ASPECTOS TEÓRICOS Y PRACTICOS
SVEN GARD, M.D.
Profesor de Investigaciones Viroldgicas, Escuela de Medicina, Kurolinska Institutet, Estocolmo, Suecia
ESTRUCTURA DEL VIRUS
El cuadro que se desprende de los estudios de la ultraestructura de los virus en general es, fundamentalmente, uniforme. Se ha determinado que el ácido nucleico y la pro- teína son los componentes esenciales de todos los virus hasta ahora estudiados. Inde- pendientemente de que el ácido nucleico sea del tipo de la ribosa o de la desoxiribosa, parece que está localizado en el interior de la partícula del virus, en los esféricos o casi esféricos, formando una especie de núcleo, cubierto de una capa de proteína. Al parecer, los virus de la poliomielitis no son una excep- ción a esta regla. Según los análisis efectua- dos por Schwerdt y Schaffer (1 l), estos virus
contienen de 22 a 30 % de ácido ribonu- cleico (ARN), y se supone que el resto de la partícula está formado de proteína. Taylor y McCormick (12) han demostrado que, bajo un haz electrónico, el virus está com- puesto de una parte central más opaca y más resistente, rodeada de una capa perifé- rica transmisora de electrones, más plástica y al parecer hidratada. Las propiedades ópticas del electrón y el tamaño del núcleo central hacen muy probable que se identi- fique con el componente de ácido nucleico de que tratan Schwerdt y Schaffer.
Los experimentos de Gierer y Schramm (4) sobre el virus mosaico del tabaco, repetidos después por otros autores con ciertos virus de animales, indican clara- mente que la capacidad de provocar la infección y multiplicación del virus reside exclusivamente en el ácido nucleico del virus, mientras que, al parecer, la proteína es la única que determina las propiedades anti- génicas del virus. Hasta ahora, no se ha
* Publicado en inglés en Bulletin of the World Health Orgunization, Val. 17, No. 6, 1957. *
podido probar la existencia de anticuerpos que reaccionen con el ácido nucleico. El ácido nucleico libre es infeccioso, aunque mucho menos en proporción que el virus íntegro. Es también mucho menos resistente a la acción de las enzimas y otros agentes de
inactivación. Por lo tanto, parece ser que la proteína del virus cumple una doble finali- dad: protege al ácido nucleico lábil de los factores externos de inactivación y propor- ciona un mecanismo (receptores) en virtud del cual el virus penetra más fácilmente en la célula huésped.
NATURALEZA DE LAS REACCIONES DEL FORMALDEHIDO CON SUBSTANCIAS
ORGANICAS
El formaldehido es un típico agente astrin- gente y, por consiguiente el conocimiento de sus reacciones con las proteínas tiene gran importancia práctica. Además, desde su empleo por Sorensen para facilitar la de- terminación cuantitativa de los aminoácidos, la cinética de las reacciones del formol ha pasado a ser una cuestión de gran importan- cia teórica. Como consecuencia de todo ello, se han hecho amplios y minuciosos estudios sobre la acción del formaldehido sobre las proteínas. En el volumen 2 de Advances in Protein Chemi.@p figura un análisis de las investigaciones efectuadas en este campo,
peptídicos y estructuras anulares. La mayo- posibilidad de que se produzcan reacciones ría de estas reacciones parece que se pro- con las bases que contengan nitrógeno, así ducen en dos o más fases, siendo 1s fase como con los azúcares de los ácidos nucleicos. inicial totalmente reversible, mientras que, Sin embargo, parece ser que la afinidad del más tarde, se presentan reacciones irre- agente químico por estas dos substancias es versibles y secundarias. Por lo tanto, se relativamente escasa. Esta cuestión debe ser establece inicialmente un equilibrio entre el objeto de nuevos estudios sistemáticos y formaldehido libre y el reversiblemente com- completos.
binado, que va seguido de una lenta y gra-
dual desaparición del formaldehido química- ASPECTOS TEORICOS DE LA INACTIV.4CION DE mente demostrable. Las reacciones secunda- LOS VIRCS CON FORMbLDEHLDO
rias consisten principalmente en la formación De los antecedentes que se acaban de in- de puentes de metileno o polimetileno entre dicar, se deduce claramente que la inactiva- los dos puntos de reacción. De este modo ci6n de los virus con formaldehido tiene que pueden surgir nuevas estructuras anulares, ser un procedimiento sumamente compli- unirse firmemente las cadenas laterales, o cado. Cabe esperar principalmente que el formarse puentes entre las moléculas de pro- agente químico ejerza dos clases distintas de teína adyacentes. El efecto general es, pues, efectos. Es evidente que la destrucción de la una estructura de las proteínas más firme, capacidad de multiplicación, o sea una ver- menos flexible, más densa y menos permea- dadera inactivación, tiene que comprender ble, que constituye la base de la acción alguna alteración química irreversible del astringente. Mediante la saturación gradual ácido nucleico. Por otro lado, cabe muy bien de grupos muy cargados y reactivos, la pro- suponer que una reacción producida única o teína se hace también menos soluble y principalmente con la capa de proteína, sin químicamente más inerte. dejar, en realidad, inactivo el ácido nucleico,
Se han elaborado varios métodos analíti- tenga un efecto sobre la infectividad. Los cos para la identificación química de las lugares receptores pueden alterarse química- diversas fases de estas reacciones graduales. mente y, por consiguiente, dar lugar a que la Su propósito es encontrar técnicas que permi- célula absorba menos fácilmente la partícula tan establecer una diferenciación entre el de virus; o bien que la estructura firme y la formaldehido libre y el reversible. A este inercia química de la proteína tratada con respecto, el carácter reversible de las reaccio- formaldehido interfieran con el desprendi- nes constituye una evidente dificultad. miento del ácido nucleico, una vez que el Cualquier interferencia química con un virus ha entrado en la célula.
sistema sumamente lábil puede modificar el Cabe esperar que este último tipo de reac- delicado equilibrio y, hasta cierto punto, ci6n, que tiene lugar principalmente en la alterar el cuadro general. Los llamados superficie de la partícula de virus, siga el métodos de “difusión de gas” son, al parecer, curso de una reacción de primer orden mien- los menos perjudiciales a este respecto, pero tras el medio contenga un exceso de formal- son también los menos exactos. A fin de dehido libre. Sin embargo, no tiene por qué evitar estas dificultades, hemos elaborado un ser una reacción de primer orden. En reali- método microbiológico de determinación del dad, si existen varios grupos químicos con formaldehido libre, que parece ser lo sufi- diferentes ritmos específicos de inactivación, cientemente exacto y sensible para este funcionalmente intercambiables y distribui- propósito, y que se describe más adelante. dos de manera desigual por la superficie del
Apenas se han estudiado las reacciones virus, así como entre las partículas del entre el formaldehido y las substancias mismo, la aceleración de conjunto de la orgánicas no proteínicas, concretamente los reacción puede disminuir a medida que desa- ácidos nucleicos. Cabe suponer a ptiori la parezcan los grupos más fácilmente inacti-
vados y, en consecuencia, predominar los más resistentes. Este mecanismo parece ser menos probable, aunque no hay que descar- tarlo a priori.
El primer efecto mencionado del trata- miento con formol, 0 sea, una reacción lo- calizada en lugares esenciales del componente de ácido nucleico del virus, comprende nece- sariamente una penetración del agente, a través de la capa de proteína, en el interior de la partícula de virus. En teoría, este pro- ceso ~610 podría llegar a ser una reacción de primer orden si entre la capa periférica de proteína y el agente inactivante no se produ- jera una acción recíproca. Esta no es, natu- ralmente, la situación actual. La penetración del formaldehido puede concebirse en cual- quiera de las dos formas siguientes, o bien en ambas: a) como una difusión del formalde- hido a través de la proteína hidratada, lo que sería posible desde el punto de vista estereo- químico, dado el poco tamaño de la molécula de formaldehido, o b) puede producirse escalonadamente de una reacción reversi- ble a otra, y tal vez con los grupos amino sirviendo de escalones por los que el agente químico pasa de la superficie al interior. A medida que se producen reacciones secunda- rias en la proteína, ambas vías quedan gra- dualmente bloqueadas. La creciente den- sidad de la proteína, por la formación de puentes y anillos secundarios, aumenta el obs- táculo estereoquímica a la libre difusión; me- diante lentas reacciones irreversibles, los escalones del segundo tipo de penetración van quedando destruidos gradualmente. Por consiguiente, si una partícula de virus escapa a la inactivación en una fase inicial del pro- ceso, adquirirá creciente resistencia a ella. Cabe esperar, pues, que la inactivación del ácido nucleico continúe a un ritmo cada vez más lento. En el supuesto de que la reacción entre el formaldehido y la proteína del virus sea de primer orden, el problema de la ciné- tica de la inactivación del ácido nucleico puede ser abordado matemáticamente (2).
Partiendo de esos supuestos, la inactiva- ción de los virus en general con formaldehido
seguiría esencialmente el mismo curso. Puesto que hay pocos-si es que de hecho hay alguno- agentes químicos específicos para reaccionar con el ácido nucleico única- mente, dejando a la proteína intacta, estas consideraciones pueden aplicarse de un modo general a toda inactivación química de virus, en cuyo caso cada agente químico se caracte- rizaría tal vez por su reacción específica constante. Es de esperar que haya excepcio- nes a la regla general en los casos en que los receptores son indispensables en el meca- nismo de la infección y, al mismo tiempo, quedan destruidos por el formaldehido. En tales casos, y solamente en ellos, puede pre- verse una reacción de primer orden.
RESULTADOS EXPERIMENTALES
Salk (9, 10) y posteriormente el Comité Técnico de los Estados Unidos sobre la Va- cuna contra la Poliomielitis, han afirmado que la inactivación de los virus de la poliomielitis con formaldehido sigue el curso de una reac- ción de primer orden, es decir, que “los datos relativos a la inactivación obtenidos por empresas productoras de Alemania, Austra- lia, Bélgica, Canadá, Dinamarca, Estados Unidos, Inglaterra, Israel y la Unión Suda- fricana demuestran, sin lugar a duda, que la tasa de inactivación de los virus de poliomie- litis, establecida por Salk, es, para los fines prácticos, suficientemente aproximada a una Iímea recta en una escala semilogarítmica, cuya pendiente permite predecir el tiempo de inactivación de un núcleo en el que todas las partículas de virus sean accesibles al for- maldehido ”
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que, a su vez, se observó que se aproximaba mucho a la ecuación teórica antes mencio- nada (2).
Esta controversia no ha quedado total- mente aclarada. Pero aun así se debe indicar en primer término que la declaración termi- nante sobre las experiencias obtenidas por varios fabricantes, hecha por Bodian, en nombre del Comité Técnico de Estados Uni- dos sobre la Vacuna contra la Poliomielitis, en la Cuarta Conferencia Internacional de Poliomielitis (Ginebra, 1957), difícilmente puede considerarse exacta. Hasta ahora, ~610 dos grupos dedicados activamente a la producción de la vacuna han publicado in- formes sobre la inactivación (5, 13). Ambos informes ponen de relieve el hecho de que las curvas de inactivación se desvían sistemáti- camente de la línea recta. Además, Lépine (6), al dar cuenta en el Tercer Simposio de la Asociación Europea contra la Poliomielitis, celebrado en Zurich, de las experiencias ob- tenidas en Francia, no pudo aceptar la ver- sión oficial norteamericana. Por último, se- gún comunicaciones personales de Nagler, Goffe y Goldblum, las observaciones efectua- das en los Laboratorios Connaught, Bur- roughs Wellcome, y en Israel no han con- firmado los resultados obt’enidos por Salk. Hay que añadir que los datos aportados por Haas et al (5) concuerdan muy bien con la fórmula empírica hallada para describir las observaciones de Suecia (3), y lo mismo parece que ocurre con los datos de Burroughs Wellcome.
Es muy probable que la explicación de las discrepancias de los resultados obtenidos radique en algunas diferencias técnicas de las condiciones en que se efectuaron los ex- perimentos o en los métodos utilizados para determinar la actividad. Al parecer, todos los que afirman haber encontrado desviacio- nes de una reacción de primer orden con- servaron cuando menos durante dos semanas, los cultivos de tejido utilizados para la de- terminación de la actividad del virus, y ade- más los investigadores suecos han confir- mado, por lo menos, todos los resultados esenciales mediante subcultivos y tipifica- ción. Según una reciente comunicación per-
sonal de Salk, esto no se efectuó en las pruebas en que se basan sus afirmaciones y las del Comité Técnico de Estados Uni- dos. En lugar de ello, la lectura final de todas las titulaciones se efectuó al sexto 0 séptimo dfa después de la inoculación. Esta es una diferencia que tiene importancia extraordi- naria y que probablemente facilita la clave de la cuestión. Las observaciones de Suecia, todavía no publicadas, demuestran que el período necesario para producir cambios cito- patogénicos aumenta progresivamente con el período de tratamiento del virus con formol. Al nivel de supervivencia de 1O-6 a lo-‘, no es excepcional no encontrar indicio alguno de degeneración de los cultivos al cabo de 7 días, y después de 14 días casi no se encuentra en ningún caso, hallazgo que nunca se observa en cultivos inoculados con diluciones limitantes de virus no tratado. Este fenómeno puede considerarse que es una expresión de la acción del formaldehido en la superficie de la partícula del virus, según se ha explicado anteriormente. Por lo menos, indica que pueden ocurrir alteraciones del virus, aparte de la innctivación manifiesta. Las lecturas que se efectúen al sexto día pueden muy bien medir el virus residual, prácticamente intacto, y de esta manera, de acuerdo con el razonamiento antes expuesto, seguir un curso que coincida con el de la reacción de primer orden o que se aproxime a ella.
Por supuesto, las reacciones en la super- ficie, tal como se supone que las registró Salk, si bien tienen cierto interés teórico, son de una importancia práctica muy limi- tada, excepto desde un punto de vista técnico. De manera especial, no parece aconsejable elaborar un procedimiento para la producción de vacuna sobre la base de observaciones que se refieren ~610 a las reac- ciones en la superficie.
de las alteraciones químicas de la proteína del virus; y b) una creciente proporción de las partículas de virus quedan inactivadas en el verdadero sentido de la palabra. Si bien en una partícula de virus el primero de los efectos mencionados se puede producir gra- dualmente, el segundo hay que considerarlo como un fenómeno de “todo o nada”.
CONCENTRACION DE FORMALDEHIDO
Es evidente que no hay razón para hablar de un tipo o aceleración de reacción a menos que las condiciones de la misma sean defini- das y constantes. En el actual sistema, fac- tores tales como el pH, la temperatura y la composición iónica se controlan fácilmente. Ahora bien, es menos fácil estandarizar el contenido de materia orgánica. La presencia de aminoácidos, productos de degeneración de proteínas y desechos de células en el líquido de cultivo en tejido, plantea proble- mas específicos. La materia no vira1 de esta naturaleza reacciona con el formaldehido, de una manera tanto reversible como irreversi- ble, interfiriendo así con la inactivación del virus. Cabe esperar, sin embargo, que las reacciones reversibles, sin privar realmente al sistema de formaldehido reactivo, afecten el ritmo de inactivación al reducir la concen- tración de formaldehido libre de la mezcla. No obstante, esto serviría principalmente para estabilizar el sistema, formando el formaldehido reversible una reserva con el que se podrían reemplazar las posibles pérdi- das y mantener así el equilibrio. Por otro lado, el efecto sobre el curso principal de la reacción sería insignificante, es decir, la fórmula de la reacción sería la misma, aunque los valores numéricos de sus factores constan- tes se alteraran. En cambio, las reacciones irreversibles consumirían el formaldehido, y a medida que se prosiguieran estos procesos, habría que esperar desviaciones graduales del curso determinado en teoría.
Las dificultades con que tropezaron los productores comerciales en la obtención de resultados invariablemente uniformes fueron interpretadas por Salk y el Comité Técnico de Estados Unidos como prueba de la pre- sencia, en el material de cultivo en tejido,
de agregados de partículas de virus o del revestimiento de partículas de virus por desechos y otros materiales derivados de la célula, que las protegían contra la acción del formaldehido, causando así una desviación del supuesto curso lineal de la reacción. Para remediar esta situación, se recomendaron filtraciones interpuestas, y se pusieron en vigor las correspondientes enmiendas de los Requerimientos Mínimos. Este es el procedi- miento que emplea actualmente la mayoría de los productores, no sólo de Estados Uni- dos, sino también de otros países. Según sea el tipo de filtros utilizados, esta técnica parece que produce preparaciones que pasan, con mayor uniformidad, las pruebas de segu- ridad prescritas, pero a costa de perder en el proceso de filtración una considerable pro- porción del material antigénicamente activo. Los tipos 3, 1 y 2 resultan afectados en ese orden.
Hay que destacar que, hasta ahora, no se ha presentado ninguna prueba experimental importante de la validez de la mencionada interpretación de las observaciones. Puede considerarse como un hecho establecido que la inactivación no es una reacción de primer orden y que, por esta sola razón, su curso tiene que desviarse de la línea recta. Lycke (7) ha demostrado de manera convincente que esta desviación no se debe a la formación de agregados o a la existencia de otras forma- ciones heterogéneas. Esta sola razón puede explicar fácilmente la imposibilidad, por parte de los productores comerciales, de lograr resultados satisfactorios siguiendo el procedimiento original de Salk, que prescri- bía un período de retención de sólo siete días. El nivel de supervivencia prevista en ese período era de 10-I’. Con una actividad inicial de 10’~~ DI,,/ml, el contenido previsto de virus activo sería aproximadamente de una D15,, por 3 litros, que queda bien dentro de la amplitud de demostrabilidad con las actuales pruebas de seguridad. Sin embargo, los resultados obtenidos después de un período de retención hasta de 14 días (37”C., 1: 4.000 de formalina) difícilmente pueden explicarse de esta manera.
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ratorios se observó en algunas ocasiones que la inactivación, después de haber seguido el curso establecido en teoría hasta un nivel de supervivencia de lOes, disminuía en grado importante, y puesto que, según la argu- mentación antes expuesta, cabía esperar este fenómeno si se producía una pérdida de formaldehido, se trató de estudiar las po- sibles variaciones de la concentración de formaldehido libre en el curso del proceso de inactivación. Los diversos métodos químicos probados para el análisis de formaldehido “libre” indicaron una disminución de la concent,ración a medida que se producía la reacción. Los valores numéricos obtenidos, fueron distintos, según los métodos utiliza-
dos, y la reproducibilidad en ensayos dupli- cados no resultó plenamente satisfactoria. Por consiguiente, se trató de encontrar un método microbiológico de ensayo, más sensi- ble que los métodos químicos, que permitiera determinar la cualidad particular sobre la que se deseaba obtener datos, es decir, la ca- pacidad para inactivar los virus. Se estimó que, por permitir la evaluación fácil y exacta mediante el recuento de placas, el bacterió- fago era el medio ideal para la prueba.
A este fin se eligió un bacteriófago de estafilococo que produce placas de un ta- maño uniforme. En experimentos de inacti- vación, se observó que se ajustaba al patrón establecido para los virus de la poliomielitis. No obstante, durante las primeras horas, a un nivel de supervivencia de lOe3 aproxima- damente, el curso de inactivación se apro- ximó suficientemente a una línea recta como para considerar que este intervalo resultaba adecuado a los fines de ensayo. Se observó que el ritmo de inactivación en este intervalo era proporcional a la concentración de formaldehido añadida y, por lo tanto, el método de ensayo adoptado finalmente fue el siguiente :
A 19 partes del material de ensayo se añadió una parte de un bacteriófago concen- trado y parcialmente purificado. La mezcla de reacción se ajustó a pH 7 y se mantuvo durante 3 horas a la temperatura de 37°C. Después de añadirle bisulfito, se prepararon
diluciones décuplas y se efectuaron recuentos de los bacteri6fagos supervivientes. De cada dilución, se administraron con cuentagotas
12 gotas de 0,Ol ml. a láminas sembradas de estafilococo, que fueron incubadas durante 4 horas a una temperatura de 37”C., dejándo- las durante toda la noche a la temperatura ambiente. Se anotaron por separado los recuentos de placas de cada gota y se com- probó la variación producida dentro de cada dilución. Como controles se emplearon bacteriófago, más líquido de cultivo, en tejido solamente, y también bacteriófago y líquido de cultivo en tejido, con formaldehido. Se expresó la concentración relativa de formal- dehido, por la diferencia logarítmica entre el control de bacteriófago y la muestra de la prueba. Observaciones: a) la presencia de antibióticos en el líquido de cultivo en tejido hace que las diluciones menores de 10-d re- sulten inadecuadas o dudosas para fines de recuento; de ahí que se utilicen preparacio- nes concentradas de bacteriófago; b) a fin de no alterar el equilibrio del formaldehido, el volumen de bacteriófago, así como la canti- dad de materia orgánica añadida, deben ser proporcionalmente insignificantes; por eso se utiliza material purificado; y c) los resultados más exactos se obtienen con recuentos de 20 a 50 placas por gota. Para lograr este propó- sito se pueden incluir grados semilogarítmi- cos de dilución. En esas condiciones se ob- servó que la desviación estándar era de 0,03 unidades logarítmicas.
octavo día se alcanzó el nivel final y la pérdida fue del 45 %.
Estas observaciones parece que explican satisfactoriamente las irregularidades regis- tradas en la producción ordinaria. Por lo menos, los resultados obtenidos en Estocolmo pueden explicarse plenamente de esa forma. El efecto de la filtración encaja también en este cuadro. Es de suponer que este pro- cedimiento afecte a los resultados de dos maneras: a) por la retención del virus, tanto activo como inactivado, como ya se indicó anteriormente; y b) por la eliminación de la mezcla de reacción de los desechos de tejido y posiblemente materia orgánica no vira1 precipitada, y por la absorción de aminoácidos y proteínas molecularmente dispersos, aminorando así el descenso de la actividad del formaldehido que, de otro modo, cabría esperar que se produjera más tarde en el curso del proceso. El procedi- miento, esbozado en los Requerimientos Mínimos de Estados Unidos y actualmente adoptado por la mayoría de los productores,a comprende dos filtraciones, una antes de añadir el formaldehido y la otra después de que la curva de inactivación haya alcanzado la “línea de base”. Al parecer, esta técnica ha resultado eficaz para reducir la proporción de lotes de vacuna que no pasan la prueba de seguridad. Por otro lado, la filtración va acompañada de considerables pérdidas de antigemcidad. De ahí que el problema no sea ya de seguridad de las vacunas, sino de su actividad.
Puesto que, al parecer, la falta de uniformi- dad de los resultados de la inactivación se deriva de las variaciones de la cantidad de formaldehido consumido en el curso del proceso y de la tasa a que se reduce su concentración, parece que la manera más lógica de vencer estas dificultades consiste en un control continuo y en el manteni- miento de un nivel constante de la actividad a Por lo menos, dos productores fuera de los Estados Unidos utilizan filtros de vidrio calcinado en lugar de los de tipo Seitzpad, prescritos en los RequerimientosMínimos, al parecerconresultados satisfactorios.
del formaldehido mediante la adición suple- mentaria del agente a medida que sea nece- sario. De esta manera se elimina la necesidad de una filtración intermedia. Este procedi- miento se ensayó en nuestros laboratorios en varios experimentos en pequeña escala, así como en un número limitado de lotes de vacuna en gran escala (cada lote de 6 X 15 litros). Desde su adopción, no se regist,raron desviaciones del curso de inactivación esta- blecido en teoría. Así, pues, no han surgido complicaciones debidas a la posible het,ero- geneidad física del virus, producidas por aglomeración 0 revestimiento. Aunque los resultados preliminares son muy halagüeños, tanto en lo que respecta a la consistencia de la inactivación como a la potencia inmuno- génica del producto, es preciso proseguir los experimentos antes de poder establecer un juicio definitivo.
REFERENCIAS
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(2) Gard, S.: En Ciba Foundation symposiwn on the nature of viruses, Londres, 1957, pag. 123. (3) Gard, S., y Lycke, E.: Arch. ges. Virusforsch.
(En prensa)
(4) Gierer, A., y Schramm, G.: Arature (Lond.), 177:702, 1956.
(5) Haas, R., et al.: 2. Hyg. Infekt Kr., 143:490, 1957.
(6) Lépine, P.: En Third symposium of the Eu- ropean Association against Poliomyelitis, Bruselas, 1956, pág. 7.
(7) Lycke, E.: Arch. ges. Virusforsch. (En prensa)
(8) Lycke, E.: Melén, B., y Wrange, G. : Arch. ges. Virusforsch., 7:378, 1957.
(9) Salk, J. E.: Jour. Am. Med. Assn., X%:1239, 1955.
(10) Salk, J. E., et al.: Am. Jour. Pub. Health, 44:563, 1954.
(Il) Schwerdt, C. E., y Schaffer, F. L.: Ann. N. Y. Atad. Sci., 61:740, 1955.
(12) Taylor, A. R., y McCormick, M. J.: Yale Jour. Biol. Med., 28:589, 1955.
(13) Timm, E. A., et al.: Jour. Immunol., 77444, 1956.
