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Imunoexpressão de 2 e 14 e do inibidor TIMP2 no câncer colorretal

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Academic year: 2018

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

FACULDADE DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA E MEDICINA LEGAL

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA

FRANCISCO NÉLSON NÓBREGA FURTADO

IMUNOEXPRESSÃO DE METALOPROTEINASES 2 E 14

E DO INIBIDOR TIMP-2 NO CÂNCER COLORRETAL

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IMUNOEXPRESSÃO DE METALOPROTEINASES 2 E 14

E DO INIBIDOR TIMP-2 NO CÂNCER COLORRETAL

Dissertação submetida à Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Patologia, da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre.

Orientador: Prof. Dr. Paulo Roberto Carvalho de Almeida.

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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Federal do Ceará

Biblioteca de Ciências da Saúde

N675i Furtado, Francisco Nelson Nóbrega.

Imunoexpressão de metaloproteinases 2 e 14 e do inibidor TIMP-2 no câncer colorretal/ Francisco Nelson Nóbrega Furtado. – 2012.

86 f. : il.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Ceará, Faculdade de Medicina, Programa de Pós- Graduação em Patologia, Fortaleza, 2012.

Orientação: Prof. Dr. Paulo Roberto Carvalho de Almeida

1. Neoplasias Colorretais. 2. Metaloproteinase 2 da Matriz. 3. Metaloproteinase 14 da Matriz. 4. Inibidor Tecidual de Metaloproteinase-2. 5. Progressão da Doença. I.Título.

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IMUNOEXPRESSÃO DE METALOPROTEINASES 2 E 14

E DO INIBIDOR TIMP-2 NO CÂNCER COLORRETAL

Dissertação submetida à Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Patologia, da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre.

Defendida em: 09/08/2012

BANCA EXAMINADORA

______________________________________________________ Prof. Dr. Paulo Roberto Carvalho de Almeida (Orientador)

Universidade Federal do Ceará - UFC

______________________________________________________ Prof. Dr. Marcos Venício Alves Lima

Universidade Estadual do Ceará – UECE

______________________________________________________ Prof. Dr. Lusmar Veras Rodrigues

Universidade Federal do Ceará – UFC

______________________________________________________ Profª. Drª. Conceição Aparecida Dornelas

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para realizar a pesquisa.

À CAPES – Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior, pelos recursos financeiros que tornaram possível a realização da pesquisa.

Ao prof. Dr. Paulo Roberto Carvalho de Almeida, um excelente professor e orientador que mostrou ser uma pessoa altamente competente, compreensiva e dedicada. Um verdadeiro exemplo de profissional a ser seguido.

À profª Drª Conceição Aparecida Dornelas, uma professora altamente prestativa, atenciosa e que esteve sempre por perto nos apoiando. Uma pessoa a quem tenho também muita admiração.

À profª Drª Margarida Maria de Lima Pompeu, também muito atenciosa e que mostrou grande interesse em acompanhar o nosso trabalho desde o início e pelo fato de que sempre esteve disposta a nos auxiliar no que fosse preciso.

Ao prof. Dr. José Telmo Valença Junior, que demonstrou ser muito atencioso e interessado no nosso estudo e que também sempre esteve por perto nos apoiando.

Aos acadêmicos do curso de medicina da UFC, João Tarcísio Alves Maia Filho e Renato Braga Vieira , que foram de fundamental importância principalmente para a exaustiva seleção da amostra do trabalho e ao Dr. João Paulo Aguiar Sampaio pela realização da técnica do tissue microarray.

Aos funcionários do Departamento de Patologia e Medicina Legal (DPML) da UFC : Susana Moreira de Souza, Francisco Saliésio Morais Freitas e Sebastião da Silva Lima que deixaram uma importante contribuição para a realização da parte prática do trabalho entre outros funcionários que direta ou indiretamente também nos ajudaram bastante.

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“A esperança de um novo dia torna belo o entardecer ”

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metaloproteinases de matriz (MMPs) são importantes enzimas que facilitam a invasão e disseminação do tumor em vários tipos de câncer, inclusive o colorretal. Os inibidores teciduais de metaloproteinases (TIMPs) são os principais inativadores fisiológicos destas enzimas. Este estudo avaliou a expressão de 2 (MMP-2), metaloproteinase-14 (MMP-metaloproteinase-14) e inibidor tecidual de metaloproteinases-2 (TIMP-2) no câncer colorretal. O imunomarcador CD68 foi utilizado para caracterizar a natureza das células mononucleadas do estroma. Amostras teciduais de 50 casos de colectomias, devido ao câncer colorretal no período de 2004 a 2010, obtidas dos arquivos do Departamento de Patologia e Medicina Legal (DPML), Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará (UFC), foram analisadas. Realizou-se tissue microarrays e a seguir imuno-histoquímica para avaliar a expressão de MMP-2, MMP-14 e TIMP-2 de acordo com os seguintes escores baseados em outros relatos: 0= sem imunomarcação ou raras células marcadas (<5%); 1 = discreta marcação na maioria (> 50%) das células tumorais ou células mononucleares do estroma, ou moderada marcação em uma minoria de células (<50 %); 2 =marcação moderada na maioria (> 50%) de células tumorais ou células mononucleares ou intensa marcação em minoria de células (<50%); 3 = marcação intensa na maioria (> 50%) de células tumorais ou células mononucleares. Observou-se relação entre a expressão aumentada de MMP-14 em mononucleares de tumor primário e casos sem metástases linfonodais (MMP-14, escores 2 e 3/N0 : 23/24 = 95%; N1-N3: 14/20 = 70%, p = 0,0353). No entanto, nenhuma relação significativa foi encontrada entre a expressão de MMP-14, MMP-2 e TIMP-2 nos tumores primários em células cancerosas ou mononucleares e outros parâmetros clínico-patológicos. A imunoexpressão de MMP-2 foi negativa nas células neoplásicas, em tumores primários (47/47=100%) e metastáticos (12/12 = 100%). A imunorreatividade de MMP-14 em células neoplásicas foi frequentemente positiva em tumores primários (50/50 = 100%) e metastáticos (7/8= 88%). Em mononucleares, a maioria dos quais macrófagos (corados pelo CD68), a expressão positiva de MMP-14 também predominou marcadamente, tanto em tumores primários (46/47 = 98%) como em carcinomas metastáticos (9/10 = 90%). A expressão de TIMP-2 em células neoplásicas, discreta, ocorreu em 70% de tumores primários (35/50 casos) e 100% dos metastáticos (8/8). A imunocoloração para TIMP-2 em macrófagos associados ao tumor (TAMs) foi ainda mais elevada do que nas células neoplásicas. Em conclusão, a MMP-14 e TIMP-2 são frequentemente expressas em carcinomas colo-retais em ambas localizações anatômicas, principalmente nas metástases para linfonodos , sugerindo que estas proteases desempenham papel importante na invasão local e na progressão tumoral neste tipo de câncer. A predominância destes marcadores nas células mononucleares (sobretudo macrófagos) , claramente evidentes na positividade para a MMP-2, enfatiza a importância do microambiente tumoral no desenvolvimento de neoplasias.

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1 Marcação do bloco receptor do TMA... 36

2 Bloco de TMA completamente marcado ... 36

3 Agulha metálica de crochê com 2 mm de diâmetro para preparação do TMA... 36

4 Perfuração do bloco receptor com agulha de crochê. Obtenção de orifícios cilíndricos receptores... 5 Vazador de couro (punch) manual modificado (Graziano®), para retirada de material do bloco doador... 37

6 Vazador de couro (punch) manual modificado (Graziano®), detalhe... 37

7 Blocos receptores de TMA prontos e recobertos por parafina... 38

8 Bloco receptor de TMA em detalhe. Produto final ... 38

9 MMP-2 – Controle positivo... 42

10 MMP-2. Controle negativo... 43

11 MMP-14 – Controle positivo... 43

12 MMP-14. Controle negativo... 44

13 TIMP-2. Controle positivo... 44

14 TIMP-2. Controle negativo... 45

15 Células neoplásicas e microambiente tumoral... 45

16 Caracterização de mononucleares no microambiente tumoral... 46

17 Expressão de MMP-14 nos mononucleares em relação à progressão tumoral-linfonodal ... 53

18 Expressão de MMP-2 em mononucleares no tumor primário... 57

19 Expressão de MMP-2 em mononucleares no linfonodo... 58

20 Expressão de MMP-14 em câncer colorretal primário... 59

21 Expressão de MMP-14 no microambiente tumoral e células neoplásicas... 60

22 Expressão de TIMP-2 em mononucleares no tumor primário... 62

23 Expressão de TIMP-2 em metástases linfonodais no câncer colorretal... 63

24 Expressão de TIMP-2 em células neoplásicas e mononucleares no tumor primário. 64 25 Expressão de TIMP-2 em células neoplásicas e mononucleares no linfonodo... 64

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29 Expressão de MMP-2, MMP-14 e TIMP-2 em células neoplásicas no tumor

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1 Expressão de MMP-2, MMP-14 e TIMP-2 em células epiteliais de mucosa normal e tumoral , em carcinomas colorretais... 2 Expressão de MMP-2, MMP-14 e TIMP-2 em mononucleares do estroma

de mucosa normal e tumoral , em carcinomas colorretais... 3 Expressão de MMP-2 e variáveis clínico-patológicas em células neoplásicas no carcinoma colorretal... 4 Expressão de MMP-2 e variáveis clínico-patológicas em mononucleares no

carcinoma colorretal... 5 Expressão de MMP-14 e variáveis clínico-patológicas em células neoplásicas

no carcinoma colorretal... 6 Expressão de MMP-14 e variáveis clínico-patológicas em mononucleares no

carcinoma colorretal... 52 7 Expressão de TIMP-2 e variáveis clínico-patológicas em células neoplásicas

no carcinoma colorretal... 54 8 Expressão de TIMP-2 e variáveis clínico-patológicas em mononucleares no

carcinoma colorretal... 55 9 Expressão de MMP-2 em células neoplásicas do tumor primário e linfonodos

no carcinoma colorretal... 56 10 Expressão de MMP-2 em mononucleares do tumor primário e linfonodos no

carcinoma colorretal... 57 11 Expressão de MMP-14 em células neoplásicas do tumor primário e

linfonodos no carcinoma colorretal... 59 12 Expressão de MMP-14 em mononucleares do tumor primário e linfonodos

no carcinoma colorretal... 60 13 Expressão de TIMP-2 em células neoplásicas do tumor primário e linfonodos

no carcinoma colorretal... 61 14 Expressão de TIMP-2 em mononucleares do tumor primário e linfonodos no

carcinoma colorretal... 62 50

51 49 46

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ADAMs A Desintegrin And Metalloproteinase /A Desintegrina e Metaloproteinase

APC Adenomatous polyposis coli/ PoliposeAdenomatosaColônica APC-β catenina PoliposeAdenomatosaColônica- β catenina

Caderina Calcium-Dependent Adherence Protein /Proteina de Aderência dependente de cálcio

Caderina-E Proteina de Aderência dependente de Cálcio-Epitelial Caderina-N Proteina de Aderência dependente de Cálcio- Neuronal

CCHNP Colorectal Cancer Hereditary Non-Polyposis / Câncer Colorretal Hereditário Não-Polipose

CCR Câncer colorretal

DNA Ácido desoxirribonucléico

DPML Departamento de Patologia e Medicina Legal

FGF Fibroblast Growth Factor/ Fator de crescimento Fibroblástico HUVECs Human Umbilical Vein Cord

INCA Instituto Nacional do Câncer K-RAS Kirsten-rat sarcoma

LMA Leucemia mielóide aguda MB Membrana Basal

MEC Matriz extracelular

MET Mesenchymal epithelial transition / transição epitelial- mesenquimal

MLH1 mutL homolog 1, colon cancer, nonpolyposis type 2 (E. coli) [Homo sapiens]

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MSH2 e 6 MutS homolog 2, colon cancer, nonpolyposis type 1 (E. coli) [Homo sapiens]

MT1-MMP Membrane-type 1 Metalloproteinase/ Metaloproteinase de tipo membranar-1

NO NitricOxide /Óxido Nítrico OMS Organização Mundial da Saúde

P53 Genesupressor,consideradooguardiãodogenoma PAF Polipose adenomatosa familiar

PMS1 Postmeiotic segregation increased 1 (S. cerevisiae) [Homo sapiens] Aumentado na segregação pos-meiótica-1

RNAm Ácido ribonucléico mensageiro

SMAD -2 e 4 S mothers against decapentaplegic-(genes transdutores de TGF-B) TEM Transição epitelial-mesenquimal

TGF-β Transforming growth factor-β/Fator de crescimento transformador β TIMPs Tissue Inhibitor of Metalloproteinases / inibidor tecidual de

metaloproteinases

TIMP-2 Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-2/ inibidor tissular de Metalloproteinase-2

TMA Tissue microarray. Microarranjo tissular

TNM Estadiamento tumoral: Topografia; linfonodos; Metástases Tris/EDTA Tampão contituido por:hydroxymethyl- aminomethane/

(16)

1 INTRODUÇÃO……… 16

1.1 Câncer: aspectos epidemiológicos………...... 16

1.2 Câncer colorretal: aspectos epidemiológicos... 16

1.3 Carcinogênese colorretal………..... 19

1.3.1 A via da instabilidade cromossômica... 19

1.3.2 A via da instabilidade de microssatélites... 20

1.4 O microambiente tumoral... 21

1.4.1 A matriz extracelular……….. 22

1.4.2 As metaloproteinases (MMPs): aspectos gerais... 23

1.4.3 Inibidores teciduais de metaloproteinases (TIMPs)... 27

1.4.4 As MMPs e a transição epitelial-mesenquimal... 28

1.4.5 MMPs e câncer……… 29

1.4.6 MMPs e o câncer colorretal... 31

2 OBJETIVOS... 34

3 MATERIAIS E MÉTODOS... 35

3.1 Casuística e material utilizado... 35

3.2 Microarranjo tissular (Tissue microarray–TMA)... 35

3.3 Imunohistoquímica... 38

3.4 Controles... 40

3.5 Escores... 40

3.6 Avaliação intra- e inter-observadores... 40

3.7 Análise estatística... 41

3.8 Aprovação no Comitê de Ética em Pesquisa com seres humanos... 41

4 RESULTADOS... 42

4.1 Controles... 42

4.2 Imunoexpressão em mucosa normal versus amostras de tecido tumoral... 46

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4.6 Expressão de TIMP-2 em células neoplásicas e mononucleares... 61

4.7 Síntese dos resultados em valores relativos... 67

5 DISCUSSÃO... 68

6 CONCLUSÕES... 73

REFERÊNCIAS... 74

APÊNDICE... 85

ANEXO... 86

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1 INTRODUÇÃO

1.1 Câncer: aspectos epidemiológicos

O câncer é uma das principais causas de morbidade e mortalidade no mundo. Conhecido há muitos séculos, o câncer foi amplamente considerado como uma doença dos países desenvolvidos. Há aproximadamente quatro décadas, a situação vem mudando, e a maior parte do ônus global do câncer pode ser observada em países em desenvolvimento, principalmente aqueles com poucos e médios recursos. Assim, nas últimas décadas, o câncer ganhou uma dimensão maior, convertendo-se em um evidente problema de saúde pública mundial. A Organização Mundial da Saúde (OMS) estimou que, no ano 2030, podem-se esperar 27 milhões de casos incidentes de câncer, 17 milhões de mortes por câncer e 75 milhões de pessoas vivas, anualmente, com câncer. O maior efeito desse aumento vai incidir em países de baixa e média renda (INCA, 2011).

Em países considerados de primeiro mundo, predominam os cânceres de pulmão, mama, próstata e cólon. Nos países em desenvolvimento, os cânceres predominantes são os de estômago, fígado, cavidade oral e colo do útero. Mesmo na tentativa de se criar padrões mais característicos de países ricos em relação aos de baixa e média renda, o padrão está mudando rapidamente, e vem-se observando um aumento progressivo nos cânceres de pulmão, mama e cólon e reto nos países em desenvolvimento, os quais, historicamente, não apresentavam essa importância e magnitude(INCA, 2011).

No Brasil, as estimativas para o ano de 2012 serão válidas também para o ano de 2013 e apontam a ocorrência de aproximadamente 518.510 casos novos de câncer, incluindo os casos de pele não melanoma, reforçando a magnitude do problema do câncer no país. Sem os casos de câncer da pele não melanoma, estima-se um total de 385 mil casos novos. Os tipos mais incidentes serão os cânceres de pele não melanoma, próstata, pulmão, cólon e reto e estômago para o sexo masculino; e os cânceres de pele não-melanoma, mama, colo do útero, cólon e reto e glândula tireóide para o sexo feminino (INCA, 2011).

1.2 Câncer colorretal : aspectos epidemiológicos

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e outros países asiáticos. Em países sabidamente com alto risco para o desenvolvimento deste tipo de câncer, a incidência apresenta uma estabilidade ou até mesmo um declínio, como é o caso dos países da Europa ocidental, do norte europeu e da América do Norte, além da Austrália (INCA, 2011). Apesar dos avanços na detecção precoce e no tratamento, o CCR é ainda responsável por uma mortalidade bastante significativa e representa a segunda causa de morte por câncer nos Estados Unidos, com uma taxa de sobrevida média de 5 anos em cerca de 67% dos casos (GUASTADISEGNI et al., 2010).

Para o Brasil, no ano de 2012, esperam-se 14.180 casos novos de câncer do cólon e reto em homens e 15.960 em mulheres. Esses valores correspondem a um risco estimado de 15 casos novos a cada 100 mil homens e 16 a cada 100 mil mulheres. Sem considerar os tumores da pele não melanoma, o câncer do cólon e reto em homens é o segundo mais frequente na região Sudeste (22/100 mil) e o terceiro nas regiões Sul (18/100 mil) e Centro-Oeste (14/100 mil). Na região Norte (4/100 mil), ocupa a quarta posição e, na região Nordeste (5/100 mil), a quinta. Para as mulheres, é o segundo mais frequente nas regiões Sudeste (23/100 mil) e Sul (20/100 mil), o terceiro nas regiões Centro-Oeste (15/100 mil) e Nordeste (7/100 mil), e o sexto na região Norte (5/100 mil)(INCA, 2011).

Essa neoplasia é considerada de bom prognóstico se a doença for diagnosticada em estádios iniciais. A sobrevida média global em 5 anos se encontra em torno de 55% nos países desenvolvidos e 40% para países em desenvolvimento. Assemelhando-se à incidência, as taxas de mortalidade são mais baixas em mulheres do que nos homens, exceto na região do Caribe(INCA, 2011).

O desenvolvimento de várias formas comuns de câncer é resultado da interação entre fatores endógenos e ambientais, sendo o mais notável desses fatores a dieta. Uma dieta com base em um alto consumo de frutas, vegetais frescos, cereais e peixes, bem como a prática de atividade física, estão associadas a um baixo risco de desenvolvimento do câncer do cólon e reto. Por outro lado, o consumo excessivo de carne vermelha, embutidos e bebidas alcoólicas, o tabagismo e a obesidade ou o sobrepeso favorecem o desenvolvimento desse tipo de câncer. Mas os fatores de risco mais relevantes são a história familiar de câncer colorretal e a predisposição genética ao desenvolvimento de doenças crônicas do intestino. A idade também é considerada um fator de risco, uma vez que tanto a incidência como a mortalidade aumentam com a idade(INCA, 2011).

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adenomatosos colorretais (precursores do câncer do cólon e reto), bem como tumores em estádios bem iniciais. Mesmo em países com maiores recursos, a relação custo-benefício em investimentos para estratégias apropriadas de prevenção e detecção precoce do câncer do cólon e reto tem impossibilitado a implantação de rastreamento populacional. Essas estratégias não têm o objetivo de diagnosticar mais pólipos ou lesões planas, mas sim de diminuir a incidência e a mortalidade por esse tipo de neoplasia(INCA, 2011).

Observações histológicas levaram à idéia de que tumores colorretais desenvolvem-se através de um grau de agravamento da displasia da mucosa do cólon normal. Posteriormente, uma via genética para esta seqüência adenoma-carcinoma foi inicialmente proposta por Fearon & Vogelstein no início dos anos 90 e desde então tem sofrido modificações. Atualmente existe uma grande quantidade de estudos epidemiológicos, histopatológicos e genéticos que fornecem evidência em apoio a este modelo. As distribuições etárias de adenomas e carcinomas mostram que a prevalência de ambos aumentam com a idade, mas que a prevalência de adenomas ocorrem em cerca de 5 anos anteriores ao de carcinomas. Além disso, a distribuição geográfica dos adenomas colorretais se correlaciona bem com a distribuição dos casos de câncer colorretal em todo o mundo (LESLIE; CAREY, 2002; WEI; WOLIN; COLDITZ, 2010).

Vários estudos histopatológicos têm demonstrado uma associação entre adenomas e carcinomas colorretais. Vários relatos mostram que cerca de um terço dos adenomas intestinais tem potencial de malignização(PEREA et al., 2010).

(21)

1.3 Carcinogênese colorretal

No carcinoma colorretal, é possível identificarmos duas vias de carcinogênese, também válidas para os cânceres esporádicos: a via APC-β catenina , também conhecida como via da instabilidade cromossômica onde ocorrem alterações nos genes K-Ras e p53 (FELIN et al., 2008), mais relacionada com a carcinogênese dos tumores intestinais do colo esquerdo e com a Polipose adenomatosa familiar (PAF); e a via da instabilidade de microssatélites com mutações nos genes do reparo de DNA como hMSH2 e hMLH1(FELIN et al., 2008), associada à carcinogênese colônica direita e com a Síndrome de câncer colorretal hereditário sem polipose conhecida também como Síndrome de Lynch (SUGAI et al., 2006; BENEDIX et a l., 2010).

1.3.1 A via da instabilidade cromossômica

Identificada em quase 85% dos casosesta é a via genética mais comum de ocorrer em carcinomas colorretais. Embora seja amplamente reconhecido que o câncer colorretal com essa alteração esteja associada a um pior prognóstico, os mecanismos moleculares que resultam desta anormalidade são mal compreendidos (FIORINO et al., 2010; TESTRO; VISVANATHAN, 2009).

Esta via é associada a uma mutação no gene APC que pode co-existir com uma deleção no cromossomo 18 . O braço longo do cromossomo 18 é conhecido por conter os genes alterados no câncer colorretal: o SMAD-2 e o SMAD-4. Mutações no gene SMAD-4 também estão relacionadas à síndrome da polipose juvenil que também está associada com o câncer colorretal (ROWAN et al., 2005; CHOW; MACRAE, 2005).

Mutações hereditárias no gene APC são conhecidas por resultar na doença autossômica dominante conhecida como polipose adenomatosa familiar (PAF) que se caracteriza pelo desenvolvimento de numerosos pólipos adenomatosos no trato gastrointestinal. O gene APC é um gene supressor de tumor e verificou-se que as versões mutantes deste gene ocorrem na maioria dos cânceres colorretais esporádicos e também muito cedo no desenvolvimento de adenomas (PHELPS et al., 2009).

(22)

A função normal da proteína APC é a de se ligar com a β-catenina e promover sua degradação citosólica. Mutações no gene APC, que resultam na carcinogênese costumam causar defeito na ligação do APC com a β-catenina. Portanto, os efeitos são o aumento dos níveis de β-catenina que, por sua vez é translocada para o núcleo da célula onde age ativando genes que promovem o ciclo celular(KENNELL; CADIGAN, 2009; SENA et al., 2006).

O gene K-RAS é um proto-oncogene , ou seja, é um gene celular normal cujo produto promove a proliferação celular. Mutações associadas com o carcinoma colorretal são mais comumente encontrados nos códons 12 e 13 do éxon 1 e códon 61 do exon 2. Estas mutações levam a uma proteína K-RAS constitutivamente ativa que, então, predispõe ao desenvolvimento e progressão de pólipos (MALUMBRES; BARBACID, 2003; HATZIVASSILIOU et al., 2010; SAIF; SHAH, 2009).

O importante papel desempenhado pelo K-RAS na patogênese do carcinoma colorretal é realçado pelo fato de que mutações no K-RAS foram encontrados em mais de 50% dos casos. Adenomas não expressam K-RAS mutado. A sua expressão aumentada é vista em pólipos displásicos e também está associada com a progressão da seqüência adenoma-carcinoma. Também deve ser salientado que as mutações no K-RAS têm sido observados em várias outras doenças malignas (YUEN et al., 2002; WANG et al., 2006; VELHO et al., 2008; JANCI´K et al., 2010).

Mutações no gene p53, conhecido como o guardião do genoma, têm sido encontrados em quase 50% de todos os cânceres colorretais em todo o mundo. O p53 desempenha uma variedade de papéis cruciais na célula incluindo a regulação do ciclo celular, apoptose e reparo de DNA. Quando uma célula sofre uma mutação e tem seu DNA alterado a proteína p53 age causando a interrupção do ciclo celular em G1e induz os genes de reparo do DNA. Se a célula que sofreu a mutação não puder ser reparada ela é conduzida pela p53 para entrar em senescência ou sofrer apoptose . Portanto, não é surpreendente que as mutações no p53 ocorrem com frequências tão altas em muitos diferentes tipos de câncer(KERN et al., 2002).

1.3.2 A via da instabilidade de microssatélites

(23)

Assim como na via da instabilidade cromossômica, na MSI há um acúmulo de mutações, porém os genes envolvidos são diferentes. O reparo defeituoso do DNA provocado pela inativação de genes de reparo do emparelhamento errôneo do DNA é o evento inicial e fundamental nos cânceres colorretais que seguem essa via. Mutações hereditárias em um dos cinco importantes genes de reparo do emparelhamento errôneo do DNA (MSH2, MSH6, MLH1, PMS1 e P MS2) dão origem ao câncer colorretal hereditário não-polipose (CCHNP). Desses, o MLH1 e o MSH2 são os que mais comumente estão envolvidos nos carcinomas de colo derivados da CCHNP e nos esporádicos com defeitos nos genes de reparo do emparelhamento errôneo de DNA (POULOGIANNIS; FRAYLING; ARENDS, 2010; BELLIZZI; FRANKEL, 2009; AUCLAIR et al., 2011).

Em contraste com o caminho da instabilidade cromossômica, os mecanismos moleculares que resultam na via da instabilidade de microssatélites são relativamente bem conhecidos. Este caminho está intimamente relacionado com o sistema que corrige eventuais erros cometidos por polimerases de DNA durante a replicação do DNA. As sequências de microssatélites são particularmente suscetíveis a erros de replicação e, portanto, qualquer mutação que prejudica a eficácia do sistema predispõe para o desenvolvimento desta via (VILAR; GRUBER, 2010; SHAH; HILE; ECKERT, 2010).

1.4 O microambiente tumoral

Em anos recentes, tem-se dado bastante ênfase ao microambiente tumoral na gênese das neoplasias, ou seja, ao estroma tumoral, tanto através de suas células (fibroblastos, macrófagos, células endoteliais, mastócitos e neutrófilos) quanto através da matriz extracelular. Nesta, papel proeminente tem sido atribuído a proteases envolvidas na lise e remodelamento da mesma, das quais se destacam as metaloproteinases (MBEUNKUI; JOHANN, 2009; JOYCE; POLLARD, 2009).

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existente (EGEBLAD; NAKASONE; WERB, 2010; POSCHKE; MOUGIAKAKOS; KIESSLING, 2011).

Os tumores sólidos compreendem não só as células malignas, mas também vários outros tipos de células não-malignas, que em conjunto constituem o estroma tumoral. Este último pode ser composto de muitos tipos de células, incluindo fibroblastos, células epiteliais, pericitos, miofibroblastos, células endoteliais, e células inflamatórias do sistema imune, além da matriz extracelular. Este tecido participa de forma dinâmica no desenvolvimento e na progressão do câncer. Existem muitas interações entre as células do tecido do estroma e as células cancerosas. Em conjunto, as células não-malignas do estroma tumoral produzem um microambiente único que pode modificar as propriedades neoplásicas das células tumorais. Por sua vez, durante o curso de tumorigênese, as células tumorais contribuem para a geração e modificação do microambiente do tumor. Portanto, o microambiente tumoral é uma rede dinâmica, que inclui as células cancerosas e as do tecido do estroma, bem como a toda a matriz extracelular circundante(SPANO; ZOLLO, 2012).

1.4.1 A matriz extracelular

A matriz extracelular (MEC) é uma complexa rede de macromoléculas com distintas propriedades e que embora seja rigorosamente controlada durante o desenvolvimento embrionário, homeostase e processo inflamatório, ela perde sua regulação em doenças como o câncer. A MEC tem um papel central na organização da arquitetura do tecido em animais e humanos, proporcionando o andaime estrutural para as células. Ela é composta de uma grande variedade de componentes bioquimicamente distintos incluindo proteínas, glicoproteínas, proteoglicanos e polissacarídeos com diferentes propriedades físicas e bioquímicas (WHITTAKER et al., 2006; OZBEK et al., 2010).

No entanto, a MEC não é meramente uma estrutura passiva, e sim um ambiente dinâmico que interage com as células e as influencia em suas funções, como na proliferação, no crescimento, na diferenciação, na adesão, na migração e na sobrevivência. Por outro lado, as células, neoplásicas e do estroma, também são capazes de influenciar e reorganizar a sua MEC circundante. A interação regulada entre a MEC e as células é essencial para manter o microambiente fisiológico e a homeostasia. Assim, distúrbios neste regulamento complexo têm sido implicados em diversos processos patológicos, incluindo o crescimento descontrolado do tumor, a invasão e a metástase (AITKEN; BÄGLI, 2009).

(25)

pelas células cancerosas da capacidade de sobreviver, crescer e invadir. Ao longo do caminho, as células cancerosas muitas vezes perdem diferenciação e polaridade e passam a alterar a integridade dos tecidos e das células do estroma para promover seu próprio crescimento (HANAHAN; WEINBERG, 2011; FEIGIN; MUTHUSWAMY, 2009; LUO et al., 2009; AITKEN; BÄGLI, 2009).

Uma característica importante dos órgãos epiteliais, que é frequentemente perdido no câncer, é que suas células tem polaridade distinta e uma arquitetura que são indispensáveis para a formação e função de órgãos. A MEC alterada pode comprometer a dinâmica da membrana basal como uma barreira física e promover a transição epitelial-mesenquimal, que, juntos, podem facilitar a invasão dos tecidos por células cancerosas (GHAJAR; BISSELL, 2008 ; SONG et al., 2000; DUONG; ERICKSON, 2004; RADISKY et al., 2010).

A MEC anormal afeta indiretamente as células cancerígenas, influenciando o comportamento das células do estroma, incluindo células endoteliais, células do sistema imunológico e fibroblastos. Estes últimos são os principais responsáveis pela produção da MEC anormal. Como resultado, a MEC anormal promove a formação de um microambiente tumorigênico (BHOWMICK et al., 2004; ORIMO et al., 2005; QUANTE et al., 2011).

Uma das características mais proeminentes das interações entre as células e a MEC é que elas são recíprocas. Enquanto as células estão constantemente criando, quebrando e realinhando os componentes da MEC para alterar suas propriedades, esta última regula o comportamento das células. Assim quaisquer alterações na MEC tem como resultado modificações nas atividades celulares (BUTCHER et al., 2009).

Várias características e propriedades da MEC contribuem para a sua importância no desenvolvimento normal e nas patologias. A remodelação da MEC é altamente regulada durante o desenvolvimento e é realizada principalmente através do controle da expressão ou da atividade de enzimas proteolíticas que incluem as metaloproteinases (MMPs) (PAGE-MCCAW et al., 2007; YU et al., 2011; AITKEN; BÄGLI, 2009).

1.4.2 As metaloproteinases (MMPs): aspectos gerais

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inibidores teciduais de metaloproteinases, agem regulando a ação das MMPs e ficou demonstrado que os mesmos agem inibindo também o crescimento tumoral e a angiogênese em uma variedade de sistemas in vivo (ZAGOURI et al., 2011).

Elas formam uma família de mais de 25 enzimas proteolíticas zinco-dependentes e que compartilham várias semelhanças em termos de sua estrutura, regulação e função. Sua estrutura inclui geralmente três domínios peptídeo: um domínio pró-peptídeo, um domínio catalítico contendo zinco (ambos são altamente conservados ao longo da evolução e da família MMP) e um domínio C terminal, que determina sua especificidade de substrato (NAGASE; WOESSNER, 1999; BODE; MASKOS, 2011).

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Quadro 1 – Nomenclatura e substratos das MMPs

MMP NOMENCLATURA

USUAL

PESO

MOLECULAR kDa

SUBSTRATO

MMP-1 Colagenase-1 /

Colagenase Intersticial

57* / 47 A Colágeno tipos I, II, III, VII, X,

proteoglicanos

MMP-2 Gelatinase A 72* / 66 A Gelatina, Colágeno

tipos IV, V, VII, IX, X

MMP-3 Estromelisina-1 60* / 52 A Fibronectina,

Laminina, Elastina, Proteoglicanos, Gelatina, Colágeno tipos IV, V, e IX

MMP-7 Matrilisina 28* / 19 A Gelatina, Fibronectina,

Laminina, Elastina, Colágeno tipo IV

MMP-8 Colagenase Tipo

Neutrófilo / Colagenase-2

85* / 64 A Colágeno tipos I, II, III, VIII, X,

Fibronectina e Proteoglicanos

MMP-9 Gelatinase B 92* / 86 A Gelatina, Colágeno

Tipos IV, V, VII, X, Fibronectina, Elastina e Proteoglicanos

MMP-10 Estromelisina 2 53* / 47 A Fibronectina Caseína,

Gelatina, Colágeno tipos I, III, IV e V

MMP-11 Estromelisina 3 60* / 47 A Colágenos tipos, IV,

V, IX, X, Laminina, Elastina, Fibronectina e Proteoglicanos

MMP-12 Elastase de Macrófagos 54* / 45 A Elastina

MMP-13 Colagenase-3 60* / 48 A Colágeno I, II, III, VII,

VIII, e X, Tenascina, Gelatina

MMP-14 MT1-MMP 66* / 54 A Pro-MMP2, Colágeno

tipos I, II, III, Gelatina, Fibronectina,

Vitronectina, Laminina

MMP-15 MT2-MMP 76 Pro-MMP2, Gelatina,

Fibronectina,

Vitronectina, Laminina

MMP-16 MT3-MMP 65* / 63 A Pro-MMP2, Colágeno

tipo III, Gelatina, Fibronectina

MMP-17 MT4-MMP 65* / 63 A Pro-MMP2,

Fibrina/Fibrinogênio, Gelatina

MMP-19 RASI-1 59 Colágeno nativo tipo

IV, Gelatina,

Laminina,Fibronectina

MMP-20 Enamelisina 56 Amelogenina,Agrecan.

MMP-23 CA-MMP 44 Gelatina

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Fibronectina, Proteoglicanos, Gelatina

MMP-25 MT6-MMP / Leucosina 62 MMP2,

Pro-MMP9, Colágeno Nativo tipo IV , Gelatina, Fibronectina, Proteoglicanos, Laminina-1,

Fibrina/Fibrinogênio

MMP-26 Matrilisina-2 29 Pro-MMP9, Colágeno

Nativo tipo IV,

Gelatina, Fibronectina, Fibrina/Fibrinogênio

MMP-27 - 59 -

MMP-28 Epilisina 59 -

*Peso molecular do Zimogênio. A - peso molecular da forma ativa. Fonte: Adaptado de Altadill et al., 2012 .

A maioria das MMPs são secretadas como enzimas inativas ou seja, zimogênios e requerem portanto um processo proteolítico para se tornarem ativas. A ativação de zimogênios pode ser realizada através de caminhos químicos ou proteolíticos. No primeiro caso, os fatores químicos como Moléculas reativas de oxigênio normalmente produzem ativação in vitro. O óxido nítrico (NO) foi capaz de ativar a pro-MMP-9 durante isquemia cerebral, demonstrando uma ativação química da pró-MMP. A ativação proteolítica é o mais importante caminho biologicamente e freqüentemente ocorre uma ativação em cascata de MMPs no tecido. Por outro lado, as MMPs ativadas anteriormente como MMP-3,MMP-7 e MMP-10 também podem ativar outras pro-MMPs secretadas . De fato, a ativação das MMPs requer uma complexa cascata de ativação catalítica que conduz a um efeito proteolítico amplificado (ROY; ZHANG; MOSES, 2006; STRACKE et al., 2000).

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papel na homeostase dos tecidos (MURPHY; NAGASE, 2008; HADLER-OLSEN et al., 2010; RA; PARKS, 2007).

1.4.3 Inibidores teciduais de metaloproteinases (TIMPs)

As MMPs e os TIMPs estão criticamente envolvidos em uma série de processos fisiológicos, incluindo o desenvolvimento de órgãos, cicatrização e angiogênese . Por outro lado, o aumento da atividade das MMPs tem um papel importante em várias condições patológicas, tais como na artrite, nas doenças cardiovasculares e no câncer. Há claras evidências de que diferentes MMPs e seus inibidores estão envolvidas na invasão tumoral e metástase (PAGE-MCCAW; EWALD; WERB, 2007; FATA et al., 2000; BURRAGE et al., 2006; WESTERMARCK; KÄHÄRI, 1999).

Os inibidores tissulares de metaloproteinases (TIMPs) são inibidores específicos de MMPs, que agem controlando as atividades locais das MMPs nos tecidos. Quatro TIMPs (TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3 e TIMP-4) foram identificados e são capazes de inibir as atividades de todas as MMPs conhecidas. Os quatro membros têm muitas semelhanças e especificidades que se sobrepõem, mas as suas propriedades bioquímicas e padrões de expressão local exibem características distintas (GOMEZ et al. 1997; BAKER; EDWARDS; MURPHY, 2002).

Os TIMPs possuem atividades biológicas que são independentes da inibição das MMPs e podem regular o crescimento celular, a sobrevivência, a migração e a angiogênese (CRUZ-MUNOZ; KHOKHA, 2008; BOURBOULIA; STETLER-STEVENSON, 2010; BREW; NAGASE, 2010).

(30)

é a de regular essencialmente entre outras atividades a atividade proteolítica das MMPs. Na literatura os TIMPs são normalmente retratados somente como inibidores de MMPs porém eles estão envolvidos em diversas atividades biológicas tais como na diferenciação celular, no crescimento, na migração, na invasão, na angiogênese e na apoptose, e esses efeitos são independentes da inibição que os mesmos causam na atividade proteolítica da MMPs (HERNANDEZ-BARRANTES et al., 2000; STRONGIN et al., 1995; BREW; NAGASE, 2010).

1.4.4 As MMPs e a transição epitelial-mesenquimal

A migração celular é altamente relacionada com a atividade proteolítica das MMPs que regulam a dinâmica da MEC e as interações célula-célula. Por exemplo, pode-se citar que a produção de peptídeos através da degradação de moléculas da MEC, como colágeno tipo IV e a laminina-5, promove a migração de células neoplásicas. A super-expressão de MMPs diversas (MMP-2, -3, -9, -13, -14) tem sido associada com um processo fundamental de transição morfológica conhecido como transição mesenquimal. A transição epitelial-mesenquimal (TEM) é um processo em que as células epiteliais perdem suas propriedades e ganham características mesenquimais. Este processo está associado com a diminuição da expressão de marcadores epiteliais como a E-caderina e o aumento da expressão de marcadores mesenquimais como a N-caderina. Além disso, as células que passam pela transição epitelial-mesenquimal perdem a sua polaridade, ocorrendo com isso uma redução das interações intercelulares e um grande aumento na capacidade migratória. Isso mostra o importante papel desse processo no crescimento do tumor invasivo e na progressão do câncer. Recentes estudos indicam a implicação de MMP-28 na ativação proteolítica do TGF-β, um potente indutor da transição epitelial-mesenquimal (XU et al., 2001; KOSHIKAWA et al., 2000; BACIU et al., 2003; POLYAK; WEINBERG, 2009; NOE et al., 2001; ILLMAN et al., 2006; HELDIN; LANDSTRO; MOUSTAKAS, 2009).

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1.4.5 MMPs e câncer

No entanto, enquanto as MMPs são bastante importantes na invasão tumoral, evidências crescentes sugerem que elas também estão envolvidos nas fases iniciais da carcinogênese. Este último efeito não está relacionado apenas com a sua ação proteolítica sobre a MEC e sim com outras funções tais como, a regulação da apoptose e da angiogênese (EGEBLAD; WERB, 2002).

Além de degradar seletivamente vários componentes da matriz extracelular, as MMPs ativam fatores de crescimento e citocinas que agem na MEC. Elas são capazes também de ativar vários fatores de crescimento, citocinas e quimiocinas e de clivar proteínas de superfície celular (receptores de citocinas, moléculas de adesão celular, etc). Através de sua atividade proteolítica, as MMPs desempenham um papel crucial na invasão e metástase e regulam proliferação celular, a sobrevivência, a invasão, a inflamação e a angiogênese (KESSENBROCK; PLAKS; WERB, 2010; KLEIN; BISCHOFF, 2011; ROY; YANG; MOSES, 2009; HATFIELD; REIKVAM; BRUSERUD, 2010; CAUWE; VAN DEN STEEN; OPDENAKKER, 2007; RODRIGUEZ; MORRISON; OVERALL, 2010; DERYUGINA; QUIGLEY, 2010).

Dentre os diversos tipos de MMPs as gelatinases tem destaque pois são superexpressas em uma variedade de tumores malignos e sua expressão e atividade são frequentemente associados com a agressividade do tumor e a um mau prognóstico. Níveis elevados de MMP-2 e / ou MMP-9 são encontrados no câncer de mama, de pâncreas, de ovários, câncer cerebral, colorretal, câncer de próstata, bexiga, de pulmão e nos melanomas. A Expressão desregulada de MMPs também é observada em doenças hematológicas malignas, como na leucemia linfoblástica aguda, na leucemia de células T, na leucemia mielóide aguda (LMA), na leucemia mielóide crônica,nas síndromes mielodisplásicas e nos linfoma de Hodgkin e não-Hodgkin (KLEIN; BISCHOFF, 2011; ROY; YANG; MOSES, 2009; TURPEENNIEMI-HUJANEN, 2005; YU; HAN, 2006; RYDLOVA et al., 2008; KLEIN et al., 2004) .

(32)

As células tumorais podem secretar MMPs ou ainda aumentar a expressão das mesmas nas células vizinhas do estroma de forma parácrina, levando à degradação da MEC. Esta atividade das MMPs induzida pelo tumor é um pré-requisito para o crescimento do tumor invasivo e é necessário para a intravasação, extravasamento de células tumorais e invasão distante a órgãos secundários durante a progressão metastásica. Tem sido demonstrado em vários estudos experimentais que a capacidade invasiva e metastática das células tumorais pode ser diminuída através da inibição seletiva de MMPs em vários modelos murinos Em tecidos de tumores humanos, níveis elevados de expressão MMP foram correlacionadas com maior grau de estadiamento do tumor. Além disso, o aumento dos níveis de MMPs nos tecidos, no soro e urina têm sido associados com maus resultados em vários tipos de câncer (APARICIO et al., 1999; HAQ et al., 2000; NELSON et al., 2000; KUPFERMAN et al., 2000; LOCHTER et al., 1997; VIHINEN; KÄHÄRI, 2002; ROY; YANG; MOSES, 2009).

Como já foi dito a maioria das MMPs são produzidas e secretadas pelos tecidos intersticiais na vizinhança do tumor em resposta à estimulação de células tumorais. As MMPs desempenham um papel importante no desenvolvimento e crescimento de tumores colorretais e no processo de metástase (ROY; YANG; MOSES, 2009; SUN; ZHANG, 2006; VAN DER JAGT et al., 2010).

A visão mais emergente, que se reflete em vários estudos revela que a expressão e o papel das MMPs e seus inibidores naturais ou seja, os inibidores teciduais das metaloproteinases (TIMPs) são bastante diversificados durante o desenvolvimento do câncer. Como já foi dito a sobre-expressão de MMPs no microambiente do tumor depende não só das células cancerosas, mas também das células vizinhas do estroma, que são induzidas pelas células cancerosas de forma parácrina. As células cancerosas estimulam células do hospedeiro, tais como fibroblastos de constituir uma importante fonte de MMPs através da secreção de interleucinas e fatores de crescimento. Estudos recentes mostram que os membros da família das MMPs exercem papéis diferentes em fases diferentes durante a progressão do câncer. Em particular, elas podem promover ou inibir o desenvolvimento do câncer, dependendo entre outros fatores do estágio do tumor, da localização do mesmo (metástase primária), localização da enzima (células do tumor,ou do estroma) e o perfil do substrato (MURPHY, 2008).

(33)

capacidade de promover a invasão. Esse local da célula onde ocorre a ação das MMPs para promover a invasão é o invadopódio. É no invadopódio onde a degradação ativa da MEC ocorre. Proteinases como a MMP-14 também conhecida como MT1-MMP, e MMPs secretadas e ativadas no local, tal como MMP-2 e -9 estão presentes nos invadopódios, degradando uma grande variedade de macromoléculas da MEC e com isso facilitam a invasão celular (WEAVER, 2006).

As MMPs exibem um duplo papel no sistema vascular do tumor, pois podem atuar tanto estimulando como inibindo a angiogênese, dependendo principalmente dos componentes derivados da clivagem do colágeno e do tempo de expressão durante a angiogênese do tumor . Os principais integrantes da família das MMPs que participam da angiogênese do tumor são principalmente a MMP-2, MMP-9 e MMP-14 (RUNDHAUG, 2003).

Para que as células continuem a proliferar e migrar no câncer, é necessário formar novos vasos sanguíneos. O primeiro passo neste processo é a eliminação das barreiras físicas pela degradação da MEC e posteriormente a geração de fatores pró-angiogênicos. Por exemplo a MMP-9 é bastante importante para a angiogênese, porque aumenta a biodisponibilidade de fatores importantes nesse processo, como o Fator de Crescimento Endotelial Vascular, o VEGF, que é o mais potente mediador da vascularização do tumor e o Fator de Crescimento Fibroblástico Básico , o FGFb , pela degradação dos componentes extracelulares, tais como colágeno tipo IV, XVIII e Perlecan, respectivamente (XU et al., 2001; BERGERS et al., 2000; WHITELOCK et al., 1996; IOZZO; ZOELLER; NYSTRÖM, 2009).

O saldo angiogênico é rigorosamente regulado pelas MMPs, porque elas também podem diminuir a formação de vasos sanguíneos através da geração de fragmentos de degradação que inibem a angiogênese (IOZZO; ZOELLER; NYSTRÖM, 2009; O’REILLY et al., 1999; WEN et al., 1999; THEOCHARIS et al., 2010).

1.4.6 MMPs e o câncer colorretal

(34)

crescimento e a progressão do câncer, angiogênese e aparecimento de metástases . Neste sentido, a detecção da expressão das MMPs, moléculas efetoras da degradação de elementos da membrana basal, torna-se de grande importância. Alterações nas MMPs têm sido relacionadas com alto grau de malignidade, agressividade tumoral, maior capacidade de invasão, progressão da doença, metástase e prognóstico desfavorável em vários sítios tumorais (FELIN et al., 2008).

A MT1-MMP, também denominada MMP-14, foi a primeira metaloproteinasse de membrana a ser identificada. MMP-14 é uma importante ativadora de várias MMPs secretadas, como a pro-MMP-2 e a pro-MMP-13. O aumento da expressão de MMP-2 está associado com maior potencial metastático em uma variedade de sistemas e, provavelmente, desempenha um papel central na invasão tumoral . No CCR, o aumento da expressão de MMP-14, se correlaciona com o estágio avançado do tumor .Vários estudos examinaram a relação entre os níveis de expressão de MMP-14, e os resultados em pacientes com câncer . Esses estudos descobriram que o excesso de MMP-14, está associada com mau prognóstico(KANAZAWA et al., 2010).

A MMP-14 é assim considerada iniciadora da cascata de ativação das MMPs. Lafleur et al. (2001) demonstraram que a MMP-14, era a principal enzima requerida para ativação da pró-MMP-2 em células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs), uma vez que anticorpos anti-MMP-14, bloqueiam este processo. O papel ativador da MMP-14, foi também descrito no processo de invasão tumoral, sendo produzido por células tumorais e fibroblastos no câncer gástrico e pancreático, e principalmente por fibroblastos no câncer colorretal (NABESHIMA et al., 2002) .

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2 OBJETIVOS

2.1 Geral

-Avaliar a imunoexpressão das metaloproteinases 2 e 14 e do inibidor tissular TIMP-2 no adenocarcinoma colorretal.

2.2 Específicos

-Avaliar a expressão das metaloproteinases 2 e 14 e de TIMP-2 no carcinoma intestinal de colo direito em comparação ao carcinoma de colo esquerdo

-Verificar a possível associação entre a expressão de MMP-2, MMP-14 e TIMP-2 e aspectos clínico-patológicos, com ênfase para o estadiamento (TNM)

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3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Casuística e material utilizado

Trata-se de um estudo de corte transversal, semiquantitativo, envolvendo todos os casos de blocos histológicos provenientes de colectomia devido ao carcinoma colorretal, no período de 2006-2010 (n=50), registrados nos Arquivos de Patologia Cirúrgica do Departamento de Patologia e Medicina Legal da Universidade Federal do Ceará. Secções de mucosa colônica histologicamente normal foram obtidas dos limites cirúrgicos distantes da neoplasia, em 16 casos.

Critério de inclusão: Todas as amostras dos casos fixadas em formalina a 10%, submetidas a processamento histológico e incluídas em parafina, durante o período de 2006 a 2010.

Critério de exclusão: Foram excluídos os casos com material insuficiente , aqueles que não foram fixados de forma adequada (que apresentaram autólise), casos de pacientes que foram submetidos a tratamento quimioterápico e também os que mostraram necrose tumoral extensa e por último os casos que não correspondiam histologicamente a carcinomas e casos de perda de material adequado durante os procedimentos técnicos.

3.2 Microarranjo tissular (Tissue microarray–TMA)

Bloco receptor do TMA – Foi utilizada uma técnica alternativa de baixo custo desenvolvida por nosso grupo (Gurgel et al , 2012), baseada em estudos prévios (WANG et al., 2006; DAN et al., 2004) para preparação do bloco receptor do TMA. Inicialmente foram confeccionados blocos maciços com parafina histológica granulada. Em seguida utilizou-se um papel molde com 24 pontos equidistantes, colocado sobre o bloco, com posterior marcação de 24 pontos no bloco de parafina com pincel atômico.(Figuras 1 e 2).

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Figura 1 - Marcação do bloco receptor do TMA Figura 2 - Bloco de TMA completamente marcado

Posteriormente foram confeccionados orifícios no bloco de parafina por meio da utilização de uma agulha padrão de crochê com 2 mm de diâmetro, através de movimentos giratórios suaves para evitar a quebra da parafina.(Figuras 3 e 4).

Figura 3 - Agulha metálica de crochê com 2 mm de diâmetro para preparação do TMA

Figura 4 - Perfuração do bloco receptor com agulha de crochê. Obtenção de orifícios cilíndricos receptores

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doadores fossem marcados com um círculo na região selecionada de cada bloco para permitir a retirada dos cilindros correspondentes de tecido incluso em parafina. O próximo passo foi a retirada de amostras tissulares impregnados por parafina do bloco doador com a utilização de um vazador de couro manual Graziano® (punch) modificado, segundo publicação prévia

(GURGEL et al., 2012) ; figuras 5 e 6.

Figura 5 - Vazador de couro (punch) manual modificado (Graziano®), para retirada de material do bloco doador

Figura 6 - Vazador de couro (punch) manual modificado (Graziano®, detalhe)

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Figura 7 - Blocos receptores de TMA prontos Figura 8 - Bloco receptor de TMA em detalhe e recobertos por parafina Produto final

3.3 Imunohistoquímica

Inicialmente os blocos do tissue microarray foram submetidos à microtomia, com cortes de quatro micrômetros de espessura e em lâminas silanizadas. Estas lâminas foram deixadas por 1 hora na estufa a 60ºC e em seguida foram desparafinizadas em 3 passagens no xilol por 5 minutos cada.

Os processos de diafanização, reidratação e recuperação do epítopo foram feitos utilizando-se o módulo de pré-tratamento Dako PT Link™ e Tampão Tris/EDTA pH 9,0 (3 em 1); (Target Retrieval Solution pH 9,0, 3-in-1; Ref: S2375; Dako).

Em seguida, as lâminas foram retiradas do módulo de pré-tratamento e deixadas imersas em tampão de lavagem (EnVision™ FLEX Wash Buffer; Ref: K8007, Dako) na temperatura ambiente por cinco minutos.

Posteriormente foi realizado o bloqueio da peroxidase endógena com o reagente EnVision™Peroxidase-Blocking (Ref: SM801, Dako) por dez minutos. Logo após, os cortes histológicos foram colocados em três banhos de água destilada e, depois, em tampão de lavagem por cinco minutos.

No momento da diluição dos anticorpos primários, utilizou-se o diluente padrão (EnVision™ FLEX Antibody Diluent,Ref: K8006, Dako). As lâminas foram incubadas com o anticorpo primário diluído em título pré-estabelecido a 25ºC por 13 horas.

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anti-MMP-2 (de camundongo anti-humano, sc-13595, SCBT®), anti-MMP-14 (de camundongo anti-humano, sc-80210, SCBT®) e anti-TIMP-2 (de camundongo anti-humano, sc-21735, SCBT®).

-Diluições do Anticorpo primário: MMP-2( 1:10);MMP-14 (1:10);TIMP-2(1:10)

Logo após, as lâminas foram lavadas duas vezes em tampão de lavagem por três minutos e permaneceram incubadas com um amplificador de sinal por trinta minutos (EnVision™ FLEX+Mouse LINKER; Ref: K8021), sendo imersas em dois banhos de tampão de lavagem, por três minutos.

Para a detecção foi utilizado um sistema polimérico livre de biotina (Dako EnVision™FLEX/HRP; Ref: SM802, Dako) incubando-se os cortes histológicos por trinta

minutos a 25ºC. Em seguida, foram lavadas duas vezes por três minutos. Posteriormente, os cortes foram incubados em solução substrato cromógeno (EnVision™

FLEX DAB+ Chromogen;Ref: DM827) por 5 minutos a 25ºC.

Logo após, as lâminas foram lavadas em água destilada e contracoradas com Hematoxilina (EnVision™ FLEX Hematoxylin; Ref: K8008) por cinco minutos, sendo depois lavadas em água corrente e desidratadas em etanol absoluto através de três banhos de trinta segundos, seguidos de três banhos de xilol por trinta segundos. Finalizou-se o processo com a montagem, anexando a lamínula com o Bálsamo do Canadá, deixando as lâminas prontas para a posterior observação em microscópio óptico.

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3.4 Controles

• Controles positivos: Placenta para MMP-2 (ROJIANI et al., 2010), Rim para MMP-14 (BONFIL et al., 2007), Pulmão para TIMP-2 (DONG et al., 2005).

• Controles negativos: estes foram obtidos a partir da supressão (retirada) do anticorpo primário.

3.5 Escores

• Os seguintes escores, utilizados previamente em relato anterior (GURGEL, 2011),baseados em outros autores (BUSKENS et al, 2003 ) foram atribuídos a cada imunomarcador, expresso ou não, levando-se em conta a intensidade da coloração e a percentagem de células coradas em cada amostra examinada, nas células neoplásicas ou mononucleares do estroma presentes no microambiente tumoral: 0 = ausência de imunomarcação ou raras células coradas (<5%); 1= marcação discreta na maioria (> 50%) das células tumorais ou inflamatórias mononucleadas; marcação moderada em minoria de células (< 50%); 2= marcação moderada na maioria (> 50%) das células tumorais ou inflamatórias mononucleadas; marcação intensa em minoria de células (<50%); 3= marcação intensa na maioria (> 50%) das células tumorais ou inflamatórias mononucleadas. Os escores 1, 2 ou 3 serão classificados pelo padrão predominante,em cada caso.

• Escores 0 e 1 serão considerados “baixa expressão” enquanto escores 2 e 3 corresponderão a “alta expressão’’.

3.6 Avaliação intra e inter-observadores

(43)

3.7 Análise estatística

Utilizou-se o teste exato de Fisher nas correlações clínico-patológicas e demais tabelas de contingência. O valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significante. Optou-se pelo programa GraphPad Prism 5 para realização dos gráficos e testes estatísticos.

3.8 Aprovação no Comitê de Ética em Pesquisa com seres humanos

(44)

4 RESULTADOS

4.1 Controles

As figuras seguintes mostram os controles externos positivo e negativo de amostras selecionadas, de acordo com o que é indicado na literatura, para MMP-2 (ROJIANI et al., 2010), MMP-14 (BONFIL et al., 2007) e TIMP-2 (DONG et al., 2005).

Figura 9 - MMP-2 – Controle positivo.

Marcação em algumas áreas (setas). Placenta - 400X

(45)

Figura 10 - MMP-2. Controle negativo.

Retirado anticorpo primário.Ausência de imunomarcação. Placenta – 400X

Figura 11 - MMP-14 – Controle positivo.

Marcação intensa em túbulos renais(setas brancas). Observar glomérulo negativo (seta preta, controle interno negativo). Rim - 400X

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Figura 12 - MMP-14. Controle negativo.

Retirado anticorpo primário.Ausência de imunomarcação. Rim – 400X

Figura 13 - TIMP-2. Controle positivo.

Marcação moderada em mononucleares (macrófagos) adjacentes aos septos alveolares

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Figura 14 - TIMP-2. Controle negativo.

Retirado anticorpo primário.Ausência de imunomarcação. Pulmão– 400X

As figuras seguintes mostram mononucleares em corte usual corado pela Hematoxilina Eosina e após marcação pelo CD68. A maioria destas células apresentou positividade intensa para este marcador, o que os identifica como macrófagos.

Figura 15 – células neoplásicas e microambiente tumoral

Seta: Mononucleares no estroma tumoral, corados pela H & E( setas), em torno

d de células tumorais dispostas em arranjo glandular(*) -400X

(48)

Figura 16 – caracterização de mononucleares no microambiente tumoral

Mononucleares corados intensamente pelo CD68 o que os identifica como macrófagos. Observar ausência de marcação em células tumorais adjacentes - 400X

4.2 Imunoexpressão em mucosa normal versus amostras de tecido tumoral

As tabelas 1 e 2 apresentam a expressão de MMP-2, MMP-14 e TIMP-2, por escores, nos dois tipos celulares estudados, em amostras de carcinomas colorretais primários e na mucosa colônica normal.

Tabela 1 – Expressão de MMP-2, MMP-14 e TIMP-2 em células epiteliais de mucosa normal e tumoral , em carcinomas colorretais

Escores IHQ

Células epiteliais

MMP-2 MMP-14 TIMP-2

Normal Tumoral Normal Tumoral Normal Tumoral

0 14 47 2 0 14 15

1 0 0 5 9 2 24

2 0 0 5 12 0 11

3 0 0 2 29 0 0

TOTAL 14 47 14 50 16 50

(49)

Em relação à freqüência de positividade, MMP-2 foi mais expressa em mononucleares do microambiente tumoral (10/35 casos=29%) do que neste tipo de células presente na mucosa colônica normal (2/14 casos=14%; tabela 2). Apenas 2 dos casos positivos tiveram alta expressão, no tecido tumoral e nenhum na mucosa normal.

Tabela 2 – Expressão de MMP-2, MMP-14 e TIMP-2 em mononucleares do estroma de mucosa normal e tumoral , em carcinomas colorretais

Escores IHQ

Mononucleares do estroma

MMP-2 MMP-14 TIMP-2

Normal Tumoral Normal Tumoral Normal Tumoral

0 12 25 1 1 6 6

1 2 8 2 7 10 11

2 0 2 5 15 0 16

3 0 0 6 24 0 10

TOTAL 14 35 14 47 15 43

IHQ = Imunohistoquímica;

A MMP-14 foi mais expressa nas amostras de tumor, tanto em células neoplásicas quanto em mononucleres. A principal diferença ocorreu em células neoplásicas, com positividade em 100% dos casos (50/50) comparado com 14% das células epiteliais normais da mucosa (2/14; p=0,0451). A alta expressão (escores 2 e 3) esteve também muito mais presente nas células epiteliais tumorais (41/50=82% versus 7/14=50% da mucosa normal; p=0,0314). Nos mononucleares, MMP-14 apresentou discreto aumento em frequência e alta expressão, na amostra de carcinomas colorretais, mas com diferença não significante em relação à mucosa não-tumoral (tabelas 1 e 2).

(50)

4.3 Imunomarcação e variáveis clínico-patológicas

As tabelas numeradas de 1 a 6 mostram a associação entre a expressão de MMP-2, de MMP-14 e do TIMP-2 em células neoplásicas e mononucleares com as variáveis clínico-patológicas de sexo,idade, localização anatômica, dimensão do tumor, invasão angiolinfática, infiltração perineural e TNM (T e N) em 50 casos de carcinoma colorretal, sendo 36 localizados no colo esquerdo e 14 no direito.

Pode-se observar o predomínio de pacientes do sexo masculino, com faixa etária acima dos 50 anos de idade, e tumores que, em sua maioria, se encontravam no colo esquerdo e em estágios mais avançados apesar de que na maioria dos casos (55%) não houve metástases linfonodais.

Os tumores apresentam-se na maior parte dos casos com o diâmetro maior que 5 centímetros e tanto a invasão angiolinfática quanto a infiltração perineural estiveram ausentes na maioria dos casos.

O padrão de imunomarcação variou de acordo com o anticorpo e mostrou nas células neoplásicas que a MMP-2 não apresentou coloração alguma, ou seja, expressão negativa enquanto o TIMP-2 apresentou marcação em todos os escores. Nos mononucleares, a MMP-2 apresentou marcação até o escore 2, enquanto que o TIMP-2 e a MMP-14 apresentaram marcação em todos os escores.

(51)

Ao se analisar a tabela seguinte (tabela 3) verifica-se que nas células neoplásicas a expressão de MMP-2 foi negativa em todos os casos, não sendo assim demonstrada relação entre a expressão deste imunomarcador com as demais variáveis analisadas.

Tabela 3 - Expressão de MMP-2 e variáveis clínico-patológicas em células neoplásicas no carcinoma colorretal

Variáveis clínico-patológicas

Expressão de MMP-2 (células neoplásicas) Escores

n 0 1 2 3 # p

Localização anatômica

Colo Direito 14 12 0 0 0 2 -

Colo Esquerdo 36 35 0 0 0 1

Sexo

Masculino 29 27 0 0 0 2 -

Feminino 21 20 0 0 0 1

Idade

< 50 11 9 0 0 0 2

≥50 38 37 0 0 0 1 -

# 1 1 0 0 0 0

Dimensão do tumor

<5 cm 12 11 0 0 0 1

≥ 5 cm 37 35 0 0 0 2 -

# 1 1 0 0 0 0

Invasão angiolinfática

Ausente 27 24 0 0 0 3

Presente 21 21 0 0 0 0 -

# 2 2 0 0 0 0

Infiltração perineural

Ausente 9 8 0 0 0 1

Presente 7 7 0 0 0 0 -

# 34 32 0 0 0 2

Grau de invasão (T)

T1 2 2 0 0 0 0

T2 - T4 46 43 0 0 0 3 -

# 2 2 0 0 0 0

Metástases linfonodais (N)

N0 26 23 0 0 0 3

N1 - N3 21 21 0 0 0 0 -

# 3 3 0 0 0 0

Total 50 47 0 0 0 3

(52)

Nos mononucleares ,a MMP-2 apresentou marcação até o escore 2 (tabela 4).A maior parte dos casos apresentou baixa expressão deste biomarcador (marcação com escores 0 e 1).

Pode-se dizer que não houve relação entre a expressão de MMP-2 com os demais variáveis. Tabela 4 - Expressão de MMP-2 e variáveis clínico-patológicas em mononucleares no carcinoma colorretal

Variáveis Clínico-patológicas

Expressão de MMP-2 (Mononucleares) Escores

n 0 1 2 3 # p

Localização anatômica

Colo Direito 14 7 3 0 0 4 1,0000

Colo Esquerdo 36 18 5 2 0 11

Sexo

Masculino 29 15 4 0 0 10 0,2017

Feminino 21 10 4 2 0 5

Idade

< 50 11 6 2 0 0 3

≥50 38 18 6 2 0 12 1,0000

# 1 1 0 0 0 0

Dimensão do tumor

<5 cm 12 5 2 1 0 4

≥ 5 cm 37 20 6 1 0 10 0,4101

# 1 0 0 0 0 1

Invasão angiolinfática

Ausente 27 9 4 2 0 12

Presente 21 14 4 0 0 3 0,1989

# 2 2 0 0 0 0

Infiltração perineural

Ausente 9 3 1 0 0 5

Presente 7 4 1 0 0 2 -

# 34 18 6 2 0 8

Grau de invasão (T)

T1 2 2 0 0 0 0

T2 - T4 46 22 8 2 0 14 1,0000

# 2 1 0 0 0 1

Metástases linfonodais (N)

N0 26 12 4 2 0 8

N1 - N3 21 12 3 0 0 6 0,4886

# 3 1 1 0 0 1

Total 50 25 8 2 0 15

(53)

Conforme pode-se observar na tabela abaixo (tabela 5) verifica-se que prevaleceu a alta expressão de MMP-14 nas células neoplásicas com a maior parte dos casos com escore 3. Em nenhum dos casos houve expressão negativa.Não houve relação entre a expressão deste imunomarcador com as demais variáveis analisadas.

Tabela 5 - Expressão de MMP-14 e variáveis clínico-patológicas em células neoplásicas no carcinoma colorretal

Variáveis clínico-patológicas

Expressão de MMP-14(Células Neoplásicas) Escores

n 0 1 2 3 p

Localização anatômica

Colo Direito 14 0 2 6 6

1,0000

Colo Esquerdo 36 0 7 6 23

Sexo

Masculino 29 0 3 9 17

0,1404

Feminino 21 0 6 3 12

Idade

< 50 11 0 0 1 10

0,0980 ≥ 50

38 0 9 11 18

# 1 0 0 0 1

Dimensão do tumor

< 5 cm 12 0 3 0 9

0,6693

≥ 5 cm 37 0 6 11 20

# 1 0 0 1 0

Invasão angiolinfática

Ausente 27 0 5 5 17

1,0000

Presente 21 0 4 6 11

# 2 0 0 1 1

Infiltração perineural

Ausente 9 0 1 2 6

0,5500

Presente 7 0 2 1 4

# 34 0 6 9 19

Grau de invasão (T)

T1 2 0 0 0 2

1,0000

T2 - T4 46 0 9 11 26

# 2 0 0 1 1

Metástases linfonodais (N)

N0 26 0 3 5 18

0,2631

N1 - N3 21 0 6 6 9

# 3 0 0 1 2

Total 50 0 9 12 29

Imagem

Figura 1 - Marcação do  bloco receptor do TMA       Figura 2 - Bloco de TMA completamente marcado
Figura 5 - Vazador de couro (punch)  manual modificado  ( Graziano®),  para retirada de material                   do bloco doador
Figura 7 - Blocos receptores de TMA prontos    Figura 8 - Bloco receptor de TMA em detalhe    e recobertos por parafina                                         Produto final
Figura 9 -  MMP-2  –  Controle positivo.
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