -/- V + + + - + - C. tropicalis - V + A/G A/G A/G -/- V + + + - + - 5 C. kef y r - - + A/G A/G -/- A/G A/G + + - + Gl: glicose; S: sacarose; M:

maltose; L: lactose; GA: galactose; R: rafinose.

A: produ ção de áci do; G: prod ução de gás; ( + ): prova p o sitiva; ( - ): p rova neg

(45)

pelas provas fenotípicas foram semeadas em agar Sabouraud dextrose (Difco) e incubadas à 45ºC por 48 horas. Candida dubliniensis, ao contrário de C. albicans, não se desenvolve ou cresce escassamente a essa temperatura49.

4.8 Testes de susceptibilidade aos antifúngicos

Um total de 22 isolados de C. albicans, 10 isolados de C. tropicalis, 1 isolado de C. lusitaniae de enxágües bucais de pacientes portadores de hanseníase e 20 isolados de C. albicans, 6 isolados de C. tropicalis, 1 isolado de C. kefyr, 1 isolado de C. lusitaniae e 1 isolado de C. glabrata de indivíduos controle foram testados.

Testes de susceptibilidade aos antifúngicos foram realizados pelo método de microtitulação em placas estéreis com 96 micropoços (Difco, Detroit, USA) como descrito por Clinical end Laboratory Standards Institute/CLSI/NCCLS42 (2002. Inicialmente, os isolados foram semeados em agar Sabouraud Dextrose e as placas foram incubadas por 48 h a 37ºC. Depois deste período, 5 colônias maiores que 1 mm de diâmetro foram selecionadas e suspensas em solução salina estéril (NaCl 0,85%), obtendo-se uma concentração inicial de 1-5 x 106 células/ml (0,5 da escala de Mc Farland). Esta suspensão foi diluída em 5 ml de meio RPMI (Sigma, St Louis, MO, USA) tamponado em pH 7,0 com 0,165 M de ácido morfolinopropanesulfônico (MOPS, Sigma, St Louis, USA), obtendo uma concentração final de 0,5 a 1x103a 2,5x103células por ml.

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Os antifúngicos anfotericina B (Sigma Chemical Company, St Louis, MO, USA), fluconazol (Vivência farmácia de manipulação, Pindamonhangaba, SP), cetoconazol (Vivência farmácia de manipulação, Pindamonhangaba, SP) e 5-fluorocitosina (Sigma Chemical Company, St Louis, MO, USA), foram usados para os testes de susceptibilidade. As drogas foram dissolvidas dimetil sulfóxido (Sigma Chemical Company, St Louis, MO, USA) – DMSO e água destilada na concentração de 640 µg/ml obtendo-se a solução inicial. As soluções foram diluídas em meio RPMI e as faixas de concentração final foram de 1,0 a 0,04 µg/ml para anfotericina B, de 32 a 0,02 µg/ml para cetoconazol e de 64 a 0,08 µg/ml para 5-fluorocitosina e fluconazol. Nas placas de microtitulação, 100 µl da suspensão celular foi inoculada a 100 µl das diluições dos fármacos a serem testados. Incluiu-se controle de crescimento de todas as cepas, assim como controle de esterilidade do meio de cultura. Após 24 h de incubação à 37ºC, os títulos foram determinados visualmente pela comparação com o crescimento do controle. Para a anfotericina B, o MIC (Concentração Inibitória Mínima) foi definido onde se observou 100% de inibição de crescimento fúngico. Para o fluconazol, cetoconazol e 5-fluorocitosina, o MIC foi definido onde houve a mais baixa concentração que resultou em 80% de crescimento fúngico.

Os resultados foram expressos com intervalos de variação de mínimos e máximos valores de MIC obtidos por cada espécie de Candida. Os valores de MIC50 e MIC90foram observados. Estes valores representam a concentração do fármaco que inibe o crescimento de 50% e 90% dos isolados, respectivamente. Candida parapsilosis ATCC 22019 foi usado como controle de qualidade para todos os experimentos. Os pontos de leitura considerados para os fármacos testados para a classificação dos isolados como susceptíveis ou resistentes de acordo com os parâmetros que se seguem: < 1 = S, • 2 = R para anfotericina B; < 32 = S, • 64 = R para fluconazol; < 16 = S, • 32 = R para 5-fluorocitosina;

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< 8 = S, • 16 = R para cetoconazol (S=sensível, R=resistente, valores em µg/ml) de acordo com Sutton et al.81.

4.9 Análise estatística

A análise estatística dos resultados obtidos foi realizada comparando os dados referentes à contagem das espécies de Candida estudas para cavidade bucal no grupo hanseníase e no controle (UFC/ml) por ANOVA, teste de Mann-Whitney, com nível de significância 5%.

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5 RESULTADOS

Foram coletadas amostras de 38 indivíduos portadores de hanseníase multibacilar, com idade entre 10 e 89 anos, com média 49,5 anos e desvio padrão 20,3. Destes, 47,4% (n=18) eram do gênero masculino e 52,6% (n=20) do gênero feminino.

A idade dos indivíduos do grupo controle variou entre 11 e 89, com média de 50,9 anos e desvio padrão de 20,3.

Os dados individuais referentes aos pacientes do grupo hanseníase e indivíduos controle estão apresentados no Anexo C.

5.1 Gênero Candida

Vinte e cinco (65,8%) dos pacientes hansenianos estudados foram positivos para leveduras na cavidade bucal. No grupo controle observou-se que 47,4% foram positivos para este microrganismo (Tabela 1).

Tabela 1- Distribuição porcentual de indivíduos positivos e negativos para levedura do gênero Candida nos grupos hanseníase e controle

Hanseníase Controle

N % n %

Positivos 25 65,8 18 47,4

Negativos 13 34,2 20 52,6

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Os dados obtidos para as contagens de leveduras nos grupos estudados estão apresentados na Tabela 2.

Não foi observada diferença estatisticamente significativa entre os valores de UFC/ml obtidos nos grupos hanseníase e controle (p=0,0918).

Tabela 2 - Estatística descritiva dos dados obtidos para os grupos hansenianos e controle (Valores em UFC/ml)

Hansenianos Controle Número 38 38 Mínimo 0,0 0,0 Percentual 25% 0,0 0,0 Mediana 68,8 0,0 Percentual 75% 1722 238 Máximo 50800 16863 Média 2349 798 Desvio padrão 8301 2783

Na Figura 1 estão apresentados os valores de mediana e desvios-padrão de UFC/ml obtidos no grupo hanseníase e controle.

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