Desenvolvimento de um biossensor molecular para o estudo translacional da Fibrose Quística e outras doenças respiratórias

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- Especialização em Bioquímica -

Desenvolvimento de um biossensor molecular para o

estudo translacional da Fibrose Quística e outras

doenças respiratórias

Ângela Sofia Dias Alves

Dissertação

Mestrado em Bioquímica

Universidade de Lisboa

Faculdade de Ciências

Departamento de Química E Bioquímica

Orientadores:

Dr. Paulo Matos

Prof. Dr Carlos Farinha

2014/2015

Universidade de Lisboa

Faculdade de Ciências

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Agradecimentos

Gostaria de deixar um agradecimento especial a todos aqueles que, de uma forma ou de outra,

contribuíram para a realização desta tese de mestrado.

Em primeiro lugar queria agradecer ao Dr Paulo Matos por ter orientado e supervisionado o

meu trabalho, pela confiança depositada e pela simpatia e boa disposição com que sempre me

recebeu. Queria agradecer igualmente ao Instituto Nacional de Saúde Dr Ricardo Jorge,

especialmente ao Dr Peter Jordan, por me ter acolhido no laboratório de Oncobiologia e Vias

de Sinalização.

Queria agradecer também às colegas de laboratório – Andreia Henriques, Joana Pereira e

Cláudia Loureiro –, com as quais cresci pessoalmente e, acima de tudo, profissionalmente. Um

agradecimento muito especial à Dr Patrícia Barros cuja disponibilidade, conselhos e

ensinamentos que tanto contribuíram para o sucesso desta tese e para o meu enriquecimento

científico.

Por fim, quero agradecer à minha família pelo apoio e suporte que sempre me deram ao longo

do meu percurso académico. Ao Diogo, pela confiança, apoio e compreensão.

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Índice

Agradecimentos

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Resumo

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Abstract

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Introdução

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Fibrose Quística - 9 - História - 9 - Descrição Clínica - 9 - CFTR - 10 - A proteína CFTR - 10 - O gene CFTR - 11 - Biossíntese e Tráfego - 15 - Condutância - 18 -

Estabilidade e Controlo de Qualidade de Proteínas Membranares - 18 - Estratégias para Correção de defeitos Moleculares da CFTR-F508del - 19 -

Terapía Génica - 20 -

Correção do Folding Proteico - 21 -

Correção da Função - 22 -

Retenção e estabilização na membrana apical - 23 - Estratégia para a identificação de novos fármacos para o tratamento da FQ - 25 -

Objetivos

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Apresentação de Resultados

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Caracterização do mecanismo através do qual a ativação da sinalização via GTPase Rac1 permite a retenção na MP da CFTR-F508del resgatada - 29 -

Caracterização do mecanismo de estabilização membranar da CFTR-F508del por ativação da sinalização de Rac1 - 29 - Otimização das condições experimentais para analisar a composição de macro-complexos proteicos contendo CFTR na MP - 29 - Caraterização dos complexos pós-Golgi contendo CFTR-F508del - 31 - Determinação do mecanismo de bloqueio da ligação da CHIP - 33 - Abertura do 2º PDZ do NHERF1 também estabiliza no pós-Golgi CFTR-F508del resgatada farmacologicamente - 34 - Construção de um sistema biossensor para deteção da retenção de

CFTR-F508del na MP - 37 -

Construção do sistema biossensor - 37 - Validação do sistema de deteção molecular - 38 - Adaptação do sistema à deteção por FRET - 39 - Utilização par mCherry/GFP - 41 - Utilização do par YFP/CFP - 43 -

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Discussão e Principais Conclusões - 45 -

Perspetivas Futuras - 49 -

Materiais e Métodos - 51 -

Cultura de Células - 51 -

Culturas celulares utilizadas - 52 -

Transfeções - 53 -

Células CFBE - 55 -

Células BHK - 55 -

Ensaios de Temperatura - 56 -

Construções Plasmídicas - 56 -

Introdução à técnica de Clonagem - 56 -

Metodologia - 63 - Imunoprecipitação e Imunoblotting - 65 - Introdução à técnica - 65 - Metodologias - 69 - Imunoprecipitação de CFTR - 69 - DSP Crosslink e Imunoprecipitação da CFTR - 69 - Western Blot - 70 - Fluorescência - 71 -

Introdução à Microscopia de Fluorescência - 71 -

FRET - 74 -

Imunofluorescência- 78 -

Análise Estatística - 79 -

Bibliografia

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Resumo

A Fibrose Quística (FQ), doença autossómica com maior letalidade na população de origem caucasiana, capta a atenção da comunidade investigadora focada na compreensão pato-fisiológica, identificação de compostos e novos alvos terapêuticos que possibilitem corrigir a expressão funcional dos canais mutantes de CFTR na membrana apical de células epiteliais.

A mutação F508del, presente em pelo menos um alelo em mais de 80% dos doentes, causa um processamento deficiente da proteína, conduzindo à sua acumulação no retículo endoplasmático e degradação prematura. Sendo tão frequente, esta mutação tem sido o alvo principal da comunidade científica de modo a reverter os defeitos causados pela mesma. Embora tenham surgido estratégias terapêuticas, baseadas principalmente em pequenas moléculas moduladoras do folding e tráfego da CFTR-F508del, estas têm tido pouco sucessoem resgatar a função desta proteína nos pacientes. Entre vários fatores por detrás deste insucesso, encontram-se os mecanismos de Controlo de Qualidade Periférica de Proteínas (MCQPP) que removem da membrana proteínas resgatadas farmacologicamente por ainda apresentarem conformações impróprias. Este mecanismo atua por intermédio de proteínas chaperones e co-chaperones como a ubiquitina-ligase CHIP que, ao mediar a ubiquitinação da CFTR-F508del na membrana plasmática (MP) promove a sua internalização e degradação, reduzindo a eficácia dos tratamentos farmacológicos existentes.

Aqui é descrito um novo mecanismo molecular que permite evitar o reconhecimento da CFTR-F508del pelos MCQPP. Este baseia-se uma alteração conformacional da proteína NHERF1 que impede a ligação da ubiquitina-ligase CHIP às proteínas CFTR-F508del resgatadas farmacologicamente para a MP. Mostra-se ainda que a manipulação deste mecanismo permite melhorar significativamente a eficácia dos fármacos disponíveis para o tratamento da FQ por reter a CFTR-508del resgatada à superfície das células.

Tornou-se então pertinente o desenvolvimento de um biossensor molecular, fluorescente, com base no mecanismo caracterizado, que possa ser aplicado em ensaios de rastreio de alto-rendimento para identificar e caraterizar formas de ativar farmacologicamente este mecanismo para melhorar as terapêuticas actuais para a FQ.

Keywords:

Fibrose-Quística; Controlo de Qualidade Periférica; VX-809; Biossensor Molecular; NHERF1; CFTR-F508del

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Abstract

Cystic fibrosis (CF), an autosomal disease with increased mortality in the population of Caucasian origin, gathers the attention of the community around the pato-physiological understanding, identification of new therapeutic targets and compounds aiming to correct the functional expression of the mutant CFTR channel

in the apical membrane of epithelial cells.

The F508del mutation, present in at least one allele in more than 80% of the patients, causes a defective protein processing, leading to their accumulation in the endoplasmic reticulum and premature degradation. Being so frequent, this mutation has been the most studied one. While there have been therapeutic strategies, mainly based on small molecule modulators of CFTR folding and F508del traffic, these have had low success in rescuing the function of theprotein in patients. Among several factorsthis is due to, the Peripheral Quality Control Mechanisms Proteins (MCQPP) whose function is to remove from the membrane pharmacologically rescued proteins due to the improper conformations. This mechanism operates through protein chaperones and co-chaperones such as ubiquitin ligase CHIP that mediating the ubiquitination of F508del-CFTR in the plasmatic membrane (PM) promotes its internalization and degradation, reducing the effectiveness of pharmacological treatments developed this far.

Here we describe a new molecular mechanism from which is possible to prevent the recognition of the CFTR-F508del by MCQPP. This is based on a conformational change in the protein NHERF1 that prevents the binding of ubiquitin-ligase CHIP to pharmacologically rescued CFTR-F508del to thePM. It is also shown that manipulation of this mechanism significantly improves the efficacy of the drugs available for the treatment of CF by retaining the CFTR-508del rescued from the cell surface. It became relevant to develop a molecular biosensor, fluorescent, based in the characterized mechanism, which can be applied in high-throughput screening assays to identify and characterize ways to enable pharmacologically this mechanism to improve treatments currently available for the benefit of CF patients.

Keywords: