PAULO ALFREDO FEITOZA BÖHM
AÇÕES METABÓLICAS DO ALELOQUÍMICO JUGLONA NAS RAÍZES DE SOJA
Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas (área de concentração Biologia Celular e Molecular) da Universidade Estadual de Maringá, para obtenção do grau de Doutor em Ciências Biológicas.
Maringá Maio – 2009
PAULO ALFREDO FEITOZA BÖHM
AÇÕES METABÓLICAS DO ALELOQUÍMICO JUGLONA NAS RAÍZES DE SOJA
Prof. Dr. Osvaldo Ferrarese-Filho Orientador
Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP) (Biblioteca Central - UEM, Maringá – PR., Brasil)
Böhm, Paulo Alfredo Feitoza
B676a Ações metabólicas do aleloquímico juglona nas raízes de soja / Paulo Alfredo Feitoza Böhm. -- Maringá, 2009.
62 f. : figs., tab.
Orientador : Prof. Dr. Osvaldo Ferraresi-Filho. Tese (doutorado) - Universidade Estadual de
Maringá, Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas, 2009.
1. Aleloquímico juglona - Raízes de soja. 2. Juglans nigra - Seleção natural - Aleloquímico. 3. Soja - Raizes - Espécies reativas de oxigênio. 4. Soja - Raizes - Atividades das peroxidases. 5.
Lignificação - Raízes de soja. 6. Reactives species oxygen (ROS) I. Ferraresi-Filho, Osvaldo, orient. II. Universidade Estadual de Maringá. Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. III. Tílulo.
BIOGRAFIA
Paulo Alfredo Feitoza Böhm, filho de Paulo Böhm e Genalva Feitoza Böhm, nasceu em 03 de setembro de 1976, em Maringá, Paraná. Em março de 1998, iniciou o curso de Ciências Biológicas na Universidade Estadual de Maringá, graduando-se em julho de 2001. Tem experiência na área de botânica, atuando principalmente nos temas relacionados à Bioquímica Vegetal com ênfase no Metabolismo Secundário de Plantas. Concluiu o Mestrado no PBC (Programa de pós-graduação em Ciências Biológicas), em 2004. Iniciou o Doutorado em Ciências Biológicas (Biologia Celular e Molecular) em 2005, na Universidade Estadual de Maringá. Atualmente é professor da rede particular de ensino.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus, que sempre ilumina meus caminhos e fortalece para sempre continuar.
Aos meus pais, Paulo e Genalva que sempre investiram e me incentivaram nos estudos.
A minha esposa, Franciele pelo carinho, compreensão e ajuda tanto no trabalho como em casa.
Ao professor Osvaldo e a professora Maria de Lourdes, pela orientação dedicada, pela amizade e principalmente pelos exemplos de vida.
Aos colegas de laboratório que me acompanharam nesta tragetória, em especial ao meu amigo Victor Hugo Salvador, Aparecida Maria Dantas Ramos e Flausina Cenerini.
A todos os professores que contribuíram com minha formação para chegar até aqui.
Dedicatória: À minha filha Helena, que está por vir, dedico.
APRESENTAÇÃO
Esta Tese é composta de uma Revisão e de dois Artigos Científicos. A revisão descreve o estado atual da arte no que tange à alelopatia e juglona. O primeiro artigo descreve os efeitos de juglona no crescimento e lignificação das raízes de soja. O segundo artigo descreve os efeitos de juglona nas atividades de enzimas anti-oxidativas nas raízes de soja. Em consonância com as regras do Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas, os artigos foram redigidos de acordo com a revista Allelopathy Journal (Qualis B1).
P.A.F. Böhm. Juglone as an allelopath.
P.A.F Böhm, F.M.L.Z. Böhm, M.L.L. Ferrarese, O. Ferrarese-Filho. Juglone inhibits soybean root growth and induces lignification. Allelopathy Journal (a ser submetido).
P.A.F. Böhm, F.M.L.Z. Böhm, M.L.L. Ferrarese, A. R. Soares, O. Ferrarese-Filho. Reactive species oxygen and related anti-oxidative enzymes in juglone-stressed soybean roots. Allelopathy Journal (a ser submetido).
RESUMO GERAL
INTRODUÇÃO E OBJETIVOS – Plantas superiores regularmente liberam compostos orgânicos no ambiente, os quais são adicionados ao solo. Alguns destes compostos têm sido citados como agentes de interações entre plantas, fenômeno conhecido como alelopatia. Estes compostos são liberados por vários mecanismos incluindo a lixiviação pela água pluvial, exsudação pelas raízes, decomposição natural de partes das plantas na superfície ou no próprio solo. Todas estas possibilidades envolvem o contato dos metabólitos secundários com a rizosfera ou com o solo, onde as plantas devem absorvê-lo. A ação primária dos compostos alelopáticos ainda não foi estabelecida, mas alguns efeitos fisiológicos são conhecidos. Tipicamente os aleloquímicos interferem nas plantas superiores suprimindo a germinação, causando injúrias durante o crescimento da raiz e meristemas e, então, inibindo o crescimento das plantas. Este é o caso das naftoquinonas. Estes compostos fenólicos ocorrem em cerca de 20 famílias de plantas, e são derivados das vias do ácido chiquímico e do ácido o-succinobenzóico. Efeitos inibitórios da nogueira preta (Juglans nigra L.) sobre várias espécies de plantas são conhecidos há muitos anos. A ação alelopática da nogueira preta afeta o crescimento de várias plantas de pastagens, plantas ornamentais e várias espécies lenhosas. O agente ativo causador da inibição do crescimento é a juglona, uma naftoquinona. Nos tecidos vivos, este composto é encontrado na sua forma reduzida não tóxica, a hidrojuglona. Contudo quando exposta ao ar, hidrojuglona é oxidada e a forma tóxica, juglona, que é liberada. As plantas respondem variadamente à presença de juglona, e esta toxicidade inclui efeitos no crescimento, no conteúdo de clorofila, na fotossíntese e na respiração. Juglona exibe efeitos inibitórios significativos nas plântulas e raízes de soja como diminuição do crescimento, fotossíntese, transpiração, condutância nos estômatos e respiração das folhas e das raízes. Além disso, juglona gera espécies reativas de oxigênio (ROS), que estão associadas com a redução do crescimento e perda da viabilidade celular. Dentre diferentes espécies, soja (Glycine
max L. Merrill) é considerada uma espécie sensível à juglona. Com base nisto, o
presente trabalho teve como objetivo estudar os efeitos da juglona sob dois aspectos. A) Efeitos sobre a lignificação e as enzimas envolvidas. Para isso, as atividades da fenilalanina amônia-liase (PAL) e peroxidases (PODs), além do conteúdo de lignina foram analisados durante o crescimento das raízes de soja submetidas à juglona. B) Efeitos sobre a produção de ROS e as enzimas antioxidantes. Para isso foram
analisados o comprimento das raízes, viabilidade celular, teores de superóxido (O2·−) e peróxido de hidrogênio (H2O2), atividades da superóxido dismutase (SOD), guaiacol peroxidase (GPX) e catalase (CAT), além da peroxidação lipídica.
MÉTODOS – Plântulas de três dias foram cultivadas em solução nutritiva (pH 6,0) com ou sem 5 µM de juglona. Os experimentos foram conduzidos em câmara de germinação (25°C, em ciclo de 12-h de luz/12-h de escuro e irradiação de 280 µmol m-2 s-1) durante 24 horas. As raízes foram medidas e preparadas para os experimentos. Viabilidade celular, atividades das POD solúvel e ligada, H2O2 e conteúdo de lignina foram determinados espectrofotometricamente, enquanto a atividade da PAL foi determinada por cromatografia líquida de alta performace (HPLC). Experimentos similares foram feitos, durante 12 horas, com plântulas cultivadas em solução nutritiva com 5 µM ou 10 µM de juglona, avaliando os efeitos sobre ROS e enzimas antioxidantes. Crescimento das raízes, viabilidade celular, conteúdos de O2·− e H2O2, atividades de SOD, GPX e CAT e a peroxidação lipídica foram determinadas espectrofotometricamente. ANOVA foi aplicado para verificar a significância das variações observadas. Os dados foram expressos em experimentos independentes ± S.E. As diferenças entre os parametros foram avaliadas pelo teste de Scott-Knott e foram consideradas significativas quando apresentaram valor de P <0,05.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A) Efeitos da juglona na lignificação e enzimas envolvidas. O aleloquímico claramente diminuiu o comprimento das raízes de soja seguida pela significante perda da viabilidade celular. Outro fato é que a exposição das plântulas a juglona inibiu o crescimento das raízes com significante aumento na atividade da PAL e conteúdo de lignina, sem afetar sua composição monomérica. Embora os mecanismos envolvidos ainda não sejam conhecidos, mudanças enzimáticas (PAL, por exemplo) e produção de lignina devem ser importantes para a redução do comprimento das raízes de soja. Neste sentido, é sabido que as plantas são suscetíveis aos vários aleloquímicos devido à alta atividade metabólica e lignificação durante o crescimento das raízes. Os resultados deste trabalho sugerem evidentes indícios de que a lignificação pode ser fortemente ligada ao estresse alelopático, haja vista que a produção de lignina pelas raízes já foi observada em outras espécies de plantas.
B) Efeitos sobre a produção de ROS e as enzimas antioxidantes. Os resultados revelaram que a juglona inibe o comprimento das raízes associado com significante perda da viabilidade celular. Além disso, os conteúdos de O2·− e H2O2 e a atividade da SOD foram aumentados. As atividades da GPX e CAT, além da peroxidação lipídica, não foram afetadas pela juglona. A juglona pode servir como um aceptor e doador de elétrons na respiração e na fotossíntese, criando um potencial gerador de radicais livres, que possivelmente causam danos às membranas. Isto pode ser confirmado pelo fato que a juglona aumentou a produção de ROS e afetou severamente a viabilidade celular das raízes de soja. Neste aspecto, é sabido que SOD, GPX e CAT atuam como enzimas que eliminam ROS. SOD atua como a primeira linha de defesa contra ROS dismutando O2·− para H2O2. GPX e CAT são também indispensáveis para os mecanismos de defesa, porque subsequentemente à ação da SOD, ambas detoxificam H2O2 em H2O. Os resultados do presente trabalho podem ser atribuídos à produção de ROS por juglona causando redução no crescimento das raízes de soja.
CONCLUSÕES – As principais conclusões extraídas da presente investigação são: (1) que o papel desempenhado pela juglona no processo de lignificação do crescimento de raízes de soja, induzido por aleloquímico, pode ser devido à excessiva produção de lignina, e (2) simultaneamente, a elevada produção de ROS pode, também, reduzir o crescimento das raízes de soja, associado à perda da viabilidade celular.
GENERAL ABSTRACT
INTRODUCTION AND AIMS – Higher plants regularly release organic compounds in the environment; their decay products are often added to the soil matrix and some of these have been reported as agents of plant-plant interactions, a characteristic of the well-known phenomenon called allelopathy. These compounds are released by a number of mechanisms, which include release in soil by rainwater, excretion or exudation from roots, and by natural decay of parts of plants lying above or below the ground. All these possibilities involve the contact of secondary chemicals with the rhizosphere or the bulk soil, where plants may absorb them. The primary mode of action has not been established for any allelopathic compound, albeit some physiological actions are known. The array of compounds cuts across many chemical classes, and it is unlikely they have a common mechanism of action. Allelochemicals, active against higher plants, typically suppress seed germination, causing injury to root growth and other meristems, or inhibiting seedling growth. This is likely to be the case with naphtoquinones. These phenolic compounds occur in about 20 plant families and are derived from the shikimic acid and o-succinoylbenzoic acid biosynthetic pathway. Inhibitory effect of black walnut (Juglans nigra L.) on associated plant species has been known for many years in allelopathy. Black walnut allelopathy affects growth of various vegetables, field crops, ornamental plants, and several woody species. The active agent causing growth inhibition is a naphtoquinone called juglone. In living tissues this compound is present in a reduced nontoxic form, the hydrojuglone. However, when exposed to the air hydrojuglone is oxidized and toxic juglone is released. Plant species show varying responses to the presence of juglone, and its toxicity includes effects on growth, chlorophyll content, photosynthesis and respiration. Juglone exhibits significant inhibitory effects on soybean shoot and root’s relative growth rates, leaf photosynthesis, transpiration, stomatal conductance, and leaf and root respiration. Furthermore, juglone generates reactive oxygen species (ROS), which are associated with a growth deceleration and cell viability. Among different plant species, soybean (Glycine max L. Merrill) has been considered as a juglone-sensitive crop. Based on this, current work has been planned to study the effects of juglone in two aspects. A) Effects on lignification and related enzymes. For this, phenylalanine ammonia-lyase (PAL) and peroxidase (POD) activities and lignin content were analyzed during root growth of soybean seedlings submitted to juglone. B) Effects on ROS
production and related antioxidative enzymes. For this, root length and cell viability, superoxide (O2·−) and hydrogen peroxide (H2O2) contents, superoxide dismutase (SOD), guaiacol peroxidase (GPX) and catalase (CAT) activities and lipid peroxidation were analyzed.
METHODS – Three-day-old seedlings were cultivated in nutrient solution (pH 6.0) with or without 5 µM of juglone. Experiments were carried out in a growth chamber (25°C, 12-h light/12-h dark cycle, irradiance of 280 µmol m-2 s-1) during 24 hours. Roots were then measured and prepared for assays. Cell viability, soluble and cell wall-bound POD activities, H2O2 and lignin contents were determined spectrophotometrically, whereas PAL activities and lignin monomeric composition were determined by high performance liquid chromatography (HPLC). Similar experiments were made, during 12 hours, with seedlings cultivated in nutrient solution with or without 5 µM and 10 µM juglone evaluating its effects on ROS and anti-oxidative enzymes. Root growth, cell viability, O2·− and H2O2 contents, SOD, GPX and CAT activities and lipid peroxidation were determined spectrophotometrically. ANOVA was applied to test the significance of measured differences. Data are expressed as means of independent experiments ± S.E. The difference between parameters was evaluated by Scott-Knott´s test and P values <0.05 were considered to be statistically significant.
RESULTS AND DISCUSSION
A) Effects of juglone on lignification and related enzymes. The allelochemical clearly decreased soybean root length followed by significant loss of cell viability. Another fact is that exposure of soybean seedlings to juglone inhibited root growth followed by significant increases in PAL activities and lignin contents without to affect its monomeric composition. Although the mechanisms involved are still unknown, enzymatic changes (PAL, for example) and lignin production may be important to account for the reduction in soybean root growth. In addition, it is known that plants are susceptible to several allelochemicals due to high metabolic activity and lignification during root growth. Results of this work suggest evident induction of the lignification which can be strengthened by a link between alellopathic stress and root lignin production observed in other plant species.
B) Effects of juglone on ROS production and antioxidative enzymes. Results revealed that juglone inhibited root growth associated to significant loss of cell viability. Furthermore, enhanced levels of O2·− increased SOD activities followed by increases in H2O2 contents. GPX and CAT activities and lipid peroxidation were not affected by juglone. Juglone’s ability to serve as an electron acceptor and donor in respiration and photosynthesis creates the potential to generate free radicals which possibly damage membranes. It is can be true since juglone increased ROS production and severely affected cell viability of soybean roots. In addition, it is well known that SOD, GPX and CAT act as scavenging enzymes of ROS. SOD act as the first line of defense against ROS dismutating O2·− to H2O2. GPX and CAT are also indispensable for this defense mechanism because, subsequently to the SOD action, both detoxify H2O2 to H2O. Then, results of the present work can be attributed to the ROS production by juglone causing reduced soybean root growth.
CONCLUSIONS – The main conclusions that can be drawn from the current research that (1) juglone has an important role on lignification process since allelochemical-induced inhibition of soybean root growth may be due to the excessive production of lignin, and (2) simultaneously, the enhanced ROS production may also reduce the soybean root growth associated to the loss of cell viability.
