AMPLIFICAÇÃO CRUZADA DE MARCADORES MICROSSATÉLITES DE ESPÉCIES DO GÊNERO HYPSIBOAS*

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estudos , Goiânia, v . 41, especial, p . 147-154, no v. 2014. 147

YNGRID OLIVEIRA RODRIGUES, LÍLIAN DE SOUZA

TEODORO, FERNANDA RIBEIRO GODOY, HUGO

HENRIQUE DE PÁDUA OLIVEIRA, DANIELA DE MELO

E SILVA, ALEX SILVA DA CRUZ, LYSA BRENARDES

MINASI, CLAUDIO CARLOS DA SILVA, APARECIDO DIVINO

DA CRUZ

AMPLIFICAÇÃO CRUZADA

DE MARCADORES

MICROSSATÉLITES

DE ESPÉCIES DO GÊNERO

HYPSIBOAS*

Resumo: o objetivo desta pesquisa foi de verificar a capacidade de

am-plificação de marcadores microssatélites da espécie Hypsiboas raniceps para o Hypsiboas albopunctatus. Através deste tipo de teste, é permitido a utili-zação de marcadores antecipadamente desenvolvidos e caracterizados em espécies filogeneticamente próximas. Este processo é denominado de trans-feribilidade.

Palavras-chave: Hypsiboas. Transferibilidade de primers. Microssatélite.

Genética de conservação.

A

ordem Anura compreende animais pertencentes à família Hylidae que constitui-se em uma das mais numerosas dentro da ordem e que ainda carecem de estudos evolutivos (FAIVOVICH et al., 2005). Esta família é uma das que apresentam o maior número de espécies ameaça-das, conforme citado na análise da lista brasileira de anfíbios ameaçados de extinção do Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade - IC-MBio (2014).

Por demonstrarem resistência a ambientes antropizados e poderem ampliar sua distribuição geográfica, tornam-se então, animais importantes para a gené-tica de populações. Para tanto a conservação de espécies do grupo podem ser reforçadas com o desenvolvimento de ferramentas moleculares que possibilitem conhecer a estrutura genética que se constitui de um dos principais artifícios na evolução das espécies (ROSA, 2009).

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Dentro desta família foram desenvolvidos marcadores moleculares para apenas uma espécie conhecidamente, por Arruda et al. (2010) para H. raniceps. E foram posteriormente testados pelo teste de transferibilidade de espécies relacionadas para H. albopunctatus por Oliveira (2012), que obteve sucesso na amplificação com os primers Hraniμ1 e Hraniμ4, porém não contava com o grupo focal para confirmação do teste.

Então, há capacidade de amplificação nos marcadores microssatélites desenvolvi-dos para identificação da espécie H. raniceps em outra espécie do mesmo gênero, o H.

albopunctatus?

Partindo desta questão, esperou-se que, os dois primers desenvolvidos para iden-tificação da espécie H. raniceps tenham capacidade de amplificação em outra espécie do mesmo gênero, o H. albopunctatus.

O objetivo geral desta pesquisa foi de verificar a capacidade de amplificação de marcadores microssatélites desenvolvidos para identificação da espécie H. raniceps em outra espécie do mesmo gênero, o H. albopunctatus.

Já os objetivos específicos consistem em propor regiões genômicas que poderão ser utilizadas para a identificação de H. albopunctatus, auxiliar pesquisas futuras que envolvam a identificação genômica através de marcadores microssatélites. E ainda confrontar os resultados desta pesquisa com outros previamente descritos na literatura, a fim de embasar estudos filogenéticos futuros.

A ordem Anura, constitui-se de anfíbios que encontram-se praticamente em todas as regiões do globo terrestre, exceto na Antártica. Essa longa distribuição deu-se ao longo da história evolutiva do grupo e um das características mais importantes para tanto, foi a grande variedade de formas reprodutivas, além de um complexo arranjo social (FAIVOVICH et al., 2005; HADDAD; PRADO, 2005).

Dentro da família Hylidae, existem quatro subfamílias, sendo elas Pelodryadi-nae, PhyllomedusiPelodryadi-nae, Hemiphractinae e por último a subfamília Hylinae na qual encontram-se as pererecas do gênero Hypsiboas, caracterizadas por tamanho de porte médio a grande e conhecidas como “rãs-gladiadoras” (FAIVOVICH et al., 2005).

Estas espécies H. albopunctatus e H. raniceps, são de grande interesse ecológico e evolutivo no âmbito molecular e possuem grande representatividade dentro do cerrado (141 espécies de anfíbios), que é o maior bioma brasileiro depois da Amazônia e da Mata Atlântica (BASTOS, 2008).

Neste âmbito a espécie H. albopunctatus descrita por Spix em 1824, exibe resistência às alterações ambientais, podendo conviver com ações antrópicas uma generalista que encontra-se do Centro-oeste brasileiro ao Sul, no estado do Paraná (SÁ, 2010).

Nunes e Fagundes (2008) afirmam que os anuros apresentam caracteres morfológicos conservados, o que dificulta a utilização dos mesmos em estudos taxonômicos e filogené-ticos. Número e morfologia cromossômica do grupo já são bem conhecidos. Mas como citado anteriormente, pode-se verificar a estrutura genética por morfologia cromossômica, porém variações no genoma não podem ser verificadas por estas ferramentas.

E com a utilização de ferramentas moleculares é possível verificar diretamente va-riações do genoma de um organismo, no caso, marcadores moleculares que apresentam

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estudos , Goiânia, v . 41, especial, p . 147-154, no v. 2014. 149 fenótipo molecular de regiões que podem estar presentes em regiões codantes e não codantes do genoma (MÖLLER, 2009).

Pode-se então utilizar os marcadores Microssatélites, que são regiões genô-micas altamente repetitivas e polimórficas, é amplamente utilizado em estudos de diversidade genética, identificação de espécie e testes de paternidade (ROSA, 2009).

Dentro do gênero Hypsiboas, Arruda et al.,(2010) desenvolveu 16 pares de primers para loci microssatélites de H. raniceps, e são, até o momento, os únicos marcadores desenvolvidos especificamente para uma espécie do gênero Hypsiboas (OLIVEIRA et

al., 2012).

O desenvolvimento de marcadores microssatélites tem um custo alto e a transfe-ribilidade de primers entre espécies relacionadas, ou seja, de mesma família pode ser uma alternativa para redução destes custos (SILVA et al., 2013; OLIVEIRA et al., 2012; MÖLLER, 2009).

Para tanto foi conduzido um teste com o controle ou grupo teste como descrito em seu estudo, que trata-se de DNA de H. raniceps, espécie focal. Verificar a correta amplificação dos loci microssatélite dos dois primers (Hraniμ1; Hraniμ4) que foram descritos como amplificantes por Arruda et al., (2010) para H. raniceps.

E testar a amplificação em material genético de H. albopunctatus, também com os dois primers (Hraniμ1; Hraniμ4), em que Oliveira et al., (2012) confirmou com o teste de transferibilidade entre espécies relacionadas.

Para a discussão foi feita pesquisa bibliográfica em bancos de dados e revistas científicas tais como Scielo, Bioone, em bancos de dados de Universidades e de eventos de pesquisa.

METODOLOGIA

A avaliação da transferibilidade foi realizada através de dois primers pré-selecionados e capazes de amplificar diferentes regiões do genoma de H. raniceps por amplificação para H. albopunctatus por teste de transferibilidade interespecífica.

Extração e Isolamento de DNA Genômico

O DNA para a amplificação dos locos microssatélites, foram extraídos a partir de amostras de fígado da espécie H. albopunctatus e H. raniceps que estavam embebidos em etanol absoluto e armazenados em freezer a -20ºC. Para o isolamento do DNA utilizou-se o kit de extração Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega USA), seguindo-se as instruções do fabricante.

Primers para a Amplificação dos Loci Microssatélites

Inicialmente desenvolvidos para a espécie H. raniceps, 2 pares de primers para loci microssatélites foram testados em amostras de H. albopunctatus com a intenção

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de verificar sua transferibilidade em espécies relacionadas geneticamente. Os Primers utilizados neste estudo estão presentes na tabela 1.

Loci Sequência (5’ → 3’) Amplicons N

0_{de alelos}

esperado

Hraniμ1 F: GCA CTC ATG CAG ACA CAA CT 261-271 3 R: CTG CTG CAG GAT ACT AAA GGA C

Hraniμ4 F: GAG CAC ACC ATT ATC ACA CAG AC 194-214 8 R: CAG CTT GTC AGC ATA GAG ATT GTC

Protocolo de amplificação dos locos microssatélites

As amplificações por PCR foram otimizadas para o volume final de 25µl com 70ng de DNA alvo. A concentração final para a otimização da reação foi realizada com tampão de PCR 1X, 1,5 mM de MgCl2, 0,3mM de cada DNTP (Invitrogen, USA), 2,5 pmol de cada primer, 1U Taq DNA polimerase (Invitrogen, USA). Após a realização destes ajustes nas condições de amplificação por PCR, obteve-se uma amplificação satisfatória com o protocolo de termociclagem apresentado na Tabela 2.

Para a observação da amplificação dos loci STRs, após as reações de PCR, as amos-tras submetidas à eletroforese em gel de agarose a 2% em tampão TBE 1X durante 50 minutos a 10 V/cm.

Tabela 2: Protocolo de termociclagem de marcadores microssatélites, otimizados para a espécie Hypsiboas albopunctatus.

Etapas Temperatura (ºC) Tempo (segundos) Ciclos

Desnaturação inicial 94 300 1 Desnaturação 94 30 30 Anelamento X 60 Extensão 72 60 Extensão final 72 300 Armazenamento 4 ∞ ∞

X: temperatura de anelamento específica para cada primer.

RESULTADO E DISCUSSÃO

Neste estudo as amplificações do conjunto de primers Hraniμ1 esteve de acordo com o tamanho esperado, entre 260 e 280 pares de bases (Figura 1 - 1). Entretanto, com o conjunto de primers Hraniμ4 (Figura 1 - 2) os alelos amplificados ficaram acima do tamanho esperado, aproximadamente entre 300 a 400 pb.

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Figura 1: Gel de agarose a 1,5% indicando a amplificação dos loci 1= Hraniµ1 e 2= Hraniµ 4 transferido para espécie Hypsiboas albopunctatus.

O aumento nos números de repetições de alelos microssatélites pode ser atribuído a uma possível inserção de íntrons a qual está sujeito o genoma dos organismos. Para a confirmação desta hipótese, a amostra deverá ser sequenciada. Embora a diminuição da temperatura de anelamento no processo de PCR possa, teoricamente, resultar em maior sucesso de amplificação, temperaturas abaixo de 60 ºC se mostraram insatisfatórias por não ser útil para a identificação de locos polimórficos.

Estudos demonstram que a amplificação cruzada de marcadores microssatélites de-clinam à medida que a distância genética entre os táxons aumenta. Portanto as relações filogenéticas entre o grupo focal e o grupo teste são de extrema importância para o sucesso da transferência dos marcadores (PRIMER; MERILA, 2002 apud OLIVEIRA, 2012). Tendo em vista a relação genética do H. raniceps e o H. albopunctatus, apenas a distância genética entre os táxons não seriam suficientes para explicar a baixa taxa de amplificação, já que há grande similaridade genômica de grupos tão filogeneticamente relacionados.

A amplificação de 2 locos comuns entre H. raniceps e o H. albopunctatus, testados demonstram que os dados estão condizentes com aqueles apresentados nas literaturas. Primer e Merila (2002), obtiveram 27% de amplificações positivas em estudo de transfe-ribilidade para o grupo Rana, contudo, este aumento no percentual de locos transferidos podem ser relacionados a uma maior identidade genética entre as espécies do gênero. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Deve-se levar em consideração que há ainda uma quantidade de trabalhos relacio-nados a anuros utilizando microssatélites muito escasso, menos ainda com utilização de transferibilidade entre espécies relacionadas.

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Existem muitos trabalhos na área vegetal e com animais de interesse zootécnico, mas há necessidade também de se desenvolver esses estudos com os anfíbios, especialmente os anuros, por sua enorme importância ecológica, e no caso do grupo aqui estudado, a importância da resistência aos ambientes antropizados.

Deve-se considerar ainda, que o aumento verificado nos números de repetições de alelos microssatélites demonstra que a amostra deverá ser sequenciada. Poderia se con-siderar abaixar a temperatura para a fase de anelamento na PCR, porém temperaturas abaixo de 60ºC se mostraram insatisfatórias em outros estudos.

E deve-se levar em conta também que a amplificação de 2 locos comuns entre

H. raniceps e o H. albopunctatus, que apresenta um aumento no percentual de locos transferidos podem ser relacionados a uma maior identidade genética entre as espécies do gênero.

CROSS-AMPLIFICATION MICROSATELLITE MARKERS OF SPECIES OF THE GENUS HYPSIBOAS

Abstract: the objective of this research, was to verify the ability to amplify

microsatel-lite markers for species Hypsiboas raniceps to Hypsiboas albopunctatus. Through this type of test, the use of tracers in early developed and characterized phylogenetically related species is allowed. This process is called transferability.

Keywords: Hypsiboas. Transferability of primers. Microsatellite. Genetic conservation.

Referências

ARRUDA, M. P. et al. Development of eleven polymorphic microsatellite markers for the Chaco Treefrog, Hypsiboas raniceps. Conservation Genetics Resources. Campi-nas, v. 2, n. 1, p. 93-96, 2010.

BASTOS, P. B. Preservar Sapos e Rãs. Rev. UFG, Goiânia, ano X, n. 4, 2008.

BLAUSTEIN, A. R. Chicken Little or Nero’s fiddle? A perspective on declining am-phibian populations. Herpetologica, Baltimore, v. 50, n. 1, p. 85-97, 1994.

CONTE, M. Desenvolvimento de Microssatélites e Análise Populacional de Espécies de Physalaemus do grupo ‘cuvieri’ (Anura, Leiuperidae). Tese (Doutorado em Biolo-gia Celular e Estrutural) - Universidade Estadual de Campinas, Campinas, 2009. FAIVOVICH, J. et al. Systematic Review of the Frog Family Hylidae, with Special Reference to Hylinae: Phylogenetic Analysis and Taxonomic Revision. Bulletin of the

American Museum of Natural History, Nova Iorque, n. 294, 240p, 2005.

FERREIRA, M. E.; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de Marcadores Molecu-lares em Análise Genética. EMBRAPA-CENARGEN, Brasília, 3. ed., 220p, 1998. GUIMARÃES, L. D.; BASTOS, R. P. Vocalizações e Interações Acústicas em Hyla

raniceps (Anura, Hylidae) durante a Atividade Reprodutiva. Iheringia, Goiânia, v. 93, n. 2, p. 149-158, 2003.

HADDAD, C. F. B.; PRADO, P. A. Reproductive modes in frogs and their unex-pected diversity in the Atlantic Forest of Brazil. BioScience, São Paulo, v. 55, n. 3, p. 207-217, 2005.

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estudos , Goiânia, v . 41, especial, p . 147-154, no v. 2014. 153 ICMBio, Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade. 2014. Uma

Aná-lise da Lista Brasileira de Anfíbios Ameaçados de Extinção. Disponível em: <http:// www.icmbio.gov.br/portal/images/stories/biodiversidade/faunabrasileira/livro-verme-lho/volumeII/Anfibios.pdf>. Acesso em: 08 maio 2014.

MÖLLER, M. Comparações e novas abordagens no desenvolvimento de marcadores microssatélites. Seminários em Genética e Melhoramento de Plantas. USP – ESALQ. 2009.

NUNES, R. R. A.; FAGUNDES, V. Cariótipos de oito espécies de anfíbios das subfa-mílias Hylinae e Phyllomedusinae (Anura, Hylidae) do Espírito Santo, Brasil. Bol.

Mus. Biol. Mello Leitão, Vitória, n. 23, p. 21-36, 2008.

OLIVEIRA, H. H. P. Diversidade Genética de Hilídeos do Brasil Central. Dissertação (Mestrado em Biologia Celular e Molecular) - Universidade Federal de Goiás, Goiâ-nia, 2012.

PRIMMER, C. R.; MERILA, J. A low cross-species amplification success in Ranid frogs. Conserv. Genet. Durham, n. 3, p. 445-449, 2002.

ROSA, A. J. M. Marcadores Moleculares e suas Aplicações em Estudos Populacionais de Espécies de Interesse Zootécnico. 1.ed. Planaltina – DF: Embrapa Cerrados, 2009. SILVA, M. F. N. et al. Transferibilidade de Primers Microssatélites de Phaseolus

vul-garis para Vigna unguiculata. Anais eletrônicos do III CONAC, Recife, PE. 5p. 2013. SÁ, F. P. História natural de Hypsiboas albopunctatus na região de Rio Claro, estado de São Paulo. Rio Claro, 2010. Disponível em: <http://www.athena.biblioteca.unesp. br/exlibris/bd/tcc/brc/3142/2010/sa_fp_tcc_rcla.pdf>. Acesso em: 16 ago. 2014.

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* Recebido em: 13.11.2014. Aprovado em: 26.11.2014. YNGRID OLIVEIRA RODRIGUES

Graduanda de Biologia da Pontifícia Universidade Católica de Goiás (PUC Goiás).

E--mail: yng_oliveira@yahoo.com.br LÍLIAN DE SOUZA TEODORO

Graduanda de Biologia da PUC Goiás. E-mail: lilian2000@gmail.com. FERNANDA RIBEIRO GODOY

Doutoranda de Biologia e Biodiversidade da Universidade Federal de Goiás (UFG).

E-mail: fernandargodoy@gmail.com

HUGO HENRIQUE DE PÁDUA OLIVEIRA

Mestre em Biologia Celular e Molecular pela UFG. E-mail: hugohenrique3000@yahoo. com.br.

DANIELA DE MELO E SILVA

Professora do Instituto de Ciências Biológicas da UFG. E-mail: silvadanielamelo@ gmail.com

APARECIDO DIVINO DA CRUZ

Professor do Departamento de Biologia da PUC Goiás. Coordenador do Núcleo de Pesquisas Replicon da PUC Goiás. E-mail: acruz@pucgoias.edu.br.

ALEX SILVA DA CRUZ

Doutorando em Biologia pela Universidade Federal de Goiás (UFG). Professor do Departamento de Biologia da PUC Goiás. E-mail: a.silva.cruz@hotmail.com

LYSA BERNARDES MINASI

Núcleo de Pesquisa REPLICON, Pontifícia Universidade Católica de Goiás. E-mail: minasilb@gmail.com.

CLAUDIO CARLOS DA SILVA

Núcleo de Pesquisa REPLICON da PUC Goiás. LaGene – Laboratório de Citogenética Humana e Genética Molecular, SES GO. E-mail: dasilva.genetica@gmail.com

APARECIDO DIVINO DA CRUZ

Núcleo de Pesquisa REPLICON da PUC Goiás. LaGene – Laboratório de Citogenética Humana e Genética Molecular, SES GO. E-mail: acruz@pucgoias.edu.br.