FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
FABIANA APARECIDA SANTILLI BRANDÃO
DESENVOLVIMENTO DE TÉCNICA DE BIÓPSIA OVARIANA PARA CAPRINOS (Capra hircus)
FORTALEZA-CEARÁ 2017
DESENVOLVIMENTO DE TÉCNICA DE BIÓPSIA OVARIANA PARA CAPRINOS (Capra hircus)
FORTALEZA-CEARÁ 2017
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias.
Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal.
Linha de Pesquisa: Reprodução e Sanidade de Pequenos Ruminantes. Orientador: Dárcio Itálo Alves Teixeira
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Estadual do Ceará
Sistema de Bibliotecas
Brandão, Fabiana Aparecida Santilli .
Desenvolvimento de técnica de biópsia ovariana para caprinos (Capra hircus) [recurso eletrônico] / Fabiana Aparecida Santilli Brandão. - 2017.
1 CD-ROM: il.; 4 ¾ pol.
CD-ROM contendo o arquivo no formato PDF do trabalho acadêmico com 65 folhas, acondicionado em caixa de DVD Slim (19 x 14 cm x 7 mm).
Dissertação (mestrado acadêmico) - Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária,
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Fortaleza, 2017.
Área de concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Orientação: Prof. Dr. Dárcio Itálo Alves Teixeira. Coorientação: Prof. Dr. Eduardo Leite Gastal. 1. Biopsy pick-up. 2. Caprino. 3. Células do estroma. 4. Folículos pré-antrais. 5. Ovário. I. Título.
À Deus.
Minha família: Elizabeth (mãe), Alexandre (irmão), Pedro (pai) e minha bebê felina Pérola. Amigos de vida e laboratório.
Á Deus por toda benção derramada sobre mim e como reconhecimento de que sem Ele eu nada poderia ter feito e, de que minhas conquistas seriam em vão.
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias pela oportunidade a mim concedida.
Ao órgão de fomento Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico (FUNCAP) pela concessão da bolsa e ao Programa Ciências Sem Fronteiras da CAPES, modalidade Pesquisador Visitante Especial - PVE pelo apoio financeiro.
A minha mãe, irmão e familiares por todo carinho, amor, respeito, e apoio sentimental e financeiro, dedicado a mim. Amo vocês!
Os sinceros agradecimentos ao meu orientador Dárcio Ítalo Alves Teixeira, pela amizade, disponibilidade, confiança, e oportunidade a mim concedida, a Professora Ana Paula Ribeiro Rodrigues por ter aberto as portas da pós-graduação, ao Professor José Ricardo de Figueiredo por ter aberto as portas de estágio e permitido execução do meu trabalho em seu laboratório (LAMOFOPA), ao Professor Vicente José de Figueiredo Freitas por ter me acolhido em seu laboratório (LFCR), ao Professor Eduardo Leite Gastal pelos seus ensinamentos e acolhimento durante todo o período experimental. Ao querido casal de professores Kele Amaral Alves e Benner Geraldo Alves, por me ensinarem e compartilharem muitos de seus conhecimentos, e por estarem sempre ao meu lado.
À minha equipe de trabalho e execução dos experimentos por todo o conhecimento e batalhas compartilhados. Doutoranda Samara Silva de Souza, Doutorando Yago Pinto da Silva, Professora Kele, Professor Benner, Professor Dárcio, Professor Eduardo Leite Gastal, sem vocês este experimento não teria acontecido, cada um de vocês teve um papel fundamental neste processo.
A todos os funcionários do PPGCV, por estarem sempre dispostos a ajudar.
A toda a equipe do LFCR por ter me apoiado e auxiliado nos momentos mais difíceis, dando opiniões, ajudando em correções, e sendo meus amigos. Valeu cada momento que passei ao lado de cada um, adoro vocês! Em especial Lívia Magalhães, Ana Clara Sampaio, Samara Silva de Souza, Thaís Thatiane Souza, Iana Sales, Camila Cavalcanti, e a equipe de iniciação científica: Yara Diógenes, Maria Eduarda Temporal e Aniele Santos. Ao professor Antônio Carlos Monreal, por sua alegria de viver e carinho dedicado a mim.
Às minhas primas Tatiana Coradi, Juliana Coradi, e a amiga Ana Carol Rios por me incentivar.
A todos que contribuíram direta e indiretamente para a construção desta obra, os meus sinceros agradecimentos.
segura e apropriada para coletar fragmentos ovarianos in vivo de grandes animais (ex., bovinos e equinos). No entanto o uso de BPU para coletar tecido ovariano in vivo em cabras ainda não foi reportado. Os objetivos deste estudo foram: (i) testar diferentes tamanhos de agulha de biópsia para coletar o tecido ovariano in situ usando o método BPU (Experimento 1), e (ii) estudar características do tecido ovariano, como densidade, morfologia, distribuição de classe folicular pré-antral e densidade celular estromal em fragmentos de ovário obtidos in
vivo através de um método de BPU laparoscópico (Experimento 2). No Experimento 1, os
ovários de cabra (n = 20) foram coletados em um abatedouro e submetidos a BPU in situ. Foram testadas três agulhas (16, 18 e 20G). No Experimento 2, a agulha de biópsia mais eficiente do Experimento1 foi utilizada para realizar a BPU laparoscópica em cabras (n = 8). No Experimento 1, a taxa de recuperação foi maior (P < 0,05; variação de 50 a 62%) com agulhas 16G e 18G do que a agulha 20G (17%). O peso médio de fragmentos de ovário coletados pela agulha 16G foi maior (P < 0,05) do que a 18G e a 20G. No Experimento 2, 62 tentativas de BPU in vivo foram realizadas e 52 fragmentos de ovário foram coletados (taxa de sucesso de 90%). No total, 2.054 folículos pré-antrais foram registrados em 5.882 seções histológicas analisadas. A densidade folicular pré-antral média foi de 28,4 ± 1,3 folículos por cm2. A densidade folicular diferiu (P < 0,05) entre os animais e fragmentos ovarianos no mesmo animal. A densidade média das células do estroma nos fragmentos de ovário foi de 37,1 ± 0,5 células por 2500 μm2
e diferiu (P < 0,05) entre os animais. Além disso, a densidade de folículos pré-antrais e a densidade de células do estroma foram associadas (P < 0,001). A porcentagem de folículos morfologicamente normais foi de 70,1 ± 1,2 e diferiu (P < 0,05) entre os animais. A maioria (79%) dos folículos morfologicamente normais foi classificada como folículo primordial e diferiu (P < 0,05) entre os animais e entre os ovários. Em resumo, um método de BPU laparoscópico foi desenvolvido para recuperar tecido ovariano in vivo em cabras com uma taxa de sucesso satisfatória. Além disso, este estudo descreveu pela primeira vez que fragmentos de biópsia de ovários de cabra apresentam alta heterogeneidade na densidade folicular, morfologia folicular, distribuição de classes foliculares e densidade de células estromais.
fragments from live animals. However, no studies have been reported on the use of BPU to collect ovarian tissue in vivo in goats. The objectives of this study were: (i) to test different sizes of biopsy needle to collect ovarian tissue in situ using the BPU method (Experiment 1), and (ii) to study characteristics of ovarian tissue such as density, morphology, class distribution preantral follicular and stromal cell density in ovary fragments obtained in vivo using a laparoscopic BPU method (Experiment 2). In Experiment 1, goat ovaries (n = 20) were collected in a slaughterhouse and submitted to BPU in situ. Three needles (16, 18 and 20G) were tested. In Experiment 2, the most efficient biopsy needle from Experiment 1 was used to perform laparoscopic BPU in goats (n = 8). In Experiment 1, the recovery rate was higher (P < 0.05, range 50-62%) with 16G and 18G needles than the 20G needle (17%). The mean weight of ovary fragments collected by the 16G needle was greater (P < 0.05) than the 18G and the 20G needle. In Experiment 2, 62 biopsy attempts were performed and 52 ovarian fragments were collected (90% success rate). Overall, 2,054 preantral follicles were recorded in 5,882 histological sections analyzed. The mean preantral follicular density was 28.4 ± 1.3 follicles per cm2. The follicular density differed (P < 0.05) between the animals and ovarian fragments in the same animal. The mean density of the stromal cells in the ovarian fragments was 37.1 ± 0.5 cells per 2500 μm2, and differed (P < 0.05) between the animals. In addition, the preantral follicle density and the stromal cell density were associated (P < 0.001). The percentage of morphologically normal follicles was 70.1 ± 1.2 and differed (P < 0.05) among the animals. The majority (79%) of the morphologically normal follicles was classified as primordial follicles and differed (P < 0.05) between the animals and between the ovaries. In summary, a laparoscopic BPU method was developed to recover ovarian tissue in vivo with a satisfactory success rate in goats. In addition, this study described for the first time that goat ovarian biopsy fragments have high heterogeneity in follicular density, morphology, class distribution, and stromal cell density.
Figura 1 - Morfologia do ovário de mamíferos e suas estruturas... 17 Figura 2- Esquema ilustrativo da formação dos oócitos e folículos, destacando a
relação dos processos de oogênese e foliculogênese na maioria dos mamíferos. LH: hormônio luteinizante; MCI: massa celular interna... 19 Figura 3- Representação esquemática da foliculogênese e dos estádios
foliculares... 20 Figura 4- Classificação por desenvolvimento e morfologia dos folículos
pré-antrais de caprinos. Primeira linha: folículos normais; segunda linha: folículos anormais. A, E: folículos primordiais; B, F: folículos de transição; C, G: folículos primários, D, H: folículos secundários. Aumento de X400, escala de 20 µm... 21 Figura 5- Modo de ação da agulha de biópsia Tru-Cut. (1) agulha com entalhe
envolta pela bainha; (2) o empurrar da agulha dentro do ovário; (3) deslizar da bainha sobre a agulha para coletar um fragmento; e (4) retirada da agulha, bainha e fragmento... 24
Capítulo 1
Figure 1- Relationship between ovarian fragment weight and needle gauge. Ovarian biopsies were carried out in situ with different biopsy needle sizes (16G, 18G, and 20G). A linear regression analysis is represented by the equation and black line [ovarian fragment weight = 4.281 ˗ (0.174 × needle gauge); r = ˗0.36; R2
= 0.13; P <
0.001]……….. 49
Figure 2- Association between ovarian fragment weight and number of strikes of the biopsy needles in in situ procedures. The number of strikes is a combination of the different types of needles (16G, 18G, and 20G) used. A linear regression analysis is represented by the equation and black line [ovarian fragment weight = 1.487 ˗ (0.0181 × number of
and (C) number of preantral follicles per mg of tissue after a laparoscopic biopsy pick-up method. (A) Each bar represents an ovarian fragment (n = 39) collected from goats (n ……….. 51 Figure 4- Preantral follicle density in (A) ovarian biopsy fragments (n = 39)
and (B) histological sections (n = 5,882). A high variability of follicular density was observed among ovarian fragments and histological sections from the same animal. Each circle on the chart represents an (A) ovarian fragment, and (B) histological section
evaluated……….……… 54
Figure 5- Correlation analysis between preantral follicle density and stromal cell density. The association (black line) was evaluated by Spearman correlation test (r = 0.18; P < 0.001). Each circle on the chart represents a histological section evaluated (n = 527……..……… 56
Table 1- Recovery rate and mean (± SEM) weight of goat ovarian fragments collected in situ using different biopsy needle size…….. 48 Table 2- Mean (± SEM) density of goat preantral follicles in ovarian
biopsy fragments collected by laparoscopic biopsy pick-up
method……….. 52
Table 3- Variance components of the random effects (ovarian fragment and histological section) for goat preantral follicle density, after laparoscopic biopsy pick-up method……….. 53 Table 4- Mean (± SEM) density of stromal cells in ovarian biopsy
fragments harvested from goats by laparoscopic biopsy pick-up
meth………..………. 55
Table 5- Mean (± SEM) percentage of morphologically normal preantral follicles enclosed in ovarian biopsy fragments collected by laparoscopic biopsy pick-up method……….. 57 Table 6- Mean (± SEM) percentage of normal primordial and developing
follicles enclosed in ovarian fragments collected by laparoscopic biopsy pick-up method………... 58
BPU “Biopsy Pick-up” (Biópsia Pick-up) cap. Capítulo cm Centímetro (s) cm2 Centímetros quadrados CV Coeficiente de variação ed. Edição Ed. Editor e.g. Exemplo
FOPA Folículos ovarianos pré-antrais
G gauge i.m. Intramuscular In: Dentro de i.v. Intravenoso Kg Kilograma (s) mHz mega-Hertz µm Micrometro (s) µm2 Micrometros quadrados mg Miligrama (s) mL Mililitro (s) mm Milímetro (s) mm3 Milímetros cubicos min Minutos
OPU “Ovum Pick-up” P Índice de significância p. Páginas
r Coeficiente de correlação de Spearman R2 Coeficiente de determinação
s.c. Subcutâneo
SEM “Standard error of mean” (Erro Padrão da Média) UI Unidade Internacional
% Porcentagem ≥ Maior ou igual < Menor > Maior ± Mais ou menos = Igual / Dividido × Multiplicado + Mais °C Graus Célsius @ Arrouba
2 REVISÃO DE LITERATURA... 17
2.1 ARQUITETURA E FUNÇÃO OVARIANA... 17
2.1.1 Folículos ovarianos... 18
2.1.2 Oôgenese e foliculogênese... 18
2.2 MANIPULAÇÃO DE OÓCITOS INCLUSOS EM FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS (MOIFOPA)... 22
2.3 BIOTÉCNICAS REPRODUTIVAS... 22
2.3.1 Ultrassonografia como ferramenta de suporte às biotécnicas reprodutivas... 22
2.4 BIÓPSIA OVARIANA... 24 3 JUSTIFICATIVAS... 26 4 HIPÓTESES CIENTÍFICAS... 27 5 OBJETIVOS... 28 5.1 GERAL... 28 5.2 ESPECÍFICOS... 28 6 CAPÍTULO 1... 29 7 CONCLUSÕES GERAIS... 59 8 PERSPECTIVAS... 60 REFERÊNCIAS... 61
1 INTRODUÇÃO
A biópsia ovariana proporciona o acesso à população de folículos pré-antrais possibilitando a recuperação de material para estudos avaliativos ou para a preservação da fertilidade feminina, por ser uma técnica de coleta de tecido pouco invasiva. Porém, em cabras as únicas formas de obtenção de tecido ovariano são através de métodos definitivos que não preservam a continuidade reprodutiva da fêmea, pois os ovários são adquiridos de abatedouros ou após ovariectomia. Portanto, o desenvolvimento de uma técnica que colete repetidamente tecido ovariano, com mínima perturbação da função deste órgão, tem um grande valor para fins experimentais ou diagnósticos.
A técnica de biópsia ovariana pela importância experimental e diagnóstica apresenta como vantagens: (i) a possibilidade de repetição in vivo no mesmo animal; (ii) ser minimamente invasiva; (iii) podendo ser utilizada em animais em qualquer idade, estádio reprodutivo e fase do ciclo estral; (iv) utilizada para a realização de estudos do monitoramento da fisiologia reprodutiva e; (v) no diagnóstico de tumores.
A biópsia ovariana com auxílio de agulha Tru-Cut surgiu a partir da técnica de ovum pick up – OPU em vacas (BOLS et al., 1995) e posteriormente foi adaptada para realização de biópsia transvaginal para a coleta de parede de corpo lúteo em vacas (KOT et
al., 1999) e éguas (BEG et al., 2005), surgindo assim a biópsia ovariana com diferentes
diâmetros de agulhas Tru-Cut, em vacas (14G - AERTS; OSTE; BOLS, 2005; AERTS et al., 2008) e posteriormente em éguas (16G - HAAG et al., 2013a,b,c; 14G - DIEL DE AMORIM
et al., 2016), e mais atualmente em porcas (16G - BJÖRKMAN et al., 2016).
Diante disso, a escolha do diâmetro mais apropriado da agulha de biópsia Tru-Cut para a obtenção de fragmentos ovarianos em cabras é fundamental, pois se necessita de uma quantidade de tecido ovariano que possam ser utilizados em estudos avaliativos sobre a população folicular, uma vez que a reserva de folículos pré-antrais e a densidade folicular são importantes indicadores da capacidade reprodutiva de uma espécie (ALVES et al., 2015).
O estudo de parâmetros como a densidade folicular e de células do estroma ovariano são cruciais para que se obtenham sucesso em técnicas de reprodução assistida, como os transplantes de tecido ovariano. Assim para uma maximização da reprodutibilidade dos resultados experimentais em transplante ovariano, é necessário avaliar a densidade e a distribuição folicular no tecido ovariano antes que este seja transplantado (WAKASA et al., 2016). Estudos anteriores sobre a avaliação da população folicular mostraram que a heterogeneidade da densidade folicular no córtex ovariano pode estar relacionada a vários
fatores, como: a formação e migração das células germinativas primordiais durante a embriogênese (Hummitzsch et al., 2013); ao fator espécies (éguas - Haag et al., 2013b; mulheres - Schmidt et al,. 2003; ovelhas - Fransolet et al., 2014); a presença de estruturas ovarianas (éguas - Alves et al, 2016; vacas - Gao et al., 2011; búfalas - Gupta et al., 2007; ovelhas - Al-Gubory et al., 1987) e a idade (éguas - Alves et al, 2016; mulheres - Chambers et
al., 2010).
Dessa forma destaca-se a importância da elaboração da técnica de biópsia ovariana em cabras para obtenção de tecidos que possam ser utilizados em pesquisas reprodutivas com intuito de preservação da espécie bem como de melhorias nas técnicas de reprodução assistida tanto em animais domésticos como nos animais selvagens. Para uma melhor compreensão sobre a magnitude deste trabalho, a revisão de literatura a seguir apresenta uma breve abordagem sobre: arquitetura e função do ovário, incluindo oogênese e foliculogênese, folículos ovarianos, manipulação de oócitos inclusos em folículos pré-antrais (MOIFOPA), biotécnicas reprodutivas, ultrassonografia ovariana como ferramenta de suporte às biotécnicas reprodutivas e biópsia ovariana.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 ARQUITETURA E FUNÇÃO OVARIANA
O ovário é o órgão reprodutivo primário da fêmea que realiza duas funções primordiais: (I) formar a célula germinativa feminina, chamada de oócito, e (II) produzir os hormônios sexuais e diferentes peptídeos (KARLSON et al., 1982). Estas duas funções ocorrem dentro da unidade morfofuncional do ovário, denominado folículo ovariano (SANTOS, 2009).
A arquitetura ovariana é composta pelas regiões cortical e região medular, sendo que o córtex é localizado na região mais externa do ovário, com exceção dos equinos que se localiza mais internamente (HAFEZ; HAFEZ, 2004). Nesta região ovariana encontra-se o epitélio germinativo, composto por uma única camada de células epiteliais cuboides e abaixo deste epitélio se encontra a túnica albugínea, uma camada de tecido conjuntivo denso. Posteriormente as células estromais e uma grande quantidade de folículos pré-antrais (primordiais, transição ou intermediário, primários e secundários) e antrais (terciário, pré-ovulatório ou de Graaf), além de corpos lúteos e corpo albicans, compõem o córtex (COUTINHO et al., 2013). Logo, a região medular ovariana encontra-se abaixo do córtex sendo formada por tecido conjuntivo denso, com pequenas áreas de tecido conjuntivo frouxo, vasos sanguíneos, linfáticos e nervos (COUTINHO et al., 2013), conforme demonstrado na figura 1.
Figura 1. Morfologia do ovário de mamíferos e suas estruturas
2.1.1 Folículos ovarianos
O folículo ovariano é constituído por um oócito circundado por células somáticas (células da granulosa e tecais). A função dos folículos é proporcionar um ambiente ideal para a manutenção da viabilidade, crescimento e maturação do oócito (FIGUEIREDO et al., 1999). De acordo com presença ou a ausência de cavidade antral, os folículos podem ser classificados como: (1) folículos pré-antrais (FOPA) e (2) folículos antrais. Os FOPA podem ser classificados de acordo com o estádio de desenvolvimento em: (i) primordiais, que são constituídos por um oócito imaturo circundado por células da pré-granulosa de formato pavimentoso; (ii) de transição ou intermediários, que são compostos por um oócito imaturo rodeado por células da granulosa pavimentosas e cubicas; (iii) primários, estes são formados um oócito imaturo circundado por uma única camada de células da granulosa em formato cúbico e (iv) secundários, sendo estes caracterizados por um oócito imaturo circundado por duas ou mais camadas de células da granulosa de forma cubica (BRAW-TAL; YOSSEFI, 1997). Em relação aos folículos antrais terciários esses ainda são compostos por um oócito imaturo, ao passo que ao se tornarem pré-ovulatórios o oócito se torna maduro, em ambos a cavidade antral é desenvolvida em seu interior e é preenchida por fluido folicular (FIGUEIREDO et al., 2008).
Assumindo que a oogênese e a foliculogênese são processos concomitantes que precedem a ovulação e a expulsão do oócito maturado, estes processos serão abordados logo abaixo.
2.1.2 Oogênese e foliculogênese
A oogênese compreende o processo de desenvolvimento das células germinativas primordiais (CGP) que estão num processo de mitose até a finalização das sucessivas divisões meióticas do oócito (OKTEM; OKTAY, 2008). Durante o início do desenvolvimento fetal, as gônadas são colonizadas por CGP, que são oriundas do folheto embrionário endoderma. Quando as CGP chegam às gônadas primitivas, ocorre a multiplicação por mitoses e consequentemente se diferenciam, passando a serem chamadas de oogônias. Estas células passam por sucessivas mitoses e quando esta divisão cessa, inicia-se a meiose originando oócitos primários, estes estão com núcleo em prófase I, estágio de diplóteno, sendo chamada de vesícula germinativa (VG), e assim permanecerão até que o animal atinja a puberdade (VAN DER HURK; ZHAO, 2005). Com início da puberdade, em razão da liberação
pré-ovulatória do hormônio luteinizante (LH), em algumas horas antes da ovulação, a meiose é retomada e a VG se rompe, continuando a meiose até a expulsão do primeiro corpúsculo polar, formando o oócito secundário. Este oócito se encontra na segunda divisão meiótica, progredindo até metáfase II, permanecendo nesta fase, até que este oócito se fecunde por um espermatozóide. Após a fecundação, ocorre a segunda retomada da meiose e o núcleo oocitário segue pelos estádios de anáfase e telófase II, levando a liberação do segundo corpúsculo polar e formação de um oócito haplóide fecundado, determinando assim o fim da oogênese (FIGUEIREDO et al., 2008). O processo de oogênese pode ser acompanhado na Figura 2.
Figura 2. Esquema ilustrativo da formação dos oócitos e folículos, destacando a relação dos processos de oogênese e foliculogênese na maioria dos mamíferos. LH: hormônio luteinizante; MCI: massa
celular interna.
Em meio a este processo, ocorre a foliculogênese, que engloba o processo de crescimento folicular, onde um folículo primordial se desenvolve até o estádio de folículo pré-ovulatório (SILVA, 2005). É durante esta etapa, que a morfologia dos folículos é modificada devido ao crescimento do oócito, proliferação e diferenciação das células da granulosa, assim como o surgimento das células da teca, zona pelúcida e de um antro completo de líquido folicular (BRISTOL-GOULD; WOODRUFF, 2006). De acordo com o desenvolvimento os folículos podem ser classificados em dois grupos distintos: (i) pré-antrais ou não cavitários, que representam mais de 90% da população folicular do ovário e (ii) antrais ou cavitários (FIGUEIREDO et al., 2007). Os folículos primordiais encontram-se em estado quiescente (CORTVRINDT; SMITZ, 2001), após ativação eles se desenvolvem nos estágios mais avançados, até a formação do folículo pré-ovulatório. Contudo, durante a fase reprodutiva, quando muitos folículos são ativados, somente uma pequena porção (0,01%) dos folículos ativados chegarão a serem ovulados, devido a grande perda por um processo natural denominado de atresia (HANSEN et al.,2008). Conforme demonstrado na figura 3 o processo de foliculogênese.
Conforme explanado anteriormente pode-se fazer a classificação dos folículos pré-antrais pelo seu desenvolvimento (FIGUEIREDO et al., 2007) e de acordo com a morfologia em normal e anormal ou degenerado, sendo: (i) normais quando contém um oócito intacto e células da granulosa intactas e (ii) anormais ou degenerados quando contém um núcleo de oócito picnótico, ooplasma encolhido, acompanhado ou não por células de
Figura 3. Representação esquemática da foliculogênese e dos estádios foliculares
granulosa desorganizadas (por exemplo, aumento de volume com ou sem desprendimento da membrana basal). A presença de pelo menos uma dessas características acima mencionadas é indicativa da atresia. (CARVALHO et al., 2014), através da histologia podemos observar tais classificações, vide figura 4.
2.2 MANIPULAÇÃO DE OÓCITOS INCLUSOS EM FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS (MOIFOPA)
A MOIFOPA é uma biotécnica que consiste em utilizar o isolamento, a conservação por resfriamento ou criopreservação, bem como o cultivo in vitro de folículos ovarianos pré-antrais a partir de tecido ovariano (FIGUEIREDO et al., 2008). A biotécnica de MOIFOPA se fundamenta através de dois objetivos: 1) coletar ou isolar os folículos pré-antrais antes que eles sofram atresia e 2) cultivar estes até que cheguem ao estádio de maturação, evitando a atresia folicular (FIGUEIREDO et al., 2008). Além disso, um dos grandes desafios desta biotécnica é conseguir desenvolver um modelo eficiente de ovário artificial.
Fonte: arquivo pessoal.
Figura 4. Classificação por desenvolvimento e morfologia dos folículos pré-antrais de caprinos. Primeira linha: folículos normais; segunda linha: folículos anormais. A, E: folículos primordiais; B, F:
folículos de transição; C, G: folículos primários, D, H: folículos secundários. Aumento de X400, escala de 20 µm.
A
B
C
D
Pela sua importância tanto na pesquisa fundamental ou básica, essa biotécnica pode contribuir para elucidar mecanismos que envolvem a foliculogênese na fase pré-antral (FIGUEIREDO et al., 2008). O isolamento de milhares de folículos pré-antrais a partir de um único ovário e o cultivo in vitro dos oócitos incluso neles até chegarem ao estádio maturado pode contribuir para aumentar o número de animais de alto valor zootécnico ou que estejam em vias de serem extintos. Além da criopreservação de folículos pré-antrais isolados ou inclusos em tecido que podem ser fundamentais para constituir bancos de germoplasma humano e animal com intuito de conservar a fertilidade (DONNEZ et al., 2006; FIGUEIREDO et al., 2008).
2.3 BIOTÉCNICAS REPRODUTIVAS
Biotécnicas reprodutivas são ferramentas otimizadoras na produtividade, rentabilidade, intensificação do manejo reprodutivo, melhoramento genético de rebanhos (SIMPLÍCIO; FREITAS; FONSECA, 2007), além de preservar a fertilidade e produção hormonal (DITTRICH et al., 2015).
A utilização de biotécnicas reprodutivas possibilita a maximização do desempenho do melhoramento genético e preservação da fertilidade. Diante disso as biotecnologias da reprodução animal surgem como alternativa para acelerar o ganho genético e aumentar o potencial reprodutivo dos animais. Dentre as biotécnicas destaca-se a inseminação artificial, coleta e transferência de embriões que podem ser assistidos por ultrassonografia (HILDEBRANT et al., 2000) e transplantes de fragmentos ovarianos sendo essa auxiliada pelas técnicas de biópsia para a coleta de tecido (DITTRICH et al., 2015).
No intuito de impulsionar as biotécnicas reprodutivas, a ultrassonografia ovariana tem sua importância revelada logo abaixo.
2.3.1 Ultrassonografiaovariana como ferramenta de suporte às biotécnicas reprodutivas
A ultrassonografia na ciência reprodutiva oferece novas oportunidades para monitorar o ciclo sexual, a ovulação, regimes de superovulação, programas de contracepção, coleta de oócitos e procedimentos de transplante de ovário, bem como na aplicação da inseminação artificial, coleta e transferência de embriões (HILDEBRANDT et al., 2000). Nos programas de transferência de embriões é de suma importância para que ocorra êxito nesta técnica o uso do exame ultrassonográfico em períodos de pré e pós-cobertura de doadoras de
embriões, bem como na avaliação das receptoras no momento da inovulação (FERREIRA; MEIRA, 2011). Além disso, também tem sido utilizada para a coleta de fragmentos ovarianos por via transvaginal em vacas (AERTS; OSTE; BOLS, 2005; AERTS et al., 2008) e éguas (HAAG et al., 2013a,b,c) para posterior pesquisa de folículos ovarianos pré-antrais.
A ferramenta de ultrassonografia (modo B) é utilizada como tecnologia de apoio às biotécnicas de reprodução assistida permitindo em tempo real diagnosticar uma gestação, bem como determinar o número e sexo dos filhotes, acompanhar fenômenos biológicos (OLIVEIRA; FELICIANO; OLIVEIRA, 2013), monitorar a dinâmica folicular e luteal (SOUSA et al., 2011), atuar como guia para aspiração folicular na ovum pick-up – OPU (BOLS et al., 1995) e em biópsia ovariana (AERTS; OSTE; BOLS, 2005; HAAG et al., 2013a,b,c).
Estudos envolvendo o crescimento e regressão de folículos ovarianos em caprinos da raça Saanen foram realizados, sendo avaliados por ultrassonografia transretal durante quatro intervalos entre as ovulações, monitorando folículos a partir dos 3 mm, concluindo-se que existe um padrão de 4 ondas foliculares, na qual a dominância folicular ocorreu especialmente nas ondas 1 e 4 (GINTHER; KOT, 1994), demonstrando o quão eficiente é a ultrassonografia para avaliação dos ovários e estudos sobre suas estruturas.
A imagem ultrassonográfica em tempo real pode também ser utilizada para determinar o momento da ovulação em cabras, dessa forma pode ser aplicada para seleção de doadoras de oócitos em programas de transgênese ou para avaliação de doadoras com múltiplas ovulações, como visto por (TEIXEIRA et al., 2008), além da avaliação da dinâmica folicular, os folículos antrais podem mesurados a partir de 2 mm (SOUSA et al.,2011) ou a partir de 3 mm (SIMÕES et al., 2006), permitindo assim uma contagem de folículos e mensuração em tempo real.
O exame ultrassonográfico foi utilizado em um estudo para avaliar a função ovariana de ovários remanescentes em mulheres submetidas a tratamentos quimioterápicos, associada a exames hormonais (FSH, LH, estradiol, inibina A e B) após autotransplante de córtex ovariano. Foram mensurados o volume ovariano (variação: 0,3 a 13,3 mm3), número de folículos antrais (variação: 0 a 12) através do aparelho de ultrassom, juntamente com a dosagens hormonais, foi confirmado a recuperação da função ovariana através do retorno da menstruação, surgimento de folículos no exame ultrassonográfico e normalização dos níveis hormonais (SCHMIDT et al., 2005). Dessa maneira a ultrassonografia é uma ferramenta que auxilia nas técnicas de reprodução assistida, além da biópsia ovariana que será estudada logo a seguir.
2.4 BIÓPSIA OVARIANA
Estudos sobre a população de folículos pré-antrais seja para simples avaliação ou preservação da fertilidade feminina necessitam de tecido ovariano, este tem sua coleta limitada para algumas espécies, pois as únicas formas de obtenção de tecido são através de ovariectomia ou animais de abatedouro (HAAG et al., 2013a), além disso por serem métodos definitivos, não preservam a continuidade reprodutiva da fêmea. Dessa forma, a técnica de biópsia ovariana (ovarian biopsy pick-up - BPU), surgiu para possibilitar a coleta de tecido e ter acesso à população de folículos pré-antrais, sem prejudicar a função ovariana (AERTS; OSTE; BOLS, 2005) preservando a fertilidade.
Para uma melhor compreensão do funcionamento da agulha Tru-Cut e de como é feita a coleta do tecido ovariano vide figura 5.
A técnica de biópsia ovariana foi primeiramente realizada em mulheres com a finalidade de descobrir o efeito da idade sobre a reserva de folículos pré-antrais (LASS et al., 1997). Estudos sobre a preservação da fertilidade feminina utilizando a densidade e a distribuição folicular vem aumentando, pois a quantidade de folículos pré-antrais em tecido
Figura 5. Modo de ação da agulha de biópsia Tru-Cut. (1) agulha com entalhe envolta pela bainha; (2) o empurrar da agulha dentro do ovário; (3) deslizar da bainha sobre a agulha
para coletar um fragmento; e (4) retirada da agulha, bainha e fragmento.
ovariano é fundamental para o sucesso em transplantes (SCHMIDT et al., 2003; SOLEIMANI et al., 2006).
A utilização de fragmentos congelados oriundos de bancos de tecido ovariano tem se tornado comum, e a comunidade científica vêm estudando por meio de transplantes a restauração da atividade ovariana e tem reportado resultados satisfatórios que vão desde o retorno do crescimento folicular (DONNEZ et al., 2006) até nascimento de bebês (ROUX et
al., 2010; DOLMANS et al., 2013). Outros dados relatam que o autotransplante de tecido
ovariano em mulheres pós-púberes é capaz de restaurar a fertilidade com mais de 80 nascidos vivos atualmente e com uma taxa de gravidez correspondente de 23 a 37% (LADANYI et al., 2017). Os resultados promissores desses estudos demonstraram que o procedimento de biópsia possibilitou novas pesquisas com intuito de melhorar as biotécnicas reprodutivas.
A biópsia ovariana em grandes animais surgiu de uma adaptação da técnica de aspiração folicular (ovum pick-up – OPU), primeiramente testada em bovinos (AERTS; OSTE; BOLS, 2005), depois em equinos (HAAG et al., 2013a,b,c) e suínos (BJÖRKMAN et
al., 2016). Fragmentos do córtex ovariano bovino obtido por meio de biópsia demonstraram a presença de folículos pré-antrais, verificando a segurança da técnica, a repetibilidade sem prejuízo da função ovariana e a taxa de recuperação de tecido (68%; AERTS; OSTE; BOLS, 2005). A biópsia ovariana em equinos obteve um número satisfatório de folículos pré-antrais por fragmento, variando de 26,6 ± 4,7 (éguas jovens) a 15,5 ± 2,8 (éguas velhas). Neste estudo também foi reportado a repetibilidade, a alta porcentagem de folículos normais (88%), bem como uma satisfatória taxa de sucesso (72%). Com isso foi demonstrado que a técnica é segura, pois os animais que foram submetidos às biópsias continuaram ciclando e o parênquima ovariano não apresentou trauma significativo pela avaliação ultrassonográfica (HAAG et al., 2013a).
3 JUSTIFICATIVAS
A biópsia é uma técnica segura e prática para a coleta de tecido ovariano sem prejudicar a função reprodutiva e o seu uso tem possibilitado a realização de diversos estudos com aplicações clínicas nas áreas de reprodução animal e humana. O procedimento de biópsia tem possibilitado a obtenção de satisfatórias taxas de recuperação in vivo de tecido ovariano (por exemplo: 86% em equinos, 68% em bovinos) provendo uma fonte de material para posterior aplicação em diversas técnicas de reprodução assistida (ex., cultivo in vitro, criopreservação e transplante de tecido ovariano).
Dessa forma, este estudo teve como destaque os seguintes pontos: (i) inovação; pois em caprinos não existem estudos abordando a aplicação da técnica de biópsia ovariana; (ii) a identificação de um melhor dispositivo de biópsia ovariana adequado que auxiliará no desenvolvimento de futuros projetos com o propósito de implantar técnicas para obtenção de tecido ovariano in vivo em animais domésticos e selvagens.
4 HIPÓTESES CIENTÍFICAS
As seguintes hipóteses científicas foram consideradas: (i) a agulha de biópsia de maior diâmetro possibilita a obtenção de melhores taxas de recuperação de tecido ovariano; (ii) o procedimento de biópsia não compromete a morfologia dos folículos pré-antrais sendo a normalidade semelhante entre os fragmentos de tecido ovariano; (iii) a distribuição folicular pré-antral difere entre os fragmentos de biópsia de um mesmo animal; e (iv) a densidade folicular pré-antral e de células do estroma ovariano variam consideravelmente entre fragmentos e entre as secções histológicas de um mesmo fragmento ovariano.
5 OBJETIVOS
5.1 OBJETIVO GERAL
Desenvolver e avaliar a eficiência da biópsia ovariana por laparoscopia para a obtenção de tecido ovariano in vivo em cabras.
5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Determinar o diâmetro mais apropriado da agulha de biópsia Tru-Cut para obtenção de fragmento ovariano;
Determinar a taxa de recuperação de fragmentos ovarianos pela técnica de BPU; Determinar o peso em miligramas dos fragmentos de biópsia;
Determinar a população de folículos pré-antrais nos fragmentos de biópsia; Determinar a densidade em cm2 de folículos pré-antrais por fragmento e por
miligrama de tecido ovariano;
Determinar a densidade celular em 2.500 µm2 por fragmento ovariano;
Avaliar a viabilidade dos folículos pré-antrais encontrados nos fragmentos de biópsia;
6 CAPÍTULO 1
Método de coleta de biópsia ovariana laparoscópica para cabras
“Laparoscopic ovarian biopsy pick-up method for goats”
Artigo submetido ao periódico: Theriogenology Em: junho de 2017
Highlights
1) A laparoscopic biopsy pick-up method has been developed to harvest ovarian tissue in vivo in goats.
2) Preantral follicle density has been determined for the first time in goat ovary.
3) Goat ovarian biopsy fragments have a high heterogeneity in follicular density, morphology, class distribution, and stromal cell density.
Laparoscopic ovarian biopsy pick-up method for goats
Fabiana A.S. Brandão a, Benner G. Alves b, Kele A. Alves b, Samara S. Souza a, Yago P. Silva
a
, Vicente J.F. Freitas a, Dárcio I.A. Teixeira a, Eduardo L. Gastal c, *
a
Laboratory of Physiology and Control of Reproduction, State University of Ceará, Fortaleza, CE, Brazil
b
Laboratory of Manipulation of Oocytes and Preantral Follicles, State University of Ceará, Fortaleza, CE, Brazil
c
Department of Animal Science, Food and Nutrition, Southern Illinois University, Carbondale, Illinois, USA.
*Corresponding author. Tel: +1-618 453 1774; fax: +1-618 453 5231 E-mail address: egastal@siu.edu (Eduardo Leite Gastal)
ABSTRACT
Biopsy pick-up (BPU) has been considered a safe method to harvest ovarian fragments from live animals. However, no studies have been reported on the use of BPU to collect in vivo ovarian tissue in goats. The goals of this study were: (i) to test different biopsy needle sizes to collect ovarian tissue in situ using the BPU method (Experiment 1), and (ii) to study ovarian tissue features such as preantral follicle density, morphology, class distribution, and stromal cell density in ovarian fragments obtained in vivo through a laparoscopic BPU method (Experiment 2). In Experiment 1, goat ovaries (n = 20) were collected in a slaughterhouse and subjected to in situ BPU. Three needles (16, 18, and 20G) were tested. In Experiment 2, the most efficient biopsy needle from Experiment 1 was used to perform laparoscopic BPU in goats (n = 8). In Experiment 1, the recovery rate was greater (P < 0.05; range 50 - 62%) with 16G and 18G needles than the 20G (17%) needle. The mean weight of ovarian fragments collected by the 16G needle was greater (P < 0.05) than the 18G and the 20G needle. In Experiment 2, 62 biopsy attempts were performed and 52 ovarian fragments were collected (90% success rate). Overall, 2,054 preantral follicles were recorded in 5,882 histological sections analyzed. Mean preantral follicular density was 28.4 ± 1.3 follicles per cm2. The follicular density differed (P < 0.05) among animals and ovarian fragments within the same animal. The mean stromal cell density in the ovarian fragments was 37.1 ± 0.5 cells per 2500 µm2, and differed (P < 0.05) among animals. Moreover, preantral follicle density and stromal cell density were associated (P < 0.001). The percentage of morphologically normal follicles was 70.1 ± 1.2, and differed (P < 0.05) among animals. The majority (79%) of the morphologically normal follicles was classified as primordial follicles, and differed (P < 0.05) among animals and between ovaries. In summary, a laparoscopic BPU method has been developed to harvest ovarian tissue in vivo with a satisfactory success rate in goats. Furthermore, this study described for the first time that goat ovarian biopsy fragments have a high heterogeneity in follicular density, morphology, class distribution, and stromal cell density.
1. Introduction
Ovarian biopsy procedures have been developed and used in research for collection of different types of ovarian tissue, such as: corpus luteum (equine: [1-3]; bovine: [4-5]; swine: [6]) and ovarian parenchyma with preantral follicles (human: [7-10]; bovine: [11]; equine: [12-19]; ovine: [20]). Furthermore, ovarian biopsy has also been used for clinical purposes to facilitate differential diagnosis of cancer in women [21,22] and mares [23]. However, in some species, ovarian tissue harvesting in vivo may be difficult to be accomplished due to anatomical limitations; in those cases, ovarian tissue can only be harvested after invasive surgical procedures involving a laparotomy associated or not to an ovariectomy.
From ovarian biopsy fragments its possible to estimate the reproductive potential of a species as well as to design strategies to control fertility or assisted reproductive techniques (ARTs). In this way, the goat may be a useful animal model to develop an in vivo ovarian biopsy technique and subsequently reproductive studies that can be applied in medium sized wild species, such as endangered herbivores (saga antelope, [24]; bighorn sheep, [25]; markhor goats, [26]), or those considered in overabundance white-tailed deer in North America; [27,28].
A high follicular heterogeneity has been shown in ovaries of several species (women: [29]; ovine: [30]; equine: [16,17]; deer: [28]). Therefore, studies targeted to investigate in detail the preantral follicle reserve and density and stromal cell density in biopsied ovarian fragments of several species is crucial for future clinical benefits when subjecting this tissue to in vitro culture, cryopreservation, and transplantation [19].
The aims of this study in goats were to (i) test in situ different biopsy needle sizes to harvest ovarian tissue, (ii) develop an in vivo laparoscopic ovarian biopsy pick-up (BPU) method, and (iii) assess ovarian tissue features such as preantral follicle density, morphology, class distribution, and stromal cell density in ovarian biopsied tissue.
2. Materials and methods
All experimental procedures were approved by the Ethics Committee for the Use of Animals of the State University of Ceará (protocol #2945644/15). The study was carried
out in two experiments: in situ ovarian biopsy (Experiment 1) and in vivo laparoscopic ovarian biopsy (Experiment 2).
2.1. Experiment 1. In situ ovarian biopsy
Ovaries (n = 20) from crossbred goats (2 to 4 years old) were collected at a local slaughterhouse, immediately washed in 70% alcohol (v/v) followed by phosphate buffered saline (PBS), and transported at 4°C to the laboratory.
Biopsy needles (TRU-Cut, Gallini Devices; Mantova, Italy) of sizes 16, 18, and 20G (notch: 1.7 cm, and length: 20 cm) were tested to in situ collection of ovarian tissue. The ovaries were manually stabilized for needle penetration into the cortical region in a tangent plane to the ovarian surface. After, the internal stylet was advanced into the ovary, the notch was exposed, and the device was fired to harvest the ovarian tissue. Immediately after harvesting, biopsy fragments were washed in a Petri dish with PBS, and the weight recorded. Each ovary was punctured six times (twice with each needle), and ovarian structures such as preovulatory follicles and corpora lutea were avoided at the time of needle penetration. All biopsies were performed by the same operator.
The recovery rate of ovarian tissue for each needle was calculated by the following formula: recovery rate = (number of fragments harvested/number of punctures performed) × 100.
2.2. Experiment 2. In vivo laparoscopic ovarian biopsy
2.2.1. Animals
Eight crossbred goats, 2 to 4 years old, were used for the collection of ovarian tissue by in vivo laparoscopy procedure. During the experiment, the animals were kept on pasture, supplemented with hay, balanced concentrate, minerals, and water ad libitum. Before the biopsy procedure, ovaries and uterus of each goat were evaluated by B-mode transrectal ultrasonography (SIUI, model CTS-8800V Plus; San Jose, USA) equipped with 7.5 MHz linear transducer. No hormone treatment was used during the experimental period.
2.2.2. Ovarian tissue collection
All goats were deprived of water and food for a period of 36 hours prior the laparoscopic procedure. Sedation and analgesia were induced with atropine sulfate 1% (Fagra, 0.048 mg/kg i.m., Vetoquinol; São Paulo, Brazil), and thiopental 2.5% (Tiopentax, 20 mg/kg i.v., Cristália; São Paulo, Brazil). After anesthetic induction, the goats were placed in a dorsal restraint and intubated with an inflatable cuff (7.5 mm, 30 cm, Solidor; Guangzhou, China) coupled to an inhalation anesthesia machine (Conquest 3000, HB Hospitalar; São Paulo, Brazil). Deep anesthesia was maintained with isoflurane 3% (Isoforine, Cristália; São Paulo, Brazil).
Ovarian tissue collection was performed using a laparoscopic system (Karl Storz, Tuttligen; Germany). Three abdominal insertions were performed with the aid of a trocar. The first insertion was performed 10 cm cranial to the udder, and 15 cm laterally the alba line. After that, the abdominal cavity was inflated with air to facilitate visualization, manipulation of the reproductive tract, and aid in the positioning of the trocar to perform the remaining insertions. The second insertion was performed contralateral to the first, and used for the insertion of an atraumatic forceps (Clickline Grasping Forceps, Karl Storz; Tuttligen, Germany). Immediately, a third trocar was inserted parallel and medially to the atraumatic forceps at a distance of 3 to 4 cm for the passage of a biopsy needle (TRU-Cut, 16G), as previously described in Experiment 1.
After localization and positioning of the ovary, the biopsy device was inserted tangent to the ovarian surface, avoiding structures such as preovulatory follicles and corpora lutea. Immediately after partial penetration, the notch was exposed taking care to not exceed the entire length of the ovary and the device was fired for harvesting the ovarian tissue. The time required for each surgical procedure ranged from 29 to 90 min per animal. The ovarian fragments were removed from the needle notch with the aid of a 26G needle, washed in a Petri dish with PBS, and the weight recorded. Each ovary was punctured until at least two fragments were obtained. After completion of the procedure, the ovaries were washed under pressure with heated saline solution (37°C) supplemented with sodium heparin 20 UI/mL (Hepamax; São Paulo, Brazil) to prevent ovarian adhesions.
After each biopsy procedure flunixin meglumine (Banamine, 1.1 mg/kg s.c.; Schering-Plow Santé Animale; Segré, France) and ceftiofur clorhidrato (CEF50, 1 mg/kg i.m.; União Química Farmacêutica, São Paulo, Brazil) were administered during three days, as
analgesic and antibiotic therapy approaches, respectively. Ultrasonographic evaluations were performed in all goats thirty days after the biopsy procedure.
2.3. Histological processing
The ovarian fragments of Experiment 2 were separately fixed in 4% paraformaldehyde for two hours and then transferred to 70% alcohol. After standard histological procedures, the samples were completely cut into serial sections (7 μm) and stained with Schiff Periodic Acid (PAS) and hematoxylin. Histological slides were analyzed under light microscopy (Nikon E200; Toyo, Japan) at ×400 magnification coupled to an image capture system (Nikon, Coolpix 4500).
2.4. Follicular classification and morphology
The preantral follicles were classified according to their development stage [31] into primordial (oocyte surrounded by a single layer of flattened granulosa cells); transition (single layer of both flattened and cuboidal granulosa cells around the oocyte); primary (a single layer of cuboidal granulosa cells around the oocyte); and secondary (oocyte with zona pellucida surrounded by two or more layers of cuboidal granulosa cells). Follicles with oocyte nucleus visualized were morphologically classified as normal (intact oocyte with granulosa cells well organized) or abnormal (oocyte with pyknotic nucleus, retracted cytoplasm and disorganized granulosa cells) [32]. All end points were evaluated by a single operator.
2.5. Follicular density and ovarian stromal cell density
The follicular density was determined as previously reported [15]. Briefly, the perimeter of each histological section was delimited in an image editing software (Image J software, version 1.45, National Institutes of Health, USA) and the area measurement (cm2) recorded. For the evaluation of ovarian stromal cell density, ~10% of the histological sections were analyzed for each ovary fragment [16]. All evaluations and measurements were performed by a single operator.
2.6. Statistical analyses
All statistical analyses were conducted using R software version 3.0.2 (R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria). Data not normally distributed were transformed in Log10 (base 10 logarithmic). Comparison of means (ovarian fragment weight, follicular density, stromal cell density, morphologically normal follicles, and developing follicles) was evaluated by Kruskal-Wallis test and Wilcoxon Mann-Whitney test, when appropriate. Linear regression analysis was used to evaluate the relationship of ovarian fragment weight with needle gauge and number of strikes. Spearman correlation test was performed to verify the association between follicle density and ovarian stromal cell density. The recovery rate of ovarian fragments among the needles was evaluated by chi-square test. Data are presented as mean ± SEM and percentages. The statistical significance was defined as P < 0.05.
3. Results
3.1. Experiment 1. In situ ovarian biopsy
Ovaries (n = 20) were punctured two times with each type of needle and a total of 52 ovarian fragments were obtained after in situ biopsies. The recovery rate and the mean weight of the ovarian fragments collected with the different biopsy needle sizes are shown (Table 1). Overall, the tissue recovery rate was greater (P < 0.05) with 16G and 18G needles than with the 20G needle. Also, the mean weight of ovarian fragments collected with the 16G needle was greater (P < 0.05) than the 18G and 20G needles. In addition, a negative association (P < 0.05) of ovarian fragment weight with the needle gauge was observed by linear regression analysis (Fig. 1). The weight of the ovarian fragments was not influenced (P > 0.05) by the number of strikes performed with each type of needle. Therefore, results obtained with the three types of needles were combined to test the influence of the number of needle strikes on the fragment weight harvested (Fig. 2). No relationship was observed between the number of needle strikes and the weight of the ovarian fragments collected.
Using an in vivo laparoscopic ovarian BPU method, 62 biopsy attempts were performed and 52 ovarian fragments were harvested (90.5% success rate; range, 56 to 100%). The mean time (min) taken to each ovarian laparoscopic BPU procedure, including sedation and preparation of the animal, was 56.6 ± 6.3 min (range, 29 to 90 min). From the total number of ovarian fragments collected (two to three fragments per ovary), 39 fragments were randomly selected and submitted to histological processing. Overall, 2,054 preantral follicles were recorded in 5,882 histological sections with a mean of 52.6 ± 19.0 follicles per ovarian fragment [range, 0 to 708 follicles; coefficient of variation (CV) = 225%]. Results from each ovarian fragment and goat are shown (Fig. 3). On average, the weight of each ovarian fragment harvested was 4.5 ± 0.4 mg with a mean of 14.7 ± 4.8 follicles per mg of tissue [range, 0 to 164; CV = 203%]. Thirty days after the biopsy procedure, no alteration in the abdominal cavity and reproductive organs was observed.
3.2.1. Preantral follicle density
An overall mean follicle density of 28.4 preantral follicles per cm2 was obtained (Table 2). The follicle density differed (P < 0.05) among goats, and also between left versus right ovaries in four out of eight animals. Overall, the follicle density was greater (P < 0.05) in the left versus right ovary.
Considering the ovarian fragment and histological sections as random effects (Table 3) in a variance component analysis, histological sections contributed to the greatest variability (70.5%) of the total variance of follicular density in comparison with the ovarian fragment, which accounted for 29.5%. A high variability of follicle density per ovarian fragment (Fig. 4A) and histological section (Fig. 4B) within each animal was observed. Finally, the relationships between ovarian fragment weight and follicle density, and number of preantral follicles were analyzed; however, neither association was found to be significant (P > 0.05; data not shown).
3.2.2. Stromal cell density
The mean stromal cell density in the ovarian fragments (37.1 cells per 2500 µm2) differed (P < 0.05) among animals, but was similar (P > 0.05) between left and right ovaries
(Table 4). Furthermore, a positive association (P < 0.001) between stromal cell density and follicle density was observed (Fig. 5).
3.2.3. Preantral follicle morphology and follicular activation
The mean percentage of morphologically normal preantral follicles (70.1%) differed (P < 0.05) among animals, but was similar (P > 0.05) between left and right ovaries (Table 5). Moreover, 79.4% of the morphologically normal follicles were classified as primordial follicles, and the percentage of those differed (P < 0.05) among animals and between ovaries (Table 6). More (P < 0.05) normal primordial follicles were observed in the right ovary.
4. Discussion
This study describes for the first time the development of a laparoscopic BPU method to harvest in vivo ovarian tissue in goats. In addition, ovarian tissue features and their associations were evaluated in the collected biopsy fragments. The technique herein developed and the findings obtained are of relevance for goat and sheep domesticated species, and may be applicable to medium sized wild endangered species (e.g., saga antelope, [24]; bighorn sheep, [25]; markhor goats, [26]).
In Experiment 1, biopsy needles of different diameters were evaluated to harvest goat ovarian tissue in situ. Overall, the fragment recovery rate was greater with 16G and 18G needles; however, the weight of the ovarian fragments collected with the 16G was greater than the other two tested needles. An ultrasound-guided transvaginal ovarian biopsy technique has been previously used in several studies with needles of different diameters and lengths to collect tissue and/or ovarian structures (e.g., corpus luteum, ovarian tumors) in women (14G needle: [33]; 18G needle: [34]), mares (12G needle: [1]; 16G needle: [12,23]), cows (18G needle: [4]; 14G needle: [35]), and sows (16G needle: [6]). The selection of an appropriate needle size (diameter and length) for an ultrasound-guided transvaginal ovarian biopsy procedure depends of the anatomical characteristics inherent to the ovary of each species (e.g., gonadal size and consistency), type of material to be collected (e.g., ovarian stroma, luteal tissue, tumor), and length of the vagina.
In Experiment 2, an overall tissue recovery success rate of 90% was obtained using a novel laparoscopic BPU method with a 16G needle in goats. The mean weight of the biopsy ovarian fragments harvested ranged from 0.7 to 11.6 mg. Several studies that used the ultrasound-guided BPU approach for ovarian tissue harvesting have reported a range of success in different species (e.g., equine: 72%, [12]; bovine: 68%, [35]; swine: 50%, [6]) as well as within the same species, according to the type of tissue harvested (e.g., equine corpus luteum: 68%, [1]; equine ovarian stroma: 86%, [19]). The results variability seems to be associated with intraovarian factors, such as the presence of ovarian structures with different densities [16], and extraovarian factors, such as needle diameter and length, operator training, visualization of the target tissue, and access to ovarian structures [11,12].
In the present study, no major difficulties were found during the laparoscopic BPU procedure in vivo. Intermittent abdominal movement of the patient during the laparoscopic procedure, and grasping, rotation, and positioning of the ovary with the atraumatic forceps for lateral/tangent insertion of the needle to harvest ovarian fragments were the main challenges handled during the in vivo BPU procedure. After 30 days of the BPU procedure, no abnormality (e.g. adhesions, infection) of the abdominal cavity and genital organs could be detected through ultrasonography. This finding is in agreement with previous reports in several animal species, which did not find any major abdominal or health problems after ultrasound-guided transvaginal ovarian biopsy procedures (bovine: [35]; equine: [12-14,23]; swine: [6]). Similarly, no post-operative complications have been reported in general for women undergoing laparoscopic ovarian biopsy procedures [7-10]. In this study, the fertility of the ovarian biopsied goats could not be evaluated. Therefore, although several reports have shown no effect of the BPU procedure on cyclicity and fertility of mares [12,14,16,23] and women [36,37], follow up studies including fertility data post-ovarian BPU are necessary in goats.
The number of preantral follicles (per fragment and milligram of tissue) and the follicular density per showed a large disparity among animals and ovarian fragments of the same animal. Furthermore, the number of preantral follicles and the follicular density were not associated with the ovarian fragment weight. Regardless of how the follicular population has been evaluated in previous studies, it has been accepted that the heterogeneity of follicular density in the ovarian cortex may be related to several factors, such as the formation and migration of the primordial germ cells during the embryogenesis [38], species (mares, [13]; women, [9]; sheep [30]), presence of ovarian structures (mares, [16]; cows, [39]; buffalo,
[40]; sheep, [41]), and age (mares, [17]; women, [29]). The present study also reports, for the first time, the preantral follicular density in goat ovarian fragments. Our novel findings demonstrated that follicular density in goats was different when compared to horses (~10-fold greater; [16]) and canines (~11-fold lower; [42]), and reinforces the importance of the species as a determinant factor on follicular density.
The variance components analysis revealed that the histological sections contributed to the greatest variability in the total variance of follicular density. Similar results have been reported for other species (mares, [17]; sheep, [30]) suggesting that a minimum number of ovarian fragments and histological sections should be considered when determining ovarian follicular density. Therefore, once that follicular heterogeneity is a species-specific condition and histological evaluations are time consuming, a study to determine the number of ovarian fragments and histological sections sufficient to estimating the follicular density in goats is warranted.
The mean ovarian stromal cell density differed among animals and ovarian fragments within the same animal. Moreover, a positive association between stromal cell density and follicular density was observed. The association of follicle and stromal cell densities has been previously reported in mares [17,19]. The presence of multiple ovarian structures (antral follicles and corpus luteum) can induce a greater compression in the ovarian parenchyma and consequently lead to crowding of preantral follicles and stromal cells [17]. In addition, cell-cell and cell-follicle interactions are important because several growth factors such as bone morphogenetic proteins 4 and 7 (BMP-4 and BMP-7) expressed by stromal and/or thecal cells are positive regulators of activation and follicular development [43,44].
The percentage of morphologically normal follicles differed among animals as well between ovarian fragments within the same animal. Moreover, the majority of the normal follicles was classified as primordial and also differed among animals and between ovaries of the same animal. In mammals, several regulatory mechanisms and factors are associated with follicular viability and activation [45-47]. Moreover, the presence of clusters of primordial follicles reduces the probability of follicular activation and development of nearby follicles avoiding the premature activation and exhaustion of follicular reserve [48]. The aforementioned mechanisms determine the spatial distribution pattern throughout the ovarian stroma and support our findings of the high level of follicle heterogeneity among biopsy fragments and histological sections found in the goat ovary.
In summary, a laparoscopic BPU method has been developed to harvest goat ovarian tissue in vivo with a satisfactory success rate. Furthermore, this study described for the first time goat ovarian biopsy fragments, as previously reported for other species, having a high heterogeneity in follicular density, morphology, class distribution, and stromal cell density. The laparoscopic ovarian BPU method herein developed for goats and the ovarian tissue findings may be translatable to domesticated sheep as well as for medium sized wild endangered species. Finally, the features observed in ovarian fragments harvested by the BPU method in goats warrant attention and should be considered when using this method to harvest preantral follicles to be used for assisted reproductive technologies.
Acknowledgments
The authors are grateful to the Laboratory of Physiology and Control of Reproduction (LFCR) and Laboratory of Manipulation of Oocytes and Preantral Follicles (LAMOFOPA), for taking the space, equipment and animals. We also thank the LFCR and LAMOFOPA staffs for helping during our experiment. Research supported by Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel (CAPES; Special Visiting Researcher Grant #88881.064955/2014-01). Fabiana A.S. Brandão was the recipient of a Masters of Science scholarship from Ceará Foundation for the Support of Scientific and Technological Development (FUNCAP; Grant #BMD-0008-00665.01.08/15), Brazil.
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