UTILIZAÇÃO DO LEITE DESNATADO E DO ÁCIDO 3-INDOL ACÉTICO NA CONSERVAÇÃO DO SÊMEN SUÍNO
(Utilisation of skimmed milk and 3-indole acetic acid in swine semen preservation)
Ricardo TONIOLLI
1*, Paola Capibaribe JATAHY
1, Michelle Costa e SILVA
1& Faviano Ricelli da Costa MOREIRA
21Laboratório de Reprodução Suína e Tecnologia de sêmen/FAVET / UECE, 2ESAM - Mossoró
RESUMO
O pleno desenvolvimento da inseminação artificial na espécie suína, depende basicamente de se conseguir uma conservação prolongada do sêmen, sem perda do seu poder de fecundação. Foram coletadas amostras de dois reprodutores uma vez por semana através da técnica da mão enluvada. Formou-se quatro lotes experimentais:
1) diluidor de Beltsville (BTS); 2) BTS + 100 ng/mL de ácido 3-indol-acético (IAA); 3) leite desnatado (LD);
4) leite desnatado adicionado de 100 ng/mL de ácido 3-indol-acético (LDIAA). De cada ejaculado e para cada tratamento, foi retirado um total de 525 x10
6sptz, posteriormente diluídos de forma a completar um volume final de 15 mL por lote (sêmen + diluidor = 35 x10
6sptz/mL) dentro de cada amostra, colocados dentro de tubos de ensaio e conservados em geladeira entre 15 e 17ºC, por quatro dias. A análise seminal, vigor e motilidade, foi realizada em cinco períodos distintos a saber: D0 (dia da coleta), D1, D2, D3 e D4, após homogeinização e cinco min de incubação em banho-maria a 39
oC. Observou-se que o diluidor leite desnatado obteve os melhores resultados em relação aos outros diluidores testados até 24 h de conservação (dias D0 e D1), apresentando diferenças estatisticamente significativas (P<0,05). Após o segundo dia de conservação do sêmen, os diluidores BTS e BTS + IAA foram significativamente superiores(P<0,05). Concluindo, a adição do IAA ao diluidor BTS ou ao leite desnatado, não produziu efeito benéfico na conservação do sêmen suíno. O leite desnatado mostrou ser um excelente meio diluidor para o sêmen suíno, a condição de que não se exceda de 24 h de conservação.
PALAVRAS-CHAVES: sêmen, suíno, conservação, diluição, leite desnatado, BTS
ABSTRACT
The absolute development of the artificial insemination in the swine depends basically on achieving a long term semen conservation, without prejudicing the fertilization power. Two samples were collected animals from animals once a week by gloved-hand technique. Four experimental groups were formed: 1) Beltsville extender (BTS);
2) BTS + 100 ng/mL of 3-indole acetic acid (IAA); 3) Skimmed milk (SM); 4) Skimmed milk with 100ng/mL of 3-indole acetic acid (SMIAA). From each ejaculate and to each treatment were taken a total of 525 x 10
6sptz.
Afterwards each was diluted to complete to a final volume of 15mL per group (semen + extender = 35 x 10
6sptz/mL) and then they were put into assay tubes and maintained in the fridge between 15 and 17ºC for four days. The seminal analysis, vigor and spermatic motility, were made in five different periods: D0 (collection day), D1 and D4, after mixed and after five min of incubation in the water bath at 39ºC. It was observed that the
Ciência Animal, 11(1):21-26, 2001
Av. Paranjana, 1700, 60.740-000 Fortaleza, Ce e-mail: toniolli@roadnet.com.br
*Autor para correspondência:
skimmed milk extender had better (P<0.05) results than the other extenders tested up to 24 h of conservation (days D0 and D1). After the second day of semen conservation, the BTS and BTS + IAA were better (P<0.05).
The IAA addition to BTS extender did not produce any beneficial effect on the semen conservation. The skimmed milk demonstrated to be an excellent extender to swine semen conservation for up to 24 h.
KEYWORDS: Semen, swine, conservation, dilution, skimmed milk, BTS.
1989; SONE et al., 1992).
Tem sido demonstrado que o leite desnatado, utilizado como diluidor do sêmen equino, é de uso prático e efetivo na proteção do espermatozóide durante o período de conservação. Ele é um fluído biológico de composição complexa, contendo componentes tanto com ação benéfica quanto maléfica para o espermatozóide (BARTELLIER et al., 1998).
Na espécie caprina, a tecnologia do sêmen resfriado diluído em leite desnatado, tem-se mostrado eficiente no processo de difusão genética de reprodutores (NUNES, 1988).
É possível conservar o sêmen suíno, sob a forma líquida, por até seis dias, mantendo seu poder de fecundação, sem necessidade de se aumentar o número de espermatozóides por dose inseminante, quando em presença do ácido 3-indol acético (IAA) (TONIOLLI et al., 1996). Esta possibilidade, propicia uma maior flexibilidade no uso das doses em granjas suinícolas, permitindo uma melhor disponibilidade do sêmen e seu transporte para localidades mais distantes.
O IAA, uma auxina de origem vegetal, que ao ser introduzida nos diluidores convencionais para o sêmen de diferentes espécies, confere aos espermatozóides um incremento da motilidade, permitindo a conservação do sêmen por períodos mais longos (TONIOLLI et al., 1995 e 1996; NUNES et al., 1996). Deste modo, a qualidade do meio diluidor que permita um maior período de conservação do ejaculado, é importante para o sucesso dos resultados da inseminação artificial (PEREZ GARCIA, 1958; JOHNSON et al., 1988;
WABERSKI et al., 1990). Assim, se faz necessário o desenvolvimento de técnicas e soluções que permitam a utilização do sêmen resfriado sem queda dos resultados de fertilidade, sendo esta uma característica importante para a reprodução, em particular na espécie suína (TONIOLLI et al., 1998). Este trabalho teve por objetivo estudar o sêmen suíno, diluído no leite desnatado e conservado durante quatro dias em geladeira a uma temperatura entre 15 e 17º C.
INTRODUÇÃO
A inseminação artificial é uma técnica utilizada já há vários anos, e tem sido uma excelente alternativa tecnológica para os criadores de suínos. Ela propicia um melhor controle sanitário bem como otimiza a utilização do varrão, diminuindo o número total de reprodutores dentro da propriedade, minimizando os custos de produção para o criador (TONIOLLI, 1994).
A técnica, quando bem orientada, também favorece o progresso genético, reduzindo a freqüência de genes recessivos indesejáveis no plantel (FOOTE & PARKS, 1993). Entretanto, seu pleno uso, depende da solução de problemas relacionados à conservação de sêmen.
Atualmente, sua utilização extensiva baseia-se na conservação do sêmen resfriado, com resultados de fertilidade semelhantes aos da monta natural, mas limitando-se a aplicação do sêmen a um período máximo de três dias após a colheita (PAQUIGNON et al., 1982a; SCHEID et al., 1986).
O componente mais crítico dos métodos de conservação é a manutenção da viabilidade espermática (PARKS & GRAHAM, 1992). Para uma eficiente organização das inseminações e otimização das doses inseminantes, é essencial que o sêmen possa ser estocado por longos períodos de tempo com mínima perda da sua habilidade de fertilização (PAQUIGNON et al., 1982a ; RILLO et al., 1991).
Estudos têm sido feitos no intuito de aumentar a duração da sobrevivência do espermatozóide no sêmen suíno diluído e conservado sob a forma líquida (BARITEAU et al., 1977; SLAWETA et al., 1981;
PAQUIGNON et al., 1987 e 1988; CHENG, 1988;
GALLI & BOSISIO, 1988; RILLO et al., 1991;
SONE et al., 1992). Sabe-se que o diluidor de Beltsville
(BTS) é o mais largamente utilizado neste sentido,
permitindo taxas de fertilidade e prolificidade aceitáveis
por um período acima de três dias de conservação
(STRZEZEK et al., 1979; PAQUIGNON et al., 1982b
e 1987; GALLI & BOSISIO, 1988; REVELL et al.,
MATERIAL E MÉTODOS
Coleta
Dois reprodutores, sendo um da raça Duroc e outro da raça Landrace, foram submetidos à colheita de sêmen, uma vez por semana, através da técnica da mão enluvada, em recipiente colocado dentro de copo térmico coberto por gaze.
Diluidores
Foram testados quatro diluidores, que formaram os diferentes tratamentos:
Tratamento 1 ⇒ Diluidor de Beltsville (BTS), controle;
Tratamento 2 ⇒ BTS + 100 ng/mL de ácido 3-indol acético ( IAA ) = IAA;
Tratamento 3 ⇒ Leite desnatado = LD;
Tratamento 4 ⇒ Leite desnatado + ácido 3-indol acético a 100 ng/mL = LDIAA.
O diluidor a base de leite desnatado era composto de:
10 g de leite desnatado em pó + 0,194 g de glicose + 0,336 g de antibiótico + água destilada q.s.p. 100 mL.
Processamento dos ejaculados
Após a colheita mediu-se a concentração (x 10
6sptz/mL), volume (mL), total de espermatozóides (x 10
9sptz) e a temperatura do sêmen (º C), para cada ejaculado de cada animal. Para cada lote experimental, foi separado um total de 525 x 10
6sptz diluídos de forma a completar um volume final de 15 mL, respeitando-se sempre a concentração de 35 x 10
6sptz/mL. Este volume foi repartido em três tubos de ensaio, equivalendo cada tubo a um dia de análise (D0, D1 e D4). A diluição do sêmen proveniente de cada ejaculado, em cada um dos diluidores testados, foi feita a temperatura de 37ºC.
Análises do ejaculado
Após coleta e diluição em tubos de ensaio, o sêmen foi acondicionado e conservado em geladeira entre 15 e 17ºC, durante um período de quatro dias.
A análise seminal foi realizada em cinco períodos distintos a saber: D0 (dia da coleta), D1, D2, D3 e D4. Para cada dia de análise e para cada tratamento foi retirada uma amostra de sêmen que após agitação foi colocada em banho-maria a 37ºC por 5 min para avaliação do vigor e da motilidade espermática. Para tanto, colocou-se uma gota, 15 µL, de sêmen diluído
entre lâmina e lamínula e que foi analisada ao microscópio óptico em um aumento de 100x.
Análise estatística
Cada animal constituiu-se em uma unidade experimental com o número de ejaculados correspondendo ao número de repetições do experimento. O delineamento experimental utilizado foi o de blocos ao acaso, com a análise de variância feita através da avaliação das médias e desvios-padrão.
As diferenças entre médias foram analisadas pelo teste de Student e os resultados em porcentagem pelo Qui- quadrado corrigido, ambos a 5%, sendo utilizado o programa Statview 5.0 para a execução das análises estatísticas.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Um diluidor que permita a manutenção de condições osmóticas favoráveis durante o período de conservação do sêmen, tem sido objeto de estudo de vários autores (NORMAN et al., 1958; PILLAI et al., 1978; FARSTAD, 1996), que trabalharam no sentido de desenvolver diluidores para o sêmen de diversas espécies domésticas, utilizando soluções a base de produtos de origem animal, tais como a gema de ovo e o leite, e de origem vegetal como o leite de coco.
Observou-se que o diluidor leite desnatado adicionado ou não do ácido 3-indol acético (IAA), apresentou os melhores resultados de vigor e motilidade espermática em relação aos outros diluidores.
Entretanto, esta superioridade estatisticamente
significativa (P<0,05), foi presente apenas nos dias D0
e D1 de conservação (Fig. 1 e 2). Estes resultados
podem ter sido devido à presença das lipoproteínas e
lecitinas do leite, que segundo FOOTE (1974) e
MEMON & OTT (1981), promovem a proteção da
célula espermática contra o choque térmico, quando
adicionado ao sêmen antes do resfriamento. Por outro
lado, a partir do segundo dia de conservação do
sêmen, esta diferença foi também observada, desta
feita, a favor dos outros dois diluidores, BTS e BTS +
IAA (P<0,05). Os valores do vigor e da motilidade
tiveram uma queda bastante intensa já a partir do
segundo dia de conservação do sêmen, chegando a
zero no quarto e último dia, nos tratamentos onde o
sêmen foi mantido nos diluidores a base de leite
desnatado, demostrando a incapacidade destes diluidores sustentarem por mais de 24 h os valores de motilidade e vigor. Sabe-se que temperaturas mais altas elevam a taxa metabólica celular. Segundo GARCIA
& GRAHAN (1987), o leite desnatado é um excelente meio conservador para os espermatozóides, quando estocados a baixas temperaturas (4ºC). Entretanto, em temperaturas mais altas (15ºC), ele teria efeitos maléficos à célula espermática, devido à presença de componentes moleculares tóxicos. Provavelmente, a queda bastante acentuada nos valores de vigor e motilidade espermática após as primeiras 24 h de conservação, podem ser explicados, ao menos em parte, pelas observações destes autores.
A adição do ácido 3-indol acético (IAA) ao diluidor leite desnatado, apesar de ter estimulado os espermatozóides e propiciado valores médios maiores para as duas características estudadas, quando de sua ausência no meio diluidor, estas diferenças não foram estatisticamente significativas (P>0,05) e isto durante todo o período de conservação do sêmen. Já a partir do terceiro dia de conservação de sêmen (D3), nenhuma ação benéfica da adição do IAA foi vista, com os valores de vigor e motilidade descendo para zero. A adição do IAA ao diluidor BTS também não produziu efeito benéfico às características de vigor e motilidade espermática. Neste caso, não houve
diferença significativa (P>0,05) durante todo o período de conservação do sêmen.
Segundo AZEVEDO (1999), a adição do IAA ao leite desnatado, promove um incremento do vigor e da motilidade espermática, devido à proteção que esta auxina confere aos espermatozóides, diminuindo o estresse provocado pelo manuseio do sêmen. Entretanto, os resultados deste trabalho, não evidenciaram nenhuma ação benéfica da adição do IAA ao meio diluidor em todos os lotes do experimento, contrastando com as afirmativas do autor acima citado. Segundo observações anteriores, a adição deste componente ao diluidor BTS, não propiciou melhores resultados de fertilidade de fêmeas inseminadas. A adição do IAA a meios diluidores do sêmen do varrão, de acordo com os resultados deste trabalho em
comparação aos de outros autores, não apresentam uma ação benéfica constante, necessitando de maiores estudos in vitro e in vivo, e sobre um maior número de animais.CONCLUSÕES
O leite desnatado mostrou ser um excelente meio diluidor para o sêmen suíno, por um período não superior a 24 h. Faz-se necessário ainda maiores estudos, para se colocar em evidência a ação benéfica ou não do ácido 3-indol acético sobre o vigor e a motilidade da célula espermática resfriada, pois neste trabalho a adição do
Figura 1. Vigor espermático do sêmen suíno, diluído em diferentes diluidores e conservado a 17
oC durante quatro dias.
Letras diferentes entre colunas, dentro de cada dia de conservação, diferença estatisticamente significativa (P<0,05).
0 1 2 3 4 5
0 1 2 3 4
BTS IAA DT LDIAA
Dias de conservação
A A A
A A A AA
BB
BB
B B
B B AB
C
A BC
Vigor espermático
LD
IAA ao diluidor BTS ou leite desnatado não produziu efeito benéfico a conservação do sêmen suíno.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AZEVEDO, D. M. M. R.; TONIOLLI, R. Água de coco estabilizada suplementada com antibióticos e ácido 3- indol acético na conservação de sêmen de caprino Marota. Ci. Anim. v. 9, p. 37-42, 1999.
BARITEAU, F.; BUSSIÈRE, J.; COUROT, M.
Insémination artificielle porcine. Amélioration technique, résultats récents. J. Rech. Porc. Franc., v. 9, p. 11-14, 1977.
BARTELLIER, F.; DUCHAMP, G.; VIDAMENT, M.;
ARNAUD, G.; PALMER, E.; MAGISTRINI, M.
Delayed insemination is successful with a new extender for storing fresh equine semen at 15º C under aerobic condictions. Theriogenology, v. 50, p.2 29-236, 1998.
CHENG, W. T. K. Preservation of boar semen at 15º C.
J. Chin. Soc. Vet. Sci., v. 14, p. 339-350, 1988.
FARSTAD, W. Semen cryopreservation in dogs and foxes. Elsevier Science PII: p. 378-432, 1996.
FOOTE, R. H. Artificial Insemination. In: Reproduction in farm animals, E.S.E. Hatez. Ed. Lea and Lebiger, Philadelphia, p. 409-431, 1974.
FOOTE, R. H.; PARKS, J. E. Factors affecting the preservation and fertility of bull sperm: a brief review.
Reprod. Fert. Develop., v. 5, p. 665-673, 1993.
GALLI, A.; BOSISIO, M. Quality of semen stored at
+15º/16ºC as related to fertility of artificially inseminated in swine. Theriogenology, v. 30, p. 1185-1189, 1988.
GARCIA, M. A.; GRAHAM, E. F. Dialysis of bovine semen and its effects on fresh and freeze - thawed spermatozoa. Cryobiology, v. 24, p. 446-454, 1987.
JOHNSON, L. A.; AALBERS, J. G.; GROOTEN, J. J.
G. Artificial insemination of swine: fecundity of boar semen stored in BTS-TS, modified Modena (MM) or MR-A and inseminated on one, three and four days after collection. Zuchthygiene, v. 23, p. 49-55, 1988.
MEMON, M. A.; OTT, R. S. Methods of semen preservation and artificial insemination in sheep and goats. World Review of Animal Production. vol. 17, n.1, January - March. 1981.
NORMAN, C.; JOHNSON, C. E.; PORTERFIELD, I.
D. Livability of bovine spermatozoa at room temperature in cocconut-citrate calcium carbonate diluent. J. Dairy Sci.,v. 41, p. 733, 1958.
NUNES, J. F. A inseminação artificial em caprino no nordeste do Brasil. Rev. Brasil. Reprod. Anim., v. 12, p. 85-91,1988.
NUNES, J. F.; COMBARNOUS, Y.; OLIVEIRA, L.
F.; TEIXEIRA, M. D. Utilização da água de coco e suas frações ativas na conservação in vitro do sêmen na espécie caprina. Ci. Anim., v. 2, p. 32-43, 1996.
PAQUIGNON, M.; DACHEUX, J. L.; COUROT, M. Étude in vitro de quelques facteurs permettant un meilleur maintien de la survie des spermatozoïdes au cours d´une longue conservation. J. Rech. Porc.
Figura 2. Motilidade espermática do sêmen suíno, diluído em diferentes diluidores e conservado a 17
oC durante quatro dias.
Letras diferentes entre colunas, dentro de cada dia de conservação, diferença estatisticamente significativa (P<0,05).
0 20 40 60 80 100 120
0 1 2 3 4
Dias de conservação
Motilidade (%)
BTS IA A LD LDIA A
A A A A
A AA
B B B
B B B B
B B A B
AA
Franc, v. 14, p. 81-84, 1982a
PAQUIGNON, M.; BUSSIÈRE, J.; BARITEAU, F.;
DACHEUSE, J. L.; COUROT, M. Effect du dilueur, du taux de dilution et du plasma séminal sur la fertilité des truies après une longue conservation de la semence. J.
Rech. Porc. Franc, v. 14, p. 85-90, 1982b.
PAQUIGNON, M.; BUSSIÈRE, J.; BARITEAU, F.
Résultats récents en matiére de technologie de la conservation de la semence de verrat. J. Rech. Porc.
France, v. 19, p. 63-78, 1987.
PAQUIGNON, M.; BUSSIÈRE, J.; BARITEAU, F.
Efficacité des techniques de consérvation de la semence de verrat. INRA Prod. Anim.,v. 1, p. 271-280, 1988.
PARKS, J. E.; GRAHAM, J. K. Effects of cryopreservation procedures on sperm membranes.
Theriogenology, v. 38, p. 209-222, 1992.
PEREZ GARCIA, T. Importancia de la tecnologia en la obténcion del semen bovino. Rev. Patron. Biol. Anim., v.
4, p. 249-257, 1958.
PILLAI, V. B.; NEELAKANTA, T.; MATHAI, R.
Efficiency of cocconut - milk extender as a diluent the preservation buck semen at room temperature. Kerala J. Vet. Sci., v. 9, p. 290-292, 1978.
REVELL, S. G., GLOSSOP, C. E. A long time ambient temperature extender for boar semen. Anim. Product., v. 48, p. 579-584, 1989.
RILLO, M. S.; SANCHEZ, R.; GARENA, P. Current situation of swine artificial insemination technique with liquid semen in Spain. In: Proceedings of 2nd International Conference on Boar semen Preservation, Madrid, 26, p. 321-324, 1991.
SCHEID, I. R., WENTZ, I., SOUZA, N. M., MARIANO, M.S. Resultado comparativo da inseminação artificial de suínos com sêmen congelado
e resfriado. Comunicado Técnico - EMBRAPA, v. 100, p.1-3, 1986.
SLAWETA, R.; SIKORSKAL, J.; STRZEZEK, J. The effect of storing boar semen at 15ºC for varying lengths of time on the morphology and biological value of spermatozoa. Med. Wet.,v. 37, p. 687-690, 1981.
SONE, M.; CHIKYU, M.; YOSHIDA, M.; BAMBA, K.; OGASA, A. Storage of boar semen in liquid form Jap. J. Swine Sci., v. 29, p. 41-50, 1992.
STRZEZEK, J.; SMIGIELSKA, J.; LIMINOWICZ, J.;
CZECZOT, H.; GLOGOWSKI, J. Metabolism of boar semen diluted in differents diluents and stored at 18º-20ºC.
Wojewod. Zaklad Wet., 153-162, 1979.
TONIOLLI, R. Biotecnologia da Reprodução na espécie suína. Ci. Anim., v. 4, p. 35-43, 1994.
TONIOLLI, R.; BARITEAU, F.; BUSSIÈRE, J.;
COUROT, M.; COMBARNOUS, Y. Conservation prolongée du sperm frais de verrat. J. Rech. Porc. Franc., v. 27, p. 67-70, 1995.
TONIOLLI, R.; BUSSIÈRE, J.; COUROT, M.;
MAGISTRINI, M.; COMBARNOUS, Y. Effect of indole –3- acetic acid (plant auxin) on the preservation at 15ºC of boar semen for artificial insemination. Reprod.
Nut. Dev., v. 36, p. 503-511, 1996.
TONIOLLI, R.; MESQUITA, D. S. M.;
CAVALCANTE, S. G. Avaliação in vitro do sêmen de suíno diluído em BTS e na água de coco in natura e estabilizada. Rev. Brasil. Reprod. Anim., v. 22, p. 198- 201, 1998.
WABERSKI, D.; DIRKSEN, G.; WEITZE, K. F.;
LEIDING, C.; HAHN, R. Spermienmotilität und- morphologie in ihrer aurwirkung auf die fruchtbarkeit von besamungsebern in feldversuchen. Tieräerzt.
Praxis, v. 18, p. 591-594, 1990.
Recebido para publicação em 25.9.2000 Aceito em 7.4.2001
