INJEÇÃO NÃO CIRÚRGICA DE DNA EXÓGENO EM TESTÍCULOS DE MURINOS
Autor(es):
CAVALCANTI, Paulo Varoni; FRANCO, Adeline Dias; COLLARES, Thaís Farias; FONSECA, Alinca Peres; SILVA, Evelise Sampaio; KAEFER, Cristian; CAMPOS, Vinicius Farias; AMARAL, Marta Gonçalves;
COLLARES, Tiago; DESCHAMPS, João Carlos Apresentador: Paulo Varoni Cavalcanti
Orientador: Ricardo Berteaux Robaldo Revisor 1: Fabiana Seixas
Revisor 2: Antonio Sergio Varella Instituição: UFPel
INJEÇÃO NÃO CIRÚRGICA DE DNA EXÓGENO EM TESTÍCULOS DE MURINOS CAVALCANTI, Paulo Varoni1; FRANCO, Adeline Dias1; COLLARES, Thaís Farias1; FONSECA, Alinca Peres1; SILVA, Evelise Sampaio1; KAEFER, Cristian1; CAMPOS, Vinicius Farias1; AMARAL, Marta Gonçalves1; COLLARES, Tiago1; DESCHAMPS,
João Carlos1 1
Grupo de Pesquisa em Embriologia Molecular e Transgênese Animal – EMTA Laboratório de Biotécnicas da Reprodução
Centro de Biotecnologia – Universidade Federal de Pelotas Campus Universitário s/n Caixa Postal 354 – CEP 96010-900/RS
E-mail: pcavalcanti_fv@ufpel.edu.br
Web: www.ufpel.edu.br/cenbiot/emta
1 INTRODUÇÃO
O uso de camundongos transgênicos tem contribuído de forma significativa no avanço dos conhecimentos em ciências médicas e biológicas. O crescente desenvolvimento biotecnológico voltado para a saúde humana, através da geração de animais transgênicos tem auxiliado no tratamento da diabete, de diversos tipos de câncer, de patologias da coagulação sanguínea dentre outras doenças (Houdebine, 2000; Collares et al.., 2005; Collares & Deschamps apub Collares, 2005).
Ao contrário da microinjeção, que necessita a manipulação individual das células, a transformação genética de um grande número de embriões pode ser obtida coletivamente, em um passo, por SMGT (Sperm Mediated Gene Transfer) (Spadafora, 2002; Lavitrano et al.,1997). Experimentos conduzidos há mais de uma década mostraram que as incubações de espermatozóides isolados, seguida por fertilização in
vitro, originaram camundongos transgênicos, inclusive para mais de um gene inserido (Webster et al., 2005). Os protocolos de SMGT que obtiveram sucesso na geração de animais transgênicos requerem 3 etapas essenciais: ligação, internalização e integração do DNA.
Muitas estratégias têm sido criadas para melhorar estas etapas, com o objetivo de obter eficiência transgênica mais elevada: ICSI (Intracytoplasmic sperm injection) (Yong et al., 2003), REMI (Restriction Enzyme-Mediated Integration), LB-SMGT (Linker
Based Sperm-Mediated Gene Transfer) (Carballada & Esponda, 2001) e TMGT (Testis
Mediated Gene Transfer) (Sato et al., 1999; Sato & Nakamura, 2004; Hibbitt et al., 2005; Shen et al., 2006).
O estudo de funções gênicas em testículos, tem sido grandemente auxiliado pela utilização de camundongos geneticamente modificados, como modelos biológicos à terapia gênica. Camundongos transgênicos foram produzidos com sucesso por monta natural de fêmeas selvagens com machos pré-injetados com DNA exógeno complexado com lipossomas, em testículos (Yonezawa et al., 2001; Sato & Nakamura, 2004; Hickman-Davis & Davis, 2006).
Este estudo teve por objetivo testar distintos transfectantes complexados com DNA exógeno para gerar camundongos transgênicos via TMGT utilizando injeção não cirúrgica em testículos.
2 MATERIAL E MÉTODOS
Cinco grupos de cinco animais tiveram seus testículos injetados com 2,4% DMSO (dimetilsulfóxido), 2,4% DMA (dimetilacetamida), 2,4% Lipofectin Transfection Reagent (Invitrogen®) ou apenas DNA, além de um grupo controle. Os machos receberam uma injeção de 30 µl da solução transfectante em cada testículo. Este procedimento foi repetido cinco vezes seqüenciais, com intervalo de sete dias entre cada aplicação. Vinte e quatro horas após a última injeção, os machos foram colocados para acasalar com uma fêmea por semana, durante quatro semanas.
Uma nova rodada de acasalamento foi realizada um mês após a última injeção testicular.
Os animais nascidos, frutos destes acasalamentos, foram submetidos à excitação da luz ultravioleta para a detecção da GFP, e fragmentos de tecidos foram coletados para posterior análise de PCR e detecção dos transgênicos.
Vetor de DNA
O vetor comercial pEGFP foi utilizado para injetar nos testículos de camundongos balbc. O vetor contém uma região promotora de eucariotos e a seqüência codificadora da proteína verde fluorescente. Esta proteína demonstra uma cor fluorescente quando irradiada com a luz ultravioleta.
Soluções transfectantes
Em ensaios preliminares, notamos que em nossa realidade, um volume máximo de 30 µl por testículo é possível ser injetado. Deste modo, três transfectantes foram testados: 26,6% de DMSO, 26,6% de DMA e 26,6% de lipofectin, contendo 4 µg de pEGFP, 15 µl de corante trypan blue e 3 µl de água Milli-Q. Ainda, um grupo controle recebeu apenas o plasmídeo, o corante e a água nas mesmas concentrações, porém com o volume ajustado para 30 µl. Um segundo grupo controle foi montado utilizando apenas corante e água (15 µl de trypan blue e 15 µl de água).
Metodologia de injeção
Para a injeção testicular não cirúrgica, os animais foram tranqüilizados com 2 mg/kg de acepramazina (Acepran, Vetnil®) por via intraperitonial. Este medicamento apresenta um longo período para atingir seu efeito, por isso, 10 minutos após a tranqüilização foi iniciado o procedimento de injeção.
O ponto chave para alcançar sucesso na injeção não cirúrgica dos testículos nos camundongos está na forma da contenção do animal. Esta é realizada por três passos: posicionamento dos testículos; fixação manual dos testículos; e injeção.
O posicionamento manual dos testículos é feito com suave massagem na região abdominal do animal. Os movimentos devem ser no sentido crânio-caudal, buscando conduzir os testículos para a cavidade escrotal (fig. 9). No momento em que ambos os testículos estiverem posicionados, um pinçamento deve ser feito com as pontas dos dedos para evitar que ocorra uma nova retração testicular (fig. 10). A força aplicada deve ser moderada para que não ocorram lesões teciduais. Neste momento, realizamos uma antissepsia da bolsa escrotal utilizando álcool a 70%. Com os testículos contidos podemos realizar a injeção propriamente dita (fig. 11). O calibre da agulha deve ser o menor possível, para minimizar os danos aos testículos. Utilizamos aqui, seringas ultrafinas (ultrafine, BD Technologies®) descritas para a aplicação de insulina (fig. 11). A introdução da agulha deve ser lateralmente ao comprimento maior do testículo, a uma distância intermediária ao tamanho do testículo. A profundidade de penetração da agulha deve ser proporcional à metade da largura do testículo.
A B C
® Vetnil Ind. e Com. Produtos Veterinários Ltda., Av. José Nicolau Stabile 53, CEP: 13290-000, Louveira, São Paulo, Brasil
® BD Technologies Research and Development, 21 Davis Drive, Research Triangle Park North Carolina 27709 U.S.A
Figura 1 – Posicionamento dos testículos, onde podemos notar o sentido crânio-caudal dos movimentos (A); Fixação manual dos testículos por pinçamento digital (B); Injeção testicular: o posicionamento do animal é feito virando-o de ponta cabeça, sem soltar o escroto pinçado (C).
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Um total de vinte e cinco animais foram injetados nos testículos por 5 vezes totalizando 250 testículos injetados. Apenas um animal teve seu testículo estourado por excesso de volume e 3 animais morreram por efeitos colaterais da tranqüilização.
Foram gerados um total de 377 animais na F1, sendo que nenhum deles apresentou coloração verde fluorescente a excitação da luz ultra violeta. Amostras de tecido hepático foram coletadas para posterior realização de PCR.
4. CONCLUSÕES
Este trabalho pode demonstrar que as injeções nos testículos não afetaram as taxas de progêne. No entanto, novos estudos devem ser realizados para identificar as causas de ausência de expressão do gene exógeno que podem ser características pertinentes a molécula utilizada ou devido a características da espermatogênese inerentes a espécie, um novo ciclo de acasalamentos está sendo realizado.
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
CARBALLADA R., AND ESPONDA P. Regulation of foreign DNA uptake by mouse spermatozoa. Exp Cell Res. 262: 104–113, 2001.
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COLLARES T. and DESCHAMPS J.C. Xenotransplantes e suínos transgênicos. In: Collares, T. (Org.). Animais transgênicos: princípios e métodos. Ribeirão Preto: Ed. SBG, 2005.
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HOUDEBINE L.M. Transgenic animal bioreactores. Transgenic Res, 9:305-320, 2000. LAVITRANO M., MAIONE B., FORTE E., FRANCOLINI M., SPERANDIO S., TESTI R.
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